專利名稱：一種簡易快速高通量提取植物基因組dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種DNA提取方法，特別是涉及到ー種植物全基因DNA提取方法。
背景技術(shù)：
植物細(xì)胞內(nèi)不僅具有很高的核酸酶活性，而且其細(xì)胞壁含有大量的多糖，且其組成因物種不同而各異。這些多糖對(duì)植物基因組DNA的提取過程中的共沉淀步驟造成了影響，降低了核酸的純度。常規(guī)使用的CTAB法、尿素提取法和SDS/酚/氯仿提取基因組DNA的方法，不僅操作復(fù)雜、耗時(shí)長，而且使用了大量揮發(fā)性有機(jī)物，產(chǎn)生大量的有毒廢液。目前(2011 年)市場上的 Qiagen Puregene Accessories 包括 Cell LysisSolution (1000ml)、Protein Precipitation Solution (350ml)和 DNA Hydration Solution (500ml)試劑盒質(zhì)量和效果因生產(chǎn)批次不同而不穩(wěn)定，且提純過程較長(5小吋)、成本高(3000美金，約I美金/DNA樣本)，其煩瑣昂貴的缺陷非常不利于群體遺傳學(xué)、系統(tǒng)進(jìn)化、分子標(biāo)記輔助育種和深度測序等研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種經(jīng)濟(jì)、簡便、易行、快速、高通量的方法，從少量新鮮、4攝氏度保存(一周內(nèi))或者室溫長期保存的干燥的植物葉片中提取高質(zhì)量的全基因組植物DNA。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為I)用打孔器在植物葉片上打I片直徑為0. 6厘米的圓型新鮮葉片，葉片可4攝氏度保存?zhèn)溆?I周內(nèi)提取)，或者室溫長期保存的干燥葉片。注意事項(xiàng)葉片組織不宜過多或者過少，否則會(huì)降低DNA提取效率。不能-20攝氏度保存，否則會(huì)破壞植物組織，導(dǎo)致DNA降解，影響DNA提取質(zhì)量。2)在96孔板小管內(nèi)放入葉片、I粒直徑為0. 4厘米的鋼珠和200微升提取液。注意事項(xiàng)不能超過I粒，否則在后面振蕩步驟中會(huì)將蓋子振松，導(dǎo)致組織液和提取液滲漏。鋼珠直徑不能大于0. 3厘米，否則鋼珠球體表面積過大，導(dǎo)致研磨效率不高，葉片組織會(huì)殘留在球體表面，影響DNA提取效率。200毫升是最佳提取液劑量，否則提取DNA濃度不高。3)在96孔板上放置ー層Parafilm封ロ膜，再按緊96孔板的蓋子，并用硬物的平面(直徑約I厘米)頂端將96個(gè)小管頂端一一按緊，以防提取液和組織液滲漏。注意事項(xiàng)=Parafilm增加蓋子和管子封ロ的摩擦力，防止振蕩步驟中蓋子松動(dòng)，避免組織液和提取液的滲漏。用硬物按緊蓋子，確保蓋子封ロ緊密，處于ー個(gè)水平面，有利于振蕩。鋼珠在振蕩步驟中會(huì)撞擊蓋子，若蓋子不緊，會(huì)導(dǎo)致組織液和提取液的滲漏。4)將96孔板放置在振蕩器上，設(shè)置頻率為30次/秒，振蕩30秒，并將96孔板旋轉(zhuǎn)180度后，重新放置在振蕩器上，以相同頻率再振蕩30秒。注意事項(xiàng)30次/秒是最適合的頻率。若過低，會(huì)導(dǎo)致振蕩研磨不徹底，降低DNA的提取效率。若過高，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)抑制PCR反應(yīng)的成分的釋放，并且降低DNA的穩(wěn)定性。將96孔板旋轉(zhuǎn)180度是為了確保96孔板研磨均勻，否則會(huì)導(dǎo)致不同位置的小管提取的DNA濃度差異很大，影響PCR結(jié)果。5)將振蕩后的96孔板放入離心機(jī),設(shè)置轉(zhuǎn)速為5000rpm,室溫離心I分鐘。注意事項(xiàng)確保組織液和提取液在小管底部，否則在后續(xù)的加熱中受熱不均勻，降低DNA提取的效率。6)離心后的96孔板75度水浴20分鐘。注意事項(xiàng)加熱時(shí)間不宜過短，加熱溫度不宜過低，否則提取液不能有效破壞植物細(xì)胞，降低DNA提取效率。加熱時(shí)間不宣過長，加熱溫度不宜過高，否則會(huì)導(dǎo)致影響DNA降 解的成分釋放，降低提取DNA的穩(wěn)定性。7)將水浴后的96孔板放入離心機(jī)，設(shè)置轉(zhuǎn)速為5000rpm，室溫離心15分鐘。注意事項(xiàng)確保細(xì)胞成分雜質(zhì)有效沉淀于管底部，否則雜質(zhì)會(huì)混合在DNA上清液中，降低DNA提取效率，降低提取DNA純度。8)將離心后的上清液轉(zhuǎn)移至新的96孔平板中。注意事項(xiàng)有利于DNA和細(xì)胞雜質(zhì)的分離，否則會(huì)降低DNA的提取純度。9)加入等體積的100%異丙醇，緩慢來回反轉(zhuǎn)4次。注意事項(xiàng)使DNA和異丙醇充分混合。次數(shù)過少，導(dǎo)致DNA和異丙醇混合不均，降低DNA提取效率。次數(shù)過多，會(huì)造成DNA降解，降低DNA提取效率。10)將96孔板放入離心機(jī),設(shè)置轉(zhuǎn)速為5000rpm,室溫離心15分鐘。注意事項(xiàng)確保DNA在管底部充分沉淀，否則會(huì)降低DNA提取濃度。11)將96孔板倒置，棄去上清液，再在96孔板中加入150毫升冰浴的70%こ醇潤洗。注意事項(xiàng)こ醇過多會(huì)使沉淀在小管底部的DNA漂浮，易和こ醇ー并丟失，并有過多こ醇?xì)埩?，延長DNA干燥時(shí)間，降低DNA提取效率。こ醇過少不能充分洗脫DNA中的細(xì)胞雜質(zhì)，降低DNA提取的純度。こ醇應(yīng)保持低溫，溫度過高會(huì)降解DNA，降低DNA提取的穩(wěn)定性。こ醇濃度70%是最適宜的洗脫濃度，否則會(huì)影響洗脫效果，降低DNA提取純度。12)將96孔板放入離心機(jī)，設(shè)置轉(zhuǎn)速為5000rpm，室溫離心5分鐘后，將96孔板倒置，倒掉こ醇，并將96孔板放置在干凈的吸水紙上30秒，再換新的吸水紙?jiān)傥?0秒。小管底部乳白色團(tuán)狀物即為植物基因組DNA。注意事項(xiàng)5000rpm，離心5分鐘，確保被こ醇懸浮起來的DNA團(tuán)裝物沉入管底，而不殘留在管壁上面，否則會(huì)降低DNA提取的濃度。用吸水紙吸干，去除殘留こ醇，否則會(huì)延長后續(xù)DNA干燥時(shí)間，降低DNA提取效率。13)將96孔板正面朝上放置在通風(fēng)櫥內(nèi)干燥I小時(shí)。注意事項(xiàng)通風(fēng)干燥I小時(shí)，確保殘留こ醇揮發(fā)完全，否則會(huì)造成こ醇?xì)埩簦档虳NA純度，影響PCR反應(yīng)。14)加入40微升去離子水，并存儲(chǔ)在-20攝氏度冰箱內(nèi)。注意事項(xiàng)40微升去離子水稀釋后的DNA濃度區(qū)間為200-600納克/微升(ng/ul)，是直接進(jìn)行PCR反應(yīng)的DNA模板的最適合濃度。過多的水會(huì)降低DNA濃度，加速DNA降解。-20攝氏度長期保存DNA，溫度過高會(huì)加速DNA降解。
15)取O. 5-1微升DNA溶液直接用于PCR模板。注意事項(xiàng)直接作為PCR反應(yīng)的底物最適合的體積。本發(fā)明植物全基因組DNA提純方法區(qū)別于傳統(tǒng)方法和目前流行的QiagenPurgene,有以下優(yōu)點(diǎn)I.簡易快速(2. 5小吋)；(其他方法均超過5小吋)2.高通量(384份/次)提取DNA ；(其他方法I份/次)3.成本低廉(溶液自配，未使用昂貴酶試劑和液氮)；(其他方法使用液氮或者成本昂貴)4.所需植物組織少(I個(gè)葉片，直徑為O. 6厘米)；(其他方法均使用超過4個(gè)葉·片)5. DNA純度和濃度高(可直接用于PCR反應(yīng))；(其他方法純度和濃度偏低)6. DNA穩(wěn)定性好(可-20攝氏度保存12個(gè)月)；(其他方法穩(wěn)定性差)7.適用于多種植物(適用于玉米、水稻、高粱、大豆、小麥、擬南芥等)；(其他方法適用領(lǐng)域局限)所得的高質(zhì)量基因組DNA可廣泛應(yīng)用于植物群體遺傳學(xué)、系統(tǒng)進(jìn)化、分子標(biāo)記育種等各項(xiàng)研究。
具體實(shí)施例方式下面詳細(xì)說明本發(fā)明實(shí)施例實(shí)施例一用打孔器在新鮮玉米葉片上打I片直徑為O. 6厘米的圓型葉片。葉片可4攝氏度保存?zhèn)溆?，I周內(nèi)提取，或室溫長期保存的干燥葉片。在96孔板小管內(nèi)放入葉片、I粒直徑為O. 4厘米的鋼珠和200微升提取液。在96孔板上放置ー層Parafilm封ロ膜，再按緊96孔板的蓋子，并用硬物的平面(直徑約I厘米)頂端將96個(gè)小管頂端一一按緊，以防提取液和組織液滲漏。將96孔板放置在振蕩器上，設(shè)置頻率為30次/秒，振蕩30秒，并將96板旋轉(zhuǎn)180度后，重新放置在振蕩器上，以相同頻率再振蕩30秒。將振蕩后的96孔板放入離心機(jī)，設(shè)置轉(zhuǎn)速為5000rpm，室溫離心I分鐘。將離心后的96孔板75度水浴20分鐘。將水浴后的96孔板放入離心機(jī)，設(shè)置轉(zhuǎn)速為5000rpm，室溫離心15分鐘。將離心后的上清液轉(zhuǎn)移至新的96孔平板中。加入等體積的100%異丙醇，緩慢來回反轉(zhuǎn)4次。將96孔板放入離心機(jī)，設(shè)置轉(zhuǎn)速為5000rpm，室溫離心15分鐘。將96孔板倒置，倒掉上清液，再在96孔板中加入150毫升冰浴70%こ醇潤洗。將96孔板放入離心機(jī)，設(shè)置轉(zhuǎn)速為5000rpm，離心5分鐘后，將96孔板倒置，倒掉こ醇，并將96孔板放置在干凈的吸水紙上30秒，再換新的吸水紙?jiān)傥?0秒。小管底部乳白色團(tuán)狀物即為植物基因組DNA。將96孔板正面朝上放置在通風(fēng)櫥內(nèi)干燥I小時(shí)整。加入40微升去離子水，并存儲(chǔ)在-20攝氏度冰箱內(nèi)。取
O.5微升DNA溶液直接用于PCR模板。用Qiagen Purgene提取DNA方法作為對(duì)照。實(shí)施例ニ 用打孔器在新鮮水稻葉片上打I片直徑為O. 6厘米的圓型葉片。葉片可4攝氏度保存?zhèn)溆?，I周內(nèi)提取，或室溫長期保存的干燥葉片。其它步驟同實(shí)施例一。用QiagenPurgene提取DNA方法作為對(duì)照。實(shí)施例三用打孔器在新鮮高粱葉片上打I片直徑為O. 6厘米的圓型葉片。葉片可4攝氏度保存?zhèn)溆茫琁周內(nèi)提取，或室溫長期保存的干燥葉片。其它步驟同實(shí)施例一。用QiagenPurgene提取DNA方法作為對(duì)照。實(shí)施例四用打孔器在新鮮大豆葉片上打I片直徑為O. 6厘米的圓型葉片。葉片可4攝氏度保存?zhèn)溆?，I周內(nèi)提取，或室溫長期保存的干燥葉片。其它步驟同實(shí)施例一。用Qiagen Purgene提取DNA方法作為對(duì)照。本發(fā)明方法與Qiagen Purgene提取DNA方法比較I) DNA 穩(wěn)定性以下是用本發(fā)明(圖I.植物基因組DNA加樣5微升電泳檢測結(jié)果(左ー欄))所提取的玉米(第一行)、水稻(第二行)、高粱(第三行)和大豆(第四行)新鮮葉片基因組DNA加樣5微升電泳檢測照片。圖I左ニ欄為所提取的玉米(第一行)、水稻(第二行)、高粱(第三行)和大豆(第四行)4攝氏度保存一周的葉片基因組DNA加樣5微升電泳檢測照片。圖I左三欄為所提取的玉米(第一行)、水稻(第二行)、高粱(第三行)和大豆(第四行)室溫長期保存的干燥葉片基因組DNA加樣5微升電泳檢測照片。圖I右側(cè)是用Qiagen Purgene提取新鮮玉米(第一行)、水稻(第二行)、高粱(第三行)和大豆(第四行)基因組DNA加樣5微升電泳檢測照片(圖I)。本發(fā)明方法提取的DNA(圖I左側(cè))，在膠頂端有一條清晰的DNA條帶，DNA片段無降解,與圖I右側(cè)所示的Qiagen Purgene提取DNA方法所得到的條帶相似，說明所提取的基因組DNA穩(wěn)定性良好。以下是用本發(fā)明所提取的玉米(第一行)、水稻(第二行)、高粱(第三行)和大豆(第四行)基因組DNA經(jīng)-20攝氏度保存12個(gè)月后，取I微升為模板進(jìn)行某基因片段(Ikb)PCR擴(kuò)增的電泳檢測結(jié)果(圖2.植物基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果)。圖2右側(cè)是用Qiagen Purgene提取玉米(第一行)、水稻(第二行)、高粱(第三行)和大豆(第四行)基因組DNA經(jīng)-20攝氏度保存24小時(shí)后取I微升為模板進(jìn)行某基因片段(Ikb)PCR擴(kuò)增的電泳檢測結(jié)果。本發(fā)明方法提取的DNA(圖2左側(cè))作為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到預(yù)期Ikb大小的清晰條帶,無雜帶,與圖2右側(cè)所示的Qiagen Purgene提取DNA方法所得到的PCR產(chǎn)物片段相似，說明所提取的基因組DNA穩(wěn)定性良好，適合PCR反應(yīng)。2)純度用NanoDrop Spectrophotometer分光光度計(jì)檢測DNA的純度指標(biāo)260/280值和260/230 值-260/280 值本發(fā)明提取DNA (圖3.本發(fā)明提取DNA的NanoDrop Spectrophotometer分光光度計(jì)檢測結(jié)果)的260/280值為1·9575±0· 06751543(樣品數(shù)η = 96)Qiagen Purgene 提取 DNA (圖 4. Qiagen Purgene 提取 DNA 的 NanoDropSpectrophotometer分光光度計(jì)檢測結(jié)果)的260/280值為I. 9025±0. 115022881 (樣品數(shù) η = 96)T-test的P值=0. 370189683，差異不顯著，說明本發(fā)明方法提取的DNA與QiagenPurgene提取的DNA在純度上無差異，均有微量RNA存在，但不影響相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。-260/230 值若260/230小于2. 0，有雜質(zhì)；若2. O彡260/230彡2. 2，高純度DNA。
本發(fā)明提取DNA(圖 3)的 260/230 值為2. 085±0. 051961524(樣品數(shù) η = 96)Qiagen Purgene 提取 DNA(圖 4)的 260/230 值為1· 0125±0· 1δ4472788 (樣品數(shù) η = 96)T-test的P值=3. 89599χ 1(Γ12,差異顯著，說明本發(fā)明方法提取的DNA與QiagenPurgene提取的DNA相比較，有較高的DNA純度。3)濃度本發(fā)明方法提取DNA的濃度為400. 54±124. 4068434納克/微升(ng/ul) QiagenPurgene 提取 DNA 的濃度為119. 86±99· 23338091 納克 / 微升(ng/ul)T-test 的 P 值=
I.46027x 10'差異顯著，說明本發(fā)明方法提取的DNA濃度要顯著高干與同等稀釋條件下Qiagen Purgene提取的DNA濃度,本發(fā)明方法提取DNA更有效。數(shù)據(jù)證明，在DNA的穩(wěn)定性上，本發(fā)明方法提取DNA與Qiagen Purgene提取DNA相似，但本發(fā)明方法提取DNA較Qiagen Purgene提取DNA有較高的DNA純度和濃度。 說明書


圖I是植物基因組DNA加樣5微升電泳檢測結(jié)果圖；圖2是植物基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果圖；圖3是本發(fā)明提取DNA的NanoDrop Spectrophotometer分光光度計(jì)檢測結(jié)果圖；圖 4 是 Qiagen Purgene 提取 DNA 的 NanoDrop Spectrophotometer 分光光度計(jì)檢測結(jié)果圖。
權(quán)利要求
1.植物全基因組DNA提取方法，其特征在于DNA提取液的配方 -IOOmM三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽Tris-HCl (PH 8. O)； -IOmMこニ胺四こ酸(EDTA)； -IM氯化鉀(KCl)。
2.植物全基因組DNA提取方法，其特征在于DNA提取材料為I片直徑為O.6厘米的圓型新鮮葉片或4攝氏度保存的葉片，或室溫長期保存的干燥葉片。
3.植物全基因組DNA提取方法，其特征在于在96孔板小管內(nèi)放入I粒直徑為O.4厘米的鋼珠和200微升提取液。
4.植物全基因組DNA提取方法，其特征在于在96孔板上放置ー層ParafiIm封ロ膜，用硬物平面(直徑約I厘米)頂端將96個(gè)小管頂端一一按緊，以防提取液和組織液滲漏。
5.植物全基因組DNA提取方法，其特征在于DNA提取過程中75度的水浴20分鐘。
6.植物全基因組DNA提取方法，其特征在于將96孔板正面朝上放置在通風(fēng)櫥內(nèi)干燥I小吋。
7.植物全基因組DNA提取方法，其特征在于取O.5-1微升DNA溶液直接用于PCR模板。
全文摘要
本發(fā)明提出一種簡易快速高通量提取植物基因組DNA的方法。涉及技術(shù)領(lǐng)域?yàn)橹参锶駾NA提取方法。本發(fā)明要解決傳統(tǒng)和目前(2011年)市場上流行的提取植物基因組DNA方法中存在的成本高、操作復(fù)雜、低通量、耗時(shí)長、純度低、易污染等技術(shù)問題。本發(fā)明采用自配試劑配方，不使用酶試劑，成本低。無需液氮研磨，操作簡單。一次處理384個(gè)樣品，高通量。提取過程僅需2.5小時(shí)，耗時(shí)短。所提DNA僅需0.5微升為PCR模板，純度高。Parafilm膜封口，密封防滲漏，清潔無污染。本發(fā)明提取的植物全基因組DNA，可應(yīng)用于植物群體遺傳學(xué)、系統(tǒng)進(jìn)化、分子標(biāo)記輔助育種和深度測序等研究，適于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和普通生物實(shí)驗(yàn)室科學(xué)研究。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102839167SQ20111017080
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2011年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月23日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請(qǐng)人:匡賢彥, 李偉, 應(yīng)開