專利名稱：改進(jìn)的脂解酶及其用途的制作方法
總的來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及脂解酶領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及采用重組DNA技術(shù)改進(jìn)的脂解酶，涉及該酶的制備方法及該酶的用途，尤其是應(yīng)用酶促洗滌組合物。
脂解酶是指將甘油三酯水解為游離脂肪酸以及甘油二酯，甘油單酯以及最后水解為甘油的酶。它們還能分解更復(fù)雜的酯如植物的角質(zhì)層或皮膚的皮脂。工業(yè)上的各種酶促過(guò)程如甘油三酯的酯交換以及酯基轉(zhuǎn)移作用以及酯合成過(guò)程中都應(yīng)用脂解酶。為了有助于提高洗滌劑產(chǎn)品的去除油脂的特性，將脂解酶用于洗滌劑組合物中。
最普遍使用的脂解酶是脂酶(EC 3.1.1.3)。例如，EP-A-258 068和EP-A305 216(兩個(gè)Novo Nordisk)兩者描述了采用重組DNA技術(shù)由異源宿主微生物制備的真菌脂酶，尤其是從Thermomyces Lanuginosus/Humicola lanuginosa制備的脂酶。EP-A-331 376(Amano)描述了含有蔥頭假單胞脂酶的氨基酸序列的脂酶以及該酶的重組DNA制備技術(shù)，及其用途。在WO 89/09263以及EP-A-218272(兩個(gè)Gist-Brocades)進(jìn)一步提供了重組DNA技術(shù)制備的脂酶的例子。盡管公開(kāi)了大量的脂酶及其修飾物，但到目前為止，僅發(fā)現(xiàn)來(lái)源于Humicola lanuginosa的脂酶由于其可用作為商品名為L(zhǎng)ipolase(TM)的洗滌產(chǎn)品的附加成分而具有廣泛的商業(yè)應(yīng)用性。
脂酶的一個(gè)鑒別特征是它們具有界面活化作用。這意味著該酶對(duì)已形成界面或膠態(tài)分子團(tuán)的底物的作用比對(duì)完全溶解的底物的作用活性更高。當(dāng)將底物濃度提高至底物的臨界膠團(tuán)濃度(CMC)，并形成界面時(shí)突然提高脂解活性可出現(xiàn)界面活化作用。將試驗(yàn)結(jié)果繪制酶活性相對(duì)底物濃度圖譜，上述現(xiàn)象在該圖上表現(xiàn)為不連續(xù)的點(diǎn)。
根據(jù)脂酶分子蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中構(gòu)象變化可解釋脂酶的界面活性化作用機(jī)制。在游離的未結(jié)合狀態(tài)，由一個(gè)螺旋形的蓋覆蓋了催化結(jié)合位點(diǎn)。在結(jié)合至脂類底物上后，該蓋被取代并將催化位點(diǎn)暴露出來(lái)。也可以認(rèn)為螺形蓋與脂類界面相互作用，因而使酶仍結(jié)合至該界面上。
WO-A-92/05249(Novo Nordisk)公開(kāi)了通過(guò)遺傳手段改進(jìn)的脂酶，尤其是來(lái)自于Humicola lanuginosa的脂酶，在該酶的脂類接觸區(qū)已進(jìn)行了改變。該申請(qǐng)中將脂類接觸區(qū)定義為由螺旋形復(fù)蓋的活性形式的表面。其中的改進(jìn)包括缺失或取代該脂類接觸區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，經(jīng)增加脂類接觸區(qū)的靜電荷和/或降低其疏水性，或便于改變脂類接觸區(qū)的表面構(gòu)型。這種改進(jìn)可以采用使脂類接觸區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)帶負(fù)荷氨基酸殘基缺失，或用中性或多個(gè)帶正電荷氨基酸取代這些氨基酸，和/或用帶正電荷氨基酸替代該脂類接觸區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)中性氨基酸殘基，和/或缺失該脂類接觸區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)親水性氨基酸殘基，或由疏水性氨基酸取代這些殘基來(lái)實(shí)現(xiàn)。
角質(zhì)酶(Cutinase)是蠟酯水解酶的一個(gè)亞類(EC3.1.1.50)。這些酶能降解角質(zhì)層即存在于植物上的脂化的長(zhǎng)鏈脂肪酸和脂肪醇的網(wǎng)狀組織，作為葉和莖的保護(hù)性覆蓋層。另外，角質(zhì)酶具有某些脂解活性。即能夠水解甘油三酯。因此將這些酶作為脂酶的一個(gè)特殊種類。但是，與脂酶相反，角質(zhì)酶沒(méi)有顯示任何本質(zhì)上的界面活化作用。
角質(zhì)酶可從如植物(例如花粉)，細(xì)菌以及真菌的多種來(lái)源得到。由于其降解脂肪的特性，已有人建議將角質(zhì)酶作為酶促洗滌劑組合物的成分。例如，WO-A-88/09367(Genencor)建議將一種表面活性劑和一種基本上活化的細(xì)菌角質(zhì)酶結(jié)合可以配制有效的洗滌劑組合物。它公開(kāi)的洗滌劑組合物包括從革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌蔥頭假單胞菌ATCC 53552獲得的角質(zhì)酶。但是，在更新的歐洲專利申請(qǐng)EP-A-476 915(Clorox)中，公開(kāi)了當(dāng)以常規(guī)方法使用時(shí)，同樣的該酶(該文中稱為脂酶)在從纖維織物上去除油污漬時(shí)并不比其他脂酶更有效。
最近，已測(cè)定了從茄病鐮孢得到的角質(zhì)酶的三維結(jié)構(gòu)(Martinezet al.(1992)Nature 356，615-618)。已發(fā)現(xiàn)這些角質(zhì)酶并不具有覆蓋催化結(jié)合位點(diǎn)的螺旋形蓋子。代替之，似乎溶劑可接近該活性位點(diǎn)絲氨酸殘基。這些結(jié)果似乎已證實(shí)本發(fā)明的關(guān)于脂酶的界面活化作用機(jī)制的理論。
已將茄病鐮孢的角質(zhì)酶基因進(jìn)行克隆并已測(cè)序(Ettinger et al.，(1987)Biochemistry 26，7883-7892)。WO-A-90/09446(植物遺傳系統(tǒng))描述了該基因在大腸桿菌中的克隆和制備。在角質(zhì)酶和底物之間有或無(wú)界面對(duì)，該角質(zhì)酶能有效地催化水相和非相介質(zhì)中的酯的水解和合成?；谒目傮w穩(wěn)定性，暗示該角質(zhì)酶能用于制備如洗衣用洗滌劑的洗滌劑以及其他特殊的脂溶性制劑如化妝用組合物和香波。尚沒(méi)有公開(kāi)經(jīng)濟(jì)可行的制備該酶的方法，也沒(méi)有公開(kāi)含有角質(zhì)酶的具體的酶促洗滌劑組合物。
由于上面所述鑒別特征，即沒(méi)有界面活化作用。為了達(dá)到公開(kāi)本專利申請(qǐng)的目的，我們將角質(zhì)酶定義為基本上沒(méi)有界面活化作用的脂解酶。因此角質(zhì)酶與經(jīng)典的脂酶不同，它不具有覆蓋催化結(jié)合位點(diǎn)的螺旋形蓋。
如上所述，至今為止只有來(lái)源于Humicola lanuginosa的脂酶由于其可作為商品名為L(zhǎng)ipolase(TM)的洗滌劑產(chǎn)品的添加劑而具有廣泛的商業(yè)應(yīng)用性。在CHemistry and Industry 1990，第183-186上登載的Henrik Malmos的文章中，指出已知在洗滌過(guò)程中脂酶活性通常是低的，并且Lipolase(TM)也不例外。在干燥過(guò)程中，當(dāng)纖維織物中水含量降低時(shí)，酶恢復(fù)其活性并且水解脂肪污染垢物，在隨后的洗滌周期期間，除去經(jīng)水解的物質(zhì)。這一觀點(diǎn)也解釋了為什么在第一個(gè)洗滌周期后脂酶作用較低，但在接著的周期有顯著作用。因此，仍然需要在洗滌過(guò)程中具有顯著活性的脂解酶。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)角質(zhì)酶，尤其是茄病鐮孢的角質(zhì)酶具有明顯的，洗滌用的效果。但是，仍然需要能在富含陰離子的洗滌劑的組合物中具有改善了的洗滌用的脂解活性的角質(zhì)酶變異體，以及需要制備此類酶的方法。
根據(jù)本發(fā)明，提供了其中的氨基酸序列已以一定方式進(jìn)行了改變的角質(zhì)酶變體，該方式是指提高其與陰離子表面活性劑的相容性。更具體地講，已發(fā)現(xiàn)通過(guò)降低陰離子表面活性劑與該酶的結(jié)合力可以提高富含陰離子的洗滌劑組合物中真核角質(zhì)酶，尤其是來(lái)源于茄病鐮孢，Colletotrichum capsici，盤長(zhǎng)孢狀毛盤孢以及Magnaporthe grisea的角質(zhì)酶的脂解活性。
一種親本角質(zhì)酶的角質(zhì)酶變異體，是指以一定的方式改變了其中的氨基酸序列，該方式指特別是通過(guò)降低陰離子表面活性劑與該酶結(jié)合而提高與陰離子表面活性劑的相容性。
本發(fā)明涉及角質(zhì)酶的變異體。如上所討論，角質(zhì)酶可從例如植物(如花粉)，細(xì)菌和真菌多種來(lái)源獲得。在本發(fā)明中，作為親本角質(zhì)酶或起始材料，采用重組DNA進(jìn)行修飾的角質(zhì)酶選自于真核角質(zhì)酶。真核角質(zhì)酶可以從例如植物(如花粉)，或真菌的各種來(lái)源獲得。
(真核)真菌角質(zhì)組可能含有具有不同特異性，即葉特異性和莖特異性的兩個(gè)家族。具有葉特異性的角質(zhì)酶傾于具有酸性或中性最適PH值，而具有莖特異性的角質(zhì)酶傾于具有堿性最適PH值。具有堿性最適PH值的角質(zhì)酶更適用于堿組成的洗滌劑組合物如重垢的織物洗滌粉和洗滌液。具有酸性至中性最適PH的角質(zhì)酶更適用于輕垢的產(chǎn)品或漂洗調(diào)理劑，但也適用于工業(yè)洗滌產(chǎn)品。
在下列表Ⅰ中，列出了四種的莖-特異性角質(zhì)酶，以及它們的最適PH。
表1具有莖特異性的角質(zhì)酶的例子 最適PH茄病鐮孢 9玫瑰包鐮孢 10茄屬絲核菌 8.5甘藍(lán)鏈格孢(PNB ase I) 9本發(fā)明中特別優(yōu)選的角質(zhì)酶來(lái)源于野生型茄病鐮孢(Ettinger et al.1987)。當(dāng)用于特定洗滌劑組合物時(shí)，該角質(zhì)酶具有明顯的“洗滌用”的效果。
與來(lái)自于茄病鐮孢的角質(zhì)酶具有高度氨基酸序列同源性的角質(zhì)酶也適合作為本發(fā)明中采用重組DNA技術(shù)進(jìn)行修飾的親本角質(zhì)酶或起始材料。這樣的例子有來(lái)自Colletotrichum capsici，盤長(zhǎng)孢狀盤孢以及Magnaporthe grisea的角質(zhì)酶。在

圖11中列出了這些角質(zhì)酶的部分氨基酸序列，并從中可看出有高度同源性。
可供選擇來(lái)用于通過(guò)改變其基因而改進(jìn)茄病鐮孢角質(zhì)酶的方案是，使用源于茄病鐮孢，Colletotrichum capsici，盤長(zhǎng)孢狀毛盤孢以及Magnaporthe grisea的編碼(原)角質(zhì)酶的cDNA的5′和3′-DNA探針以及能識(shí)別其他角質(zhì)酶中的保守序列的探針來(lái)分離編碼其他真核有機(jī)體角質(zhì)酶的遺傳信息，并且如果必要，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)或PCR技術(shù)，使用這此探針以擴(kuò)增源于產(chǎn)生角質(zhì)酶的真核細(xì)胞的信使RNA(mRNA)的cDNA(參見(jiàn)，例如WO-A-92/05249)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，將得到的角質(zhì)酶編碼基因克隆于大腸桿菌并在其中表達(dá)以后，在合適條件下檢測(cè)角質(zhì)酶在去除(脂肪)污物方面的效果。在該方法中可以獲得大量的具有改善的洗滌效果的上面所述角質(zhì)酶天然存在的變異體。而且，這些天然存在的角質(zhì)酶序列為茄病鐮孢角質(zhì)酶進(jìn)一步的蛋白質(zhì)工程提供了極好的依據(jù)。
基于關(guān)于決定脂解酶的“洗滌用”活性的因子以及仔細(xì)檢查茄病鐮孢角質(zhì)酶的3D結(jié)構(gòu)(Martinez et al.(1992)Naturc 356，615-618)的新觀點(diǎn)并且檢查了茄病鐮孢角質(zhì)酶的3D結(jié)構(gòu)，我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)重組DNA技術(shù)有多種可能性可以提高該角質(zhì)酶以及一般所說(shuō)角質(zhì)酶與陽(yáng)離子表面活性劑的相容性。
從已知的茄病鐮孢角質(zhì)酶的3D結(jié)構(gòu)開(kāi)始，應(yīng)用在SYBYL分子成型軟件包裝的COMPOSER組件(TRIPOS associates，Inc.St.Louis，Missouri)中提供的基于規(guī)則的可相比的成型技術(shù)獲得盤長(zhǎng)孢角質(zhì)酶的3D結(jié)構(gòu)。應(yīng)用BIOSYM分子面型軟件包裝(BIOSYM，SanDiego，California)中提供的能量最小化方法(EM)以及分子動(dòng)態(tài)學(xué)(MD)技術(shù)精制所獲得的盤長(zhǎng)孢狀毛盤孢角質(zhì)酶模型。在該模型的EM和MD精制過(guò)程中，使用基于公知技術(shù)的方法，基于潛在的能量作用以及已知的結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)可使模型的能量分派達(dá)到最佳化。按照如二級(jí)結(jié)構(gòu)成分中氫鍵的數(shù)目和特性，氫鍵合類型，肽單位的定向主鏈二面角的值，芳香族基因的干擾角以及腔的大小的標(biāo)準(zhǔn)估測(cè)模型性質(zhì)。而且，檢測(cè)模型中非適當(dāng)掩蔽的電荷，極度顯露的疏水基以及處于能量不穩(wěn)定的位置的二硫鍵。從Ponder & Richards旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體文庫(kù)(Ponder et al.(1987)J.Mol.Biol.193，775-791)選擇相關(guān)的側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體。根據(jù)上面介紹的結(jié)構(gòu)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，從該文庫(kù)中最后選擇出特定的側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體。用MD法將側(cè)鏈原子退火至其位置上。應(yīng)用同樣的方法可獲得Magnaporthe grisea角質(zhì)酶的3D-結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明顯示以一定方式可以改進(jìn)角質(zhì)酶，該方式是降低與陰離子表面活性劑的相互作用而不改變改進(jìn)后的角質(zhì)酶的洗滌用效果?？捎枚喾N方法達(dá)到上述結(jié)果。首先，通過(guò)降低陰離子表面活性劑和酶之間的靜電荷作用而減少陰離子表面活性劑與該酶的結(jié)合。例如，通過(guò)用賴氨酸殘基替代一個(gè)或多個(gè)帶正電荷的精氨酸殘基，這此殘基的定位接近于能與陰離子表面活性劑的非極性尾相結(jié)合的疏水拼接物。通過(guò)在離精氨酸約6
的距離內(nèi)導(dǎo)入一個(gè)負(fù)電荷，例如一個(gè)谷氨酸殘基而應(yīng)蓋著該精氨酸殘基的正電荷從而也可以降低陰離子表面活性劑與該酶之間的靜電荷作用?？蛇x擇另一種方法，通過(guò)用未帶電荷的氨基酸殘基替代一個(gè)或多個(gè)正電荷精氨酸殘基可以降低陰離子表面活性劑與該酶之間的靜電荷作用，其中的精氨酸殘基的定位接近于能與陰離子表面活性劑的非極性尾相結(jié)合的疏水性拼接物。再者，通過(guò)用負(fù)電荷氨基酸殘基替代一個(gè)或多個(gè)正電荷精氨酸殘基可以降低陰離子表面活性劑與酶之間的靜電荷作用，其中所說(shuō)的精氨酸殘基的定位接近于能與陰離子表面活性劑的非極性尾相結(jié)合的疏水性拼接物。
降低陰離子表面活性劑與酶之間的結(jié)合力的另一種途經(jīng)是用疏水性較小的氨基酸殘基替代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，這些殘基定位于能與陰離子表面活性劑的非極性尾相結(jié)合的疏水拼接物。這些較小的疏水性氨基酸殘基優(yōu)選選自于下列組甘氨酸，絲氨酸，丙氨酸，天冬氨酸以及蘇氨酸。
由于這些酶提高了與陰離子的相容性，當(dāng)用作為富含陰離子洗滌劑或清潔組合物的成分時(shí)，本發(fā)明制備的角質(zhì)酶變異體在酶活性方面有優(yōu)勢(shì)。在本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容中，富含陰離子是指該洗滌劑或清潔組合物含有表面活性劑系統(tǒng)，組成該系統(tǒng)的陰離子表面活性劑含量高于5%，通常高于10%，特別是高于20%。
已發(fā)現(xiàn)在洗滌過(guò)程的主要周期中本發(fā)明的角質(zhì)酶變異體具有提高了的洗滌用性能。在洗滌過(guò)程的主要周期中具有洗滌用性能是指在用歐洲型的自動(dòng)化洗衣機(jī)進(jìn)行的單一洗滌過(guò)程中，使用就濃度，溫度而言的正常洗滌條件，含有該酶的洗滌劑組合物能從臟污的織物上除去顯著量的油污漬。應(yīng)牢記在同樣條件下，常規(guī)使用的從商業(yè)途經(jīng)購(gòu)買的脂解酶Lipolase(TM)ex Novo Nordisk完全不具有顯著的對(duì)油性污漬的洗滌用效果。
使用下面的分析方法可以估評(píng)一種酶對(duì)油性污漬的洗滌用效果。利用不含酶的洗滌劑產(chǎn)品如下文中給出的產(chǎn)品將含有低于10%棉花的新的多酯試驗(yàn)物預(yù)洗滌并且隨后徹底漂洗干凈。然后用橄欖油或其他適于水解的油污物弄臟上述的沒(méi)有臟污的布。在一個(gè)100ml聚乙烯瓶中將各塊待測(cè)布(重約1克)于30ml洗滌液中保溫。該洗滌液含有1克劑量/l的下文中給出的洗滌劑產(chǎn)品。在裝了水的Miele TMT洗衣機(jī)中，使用正常的30℃主要洗滌程序?qū)⑵空袷?0分鐘。將3LU/ml濃度的角質(zhì)酶變異體預(yù)加到洗滌液中。對(duì)照不含有任何酶。
該洗衣粉具有下列組成(按重量%)LAS 6.9皂 2.0非離子型表面活性劑 10.0沸石 27.0碳酸鈉 10.2硫酸鈉 13.0在洗滌之后，用冷水徹底漂洗布片并在干燥機(jī)中用冷空氣干燥，估測(cè)殘留脂肪的量。這一過(guò)程可用幾種方法完成。常用的方法是在Soxhlet萃取中僅用石油醚萃取所檢測(cè)的布，蒸餾掉溶劑并且通過(guò)稱重而將布片上殘留的脂肪物質(zhì)作為布片上起始脂肪量的分?jǐn)?shù)，計(jì)算出殘留脂肪物質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。
根據(jù)第二種更靈敏的方法，用溴化的橄欖油弄臟所檢測(cè)的布(Richards，S.，Morris，M.A.and Arklay，T.H.(1968)，Textile Research Journal 38，105-107)。然后在100ml的聚乙烯瓶中將每塊待測(cè)布片在30ml洗滌液中保溫。然后在裝滿水的洗衣機(jī)中，使用正常的30℃主洗滌程序和振蕩這一系列瓶子。在它程序洗滌后，將待測(cè)的布片在冷水中小心地漂洗5秒鐘。漂洗后立即將待測(cè)的布在干燥器中用冷空氣干燥。在干燥之后，借助于X-射線熒光分光光度計(jì)通過(guò)檢測(cè)布片的溴含量而決定殘留的脂肪量。測(cè)出移走的脂肪占待測(cè)布片存在的起始量脂肪的百分?jǐn)?shù)，按如下所示除去的臟污物%＝ (溴bw-溴aw)/(溴bw) ×100%其中溴bw表示在洗滌前布片上溴的百分?jǐn)?shù)，溴aw是在洗滌之后布片上溴的百分?jǐn)?shù)。
估測(cè)酶活性的再一種方法是根據(jù)經(jīng)典技術(shù)檢測(cè)460nm處的反射系數(shù)。
在本發(fā)明的內(nèi)容中，一種改進(jìn)的，變異的或被突變的酶或一種酶的變異體是指由表達(dá)一種變異基因的變異有機(jī)體產(chǎn)生的酶。一種突變基因(除僅含有靜止突變的酶以外)是指編碼一種酶的基因，該酶具有直接或間接地從其相應(yīng)的親本酶的序列衍生的一個(gè)氨基酸序列，并且酶的序列中有一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)與親本酶的序列不相同。親本酶是指相應(yīng)的未改變的基因的基因產(chǎn)物?；虻撵o止突變是指在該基因的多核苷酸序列中產(chǎn)生和變化或不同(歸因于多余的密碼子-氨基酸關(guān)系)并未導(dǎo)致該基因編碼的酶的氨基酸序列的變化。
一種變異的或突變的微生物是指一種微生物，它是一種被用于突變其編碼該酶的基因的親本微生物或是從該親本微生物遺傳下來(lái)的一種微生物。(a)通過(guò)使已存在于親本微生物的相應(yīng)基因(親本基因)發(fā)生突變，或(b)通過(guò)轉(zhuǎn)移(導(dǎo)入)直接或間接從另一種來(lái)源獲得的相應(yīng)基因，然后將其導(dǎo)入(包括突變的基因)至將成為變異微生物的微生物中而完成該微生物的上述突變過(guò)程。一種宿主微生物是指由突變基因，或其他來(lái)源的一個(gè)轉(zhuǎn)移基因構(gòu)成其一個(gè)成分的微生物。通常它是與親本微生物相同或不同的菌株或具有相同或不同的種源或遺傳特性。
具體講，本發(fā)明提供了在WO-A-90/09446(Plant Genetics Systems)中公開(kāi)的茄鐮孢的角質(zhì)酶的突變體，以及來(lái)源于Colletotrichum capsici，盤長(zhǎng)孢狀毛孢以及Magnaporthe grisea的角質(zhì)酶的突變型。采用重組DNA改進(jìn)的微生物可以制備這些角質(zhì)酶變異體，該微生物含有通過(guò)重組DNA技術(shù)獲得或制備的一個(gè)基因。
已經(jīng)鑒別了由另外一個(gè)氨基酸殘基替代幾個(gè)氨基酸殘基，例如相對(duì)于茄病鐮孢角質(zhì)酶的序列或其同源序列的突變R17E。
本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員將明白，這種改進(jìn)會(huì)影響角質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)。顯然，優(yōu)選的修飾是不會(huì)對(duì)活性位點(diǎn)周圍的靜電荷有太多影響。本發(fā)明人已經(jīng)研究出了在酶構(gòu)象的不可避免的變形與提高活性而得到的利益之間必需要達(dá)到何種水平的平衡關(guān)系，知道這種平衡何使我們具有高度的成功率，推測(cè)并制備成功的角質(zhì)酶異體。在下面的表Ⅱ或說(shuō)明書其他段落中，采用如下所示的一字母和三字母縮寫表示肽序列中的氨基酸和氨基酸殘基
表ⅡA=Ala=丙氨酸 V=Val=纈氨酸L=Leu=亮氨酸 I=Ile=異亮氨酸P=Pro=脯氨酸 F=Phe=苯丙氨酸W=Trp=色氨酸 M-Met=蛋氨酸G=Gly=甘氨酸 S=Ser=絲氨酸T=Thr=蘇氨酸 C=Cys=半胱氨酸Y=Tyr=酪氨酸 N-Asn=天冬酰胺Q=Gln=谷氨酰胺 D=Asp=天冬氨酸E=Glu=谷氨酸 K=Lys=賴氨酸R=Arg=精氨酸 H=His=組氨酸在本說(shuō)明書中，采用下列簡(jiǎn)述方法中的突變位置及特性描述了存在于蛋白質(zhì)氨基酸序列中的突變以及由該突變引起的蛋白質(zhì)本身突變通過(guò)識(shí)別受突變影響的原始氨基酸殘基;該突變的位點(diǎn)(以序列編號(hào)表示);以及通過(guò)識(shí)別被用來(lái)替代原始?xì)埢陌被釟埢?。如果有一個(gè)額外的氨基酸插入到該序列中，用連接到調(diào)節(jié)序列或參照序列的最后位在前的成員的編號(hào)上的一個(gè)或多個(gè)寫在下角的字母表示。
例如，以在17位由谷氨酰胺替代精氨酸的特征的突變按如下命名Arg 17 Glu或R17E。假設(shè)在精氨酸后面插入一個(gè)其他的氨基酸殘基如脯氨酸，可以表示為Arg 17 Arg Pro或R17RP，或者表示為＊17aP，其中將插入的殘基的位置編號(hào)命名為17a。假設(shè)在同一位點(diǎn)上缺失精氨酸，可以表示為Arg17＊或R17＊。星號(hào)表示在所命名的位置上缺失或錯(cuò)過(guò)一個(gè)氨基酸殘基，對(duì)于“錯(cuò)過(guò)”可認(rèn)為是真正缺失或僅與在該位點(diǎn)有一個(gè)殘基的另一個(gè)序列或參照序列相比有差異或同源。
用加號(hào)將多個(gè)突變分隔開(kāi)，例如，R17E+S54I+A128F表示一個(gè)攜帶了替代突變的蛋白質(zhì)，如其中指出的，氨基酸序列中三個(gè)所提及的每一個(gè)點(diǎn)發(fā)生了突變。如果必要，合并下面給出的突變。
下面顯示的表Ⅲ表示本發(fā)明的角質(zhì)酶變異體的具體實(shí)例，這些變異體基于茄病鐮孢和Magnaporthe grisea的角質(zhì)酶的序列得到的。
表Ⅲ茄病鐮孢角質(zhì)酶變異體R17L,R17K,R17E,L51A,L51S,R78L,T80D,R88E,R96N,R96Q,R156L,A195S,R196A,R196K,R196E。
Magnaporthe grisea角質(zhì)酶變異體A80D,A88E,R156L。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種制備本發(fā)明角質(zhì)變異體的方法。通常植物病原菌是天然存在的產(chǎn)生角質(zhì)酶的微生物，并且這些微生物非常不適于用作為改進(jìn)酶基因的宿主細(xì)胞。因此，將改進(jìn)(原)角質(zhì)酶的編碼基因整合到重組DNA載體中，利用重組DNA技術(shù)可將該載體轉(zhuǎn)移到優(yōu)選的宿主微生物中。為了上述目的可以使用基本上相同于WO-A-90/09446中描述的重組DNA載體。
由微生物產(chǎn)生的天然形式的角質(zhì)酶并不十分適合于發(fā)酵方法。為了提高發(fā)酵過(guò)程的產(chǎn)量。應(yīng)將編碼改進(jìn)角質(zhì)酶的基因轉(zhuǎn)移至能在便宜培養(yǎng)上快速生長(zhǎng)的微生物中，并且該微生物能合成和分泌大量的角質(zhì)酶。本發(fā)明所述的經(jīng)改進(jìn)的合適重組DNA(宿主微生物)是在不同的芽孢桿菌，棒狀桿菌，葡萄球菌以及鏈霉菌中的細(xì)菌，或低等真核生物如啤酒酵母以及其相關(guān)的種，馬克斯克魯維氏酵母及其相關(guān)種，多形以遜氏酵母及其相關(guān)種，以及曲霉屬內(nèi)的種。優(yōu)選宿主微生物是低等真核生物，因?yàn)檫@些微生物在發(fā)酵過(guò)程中可以很好地產(chǎn)生和分泌酶，并能夠糖酵解角質(zhì)酶分子。糖酵解作用可使角質(zhì)酶穩(wěn)定地存在于洗滌劑系統(tǒng)中。
本發(fā)明還提供了通過(guò)將改進(jìn)的真核角質(zhì)酶基因(例如，源于茄病鐮孢的基因)導(dǎo)入到克隆重組DNA載體中而產(chǎn)生的遺傳物質(zhì)，以及使用該遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化新的宿主細(xì)胞，并用于在新的宿主細(xì)胞中表達(dá)角質(zhì)酶變異體基因。
本發(fā)明還提供了由重組DNA技術(shù)制備或改進(jìn)的能編碼所述角質(zhì)酶變異體的多聚核苷酸，提供了含有該多核苷酸的重組DNA載體，以及含有多核苷酸和/或該重組DNA載體的重組DNA修飾的微生物。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的編碼改進(jìn)的真核角質(zhì)酶的多核苷酸，例如，具有編碼成熟角質(zhì)酶變異體的堿基序列的多核苷酸，其中多核苷酸的最后一個(gè)轉(zhuǎn)譯密碼子后跟隨一個(gè)終止密碼子，并且選擇性地在編碼成熟角質(zhì)酶變異體的核苷酸序列的相連的上游具有編碼該角質(zhì)酶變異體的前原或原序列的核苷酸序列。
在上述多核苷酸中，可以一定方式改進(jìn)源于該有機(jī)源的編碼角質(zhì)酶的核苷酸序列，該方式是指制備至少一個(gè)，最好是盡可能多的遭受“靜止”突變的編碼子，以形成編碼等價(jià)氨基酸殘基的密碼子，并且這些形成的密碼子是新宿主優(yōu)選選用的密碼子，從而在所述宿主細(xì)胞內(nèi)提供了具有改進(jìn)穩(wěn)定性的所導(dǎo)入基因的一種信使RNA。
在為原-或成熟角質(zhì)酶編碼的核苷酸序列的上游，可以定位一個(gè)核苷酸序列，該序列為適合于所選擇的宿主的信號(hào)或分泌序列編碼。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例是指一種重組DNA載體，在該載體中插入了一個(gè)為角質(zhì)酶變異體或其一種前體編碼的核苷酸序列。
例如從下列來(lái)源得到的核苷酸序列(a)天然形式的核苷酸序列(例如，編碼由茄病鐮孢產(chǎn)生的前原或原角質(zhì)酶的原始氨基酸序列);
(b)由新宿主優(yōu)選的密碼子組成的化學(xué)合成的核苷酸序列，并且在新的宿主中該核苷酸序列產(chǎn)生穩(wěn)定的信使RNA，該核苷酸序列仍編碼原始的氨基酸序列;
(c)采用遺傳工程手段從上面(a)或(b)中介紹的核苷酸序列之一衍生到的核苷酸序列，該序列編碼有不同氨基酸序列但其在洗滌劑系統(tǒng)中有更優(yōu)選的穩(wěn)定性和/或活性的茄病鐮孢角質(zhì)酶。
概括地講，能指導(dǎo)為上文中描述的角質(zhì)酶基因編碼的核苷酸序列在優(yōu)選的一種宿主中表達(dá)的重組DNA載體優(yōu)選包括下列成分(a)為成熟角質(zhì)酶或前角質(zhì)酶或一種相應(yīng)的前角質(zhì)酶編碼的雙鏈(ds)DNA，其中在已直接從分泌信號(hào)(為選定的宿主細(xì)胞優(yōu)選)的下游移走了至少部分前序列。假如應(yīng)該被轉(zhuǎn)譯的部分基因沒(méi)有以ATG密碼子作為起始密碼子，則應(yīng)在前面放置一個(gè)ATG密碼子。轉(zhuǎn)譯的基因部分應(yīng)總是以合適的終止密碼子終止;
(b)一種定位于編碼角質(zhì)酶的ds DNA的正鏈(成分(a))的上游的表達(dá)調(diào)節(jié)子(適合于選定的宿主微生物);
(c)一種定位于編碼角質(zhì)酶的ds DNA的正鏈(成分(a))的下游的終止子序列(適合于選定的宿主有機(jī)體);
(d1)促進(jìn)ds RNA整合到選定的宿主的基因組中的核苷酸序列或，(d2)適合于所選定宿主的復(fù)制源;
(e1)非強(qiáng)制性地含有一個(gè)(營(yíng)養(yǎng)缺陷型)選擇標(biāo)記。該自養(yǎng)型標(biāo)記由營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記的編碼區(qū)以及一個(gè)缺陷型啟動(dòng)子組成;
(e2)非強(qiáng)制性地含有為與宿主細(xì)胞中的角質(zhì)酶的一種前體形式的成熟和/或分泌有關(guān)的蛋白質(zhì)編碼的ds DNA序列。
上述的重組DNA載體還可以在以前定義的多核苷酸的上游和/或下游攜帶促進(jìn)角質(zhì)酶功能性質(zhì)表達(dá)的其他序列。該營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記可以由該營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記的編碼區(qū)以及一人缺陷型啟動(dòng)子區(qū)組成。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是發(fā)酵生產(chǎn)上面所述的各種角質(zhì)酶變異體之一。這種發(fā)酵可以是一般的間歇發(fā)酵，分批補(bǔ)料發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵。選擇使用那種方法根據(jù)宿主菌株以及優(yōu)選的以及優(yōu)選的后處理方法(本領(lǐng)域已知)決定。因此，本發(fā)明還提供了生產(chǎn)如本文定義的角質(zhì)酶變異體的方法，其中包括發(fā)酵培養(yǎng)一種重組DNA修飾的微生物的步驟，該微生物含有采用重組DNA技術(shù)制備的至少攜帶一個(gè)突變的基因，這種突變影響了所述角質(zhì)酶的氨基酸序列;從而使之與相應(yīng)的親本酶相比具有改進(jìn)的角質(zhì)酶活性，通過(guò)從發(fā)酵液中分離出由微生物產(chǎn)生的角質(zhì)酶，或通過(guò)從發(fā)酵液中分離出微生物細(xì)胞并破碎分離到的細(xì)胞而分離出該酶，再采用物理或化學(xué)濃縮或純化方法將從所說(shuō)發(fā)酵液或從所說(shuō)細(xì)胞得到的角質(zhì)酶變異體濃縮或部分純化，從而得到了角質(zhì)酶變異體制劑。優(yōu)選選擇的條件是能使微生物將角質(zhì)酶變異體分泌到發(fā)酵液中，并采用過(guò)濾或離心法移走后可從發(fā)酵液中回收該酶?；蛘哌€采用，后將角質(zhì)酶變異體濃縮并純化到所需的程度?；谝阎陌l(fā)酵技術(shù)以及普通使用的發(fā)酵和后處理設(shè)備得到其本身并不考慮微生物特性的發(fā)酵方法。
本發(fā)明還提供了采用重組DNA技術(shù)制備一種能產(chǎn)生角質(zhì)酶變異體的改進(jìn)微生物的方法，其特征在于將導(dǎo)入到微生物中并為角質(zhì)酶變異體編碼的基因的5′-末端與為一種(改進(jìn)的)前功能序列編碼的基因片段相融合，其中的功能前序列作為宿主微生物的信號(hào)或分泌序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種含有一個(gè)角質(zhì)酶變異體基因的重組DNA修飾的微生物并且它能產(chǎn)生由所說(shuō)基因編碼的角質(zhì)酶變異體。在一種重組DNA修飾的微生物中，優(yōu)選除去編碼天然角質(zhì)酶的基因(如果原始存在)，例如由另一種結(jié)構(gòu)基因替代。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了含有本發(fā)明角質(zhì)酶變異體的酶促洗滌劑組合物。該組合物是由角質(zhì)酶變異體與通常用于洗滌劑系統(tǒng)中的其他成分結(jié)合得到，這些其它成分包括在如本領(lǐng)域內(nèi)已知的和在EP-A-258 068中例舉的那些洗滌劑組合物和全料配制的洗滌劑和清潔組合物類型中使用的添加劑。
該洗滌組合物中的其他成分可以是許多已知種類中的任何一種，例如在GB-A-1 372034(Unilever)，US-A-3 950 277，US-A-4 011 169，EP-A-179533(Procter & Gamble)，EP-A-205 208以及EP-A-206 390(Unilever)，JP-A-63-078000(1988)，以及Research Disclosure 29056 of June 1988，以及本文提到的幾種說(shuō)明書的公開(kāi)的組合物，上述文獻(xiàn)引入本文作為參考。
本發(fā)明的角質(zhì)變異體適用于加入到任何合適形式的洗滌劑組合物中，即粒狀組合物形式，該酶的溶液或漿液或添加了載體物質(zhì)。
(例如，EP-A-258 068中公開(kāi)的以及Novo Nordisk的Savinase(TM)以及Lipolase(TM)產(chǎn)品)。
所加入的角質(zhì)酶變異體的量可以在很寬范圍內(nèi)選擇，例如在每克洗滌劑組合物為10-20，000LU，并且優(yōu)選的是在50-2，000LU的范圍內(nèi)。在本說(shuō)明書中，LU或脂酶單位的定義是相同于在EP-A-258 068(Novo Nordisk)中的定義。
同樣可以考慮應(yīng)用(細(xì)節(jié)略作改變)其他酶，如蛋白酶，淀粉酶，也可以存在纖維素酶。通過(guò)容具有PI值低于10的蛋白酶中選出一種，與該角質(zhì)酶變體一起加入該洗滌組合物中時(shí)有優(yōu)點(diǎn)。EP-A-271 154(Unilever)描述了許多種這樣的蛋白酶。與角質(zhì)酶變異體一起使用的蛋白酶包括如BPN型的枯草桿菌蛋白酶或在文獻(xiàn)中公開(kāi)的此類型的多種枯草菌蛋白酶中任何一種，例如在EP-A-130 756或EP-A-251 446(兩個(gè)均屬Genentech);US-A-4 760 025(Genencor);EP-A-214 435(Henkel);WO-A-87/04661(Amgen);WO-A-87/05050(Genex);Thomas et al.J.Mol.Biol.(1987)193，803-813;Russel et al.Nature(1987)328，496-500中描述的突變體蛋白酶。
在下面的實(shí)施例中將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。除非另有說(shuō)明，在核酸物質(zhì)的操作及分析中使用的所有技術(shù)基本上按照Sambrook et al.(1989)的描述進(jìn)行。
附圖描述如下圖1A.合成的茄病鐮孢角質(zhì)酶基因的盒1和含有的寡核苷酸的核苷酸序列。在盒序列中標(biāo)出了寡核苷酸變化。小寫字母是指開(kāi)放式閱讀框架外的核苷酸位置。
圖1B.合成的茄病鐮孢角質(zhì)酶基因的盒2和含有的寡核酸的核苷酸序列。在盒序列中標(biāo)出了寡核酸的變化。
圖1C.合成的茄病鐮孢角質(zhì)酶基因的盒3和其含有的寡核酸的核苷酸序列。在盒序列中標(biāo)出了寡核酸的變化。小與字母是指該開(kāi)放式閱讀框架以外的核苷酸位。
圖1D.編碼茄病鐮孢前原角質(zhì)酶的合成角質(zhì)酶基因的核苷酸序列。標(biāo)出了角質(zhì)酶前序列，原序列以及成熟序列。也標(biāo)出了用于克隆的位點(diǎn)以及寡核苷酸的變化。小寫字母是指開(kāi)放式閱讀框架外的核苷酸位點(diǎn)。
圖2.用于將茄病鐮孢原角質(zhì)酶的編碼序列連接到大腸桿菌PhoA前序列的衍生物的編碼序列上的合成DNA片段的核苷酸序列。標(biāo)出了核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)以及用于克隆的限制性酶位點(diǎn)。還用一個(gè)字母密碼子標(biāo)出了所編碼的Pho信號(hào)序列以及部分角質(zhì)酶基因的氨基酸序列。
圖3.盒8，一個(gè)SacⅠ-BclⅠ片段的核苷酸序列，該序列編碼轉(zhuǎn)化酶前序列和成熟茄病鐮孢角質(zhì)酶兩者的編碼序列之間的融合位點(diǎn)。
圖4.通過(guò)從pUR 2740中缺失0.2Kb SalⅠ-NruⅠ而獲得的pUR 2741質(zhì)粒，它是一種大腸桿菌-啤酒酵母穿梭載體，它包含有部分PBR 322，源于2μm質(zhì)粒的在酵母細(xì)胞中起作用的復(fù)制源點(diǎn)，一種酵母Leu2D基因，以及酵母轉(zhuǎn)化酶信號(hào)序列編碼區(qū)與受酵母gal 7啟動(dòng)子控制的一種植物α-半乳糖苷酶基因的融合體。
圖5，質(zhì)粒pUR 7219是一種大腸桿菌-啤酒酵母穿梭載體，它含有部分pBR 322，源于2μm質(zhì)粒的在酵母細(xì)胞中起作用的復(fù)制源點(diǎn)，一種酵母Leu 2D基因以及酵母轉(zhuǎn)化酶信號(hào)序列編碼區(qū)與受酵母gal 7啟動(dòng)子控制的成熟茄病鐮孢角質(zhì)酶的編碼區(qū)的融合體。
圖6.質(zhì)粒pUR 2740是大腸桿菌-啤酒酵母穿梭載體，它含有部分pBR 322，源于2μm質(zhì)粒的在酵母細(xì)胞中起作用的復(fù)制源點(diǎn)，一個(gè)酵母Leu 2D基因，以及酵母轉(zhuǎn)化酶信號(hào)序列編碼區(qū)與受酵母gal 7啟動(dòng)子控制的一個(gè)植物α-半乳糖苷酶基因的融合體。
圖7.盒5，6和7的核苷酸序列，包括exlA前序列和成熟茄病鐮孢角質(zhì)酶的編碼序列的不同類型的連接體。
圖8.將黑曲霉awamori變種基因組DNA的5.3Kb SalⅠ片段插入到pUC 19的Sal Ⅰ位點(diǎn)獲得的pAW 14B質(zhì)粒。
圖9.用含有茄病鐮孢前原角質(zhì)酶編碼序列的BspHⅠ-AflⅡ片段替代pAW 14B中包括exlA開(kāi)放式框架的BspHⅠ-AflⅡ片段而獲得的pUR 7280質(zhì)粒。因此pUR 7280質(zhì)粒含有受黑曲霉awamori變種啟動(dòng)子和終止子控制的茄病鐮孢前原角質(zhì)酶基因。
圖10.將構(gòu)巢曲霉amdS和黑曲霉awamori變種pyrG選擇標(biāo)記導(dǎo)入pUR 7280中獲得的pUR 7281質(zhì)粒。
圖11.來(lái)自于茄病鐮孢，Colletotrichum capsici，盤長(zhǎng)孢狀毛盤孢以及Magnaporthe grisea的角質(zhì)酶的部分氨基酸序列，表示在3D結(jié)構(gòu)中殘基的位置。
圖12.茄病鐮孢角質(zhì)酶和角質(zhì)酶變異體與基于LAS的洗滌劑組合物具相容性。
圖13.茄病鐮孢角質(zhì)酶和角質(zhì)酶變異體與基于PAS的洗滌劑組合物具相容性。
圖14.茄病鐮孢角質(zhì)酶和角質(zhì)酶變異體與一種強(qiáng)非離子洗滌劑組合物具相容性。
圖15.茄病鐮孢角質(zhì)酶和角質(zhì)酶變異體與SDS具相容性。
圖16.茄病鐮孢角質(zhì)酶和角質(zhì)酶變異體R17E的洗滌用效果。
參考文獻(xiàn)附于此
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實(shí)施例1構(gòu)建編碼茄病鐮孢前原角質(zhì)酶的合成基因。
基本上按照EP-A-407225(Unilever)描述的方法構(gòu)建編碼茄病鐮孢前原角質(zhì)酶的合成基因?；诠_(kāi)的茄病鐮孢基因的核苷酸序列(Soliday et al.(1984)和WO-A-90/09446，Plant Genetic Systems)，設(shè)計(jì)一種全部合成的DNA片段，使之含有編碼茄病鐮孢前原角質(zhì)酶多肽的一個(gè)區(qū)域。與原始的茄病鐮孢基因的核苷酸序列相比，該合成的角質(zhì)酶基因含有幾個(gè)核苷酸變化，通過(guò)這些變化在該基因的便利位置上導(dǎo)入限制性酶識(shí)別位點(diǎn)但并不影響所編碼的氨基酸序列。在圖1D中列出了整個(gè)合成角質(zhì)酶基因的核苷酸序列。
將從合成的DNA寡核苷酸開(kāi)始將三個(gè)分隔的盒裝配在一起而構(gòu)建成合成的角質(zhì)酶基因。在各個(gè)合成DNA盒的起始點(diǎn)上裝配一個(gè)EcoRⅠ位點(diǎn)，并在末端裝配一個(gè)HindⅢ位點(diǎn)。使用一個(gè)Applied Biosystem 380A，DNA合成儀合成寡核苷酸，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純化。為了構(gòu)建每一個(gè)盒，下面概括地描述操作步驟。將構(gòu)成一個(gè)給定盒的等摩爾量(50 pmol)的寡核酸混合，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，使其5′末端磷酸化，退火并連接。用EcoRⅠ和HindⅢ切割得到的雙鏈DNA分子的混合物，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳按分子大小分級(jí)分離，通過(guò)電洗脫從凝膠上回收分子。將得到的合成DNA盒與2.7Kb的pUC9的EcoRⅠ-HindⅢ片段相連接并將其轉(zhuǎn)移至大腸桿菌上。利用合適的寡核苷酸引物從兩個(gè)方向?qū)υS多克隆中的EcoRⅠ-HindⅢ插入片段全面測(cè)序，以驗(yàn)證合成盒的序列。使用該步驟，構(gòu)建pUR 7207(含有盒1，圖1A)，pUR7208(含有盒2，圖1B)，以及pUR7209(含有盒3，圖1C)。最后，通過(guò)將2.9Kb的pUR7207的EcoRⅠ-ApaⅠ片段與0.2Kb的pUR 7208ApaⅠ-NheⅠ片段以及pUR7209的0.3Kb的NheⅠ-HindⅢ片段結(jié)合在一起產(chǎn)生pUR 7210，從而裝配成合成角質(zhì)酶基因。該質(zhì)粒含有編碼整個(gè)茄病鐮孢的前原角質(zhì)酶的開(kāi)放式閱讀框架(圖1D)。
實(shí)施例2在大腸桿菌中表達(dá)茄病鐮孢(原)角質(zhì)酶。
構(gòu)建帶有合成角質(zhì)酶基因的用在大腸桿菌中表達(dá)載體，該載體功能相似于在WO-A-90/09446(Plant Genetic Systems)中描述的載體。設(shè)計(jì)一種構(gòu)建體，其中編碼茄病鐮孢原-角質(zhì)酶的合成基因部分由合適的大腸桿菌表達(dá)信號(hào)引導(dǎo)，這些信號(hào)是(ⅰ)一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，(ⅱ)一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及(ⅲ)一種提供一個(gè)轉(zhuǎn)譯起始密碼子并提供使原角質(zhì)酶穿過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜輸出所需的信息的信號(hào)序列。
設(shè)計(jì)一種用于將大腸桿菌phoA信號(hào)序列衍生物(Michaelis et al.，1983)融合到合成角質(zhì)酶基因的原序列上的合成接頭(見(jiàn)圖2)。為了最大程度地切割信號(hào)肽并分泌原-角質(zhì)酶，在該接頭的核苷酸序列中，將phoA信號(hào)序列的三個(gè)C-末端氨基酸殘基(Thr-Lys-Ala)改變?yōu)锳la-Asn-Ala以及角質(zhì)酶原序列的N-末端氨基酸殘基(Leu 1，參見(jiàn)圖1D)改變?yōu)锳la。該構(gòu)建形式可確保角質(zhì)酶分泌到胞外空間(參見(jiàn)WO-A-90/09446，Plant Genetic Systems)。
為了獲得這樣一種構(gòu)建體，從pUR 7210上移走含有角質(zhì)酶前序列和部分原序列的69bp的EcoRⅠ-SpeⅠ片段，并用合成的DNA接頭序列(EcoRⅠ-SpeⅠ片段)替代，該接頭序列提供了大腸桿菌phoA前序列以及經(jīng)改變的角質(zhì)酶原序列的N-末端氨基酸殘基的衍生物(圖2)。將得到的質(zhì)粒命名為pUR 7250，并用于分離0.7Kb BamHⅠ-HindⅢ片段，該片段含有一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及與phoA信號(hào)序列編碼區(qū)相融合的原角質(zhì)酶編碼區(qū)。將該片段與pMMB67EH(Furste et al.，1986)的8.9Kb BamHⅠ-HindⅢ片段連接，以產(chǎn)生pUR7220。在該質(zhì)粒中將編碼合成基因的原角質(zhì)酶融合到phoA信號(hào)序列的變化變體上并置于誘導(dǎo)型tac啟動(dòng)子控制下。
將攜帶pUR7220的大腸桿菌菌株WK6在含有0.5升IXTB培養(yǎng)基(Tartof and Hobbs，1988)的2升搖瓶中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基組成如下0.017M KH2PO40.017M K2HPO412克/升 細(xì)菌用胰蛋白胨24克/升 細(xì)菌用酵母抽提物0.4% 甘油(V/V)在100μg/ml氨芐霉素存在下，25℃-30℃，將培養(yǎng)物進(jìn)行劇烈振蕩(150rpm)培養(yǎng)過(guò)夜，生長(zhǎng)到在610nm處的OD值為10-12。加入IPTG(異丙基-β-D-吡喃半乳硫苷)到終濃度為10μm，并繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時(shí)。如果沒(méi)有觀察到所產(chǎn)生的脂解活性量進(jìn)一步顯著增加(通過(guò)分析從培養(yǎng)物回收的樣品判斷)，則通過(guò)離心而收集細(xì)胞并且重懸于原始培養(yǎng)物體積的含20%蔗糖的0℃緩沖液中。通過(guò)離心收集細(xì)胞，并重懸于原培養(yǎng)物體積的冰水中，以引起滲透休克而導(dǎo)致細(xì)胞溶解，通過(guò)離心除去細(xì)胞碎片，并用乙酸將該無(wú)細(xì)胞提取物酸化至PH 4.8，置于4℃過(guò)夜，并除去得到沉淀。通過(guò)超濾在該階段獲得純度高于75%的基本上無(wú)內(nèi)源脂酶的純化角質(zhì)酶制劑并冷凍干燥該無(wú)細(xì)胞提取物。換種方法，通過(guò)將酸化的無(wú)細(xì)胞提取物加樣到SP-Sephadex上，用PH8.0的緩沖液洗脫該酶，將該濃縮的堿溶液傳遞過(guò)適當(dāng)體積的DEAE-纖維素(Whatman DE-52)并直接將該流過(guò)DEAE的溶液加到Q-Sepharose HP(Pharmacia)柱上純化，從而將該角質(zhì)酶純化到勻質(zhì)(即純度高于95%)。用鹽梯度洗脫后產(chǎn)生均勻的角質(zhì)酶制劑，通常該制劑的總產(chǎn)量在75%以上。
實(shí)施例3編碼茄病鐮孢角質(zhì)酶變體的基因的構(gòu)建。
利用實(shí)施例1中描述的編碼茄病鐮孢前原角質(zhì)酶的合成基因，構(gòu)建在其編碼的氨基酸序列中有變化的變異體基因。為了完成該構(gòu)建過(guò)程，基本上按照實(shí)施例1中描述的相同方法，構(gòu)建組成整個(gè)合成基因的三個(gè)盒。例如，使用相同于實(shí)施例1描述的寡核苷酸(Oligos)裝配新的盒1變異體，不同之處在于將覆蓋該位點(diǎn)三聯(lián)體密碼的兩Oligos進(jìn)行突變。代替該方法，可用兩個(gè)新的Oligos，它們含有突變序列組同樣也與它們?nèi)〈脑糘ligos相同。
實(shí)施例3A利用摻入了CUTⅠ1C ⅠG的變異體(含有替代AGA的GAG)以及CUTⅠ1Ⅰ ⅠG的變異體(含有替代TCT的CTC)以替代CUTⅠ1C ⅠG以及CUTⅠ1 ⅠG(參見(jiàn)圖1A)的盒1變異體構(gòu)建為茄病鐮孢角質(zhì)酶變異體R17E編碼的基因。基本上按照實(shí)施例1中描述將新盒1克隆和測(cè)序，并用含有R17E突變的約120bp的EcoRⅠ/NruⅠ DNA片段與pUR 7210中相應(yīng)片段進(jìn)行交換，產(chǎn)生pUR7240(R17E)。用來(lái)自該質(zhì)粒的0.6KbSpeⅠ-HindⅢ片段代替PUR 7220中的相應(yīng)片段，以產(chǎn)生大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pUR 7222(R17E)。將該大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌WK6菌株中。按實(shí)施例2概括的方法培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體，并基本上按照實(shí)施例2的描述回收和純化該變異的原角質(zhì)酶。同樣用Lys或Leu替代Arg17。
實(shí)施例3B利用摻入了CUTⅠ 3F MH變異體(含代替CGG的GAG)，以及CUTⅠ 3M MH變異體(含代替CCG的CTC)以代替CUTⅠ 3F MH和CUTⅠ 3M MH(見(jiàn)圖3A)的盒3變異體構(gòu)建為茄病鐮孢角質(zhì)酶變異體R196E編碼的基因，基本上按實(shí)施例1中描述的方法將新盒3進(jìn)行克隆和測(cè)序并用R196E突變約120bp EcoRⅠ/Nru Ⅰ DNA片段與pUR 7210中相應(yīng)片段進(jìn)行變換產(chǎn)生pUR 7241(R196E)。用該質(zhì)粒的0.6Kb SpeⅠ-HindⅢ片段代替pUR 7220中的相應(yīng)片段，產(chǎn)生大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pUR 7225(R196E)。將該大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌WK6菌株上。按實(shí)施例2是概括的方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，并基本上按實(shí)施例2中描述的方法回收和純化變異的原角質(zhì)酶。基于相同方法，CCUTⅠ 3F MH變異體(含代替CGG的AAG)以及CUTⅠ 3M MH變異體(含代替CCG的CTT)代替CUTⅠ 3F MH和CUTⅠ 3M MH，從而由Lys(R196K)代替Arg 196。同樣，用CUTⅠ 3F MH變異體(含代替CGG的CTT)以及CUTⅠ 3F MH的變異體(含代替CCG的AAG)代替CUTⅠ 3F MH和CUTⅠ 3M MH，而由Leu(R196L)代替Arg196?；谕瑯臃椒ㄓ葾la代替Arg 196(R196A)。
實(shí)施例3C用摻入了CUTⅠ1F ⅠG的變異體(含有替代CTC的GCT)以及CUTⅠ1L ⅠG的變異體(含有替代GAG和AGC)以替代CUTⅠ1F ⅠG和CUTⅠ1L ⅠG(參見(jiàn)圖1A)的盒1變異體構(gòu)建為茄病鐮孢角質(zhì)酶變異體L51A編碼的基因。基本上按照實(shí)施例1中描述將新盒1進(jìn)行克隆和測(cè)序，并用含有L51A突變的約120bp的EcoRⅠ/NruⅠ DNA片段與pUR7210中相應(yīng)片段進(jìn)行交換，以產(chǎn)生pUR7242(L51A)。用該質(zhì)粒的0.6Kb SpeⅠ-HindⅢ片段代替pUR 7220中的相應(yīng)片段，產(chǎn)。生大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pUR 7245(L51A)。將該大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌WK6菌株。按實(shí)施例2概述的方法培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體，并基本上按實(shí)施例2的描述方法回收和純化該變異的原角質(zhì)酶。同樣用Ser替代Leu 51。
實(shí)施例3D利用實(shí)施例3A和3B中構(gòu)建的盒，構(gòu)建帶有兩個(gè)修飾的角質(zhì)酶變異體。在實(shí)施例3A中已經(jīng)描述了pUR 7240(R17E)的構(gòu)建過(guò)程。在實(shí)施例3B中已經(jīng)描述了含有R196E突變的EagⅠ/HindⅢDNA片段的構(gòu)建過(guò)程。用pUR 7241的ApaⅠ/HindⅢ DNA片段替代pUR 7240(R17E)的ApaⅠ/HindⅢ DNA片段，產(chǎn)生pUR 7243(R17E+R196E)。用該質(zhì)粒的0.6Kb SpeⅠ-HindⅢ片段替代pUR 7220中的相應(yīng)片段，產(chǎn)生大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pUR 7226(R17E+R196E)。用該大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌WK6菌株。按實(shí)施例2概述的方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，并基本上按實(shí)施例2描述的方法回收和純化變異原角質(zhì)酶。
實(shí)施例3E用實(shí)施例3A和3C中構(gòu)建的盒，構(gòu)建帶有兩個(gè)修飾的角質(zhì)酶變體。在實(shí)施例3A中已經(jīng)描述了pUR 7240(R17E)的構(gòu)建。在實(shí)施例3C中已經(jīng)描述了含有L51A突變的DNA片段的構(gòu)建。用pUR 7242的BclⅠ/ApaⅠ片段與pUR 7240的相應(yīng)片段進(jìn)行交換，以產(chǎn)生pUR 7244(R17E+L51A)。用該質(zhì)粒的0.6Kb SpeⅠ-HindⅢ片段替代pUR 7220中的相應(yīng)片段，產(chǎn)生大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pUR 7246(R17E+L51A)。用該大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌WK6菌株。按實(shí)施例2概述的方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，并基本上按實(shí)施例2描述的方法回收和純化變異原角質(zhì)酶。
實(shí)施例4在啤酒酵母中表達(dá)茄病鐮孢角質(zhì)酶為了在啤酒酵母中表達(dá)合成的茄病鐮孢角質(zhì)酶基因，構(gòu)建一個(gè)表達(dá)載體，其中把啤酒酵母轉(zhuǎn)化酶前序列(Taussig and Carlsson，1983)和誘導(dǎo)型gal 7強(qiáng)啟動(dòng)子(Nogi and Fukasawa，1983)置于編碼成熟角質(zhì)酶的合成基因前面。為了制備該融合體的合成角質(zhì)酶基因，合成一個(gè)銜接頭片段，其中將轉(zhuǎn)化酶前序列的編碼序列融合到編碼成熟角質(zhì)酶的N-末端的序列上?；旧习磳?shí)施例1中描述的方法(盒8，見(jiàn)圖3)，將該片段裝配作為pUC9中的EcoRⅠ-HindⅢ盒，產(chǎn)生pUR 7217。將pUR 7210和pUR 7217質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM 110(該菌株喪失了dam甲基化酶活性)，并將pUR 7217的2.8Kb BclⅠ-HindⅢ片段與pUR 7210的0.6Kb的BclⅠ-HindⅢ片段連接。產(chǎn)生pUR 7218，其中將為成熟角質(zhì)酶多肽的核苷酸序列與啤酒酵母轉(zhuǎn)化酶前序列的編碼區(qū)部分融合。
通過(guò)分離pUR 2740中的8.9Kb NruⅠ-SalⅠ片段，用Klenow多聚酶填充SalⅠ伸出末端，以及使片段重新形成環(huán)狀而從pUR 2740(Verba kel，1991，見(jiàn)圖6)衍生出表達(dá)載體pUR 2741(見(jiàn)圖4)。將pUR 2741的7.3Kb SacⅠ-HindⅢ片段與pUR 7218的0.7Kb SacⅠ-HindⅢ片段相連接，產(chǎn)生pUR 7219(參見(jiàn)圖5)。或者還可使用，將啤酒酵母pol.Ⅱ終止子置于角質(zhì)酶基因后面的HindⅢ位點(diǎn)，該終止子不是角質(zhì)酶基因有效表達(dá)所必需的。大腸桿菌-啤酒酵母穿梭質(zhì)粒pUR 7219含有在含有2μ質(zhì)粒的啤酒酵母菌株(Cir+菌株)起作用的復(fù)制源點(diǎn)，一種便于在啤酒酒酵母Leu 2-菌株中選擇高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化體的啤酒酵母Leu 2基因的啟動(dòng)子缺陷型變體，以及編碼茄病鐮孢角質(zhì)酶的成熟部分的合成基因，該基因已通過(guò)操作后連接到受誘導(dǎo)型啤酒酵母gal 7強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的啤酒酵母轉(zhuǎn)化酶前序列上。
根據(jù)電擊穿酵母細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方案，將相同于YT6-2-1L菌株(Erhart and Hollenberg，1981)的啤酒酵母SU 50菌株(a，Cir°，Leu 2，his4，can1)與2μ啤酒酵母質(zhì)粒與pUR 7219的等摩爾混合物共轉(zhuǎn)化。選擇亮氨酸原養(yǎng)型轉(zhuǎn)化體，從許多個(gè)轉(zhuǎn)化體中分離總DNA。所有轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)出含有2μ質(zhì)粒以及pUR 7219，舉例如下，當(dāng)以高拷貝數(shù)存在百，由于自發(fā)地產(chǎn)生2μ酵母質(zhì)粒，因而pUR 7219中含有的Leu 2基因的啟動(dòng)子缺陷型變異體僅能在功能上與Leu 2缺陷型菌株互補(bǔ)。通過(guò)在完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)40代以上，然后影印至選擇性的完全固體培養(yǎng)基上平板培養(yǎng)，產(chǎn)生啤酒酵母菌株SU51(a，Cir+，Leu2，his4，can1)，從而使一種轉(zhuǎn)化體中的pUR 7219質(zhì)粒穩(wěn)定。
在含有0.2升基本培養(yǎng)基的1升搖瓶中培養(yǎng)含有pUR 7219的啤酒酵母SU 51菌株，該培養(yǎng)基含有無(wú)氨基酸的酵母氮?jiǎng)? 6.7g/l組氨酸 20mg/l-葡萄糖 20g/l在劇烈振蕩(150rpm)，30℃的條件下，將培養(yǎng)物培養(yǎng)過(guò)夜生長(zhǎng)至610nm處OD值為2-4。通過(guò)離心收集細(xì)胞，并重懸于2升搖瓶中的1升YPGAL培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有
-酵母抽提物 10克/升-細(xì)菌用蛋白胨 20克/升-半乳糖 50克/升并繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時(shí)。在有規(guī)律的時(shí)間間隔點(diǎn)，從培養(yǎng)物中回收樣品，離心移走生物質(zhì)。利用橄欖油作底物，進(jìn)行滴定分析以分析上清液中的角質(zhì)酶活性。對(duì)于每一個(gè)樣品，將100至200μl之間的濾液加到5.0ml的脂酶底物(Sigma，含有作為脂酶底物的橄欖油)以及25.0ml的緩沖液(5mM Tris-HCl PH9.0，40mM NaCl，20mM CaCl2)的振蕩混合物中。上述滴定，分析是在30℃完成的，用Mettler DL25滴定儀用0.05M NaOH自動(dòng)滴定至PH9.0而測(cè)定脂肪酸的釋放。獲得一條滴定劑量相對(duì)時(shí)間的曲線。從該曲線的最大斜率計(jì)算出樣品中含有的脂酶活性的量。1個(gè)脂酶活性單位的定義是在上面限定的條件下在1分鐘內(nèi)使橄欖油釋入出1μmol脂肪酸所需的酶的量。上述測(cè)定方法是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的。
當(dāng)產(chǎn)生的角質(zhì)酶活性不再增加時(shí)，可通過(guò)離心移走細(xì)胞，并用乙酸將無(wú)細(xì)胞提取物酸化至PH4.8，按實(shí)施例1所述回收角質(zhì)酶。
實(shí)施例5在啤酒酵母中表達(dá)茄病鐮孢角質(zhì)酶變異體用pUR7241(R196E)的0.5Kb ApaⅠ-HindⅢ片段替代pUR7218的類似片段，產(chǎn)生pUR7229(R196E)，其中編碼突變的基因可操作地融合到啤酒酵母信號(hào)序列的編碼序列上。將pUR 2741的7.0Kb SacⅠ-HindⅢ片段與pUR 7229(R196E)的0.7Kb SacⅠ-HindⅢ片段相連接，產(chǎn)生pUR 7235(R196E)。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化啤酒酵母SU51菌株。按實(shí)施例4中描述培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化體，按實(shí)施例4和1描述從培養(yǎng)液中回收產(chǎn)生的變異酶。
實(shí)施例6在曲霉中表達(dá)茄病鐮孢角質(zhì)酶為了在黑曲霉awamori變種中表達(dá)合成的茄病鐮孢角質(zhì)酶基因，構(gòu)建一個(gè)表達(dá)載體，其中將編碼茄病鐮孢前原角質(zhì)酶的合成基因置于黑曲霉awamori變種的誘導(dǎo)型exl A強(qiáng)啟動(dòng)子(Maat et al.，1992 de Graaff et al.，1992)控制下。
從pAW 14B質(zhì)粒開(kāi)始構(gòu)建前原角質(zhì)酶表達(dá)質(zhì)粒(pUR 7280)，于1990年5月31日，由大腸桿菌JM 109菌株攜帶該質(zhì)粒，一起寄存于Centraalbureau voor Schimmelcultures，Baarn，The Netherlands，N°CBS 237.90，并且該質(zhì)粒含有一個(gè)約5.3Kb SalⅠ片段，在該片段上定位了0.7Kb內(nèi)切木聚糖酶Ⅱ(exl A)基因，以及2.5Kb的5′側(cè)端序列和2.0Kb的3′一側(cè)端序列(圖8)。在pAW 14B中由前原角質(zhì)酶編碼區(qū)替代了exl A編碼區(qū)。含有exl A基因的第一個(gè)密碼子(ATG)的Bsp HⅠ位點(diǎn)(5′-TCATGA-3′)以及含有exlA基因的終止密碼子(TAA)的AF 1Ⅱ位點(diǎn)(5′-CTTAAG-3′)有利于構(gòu)建pUR 7280。
按如下所述進(jìn)行構(gòu)建用Bsp HⅠ部分切割pAW 14B(7.9Kb)，并以瓊脂糖凝膠上分離線性化的質(zhì)粒(7.9Kb)隨后用BsmⅠ切割分離到的7.9Kb片段，該酶能切割處于所BspHⅠ位點(diǎn)下游的幾個(gè)核苷酸，從而移走另一BspHⅠ位點(diǎn)處的線性化質(zhì)粒。在瓊脂糖凝膠上分離這些片段，分離出7.9Kb BspHⅠ-BsmⅠ片段。用AflⅡ部分切割該片段，分離得到的7.2Kb的BspHⅠ-AflⅡ片段。
將含有編碼茄病鐮孢前角質(zhì)酶的整個(gè)開(kāi)放閱讀框架的pUR 7210的0.7Kb BspHⅠ-AflⅡ片段與pAW 14B的7.2Kb BspHⅠ-AflⅡ片段相連接，產(chǎn)生pUR 7280。隨后采常規(guī)的共轉(zhuǎn)化技術(shù)將構(gòu)建的載體(pUR 7280)轉(zhuǎn)移到霉菌(例如黑曲霉，黑曲霉awamori變種等)中，通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)切木聚糖酶Ⅱ啟動(dòng)子而使前原角質(zhì)酶基因表達(dá)。還可以提供帶常規(guī)選擇性標(biāo)記(例如amdS或pyrG，潮霉素等)的構(gòu)建型重組DNA載體。用得到的重組DNA載體轉(zhuǎn)化霉菌以產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)。作為一個(gè)例子，在表達(dá)載體中導(dǎo)入amd S和pyr G選擇標(biāo)記，以產(chǎn)生pUR 7281(圖10)。為了達(dá)到上述目的，通過(guò)用一個(gè)合成的寡核苷酸(5′-AATTGCGGCCGC-3′)將EcoRⅠ位點(diǎn)(存在于前原角質(zhì)酶基因ATG密碼子上游的1.2Kb)轉(zhuǎn)變?yōu)镹otⅠ位點(diǎn)，產(chǎn)生pUR 7282，而產(chǎn)生了一個(gè)NotⅠ位點(diǎn)。在含有整個(gè)構(gòu)巢曲霉amd S基因，黑曲霉awamori變種pyr G基因以及它們各自的啟動(dòng)子和終止子的合適DNA片段上裝配側(cè)端NotⅠ位點(diǎn)，并導(dǎo)入到pUR 7282的Not Ⅰ位點(diǎn)，產(chǎn)生pUR 7281(圖10)。
在黑曲霉awamori變種內(nèi)表達(dá)合成的茄病鐮孢角質(zhì)酶基因的另一種可選擇方法是，構(gòu)建一個(gè)表達(dá)載體，其中在編碼成熟角質(zhì)酶的合成基因前并不加上其自身的前原序列而是加是黑曲霉awamori變種exlA的前序列。
為了制備上述融合體的合成角質(zhì)酶基因，合成幾個(gè)銜接片段，其中以不同方式將exlA前序列的編碼序列連接到編碼成熟角質(zhì)酶N-末端的序列上。在盒5中，這種連接是通過(guò)將exlA前序列與角質(zhì)酶的原序列相融合而完成的。在盒6中，將exlA前序列與成熟角質(zhì)酶的N-末端相融合。盒7與盒6相同，但其中為了更好地適合切除信號(hào)肽的要求，將所編碼的成熟角質(zhì)酶多肽的N-末端殘基從原始的甘氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸殘基?；旧习磳?shí)施例1中描述從合成的寡核苷酸裝配盒5，6和7(參見(jiàn)圖7)。用盒5替代pUR 7210中的0.1Kb EcoRⅠ-SpeⅠ片段，產(chǎn)生pUR 7287。分別用盒6和7替代pUR 7210中的0.1Kb EcoRⅠ-BclⅠ片段，以產(chǎn)生pUR 7288和pUR 7289。對(duì)于質(zhì)粒pUR 7287，pUR 7288以及pUR7289中每一個(gè)，將0.7Kb的BspHⅠ-AflⅡ片段與pAW 14B的7.2Kb BspHⅠ-AflⅡ片段相連接，分別產(chǎn)生pUR7290，pUR7291以及pUR7292。
隨后采用常規(guī)共轉(zhuǎn)化技術(shù)將構(gòu)建的重組DNA載體轉(zhuǎn)移至霉菌(黑曲霉，黑曲霉awamori變種)，通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)切木聚糖酶Ⅱ啟動(dòng)子表達(dá)前-(原)-角質(zhì)酶基因。還可以給構(gòu)建的重組DNA載體提供常規(guī)選擇標(biāo)記(例如，amd S或pyr G，潮霉素)，如在實(shí)施例中描述的用于pUR7280(見(jiàn)上文)的方法，將得到的重組DNA載體轉(zhuǎn)化霉菌，以產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)。
在下列條件下培養(yǎng)用表達(dá)載體pUR7280，pUR7281，pUR7290，pUR7291，pUR7282(含有帶有或沒(méi)有相應(yīng)原序列以及角質(zhì)酶信號(hào)序列或受黑曲霉awamori變種exlA啟動(dòng)子和終止子控制的exlA信號(hào)序列的茄病鐮孢成熟角質(zhì)酶編碼區(qū))中任一種轉(zhuǎn)化的黑曲霉菌株用孢子接種多個(gè)含400ml合成培養(yǎng)基(PH6.5)的1升搖瓶(終濃度為10E6/ml)。該培養(yǎng)基有下列組份(AW培養(yǎng)基)蔗糖 10克/升NaNO36.0克/升KCl 0.52克/升KH2PO41.52克/升MgSO4·7H2O 0.49克/升酵母抽提物 1.0克/升ZnSO4·7H2O 22mg/升H3BO311mg/升MnCl2·H2O 5mg/升FeSO4·7H2O 5mg/升CaCl·6H2O 1.7mg/升CaSO4·5H2O 1.6mg/升NaH2MoO4·2H2O 1.5mg/升Na2EDTA 50mg/升在MK X培養(yǎng)搖床上30℃以200rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24小時(shí)，在生長(zhǎng)后通過(guò)過(guò)濾(0.45μm濾器)收集細(xì)胞，用無(wú)蔗糖和酵母抽提物(鹽液)的AW培養(yǎng)基洗二次，重懸于50ml鹽溶液中，并轉(zhuǎn)移至含有50ml鹽溶液的300ml搖瓶中，該鹽溶液中加入了終濃度為10克/升的木聚糖(誘導(dǎo)培養(yǎng)基)。在與上面所述相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜。用miracloth過(guò)濾得到的培養(yǎng)物以除去生物質(zhì)，基本上按上面實(shí)施例2描述方法回收角質(zhì)酶。
實(shí)施例7在曲霉中表達(dá)茄病鐮孢角質(zhì)酶變異體基本上按照實(shí)施例6中提及的途經(jīng)，但現(xiàn)在用質(zhì)粒pUR 7240(R17E)或pUR 7241(R196E)或pUR7242(L51A)代替pUR7210，用于構(gòu)建真菌表達(dá)載體，在黑曲霉awamori變種內(nèi)制備含有上述提到突變的茄病鐮孢角質(zhì)酶變異體。
實(shí)施例8鑒定和分離與茄病鐮孢角質(zhì)酶基因相關(guān)的基因從不同真菌中分離與茄病鐮孢角質(zhì)酶有不同程度同源性的角質(zhì)酶的編碼基因。在含有200ml培養(yǎng)基的500ml搖瓶中培養(yǎng)真菌培養(yǎng)物，該培養(yǎng)基是在Hankin和Kolattukudy(1968)描述的培養(yǎng)基中添加了0.25%葡萄糖，并在MKX培養(yǎng)搖床(100rpm)上28℃培養(yǎng)4天。在此時(shí)，消耗葡萄糖并加入基本上由Ettinger等人(1987)描述的角質(zhì)素水解液而誘導(dǎo)角質(zhì)酶產(chǎn)生。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(參見(jiàn)實(shí)施例4)，以有規(guī)律的時(shí)間間隔從培養(yǎng)液中回收樣品并分析脂解酶活性的存在。正常情況，在誘導(dǎo)后約2天就顯示有脂解活性，并在那時(shí)利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過(guò)過(guò)濾收集細(xì)胞。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，洗滌菌絲體，冷凍于液氮中并凍干?；旧习凑誗ambrook et al.(1989)的描述，利用硫氰酸胍法分離細(xì)胞的總RNA制劑，并采用氯化銫密度梯度離心進(jìn)行純化。利用多聚AT系統(tǒng)mRNA分離藥盒(Promga)分離多A(+)mRNA部分。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用茄病鐮孢角質(zhì)酶基因的cDNA片段作為探針將多A(+)mRNA部分進(jìn)行Northern雜交分析，以驗(yàn)證角質(zhì)酶相關(guān)基因的表達(dá)。根據(jù)供應(yīng)商的說(shuō)明，用一個(gè)ZAP cDNA合成藥盒(Stratagene，La Jolla)將含有能與探針雜交的物質(zhì)的mRNA制劑用于合成cDNA，產(chǎn)生cDNA片段，該片段帶有側(cè)端為多聚A區(qū)域的Xho Ⅰ粘性末端以及在另一末端為一個(gè)EcoRⅠ接頭。通過(guò)以有意義方向?qū)⒌玫降腸DNA片段直接克隆到λZAPⅡ載體(Stratagene，La Jolla)中，并允許表達(dá)β-半乳糖苷酶融合蛋白(Huse et al.，1988)，而構(gòu)建到了表達(dá)文庫(kù)。利用針對(duì)茄病鐮孢角質(zhì)酶的抗血清篩選這些文庫(kù)。
另一種可選擇方法是，用角質(zhì)酶特異性引物(見(jiàn)表2)，將合成的cDNA部分進(jìn)行PCR篩選。這些引物是從將幾個(gè)真菌角質(zhì)酶基因的氨基酸序列(ettinger et al.，1987)相比較得到的。對(duì)于每一套引物，都使用最佳的PCR反應(yīng)條件，并用茄病鐮孢角質(zhì)酶的cDNA作為對(duì)照。對(duì)于(合成的)即些cDNA制劑，由他們產(chǎn)生的一個(gè)特定PCR片段其長(zhǎng)度相似于(或大于)在同樣條件下用茄病鐮孢角質(zhì)酶的cDNA產(chǎn)生的PCR片段的長(zhǎng)度，通過(guò)凝膠電泳純化該P(yáng)CR片段并從該凝膠上分離該片段。
另一種可選擇方法是，利用角質(zhì)酶特異性引物的PCR篩選技術(shù)也可以直接應(yīng)用到一些真菌菌株的基因組DNA，用茄病鐮孢的基因組DNA作為陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)于這些真菌基因組DNA制劑。用它們制備的一個(gè)特異性PCR片段具有相似于(或大于)在同樣條件用來(lái)自茄病鐮孢角質(zhì)酶的cDNA制備的PCR片段的長(zhǎng)度，通過(guò)凝膠電泳純化該P(yáng)CR片段并從該凝膠上分離該片段。
對(duì)于在表達(dá)文庫(kù)方法或PCR篩選方法(用cDNA或基因組DNA)中評(píng)為陽(yáng)性的菌株以及許多其他菌株，分離到了高分子量基因組DNA。菌株的培養(yǎng)基本上按照Ettinger等人(1987)的描述進(jìn)行?；蚪MDNA的分離按照de Graaff等人(1988)描述進(jìn)行。用各種不同的限制性酶消化基因組DNA，并利用類似的cDNA插入片段(在表達(dá)文庫(kù)方法中)或PCR片段(PCR篩選方法)或茄病鐮孢角質(zhì)酶基因(其他菌株)作為探針進(jìn)行Southern雜交分析，并繪制該角質(zhì)酶基因的物理圖譜。通過(guò)凝膠電泳適當(dāng)消化的基因組DNA按大小分級(jí)分離并從凝膠上分離合適大小的片段，亞克隆到pUC19中。用相應(yīng)的cDNA插入片段(表達(dá)文庫(kù)方法)或PCR片段(PCR篩選方法)篩選這些基因組文庫(kù)，產(chǎn)生含有角質(zhì)酶基因的基因組拷貝的克隆。以兩個(gè)方向?qū)υ摶蜻M(jìn)行測(cè)序。通過(guò)分析相應(yīng)cDNA的序列或通過(guò)其他角質(zhì)酶序列(Ettinger et al.，1987)比較可鑒別內(nèi)含子。也可以從這種比較中推導(dǎo)出成熟角質(zhì)酶多肽的N-末端。利用標(biāo)準(zhǔn)的PCR技術(shù)。移走內(nèi)含子。通過(guò)遺傳操作法將開(kāi)放式閱讀框架的下游緊接一個(gè)HindⅢ位點(diǎn)，將啤酒酵母轉(zhuǎn)化酶基因的原序列的編碼序列(其前為Sac Ⅰ位點(diǎn)，與盒8對(duì)照，圖3)融合到編碼成熟角質(zhì)酶的N-末端的序列上。將得到的SacⅠ-HindⅢ片段與pUR7241的7.3Kb Sac Ⅰ-HindⅢ片段(圖4)相連接并轉(zhuǎn)化至啤酒酵母SU51菌株，其中的Sac Ⅰ-HindⅢ片段含有可操作地連接到編碼啤酒酵母轉(zhuǎn)化酶前序列的序列上的角質(zhì)酶基因?；旧习凑諏?shí)施例4描述，表達(dá)真菌角質(zhì)酶以及從培養(yǎng)液中回收該酶。
實(shí)施例9茄病鐮孢角質(zhì)酶變異體R17E，R196E和R17E+R196E與各種陰離子表面活性劑的相容性按如下所述檢測(cè)茄病鐮孢角質(zhì)以及茄病鐮孢角質(zhì)酶變異體R17E，R196E和R17E+R196E與各種陰離子表面活性劑的相容性，制備含酶的各種洗滌劑產(chǎn)品溶液。將溶液在40℃保溫，并間隔地取樣。然后按照實(shí)施例4描述的方法測(cè)定酶活性。使用下列的洗滌產(chǎn)品A-C產(chǎn)品A
產(chǎn)品B
產(chǎn)品C
組合物A-C的結(jié)果列于圖12-14中。從該結(jié)果看出，尤其是在富含陰離子的組合物A中，角質(zhì)酶變異體比野生型茄病鐮孢角質(zhì)酶更穩(wěn)定。
實(shí)施例10茄病鐮孢角質(zhì)酶變異體R196K和R196L與十二烷基硫酸鈉的相容性按如下所述檢測(cè)茄病鐮孢角質(zhì)酶以及茄病鐮孢角質(zhì)酶變異體R196K和R196L與十二烷基硫酸鈉(SDS)的相容性。在0°FH制備0.4mMSDS和10mM Tris中的酶溶液。將該溶液在40℃保溫并間隔地取樣，按實(shí)施例4描述的方法測(cè)定殘留的酶活性。結(jié)果顯示于圖15中?？梢钥闯鰞煞N角質(zhì)酶變異體比野生型茄病鐮孢角質(zhì)酶更能穩(wěn)定地與陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)相容。
實(shí)施例11檢測(cè)茄病鐮孢角質(zhì)酶變異體R17E的洗滌活性用純化的橄欖油將由機(jī)織聚酯/棉花制成的檢測(cè)布弄臟。然后在100ml聚乙烯瓶的30ml洗液中保溫每塊檢測(cè)布。在裝有水的Miele TMT洗衣機(jī)中，用正常的40℃洗滌主程序振蕩這些瓶子。該洗滌由每升中2克實(shí)施例9的洗衣粉A和B(在27°FH)組成。
結(jié)果顯示于圖16中。已證明，在各種洗滌條件下相對(duì)于野生型茄病鐮孢角質(zhì)酶而言，角質(zhì)酶變異體R17E的洗滌功能(除去油性污漬)有提高。為了比較，用Lipolase(TM)也進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)。在所有條件下，角質(zhì)酶變異體R17E都有優(yōu)勢(shì)。
權(quán)利要求
1.一種親本角質(zhì)酶的角質(zhì)酶變異體，已將其氨基酸序列以提高與陰離子表面活性劑的相容性的方式進(jìn)行改變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的角質(zhì)酶變異體，其中通過(guò)降低陰離子表面活性劑與酶的結(jié)合力而提高其與陰離子表面活性劑的相容性。
3.根據(jù)前面的任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的角質(zhì)酶變異體，其中通過(guò)降低陰離子表面活性劑與酶之間的靜電作用而提高其與陰離子表面活性劑的相容性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的角質(zhì)酶變異體。其中通過(guò)用賴氨酸殘基替代一個(gè)或多個(gè)帶正電的精氨酸殘基而降低陰離子表面活性劑與酶之間的靜電作用，其中的精氨酸的定位接近于能結(jié)合陰離子表面活性劑的非極性尾的疏水片。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的角質(zhì)酶變異體。其中通過(guò)用未帶電荷的氨基酸殘基替代一個(gè)或多個(gè)帶陽(yáng)性電荷的精氨酸殘基而降低陰離子表面活性劑與酶之間的靜電作用，其中的精氨酸的位置接近于能結(jié)合陰離子表面活性劑的非極性尾的疏水片。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的角質(zhì)酶變異體。其中通過(guò)用帶負(fù)電荷的氨基酸殘基替代一個(gè)或多個(gè)帶正電荷的精氨酸殘基而降低陰離子表面活性劑與酶之間的靜電作用，其中精氨酸的位置接近于能結(jié)合陰離子表面活性劑的非極性尾的疏水片。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的角質(zhì)酶變異體。其中通過(guò)用疏水性小的氨基酸殘基替代一個(gè)或多個(gè)的氨基酸殘基而降低陰離子表面活性劑與酶的結(jié)合，其中氨基酸定位于能結(jié)合陰離子表面活性的非極性尾的疏水片上。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的角質(zhì)酶變異體。其中的疏水性小的氨基酸殘基選自于由甘氨酸，絲氨酸，丙氨酸，天冬氨酸和蘇氨酸組成的組中。
9.根據(jù)前面的權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的角質(zhì)酶變異體。其中親本角質(zhì)酶是一種真核角質(zhì)酶。
10.根據(jù)前面的權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的角質(zhì)酶變異體，其中親本酶是一種與針對(duì)茄病鐮孢的角質(zhì)酶抗體發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的角質(zhì)酶。
11.根據(jù)前面的權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的角質(zhì)酶變異體，它是由與編碼茄病鐮孢，Colletrichum capsici，盤長(zhǎng)孢狀毛盤孢，Magnaporthe grisea的角質(zhì)酶的編碼基因的5′和/或3′-末端以及/或與角質(zhì)酶的保守序列有巨大同源的基因編碼的。
12.根據(jù)前面的權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的角質(zhì)酶變異體，修飾的殘基定位于茄病鐮孢角質(zhì)酶的氨基酸序列，或不同角質(zhì)酶相應(yīng)氨基酸的一個(gè)或多個(gè)下列位點(diǎn)上17，51，78，80，88，96，156，195，和196。
13.根據(jù)前面的權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的角質(zhì)酶變異體，修飾的殘基定位于茄病鐮孢角質(zhì)酶的氨基酸51和195周圍，或不同角質(zhì)酶的相應(yīng)氨基酸周圍的疏水片上。
14.根據(jù)前面的權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的角質(zhì)酶變異體，它是Magnoporthe grisiea角質(zhì)酶的變異體，并且含有一個(gè)或多個(gè)下列突變A80D，A88E，R156L。
15.制備前面任一項(xiàng)所述的角質(zhì)酶變異體的方法，包括下列步驟發(fā)酵培養(yǎng)含有由重組DNA技術(shù)制備的基因的一種重組DNA修飾的微生物，其中的基因編碼角質(zhì)酶變異體，以及通過(guò)從發(fā)酵液中分離由該微生物產(chǎn)生的角質(zhì)酶變異體，或通過(guò)從發(fā)酵液中分離微生物細(xì)胞，破碎分離的細(xì)胞，并且采用物理或化學(xué)濃縮和純化方法從所說(shuō)發(fā)酵液或從所說(shuō)細(xì)胞中濃縮或部分純化出角質(zhì)酶，從而制備角質(zhì)酶變異體制劑。
16.一種重組DNA修飾的微生物，該微生物已由攜帶編碼權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的角質(zhì)酶變異體的基因的一個(gè)重組DNA載體轉(zhuǎn)化，從而該微生物能表達(dá)所說(shuō)的角質(zhì)酶變異體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的重組DNA修飾的微生物，它攜帶的角質(zhì)酶變異體編碼基因是通過(guò)在其5′-末端與一個(gè)基因片段融合而導(dǎo)入到所述微生物，所述基因片段編碼具有作為宿主微生物的信號(hào)或分泌序列功能的一個(gè)(改進(jìn)的)前序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的重組DNA修飾的微生物，其中宿主微生物是一種真核生物，例如酵母屬或克魯維氏酵母屬或漢遜氏酵母，或曲霉屬的真菌。
19.根據(jù)權(quán)利要求16-18所述的重組DNA修飾的微生物，包攜帶有為權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的角質(zhì)酶變異體編碼的重組DNA載體，所說(shuō)微生物是通過(guò)將其一種祖先細(xì)胞中營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記的編碼基因進(jìn)行替代而制備的一個(gè)自養(yǎng)型突變體。
20.一種多核苷核酸，它具有為權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的成熟角質(zhì)酶變異體或一種功能等同物或其突變異體編碼的堿基序列，其中聚核苷酸的最后轉(zhuǎn)譯密碼子后跟隨一個(gè)終止密碼子，或者還具有為緊接著在成熟酶的核苷酸序列的上游的該角質(zhì)酶的前序列的核苷酸編碼序列。
21.一種具有為權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所說(shuō)的角質(zhì)酶變異體編碼的堿基序列的多核苷酸，其中多核苷酸的最后轉(zhuǎn)譯密碼子后面跟隨一個(gè)終止密碼并且該多核苷酸在其編碼成熟酶的核苷酸序列的上游選擇性地緊接一個(gè)為至少部分相應(yīng)前序列，和/或適應(yīng)于選定的宿主有機(jī)體的信號(hào)或分泌序列編碼的一個(gè)核苷酸序列。
22.一種具有為權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的成熟角質(zhì)酶變異體編碼的一種多核苷酸或一種功能等同物或其突變體，其中已以某種方式對(duì)來(lái)源生物源的角質(zhì)酶變異體的核苷酸編碼序列進(jìn)行了改進(jìn)，該方式是至少使一個(gè)密碼子并且優(yōu)選的是盡可能多的密碼子遭受“靜止”突變以形成為等同的氨基酸殘基編碼的密碼子，并且是在權(quán)利要求16-19中限定的新宿主優(yōu)選的密碼子，從而在上述宿主細(xì)胞內(nèi)提供了具有改進(jìn)的穩(wěn)定性的所導(dǎo)入基因的信使RNA。
23.根據(jù)權(quán)利要求20-22任一項(xiàng)所說(shuō)的多核苷酸，其中在編碼原或成熟角質(zhì)酶變異體的核苷酸的上游定位了一個(gè)核苷酸序列，該序列編碼適合于權(quán)利要求16-19中任一項(xiàng)限定的宿主的信號(hào)或分泌序列。
24.一種能指導(dǎo)編碼角質(zhì)酶變體基因的核苷酸序列表達(dá)的重組DNA載體，它包括下列成分a)為成熟角質(zhì)酶變異體或前角質(zhì)酶或一種相應(yīng)的角質(zhì)酶(其中至少將緊接分泌信號(hào)(對(duì)于選定的宿主細(xì)胞是優(yōu)選的)下游的部分前序列移走)編碼的雙鏈(ds)DNA，如果應(yīng)轉(zhuǎn)譯的基因部分沒(méi)有以ATG作為起始密碼子，則在該基因前面加一個(gè)ATG密碼子，并且要轉(zhuǎn)譯的基因部分以合適的終止密碼子終止或已加上了這樣一個(gè)終止密碼子。b)一種定位于編碼角質(zhì)酶變異體的ds DNA(成分(a))的正鏈的上游的表達(dá)調(diào)節(jié)子(適合于選定的宿主微生物);c)一種定位編碼角質(zhì)酶變體的ds DNA(成分(a))的正鏈的下游的終止序列(適合于選定的宿主微生物);d1)一種促進(jìn)該ds DNA整合到選定的宿主的基因組中核苷酸序列或，d2)一種適合于選定的宿主的復(fù)制源點(diǎn);e1)選擇性地含的一種(營(yíng)養(yǎng)缺陷型)選擇標(biāo)記;e2)選擇性地含有一個(gè)為與選定的宿主中角質(zhì)酶變異體的前體形式之一的成熟和/或分泌有關(guān)的蛋白質(zhì)編碼的ds DNA序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的重組DNA載體，在前面定義的多核苷酸的上游和/或下游進(jìn)一步有促進(jìn)角質(zhì)酶功能性表達(dá)的序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求24-25任一項(xiàng)所述的重組DNA載體，它攜帶由營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記的編碼區(qū)和一個(gè)缺陷型啟動(dòng)區(qū)組成的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記。
27.一種加酶洗滌劑組合物，含有權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的角質(zhì)酶變異體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種親本角質(zhì)酶的角質(zhì)酶變異體，該變異體的氨基酸序列已以提高其與陰離子表面活性劑的方式進(jìn)行改變。具體講，通過(guò)減少陰離子表面活性劑與酶的結(jié)合而提高與陰離子表面活性劑的相容性。
文檔編號(hào)C12R1/865GK1090329SQ93121760
公開(kāi)日1994年8月3日 申請(qǐng)日期1993年12月23日 優(yōu)先權(quán)日1992年12月23日
發(fā)明者M·R·艾格蒙德, H·T·W·M·范德希登, W·穆斯特斯, H·彼得斯, C·T·韋里斯, J·迪弗力格 申請(qǐng)人:尤尼利弗公司