專利名稱:一種長白山牛皮杜鵑基因組dna提取的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種高山植物基因組DNA提取的方法,屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域,具體的說涉及一種長白山牛皮杜鵑基因組DNA提取的方法。
背景技術(shù):
由于高山植物環(huán)境條件惡劣,所以高山植物通常被認為是陸地上最為極端的生物,但是高山植物卻也擁有豐富極具價值的基因資源。自1896年以來,作為生物進化研究中的熱點和難點,高山和極地植物對生境的適應(yīng)機制和策略一直倍受研究者們的關(guān)注。高山植物基因組DNA的提取技術(shù)是進行植物分子生物學(xué)研究的基本技術(shù)之一,DNA產(chǎn)率的高低,質(zhì)量的好壞直接影響到后續(xù)實驗的成敗。探討高山植物基因組DNA的提取方法是一項非常有意義的工作,為確保在農(nóng)作物環(huán)境脅迫抗性育種方面提供優(yōu)異種質(zhì)和選擇指標、為農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)研究與基因工程提供相關(guān)基因。將這種特殊的基因資源應(yīng)用在觀賞陸地植物,將保護與合理利用有效結(jié)合,走人與自然和諧發(fā)展的可持續(xù)性發(fā)展道路,這不僅有利于該區(qū)域植被的生長發(fā)育、生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定,更有利于地區(qū)經(jīng)濟的發(fā)展。高山植物的基因組提取方法有多種,近年來,人們一直致力于研究一種高效快速的提取方法,但是由于物種的特異性,高山植物的基因組提取起來并不是那么方便,。高山植物生存的環(huán)境溫度低,輻射強,在這樣的環(huán)境中,植物生長極其緩慢,產(chǎn)物消耗減少,為提高其抵御寒冷和生理干旱方面,使部分糖分和脂類物質(zhì)積累并儲存于葉片組織細胞中,使得高山植物基因組DNA的提取難度加大。王卓偉,等在對桑葉DNA提取方法研究過程中發(fā)現(xiàn)PVP還能有效地去除多糖。羅志勇等在研究中對這種方法進行了幾點改進:①提高CTAB的濃度;②對于含多酚類較多的植物,增加CTAB提取緩沖液中β_巰基乙醇的含量,同時加入PVP使其與多酚類物質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物;③增加低鹽沉淀緩沖液的量;④增加高鹽溶液中鹽的濃度。用改進的方法從人參、西洋參、三七等藥用植物中分離獲得了高純度的DNA;Porebski,等在沉淀粗提DNA時,將提取緩沖液中氯化鈉的濃度提高至2.5 mol.Γ1以使DNA在高鹽緩沖條件下優(yōu)先沉淀,`可更有效地除去多糖。余志雄對火龍果總DNA提取方法比較研究驗證了 CTAB法對火龍果基因組提取是有效,而且應(yīng)雄美對兩種不同甘蔗基因組DNA提取方法的比較,同時證明了 SDS和CTAB法都能提取到基因組DNA并且對兩種方法進行了改進。長白山杜鵑是一種有代表性高山植物,在海拔1700 m-2500 m海拔帶均有分布,其生理生化指標較為特殊,關(guān)于本研究中提到的長白山杜ill基因組提取的方案也有多種,但是不同方法對不同植物的基因組提取效果大不相同。對于杜鵑的基因組DNA提取方面的研究還是很少的。趙喜華,等以杜鵑屬常綠杜鵑亞屬井岡山杜鵑樹葉為材料分別采用CTAB法、堿裂解法、SDS法提取杜鵑基因組DNA,三種方法所提取的DNA純度及產(chǎn)率有差別,其中CTAB法較好。莊得鳳,曹后男,采用CTAB法(①取0.2 g左右研磨好的新鮮葉片置于1.5mL 離心管中,加 800 ul 經(jīng) 65°C預(yù)熱的 CTAB ( 2% CTAB; 100 mmol.Γ 1 Tris -HCl,pH8.0 ;20 mmol.17 1 EDTA ;1.4 mol.17 1 NaCl ;2% PVP )提取緩沖液,研磨前加入 2%β-巰基乙醇;充分混勻后,在水浴鍋中65°C溫浴Ih ;等)提取幾個品種長白山杜鵑的基因組DNA,所得的DNA純度高、質(zhì)量好,但是牛皮杜鵑及孢葉杜鵑基因組未能提取出來。本實驗用SDS法提取植物基因組(魏群.分子生物學(xué)實驗指導(dǎo)[M].北京:高等教育出版社,2007.)的方法:“取0.2g新鮮植物葉片,在液氮中研磨成粉末狀;轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中,加入 800 ul 細胞提取液(pH 8.0,100 mmol.I/1 Tris.HCl, 5 mmol.L-1 EDTA, 500mmol.Γ1 NaCl,1.25% SDS, 100 ul β-巰基乙醇),充分混勻;65°C水浴保溫20分鐘;從水浴中取出離心管,加入250 ul 5 mol -T1 KCl溶液,混勻,冰浴20分鐘;等”來提取長白山杜鵑的基因組,未能成功提取出其基因組DNA。
發(fā)明內(nèi)容
針對上述不足,本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)對長白山杜鵑基因組DNA提取方法中,基因組提取困難、純度低、易降解的不足,提供一種新的長白山杜鵑基因組DNA提取的方法,從而獲得純度高、穩(wěn)定性強的長白山杜鵑基因組DNA。本發(fā)明是按以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:該方法采用CTAB法與SDS法相結(jié)合,即首先采用CTAB法提取牛皮杜鵑基因組,然后再采用SDS法純化所提取的牛皮杜鵑基因組DNA。該方法的具體步驟如下:
(I )、CTAB法提取牛皮杜鵑基因組DNA:
向提取容器內(nèi)加入CTAB提取緩沖液,預(yù)熱至65 V ;將牛皮杜鵑新鮮葉片在研磨前加入B-巰基乙醇,加入量為CTAB提取緩沖液體積的4.3%V/V,經(jīng)液氮研磨成凍粉狀后迅速加入到上述預(yù)熱的CTAB提取緩沖液中,充分混勻;于65 °C溫浴4小時;然后按常規(guī)方法提取出基因組DNA ;
(2)、結(jié)合SDS法純化所提取的基因組DNA:
向上述CTAB法提取出的牛皮杜鵑基因組DNA溶液中加入1/10體積(SDS體積:基因組DNA溶液體積=1:10) 2%的SDS,冰浴10分鐘;加入1/10體積5 mol.I/1 KAc,冰浴30分鐘;18 1:下12,000 rpm離心10分鐘,取上清液;加入1/20體積2%的SDS,冰浴10分鐘;加入1/20體積5 mol.Γ1 KAc,冰浴30分鐘;離心,取上清液;酚氯仿抽提一次,取上清液;醇沉,洗滌沉淀,溶解沉淀即為純化的牛皮杜鵑基因組DNA。所述的CTAB法提取牛皮杜鵑基因組DNA的具體步驟如下:
取2.0 ml離心管,加入700 ul的CTAB提取緩沖液,65 °C預(yù)熱;取新鮮幼嫩牛皮杜鵑材料0.3 g,研磨前加入30 ul β_巰基乙醇,液氮中研磨成凍粉末狀并迅速將該凍粉轉(zhuǎn)入上述離心管中,充分混勻;水浴中65 °C溫浴4小時;然后按常規(guī)方法提取出牛皮杜鵑基因組DNA粗品;
所述的結(jié)合SDS法純化所提取的基因組的具體步驟如下:
向上述CTAB法提取出的牛皮杜鵑基因組DNA溶液中加入1/10體積2% 的SDS,冰浴10分鐘;加入1/10體積5 mol.Γ1 KAc,冰浴30分鐘;18 1:下12,000 rpm離心10分鐘,取上清液;加入1/20體積2%的SDS,冰浴10分鐘;加入1/20體積5 mol噸―1 KAcJjC浴30分鐘;離心,取上清 液;酚氯仿抽提一次,取上清液;醇沉,洗滌沉淀,溶解沉淀即為純化的牛皮杜鵑基因組DNA。以上牛皮杜鵑基因組DNA提取的方法中,所述的CTAB提取緩沖液是由:2% CTAB,100 mmol.L-1 Tris-HCl pH 8.0, 20mmol.L-1 EDTA,1.4 mol.L-1 NaCl,4% PVP 組成;所述的酚氯仿是苯酚與氯仿按1:1體積比配制而成。本發(fā)明具有以下有益的效果:1、本發(fā)明的牛皮杜鵑基因組提取方法中,首次采取了 CTAB法與SDS法結(jié)合,即CTAB法提取基因組之后,結(jié)合SDS法純化所提取的基因組。2、本發(fā)明的方法對現(xiàn)有的CTAB法和SDS法進行了有創(chuàng)造性的改進,具有突出的實質(zhì)性特點和顯著的進步,具體體現(xiàn)在:
步驟(I) CTAB法提取牛皮杜鵑基因組DNA過程中:較常規(guī)的CTAB法比:CTAB提取緩沖液中的PVP用量增加了 2%,即由2%增加至4% ;研磨前β-巰基乙醇用量較常規(guī)的CTAB法,增加了約I倍,即由2%增加至4.3% ;溫育時間由常規(guī)的CTAB法I小時延長至4小時。步驟(2)結(jié)合SDS法純化所提取的基因組過程中:SDS加量分別為0.2%(1/10體積2%的SDS)與0.1% (1/20體積2%的SDS),且是在基因組提取出來之后單獨加入的,而常規(guī)的SDS法中,SDS的加量為1.25%,且是在基因組提取出來之前混合在細胞提取液中加入的;純化步驟還分別用0.5 mol.1/1與0.25 mol Γ1的KAc代替了常規(guī)SDS法中的1.56mol.L 1 的 KCl。由于CTAB法與SDS法的結(jié)合與改進并用,克服了高山植物基因組與其它多糖、多酚類等次生代謝物難分離的困難。提取得到了用常規(guī)方法不易提取的牛皮杜鵑基因組DNA。3、本發(fā)明的方法與其他植物基因組提取的方法相比,經(jīng)檢測,本發(fā)明獲得的牛皮杜鵑基因組DNA,不僅提取效率高,而且基因組DNA的純度高,不容易降解,為后續(xù)分子生物學(xué)的研究奠定了堅實基礎(chǔ),且操作簡單可行,實用性強。
圖1是海拔2000 m左右的長白山牛皮杜鵑實物照片圖。圖2是長白山極地杜鵑基因組DNA電泳檢測結(jié)果圖,其中1-為試劑盒快速提取的長白山杜鵑基因組DNA,2-為SDS法提取的長白山杜鵑基因組DNA,3,4-均為CTAB-SDS法提取的長白山牛皮杜鵑基因組DNA。
具體實施例方式下面結(jié)合實施案例對本發(fā)明作進一步說明:
一、CTAB-SDS法提取長白山杜鵑基因組DNA
(一)、改進CTAB法提取植物基因組DNA1、取0.4 g左右的長白山牛皮杜鵑新鮮葉片,液氮研磨成粉末狀,置于2 ml離心管中,管中預(yù)先加入700 ul經(jīng)65 °C預(yù)熱的CTAB提取緩沖液(2% CTAB, 100 mmol.Γ1Tris-HCl pH 8.0,20mmol.171 EDTA ;1.4 mol.171 NaCl,4% PVP),研磨前加入30 ul β-巰基乙醇。2、迅速充分混勻后,在水浴鍋中65 °C溫浴4小時,每隔30分鐘輕輕搖勻。3、加等體積(730 ul)的酚:氯仿(I:1)混合液,顛倒混勻混合物,18 0C下12000rpm離心10分鐘;重復(fù)一次。4、取上清液,加3倍體積的無水乙醇,顛倒混勻,-20°C醇沉1-2小時。
5、18°C下12000 rpm離心30分鐘,棄上清液。6、加入I ml 70%乙醇,清洗沉淀,18°C下12000 rpm離心6分鐘;重復(fù)2次。7、棄上清,風(fēng)干沉淀。8、加入適量103 ul (ddH20:胰RNA酶預(yù)混液)(100 ul:3 ul)溶解沉淀,37 0C水浴I小時。9、加入等體積的酚:氯仿(1:1)混合液,顛倒混勻混合物,18 0C下12000 rpm離心10分鐘。10、取上清液,加1/10體積3 mol.I/1 NaAc (pH 5.2),3倍體積的無水乙醇,-200C靜置1-2小時。11、18 0C下12000 rpm離心30分鐘,棄上清液。12、加入I ml 70%乙醇,清洗沉淀,12000 rpm 18 °C離心6分鐘;重復(fù)2次。13、棄上清,風(fēng)干沉淀。 14、加入適量(30-80 ul) (ddH20:胰RNA酶預(yù)混液)溶解沉淀。(二)、結(jié)合SDS法純化植物基因組DNA
15、在上述所提基因組DNA溶液中加入1/10體積2% SDS,冰浴10分鐘。16、加入 I /10 體積 KAc (5mo I /L ),冰浴 30 分鐘。17、18 0C下12000 rpm離心10分鐘,取上清液。18、重復(fù)上述步驟15 —18,但1/10改為1/20。19、加入1/10體積3 mol.L^1NaAc,再加入3倍體積無水乙醇,-20 0C醇沉2小時,有白色絮狀沉淀出現(xiàn)時取出。20,18 0C 下 12000 rpm 離心 30 分鐘,棄上清。21、加入I ml 70%乙醇,清洗沉淀,18 1:下12000 rpm離心6分鐘;重復(fù)2次。22、棄上清,風(fēng)干沉淀,加入20ul ddH20溶解沉淀。23、短期用存于4°C,長期保存存于_20°C。三、瓊脂糖凝膠電泳檢測(見圖2)
用1.2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,電泳緩沖液為1XTAE,上樣緩沖液為10XLoadingBuffer,分子量標準Marker為DL2, 000,記錄點樣順序及點樣量(樣品:5ul,Marker:DL2,000)。用紫外凝膠成像儀在紫外燈312nm下觀察電泳結(jié)果,照相,保存。
權(quán)利要求
1.一種長白山牛皮杜鵑基因組DNA提取的方法,其特征在于:該方法采用CTAB法與SDS法相結(jié)合,即首先采用CTAB法提取牛皮杜鵑基因組DNA,然后再采用SDS法純化所提取的基因組DNA。
2.—種長白山牛皮杜鵑基因組DNA提取的方法,其特征在于:該方法的具體步驟如下: (I )、CTAB法提取牛皮杜鵑基因組DNA: 向提取容器內(nèi)加入CTAB提取緩沖液預(yù)熱至65 V ;將牛皮杜鵑新鮮葉片在研磨前加入β-巰基乙醇,加入量為CTAB提取緩沖液體積的4.3%V/V,經(jīng)液氮研磨成凍粉狀后迅速加入到上述預(yù)熱的CTAB提取緩沖液中,充分混勻;于65 °C溫浴4小時;然后按常規(guī)方法提取出牛皮杜鵑基因組DNA ; (2)、結(jié)合SDS法純化所提取的基因組DNA: 向上述提取出的牛皮杜鵑基因組DNA溶液中加入1/10體積2%的SDS’冰浴10分鐘;加入1/10體積5 mo I.Γ1 KAc,冰浴30分鐘;18 1:下12,000 rpm離心10分鐘,取上清液;加入1/20體積2%的SDS,冰浴10分鐘;加入1/20體積5 mol.L—1 KAc,冰浴30分鐘;離心,取上清液;酚氯仿抽提一次,取上清液;醇沉,洗滌沉淀,溶解沉淀即為純化的牛皮杜鵑基因組DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種長白山牛皮杜鵑基因組DNA提取的方法,其特征在于:該方法的具體步驟如下: (I )、CTAB法提取牛皮杜 鵑基因組DNA: 取2.0 ml離心管,加入700 ul的CTAB提取緩沖液,65 °C預(yù)熱;取新鮮幼嫩牛皮杜鵑材料0.3 g,研磨前加入30 ul β_巰基乙醇,液氮中研磨成凍粉末狀并迅速將該凍粉轉(zhuǎn)入上述離心管中,充分混勻;水浴中65 °C溫浴4小時;然后按常規(guī)方法提取出牛皮杜鵑基因組DNA ; (2)、結(jié)合SDS法純化所提取的基因組: 向上述提取出的牛皮杜鵑基因組DNA溶液中加入1/10體積2%的SDS’冰浴10分鐘;加入1/10體積5 mol.Γ1 KAc,冰浴30分鐘;18 1:下12,000 rpm離心10分鐘,取上清液;加入1/20體積2%的SDS,冰浴10分鐘;加入1/20體積5 mol.L—1 KAc,冰浴30分鐘;離心,取上清液;酚氯仿抽提一次,取上清液;醇沉,洗滌沉淀,溶解沉淀即為純化的牛皮杜鵑基因組DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的牛皮杜鵑基因組DNA提取的方法,其特征在于:所述的CTAB 提取緩沖液是由:2% CTAB, 100 mmol.I/1 Tris-HCl pH 8.0, 20mmol.L-1 EDTA,1.4mol.Γ1 NaCl,4% PVP組成;所述的酚氯仿是苯酚與氯仿按1:1體積比配制而成。
全文摘要
本發(fā)明屬于遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域。公開了一種高山植物長白山牛皮杜鵑基因組DNA提取的方法。該方法首次將CTAB法與SDS法相結(jié)合提取純化長白山牛皮杜鵑基因組DNA,并且提取方法中,CTAB提取緩沖液中的PVP用量為4%,較常規(guī)方法增加了2%; -巰基乙醇用量為4.3%,較常規(guī)方法增加了約1倍;65℃溫浴時間由常規(guī)方法的1小時延長至4小時;并結(jié)合SDS法純化所提取的基因組,成功地提取出了純度高、質(zhì)量好的長白山牛皮杜鵑基因組DNA。本發(fā)明克服了現(xiàn)有高山植物基因組提取困難、提取的基因組純度低、易降解的不足,對于后續(xù)的分子水平研究及高山植物基因組的研究均具有重要意義。
文檔編號C12N15/10GK103074326SQ201210113210
公開日2013年5月1日 申請日期2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月18日
發(fā)明者徐洪偉, 周曉馥, 未曉巍 申請人:吉林師范大學(xué)