一種酶促芐氧羰基-丙氨酰-谷氨酰胺的合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種深度共熔溶劑中酶促芐氧羰基-丙氨酰-谷氨酰胺的合成方法，屬于生物化工領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]二肽是在兩個氨基酸單體中加入一個肽鍵，在制藥和食品行業(yè)都很重要，谷氨酰胺是人體血液中最重要的氨基酸之一，并且在預(yù)防腸道萎縮方面扮演重要角色。然而，由于谷氨酰胺的熱不穩(wěn)定性和低溶解度，很難被直接利用。因此，丙氨酰-谷氨酰胺二肽由于它的穩(wěn)定性和高溶解度，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛的用來替代谷氨酰胺作為病人輸液的組成部分。目前為止，三個主要技術(shù)可用于多肽合成:化學(xué)合成、細胞發(fā)酵技術(shù)、酶的合成。由于條件溫和、最低的側(cè)鏈保護和酶的定向性，使用絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶(例如木瓜蛋白酶)作為一種生物催化劑，已成為20世紀非常新穎和有前途的研宄領(lǐng)域。
[0003]N-芐氧羰基-谷氨酰胺-丙氨酸(Z-Ala-Gln)是Ala-Gln的前體，使用酶的Z-Ala-Gln合成方法是使用木瓜蛋白酶作為生物催化劑與Z-Ala-OMe和Gln隨著?；w和親核試劑在水中溶解，這個方法分別使用獲得的二肽產(chǎn)量大約是35-36%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種簡單的基于靜電自組裝技術(shù)的固定化方法，形成了纖維素基材-酶-丙烯酰胺三層結(jié)構(gòu)的固定化酶。具有固定化木瓜蛋白酶固定化效率高、酶活回收率高，操作簡便，條件溫和等特點。
[0005]一種深度共熔溶劑中酶促芐氧羰基-丙氨酰-谷氨酰胺的合成方法，其特征在于包括以下步驟:
[0006]一種酶促芐氧羰基-丙氨酰-谷氨酰胺的合成方法，包括如下步驟:
[0007](I)先將DES與水混合配成DES混合液，再將谷氨酰胺分散在DES混合液中，得到懸濁液；
[0008](2)將Z-ALA-OME溶解在乙醇中，配成濃度為0.3?3.0mmo I/ml的溶液；
[0009](3)將步驟⑴所得懸濁液與三乙胺混合，攪拌溶解，再與含可溶性蛋白的木瓜蛋白酶粉和步驟(2)制得的溶液混合，在30-70°C下攪拌反應(yīng)l_24h。
[0010]所述步驟(I)所述DES混合液中DES與水的質(zhì)量比為5%?30%。
[0011 ] 所述DES為尿素-氯化膽堿DES或甘油-氯化膽堿DES。
[0012]所述懸池液中谷氨酰胺的濃度為0.08?0.25mmol/mlo
[0013]所述三乙胺與谷氨酰胺的摩爾比為2.22?10.67。
[0014]步驟(3)形成的反應(yīng)體系中谷氨酰胺與Z-ALA-OME摩爾比為1.5?4.5。
[0015]所述木瓜蛋白酶粉與三乙胺的比例為37.5?60mg/mmol。
[0016]所述木瓜蛋白酶粉中可溶性蛋白的含量為15%。
[0017]本發(fā)明使用深度共熔溶劑為反應(yīng)介質(zhì)，以木瓜蛋白酶為催化劑。在最適條件下恒溫恒pH進行反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取，并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到芐氧羰基-丙氨酰-谷氨酰胺。該反應(yīng)是一個親核反應(yīng)，反應(yīng)物由親核試劑與?；w組成。?；w與木瓜蛋白酶首先生成中間體，隨后親核試劑進攻該中間體形成Z-Ala-Gln產(chǎn)物，然而，由于反應(yīng)體系中的水同樣能作為親核試劑進攻該中間體生成副產(chǎn)物Z-A-OH，因此用傳統(tǒng)介質(zhì)所得到的產(chǎn)率很低。本發(fā)明通過在介質(zhì)中引入DES，在維持酶活性構(gòu)像的同時降低體系中的水分含量，從而減少副反應(yīng)的發(fā)生。底物谷氨酰胺(Gln)與?；墓wZ-ALA-OME的比(G/Z)影響了二肽合成的產(chǎn)率。在這個親核的反應(yīng)中H2O和谷氨酰胺可以與Z-Ala-酶(ZAE)中間體反應(yīng)。因此，增加了 G/Z的比減少了水含量，可以導(dǎo)致ZAE形成最終產(chǎn)物Z-Ala-Gln，而不是 Z-Ala-OH0
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0019](I)DES反應(yīng)介質(zhì)成本較低。
[0020](2)通過該方法合成Z-Ala-Gln產(chǎn)率較高，條件溫和，且易分離純化，具有良好的工業(yè)價值。
【附圖說明】
[0021]圖1為不同底物濃度比對產(chǎn)率的影響曲線圖。
[0022]圖2為不同水含量對產(chǎn)率的影響曲線圖。
[0023]圖3為不同酶濃度的影響曲線圖。
[0024]圖4為不同溫度對產(chǎn)率的影響曲線圖。
[0025]圖5為三乙胺濃度對產(chǎn)率的影響曲線圖。
[0026]圖6為芐氧羰基-丙氨酸-谷氨酰胺高效液相色譜圖。
[0027]圖7為芐氧羰基-丙氨酸-谷氨酰胺質(zhì)譜圖。
【具體實施方式】
[0028]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0029]實施例1
[0030]將0.2055mmol的谷氨酰胺分散在1.8ml尿素-氯化膽堿DES (含水量16.67%)水溶液中，向所得溶液中加入1.0mmol的三乙胺，攪拌溶解，與含9mg可溶性蛋白的60mg木瓜蛋白酶粉混合，按谷氨酰胺與Z-ALA-OME摩爾比為2，將0.10275mmol的Z-ALA-OME溶解在0.1ml乙醇中，在40°C下放入2ml燒瓶中攪拌反應(yīng)24h，得到Z-Ala-Gln的產(chǎn)率為62.53%。
[0031]實施例2
[0032]將0.2055mmol的谷氨酰胺分散在1.8ml尿素-氯化膽堿DES (含水量16.67%)水溶液中，向所得溶液中加入1.6mmol的三乙胺，攪拌溶解，與含9mg可溶性蛋白的60mg木瓜蛋白酶粉混合，按谷氨酰胺與Z-ALA-OME摩爾比為2，將0.10275mmol的Z-ALA-OME溶解在0.1ml乙醇中，在40°C下放入2ml燒瓶中攪拌反應(yīng)18h。得到Z-Ala-Gln的產(chǎn)率為62.62%。
[0033]實施例3
[0034]將0.2055mmol的谷氨酰胺分散在1.8ml尿素-氯化膽堿DES (含水量16.67% )水溶液中，向所得溶液中加入1.0mmol的三乙胺，攪拌溶解，與含9mg可溶性蛋白的60mg木瓜蛋白酶粉混合，按谷氨酰胺與Z-ALA-OME摩爾比為2，將0.10275mmol的Z-ALA-OME溶解在0.1ml乙醇中，在50°C下放入2ml燒瓶中攪拌反應(yīng)24h。得到Z-Ala-Gln的產(chǎn)率為62.53%。
[0035]實施例4
[0036]將0.2055mmol的谷氨酰胺分散在1.8ml尿素-氯化膽堿DES (含水量16.67% )水溶液中，向所得溶液中加入1.0mmol的三乙胺，攪拌溶解，與含9mg可溶性蛋白的60mg木瓜蛋白酶粉混合，按谷氨酰胺與Z-ALA-OME摩爾比為4.2，將0.0489mmol的Z-ALA-OME溶解在0.1ml乙醇中，在40°C下放入2ml燒瓶中攪拌反應(yīng)12h。得到Z-Ala-Gln的產(chǎn)率為70.66%。
[0037]實施例5
[0038]將0.2055mmol的谷氨酰胺分散在1.8ml尿素-氯化膽堿DES (含水量16.67% )水溶液中，向所得溶液中加入1.0mmol的三乙胺，攪拌溶解，與含9mg可溶性蛋白的60mg木瓜蛋白酶粉混合，按谷氨酰胺與Z-ALA-OME摩爾比為2，將0.10275mmol的Z-ALA-OME溶解在0.1ml乙醇中，在70°C下放入2ml燒瓶中攪拌反應(yīng)24h。得到Z-Ala-Gln的產(chǎn)率為15.14%。
[0039]實施例6
[0040]將0.2055mmol的谷氨酰胺分散在1.8ml尿素-氯化膽堿DES (含水量27.78% )水溶液中，向所得溶液中加入1.0mmol的三乙胺，攪拌溶解，與含9mg可溶性蛋白的60mg木瓜蛋白酶粉混合，按谷氨酰胺與Z-ALA-OME摩爾比為2，將0.10275mmol的Z-ALA-OME溶解在0.1ml乙醇中，在40°C下放入2ml燒瓶中攪拌反應(yīng)18h。得到Z-Ala-Gln的產(chǎn)率為48.67%。
【主權(quán)項】
1.一種酶促芐氧羰基-丙氨酰-谷氨酰胺的合成方法，其特征在于，包括如下步驟:(1)先將DES與水混合配成DES混合液，再將谷氨酰胺分散在DES混合液中，得到懸濁液； (2)將Z-ALA-OME溶解在乙醇中，配成濃度為0.3?3.0mmo I/ml的溶液； (3)將步驟(I)所得懸濁液與三乙胺混合，攪拌溶解，再與含可溶性蛋白的木瓜蛋白酶粉和步驟(2)制得的溶液混合，在30-70°C下攪拌反應(yīng)l_24h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)所述DES與水的質(zhì)量比為5%?30%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述DES為尿素-氯化膽堿DES或甘油_氯化膽喊DES。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述懸濁液中谷氨酰胺的濃度為0.08 ?0.2Smmol /ml 0
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述三乙胺與谷氨酰胺的摩爾比為 2.22 ?10.67。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步驟(3)形成的反應(yīng)體系中谷氨酰胺與Z-ALA-OME摩爾比為1.5?4.5。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述木瓜蛋白酶粉與三乙胺的比例為 37.5 ?60mg/mmol。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述木瓜蛋白酶粉中可溶性蛋白的含量為 15%。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶促芐氧羰基-丙氨酰-谷氨酰胺的合成方法，包括如下步驟：(1)先將DES與水混合配成DES混合液，再將谷氨酰胺分散在DES混合液中，得到懸濁液；(2)將Z-ALA-OME溶解在乙醇中，配成濃度為0.3～3.0mmol/ml的溶液；(3)將步驟(1)所得懸濁液與三乙胺混合，攪拌溶解，再與含可溶性蛋白的木瓜蛋白酶粉和步驟(2)制得的溶液混合，在30-70℃下攪拌反應(yīng)1-24h。本發(fā)明通過該方法合成Z-Ala-Gln產(chǎn)率較高，條件溫和，且易分離純化，操作簡便，具有良好的工業(yè)價值。
【IPC分類】C12P21-02
【公開號】CN104862363
【申請?zhí)枴緾N201510161000
【發(fā)明人】婁文勇, 徐紅, 麻麗莎, 林子超, 曹詩林
【申請人】華南理工大學(xué)
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年4月7日