專利名稱：一種從林木基因組中高通量開發(fā)ssr標(biāo)記的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從林木基因組中高通量開發(fā)SSR標(biāo)記的方法。
背景技術(shù)：
■ Ι·歹IjM(simple sequence repeat, SSR), iii^itJlM(microsatellite), 是指以廣6個(gè)核苷酸為單位在基因組中多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列(Alikaya M, Bhagwata A, Cregan B. 1992. Length polymorphisms of simple repeat DNA in soybean. Genetics. 132: 1131-1139)。SSR標(biāo)記與其它分子標(biāo)記技術(shù)相比，具有易檢測(cè)、共顯性遺傳、重復(fù)性好、 數(shù)量豐富和多態(tài)性高以及遍布整個(gè)基因組等優(yōu)點(diǎn)，因此在植物遺傳研究的眾多方面受到重視(Schlotterer C .2004. The evolution of molecular markers- just a matter of fashion. Nat Rev Genet. 5: 63-69)。SSR可分為基因組 SSR和 EST-SSR。傳統(tǒng)的基因組 SSR標(biāo)記開發(fā)一般是經(jīng)過基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建、重復(fù)序列克隆的識(shí)別和篩選以及測(cè)序等實(shí)驗(yàn)流程獲得，開發(fā)過程繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)、成本高，而且效率低(Roder MS, Korzun V，Wendehake K, Plaschke J, Tixier ΜΗ, Leroy P, Ganal MW. 1998. A microsatellite map of wheat. Genetics. 149: 2007-2023)。此外，傳統(tǒng)方法開發(fā)的基因組SSR不但數(shù)量較少，而且重復(fù)基序也限制在2 3個(gè)核苷酸，極大地限制了基因組SSR的應(yīng)用范圍(林元震，郭海，黃少偉， 劉純鑫，劉天頤，陳曉陽(yáng).2009. EST-SSR標(biāo)記在木本植物中的開發(fā)和應(yīng)用.植物生理學(xué)通訊.45 (1 : 1221-1225)。近些年來，隨著植物基因組與功能基因組研究的發(fā)展，大規(guī)模植物基因組的測(cè)序，產(chǎn)生了大量的基因組序列，并上傳到核酸公共數(shù)據(jù)庫(kù)，已成為高通量開發(fā)基因組SSR的一種資源。目前，有許多軟件可以預(yù)測(cè)SSR標(biāo)記，比如SSRIT、MISA, SSR Finder和R印eat Masker等(林元震，郭海，黃少偉，劉純鑫，劉天頤，陳曉陽(yáng).2009. EST-SSR標(biāo)記在木本植物中的開發(fā)和應(yīng)用.植物生理學(xué)通訊.45(12) :1221-1225)，但上述軟件均主要用于EST-SSR 的搜索，對(duì)于基因組，尤其是林木基因組，因其數(shù)據(jù)比較龐大，還沒有一種高通量開發(fā)林木基因組SSR標(biāo)記方法的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種高通量開發(fā)SSR標(biāo)記的方法。本發(fā)明另一目的在于提供一種桉樹基因組SSR標(biāo)記。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供利用上述桉樹基因組SSR標(biāo)記得到桉樹SSR多態(tài)性圖譜的方法。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明所提供高通量開發(fā)林木基因組SSR標(biāo)記的方法，包括以下步驟 1)從公共序列庫(kù)中獲取林木基因組序列；2)利用perl語(yǔ)言開發(fā)SSR標(biāo)記預(yù)測(cè)程序htmSSR；
3)采用步驟2)得到的htmSSR程序?qū)Σ襟E1)的林木基因組進(jìn)行SSR標(biāo)記搜索；
4)根據(jù)步驟3)中SSR序列，采用生物信息學(xué)軟件primerf.O，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，再進(jìn)行引物多態(tài)性檢測(cè)，得到多態(tài)性引物，即為基因組SSR標(biāo)記。上述方法中，在步驟2)中的程序htmSSR是利用perl語(yǔ)言開發(fā)的，同時(shí)該程序也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述方法中，在步驟3)中檢索基因組SSR標(biāo)記的同時(shí)也進(jìn)行其上下游序列各 200bp,以供步驟4)設(shè)計(jì)引物所用。上述方法中，在步驟3)后，包括以下步驟根據(jù)步驟3)中的SSR序列，采用生物信息學(xué)軟件primerf.O，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，再進(jìn)行引物多態(tài)性檢測(cè)，得到多態(tài)性引物，即為基因組 SSR標(biāo)記。 上述方法中，所述基因組為林木基因組。上述方法中，所述植物為桉樹。在可獲得林木基因組、葉綠體基因組或一定數(shù)量DNA序列的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的方法適用于所有林木物種基因組SSR標(biāo)記的開發(fā)，具體如桉樹；基因組或DNA序列越豐富，利用本方法開發(fā)標(biāo)記的效果越好。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種基因組SSR標(biāo)記，其中的一條序列如SEQ ID N0:1 所示。上述基因組SSR在構(gòu)建SSR多態(tài)性圖譜中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種桉樹SSR多態(tài)性圖譜。本發(fā)明所提供的桉樹SSR多態(tài)性圖譜，是按照包括以下步驟的方法得到的 提取桉樹的基因組DNA ；
以基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求6中所述的SSR標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，得到桉樹SSR多態(tài)性圖譜。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
在海量且巨大的桉樹基因組序列(691，297，852 bp)中高通量開發(fā)SSR多態(tài)性標(biāo)記， 采用通過htmSSR程序檢索SSR位點(diǎn)的同時(shí)也獲得其兩側(cè)各200bp的序列，用以設(shè)計(jì)引物序列，這樣的策略對(duì)于開發(fā)效率是一個(gè)很關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。以往SSRIT、MISA、SSR Finder和 Repeat Masker等軟件，搜索SSR時(shí)，一般會(huì)有序列長(zhǎng)度限制，對(duì)于基因組如此龐大的序列， 基本運(yùn)行不了。另外，它們搜索到SSR后，仍然保留SSR所在的原序列，對(duì)于EST來說，長(zhǎng)度一般在IOOObp左右，可以直接進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，但如果是基因組序列，尤其是林木基因組， 染色體或scaffold的序列往往超過100Mb，要用于引物設(shè)計(jì)幾乎不可能。本發(fā)明針對(duì)林木染色體或scaffold的序列比較龐大，改變了 SSRIT等SSR常用預(yù)測(cè)軟件的檢索模式，編寫 htmSSR程序，先從基因組中搜索SSR位點(diǎn)，同時(shí)截取其兩側(cè)各200bp的序列，獲得序列長(zhǎng)度約為400bp，降低了過長(zhǎng)序列難以或無(wú)法設(shè)計(jì)引物的難度，從而提高了從基因組數(shù)據(jù)資源中開發(fā)SSR標(biāo)記的效率。
本發(fā)明所提供的標(biāo)記可用于構(gòu)建林木的SSR多態(tài)性圖譜，進(jìn)而用于林木的QTL精細(xì)定位，尋找與其對(duì)應(yīng)的性狀；標(biāo)記也可用于研究林木系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系；此外標(biāo)記還可用來鑒定品種。本發(fā)明的方法沒有林木物種限制性，只要有其基因組序列即可，因此，將有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為桉樹基因組SSR標(biāo)記序列；
圖2為桉樹SSR多態(tài)性圖譜(圖中泳道編號(hào)分別與表1中品種編號(hào)對(duì)應(yīng))。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、高通量獲得桉樹基因組的SSR標(biāo)記一、SSR標(biāo)記的搜索與引物的設(shè)計(jì)
1、獲取桉樹基因組序列從 EucalyptusDB 資源數(shù)據(jù)庫(kù)(http //eucalyptusdb. bi. up. ac. za/)中下載桉樹基因組序列，版本為V1.0 8X，更新時(shí)間為2010年7月30日。2、編寫SSR檢索程序htmSSR
計(jì)算機(jī)配置為windows XP, CPU為E2180，內(nèi)存2G，硬盤200G。程序采用perl語(yǔ)言編寫，perl語(yǔ)言版本為ActivePerl V5. 8. 8. 822。SSR檢索程序htmSSR的代碼如下所示 #！/usr/bin/perl
#Author: YZ Lin, et al.
#Time: 18th 12， 2010
#Program name: htmSSR. pi open (IN, "<$ARGV
"); open (OUT, ">$ARGV
· SSR")；
print OUT 〃SSR_No\tID\tSSR nr. \tSSR type\tSSR\tsize\tstart\tend\n"; open (0UT2, ">$ARGV
· SSRseq"); open (SPECS, 〃 htmSSR. ini〃)； my %typrep； my $amb = 0；
while SPECS
{
%typrep = $1 /(\d+)/gi if (廠def\S*\s+(· *)/i);
if (/"int\S*\s+(\d+)/i) {$amb = $1} }；
my @typ = sort { $a <=> $b } keys %typrep； $/ =">";
my $max—repeats = 1; #count repeats my $min—repeats = 1000； #count repeats
權(quán)利要求
1.一種從林木基因組中高通量開發(fā)SSR標(biāo)記的方法，其特征在于包括如下步驟(1)從公共序列庫(kù)中獲取林木基因組序列；(2)開發(fā)SSR標(biāo)記預(yù)測(cè)程序htmSSR；(3)將htmSSR程序?qū)Σ襟E(1)的林木基因組進(jìn)行SSR搜索；(4)根據(jù)搜索到的SSR序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，經(jīng)引物多態(tài)性檢測(cè)，得到多態(tài)性引物，即為基因組SSR標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從林木基因組中高通量開發(fā)SSR標(biāo)記的方法，其特征在于步驟(2)中所述程序htmSSR是利用perl語(yǔ)言開發(fā)的，perl語(yǔ)言版本為ActivePerl V5. 8. 8. 822。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從林木基因組中高通量開發(fā)SSR標(biāo)記的方法，其特征在于步驟(3)中所述SSR搜索的同時(shí)也對(duì)序列的上下游各200bp進(jìn)行搜索，供設(shè)計(jì)引物用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從林木基因組中高通量開發(fā)SSR標(biāo)記的方法，其特征在于步驟(4)中所述涉及引物是根據(jù)SSR序列，采用生物信息學(xué)軟件primerf. 0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從林木基因組中高通量開發(fā)SSR標(biāo)記的方法，其特征在于所述林木為桉樹。
6.一種桉樹基因組SSR標(biāo)記，其序列如SEQ ID NO: 1所示。
7.權(quán)利要求6所述基因組SSR標(biāo)記在構(gòu)建SSR多態(tài)性圖譜中的應(yīng)用。
8.—種桉樹SSR多態(tài)性圖譜，其特征在于按照如下方法得到(1)提取桉樹的基因組DNA；(2)以步驟(1)所述基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求6所述SSR標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，得到桉樹SSR多態(tài)性圖譜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從林木基因組中高通量開發(fā)SSR標(biāo)記的方法，具體包括如下步驟(1)從公共序列庫(kù)中獲取林木基因組序列；(2)開發(fā)SSR標(biāo)記預(yù)測(cè)程序htmSSR；(3)將htmSSR程序?qū)Σ襟E(1)的林木基因組進(jìn)行SSR搜索；(4)根據(jù)搜索到的SSR序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，經(jīng)引物多態(tài)性檢測(cè)，得到多態(tài)性引物，即為基因組SSR標(biāo)記。本發(fā)明所述方法與傳統(tǒng)方法相比，開發(fā)效率提高4~6倍，極大減少了工作量和財(cái)力消耗，縮短了研發(fā)時(shí)間，降低了開發(fā)成本，同時(shí)可為林木高精度的遺傳連鎖圖、精確的品種鑒定等研究提供了大量的有效SSR標(biāo)記。本發(fā)明方法對(duì)林木沒有特異性，只要該物種基因組已經(jīng)測(cè)序，即可采用本發(fā)明方法，故具有廣泛的適用性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102226178SQ201110123288
公開日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月13日
發(fā)明者劉純鑫, 林元震, 莫曉勇, 陳曉陽(yáng) 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)