專利名稱：小麥矮稈基因串聯(lián)重復(fù)片段及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小麥矮桿基因串聯(lián)重復(fù)片段及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
上個(gè)世紀(jì)60年代，由于小麥的矮桿基因在小麥生產(chǎn)中的廣泛利用，使得小麥產(chǎn)量有了大幅度地提高，因此，小麥的矮桿基因Rht-Blb和Rht-Dlb被稱為“綠色革命”基因。在小麥中發(fā)現(xiàn)了 21個(gè)矮桿基因，從Rht I到Rht21 (http: / / wheat, pw. usda. gov/GG2/Triticum/wgc/2008/GeneSymbol. pdf)，其中四個(gè)，Rht-Blb (Rhtl), Rht-Blc (Rht3)，Rht-Dlb (Rht2)以及Rht-Dlc(RhtlO)是對赤霉素不敏感的，其余的基因?qū)Τ嗝顾孛舾?。Rht-Blb和Rht-Dlb分別定位在4BS和4DS上，這兩個(gè)基因被廣泛地應(yīng)用到小麥育種中。Rht-Blb和Rht-Dlb克隆后，發(fā)現(xiàn)它們編碼DELLA蛋白，而DELLA蛋白是赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個(gè)負(fù)調(diào)控因子，抑制植物的生長。當(dāng)赤霉素缺失的時(shí)候，DELLA蛋白抑制著赤霉素 相應(yīng)的基因，導(dǎo)致了依賴赤霉素成長的植株生長緩慢；相反，當(dāng)有赤霉素的時(shí)候，GA信號通過一種尚未發(fā)現(xiàn)的磷酸酶和SCFsm的復(fù)合體誘導(dǎo)了 DELLA蛋白的磷酸化，從而使得DELLA蛋白被泛素化進(jìn)一步被26S蛋白體降解。當(dāng)DELLA蛋白部分缺失而變得很難降解時(shí)，比如擬南芥中的gai，它缺失了接近N端的17個(gè)氨基酸殘基，植株就會表現(xiàn)出矮桿。在Rht-Dlb中有一個(gè)T到G堿基的突變，使得E61 (GGA)翻譯成了終止密碼子(TGA)，從而導(dǎo)致了 N端的缺失，含有該基因的植株也表現(xiàn)出半矮桿。除了缺失突變會造成矮桿現(xiàn)象以外，過量表達(dá)DELLA蛋白也會造成很強(qiáng)的致矮作用。低表達(dá)量的gal造成了輕微的矮化，而高表達(dá)量的gal則更大程度的矮化了株高，甚至是沒有突變的GAI過量表達(dá)，也會有一定的降低株高的作用。矮變一號是西安農(nóng)科所發(fā)現(xiàn)的一個(gè)自然突變體，株高只有25cm左右，是世界上最矮的小麥之一。矮變一號中的強(qiáng)降桿是Rht-Dlc(RhtlO)這個(gè)基因在起著作用，而這個(gè)基因被定位在4D染色體的短臂上，與Rht-Dlb是等位基因。在所有的小麥矮桿基因中，Rht-Dlc是降桿能力最強(qiáng)的一個(gè)。除了科學(xué)上的重要性，Rht-Dlc在小麥育種上也有重要的價(jià)值。ms2是完全顯性的雄性不育基因，也定位在4D短臂上。劉秉華研究員將ms2和Rht-Dlc整合到了一起育成了著名的矮敗小麥，敗育的小麥同時(shí)具有矮桿和不育的表型，而高桿的后代是可育的。正因?yàn)椴挥男←準(zhǔn)前珬U，因此在育種工作中很容易識別和授粉，尤其在輪回選擇育種中。矮敗小麥已經(jīng)被證明是很有價(jià)值的育種材料，利用該材料目前已培育出了 42個(gè)新的小麥品種，推廣面積I. 85億畝，增產(chǎn)小麥56億公斤，創(chuàng)造了重大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供小麥矮桿基因串聯(lián)重復(fù)片段形成的DNA分子。該DNA分子能夠極強(qiáng)的降低小麥株高。本發(fā)明所提供的DNA分子，名稱為Rht-Dlb: : Rht-Dlb，來源于小麥，是由兩個(gè)以上(如兩個(gè))的DNA片段串聯(lián)而成的分子，具體可為如下I)或2)或3)的片段I)是如下I或II或III的DNA片段I由序列表中序列I的第2218-4089位(Rht-Dlb基因)所示的核苷酸序列組成的DNA片段；II由序列表中序列I的第1-4089位(Rht-Dlb啟動子和Rht-Dlb基因)所示的核苷酸序列組成的DNA片段；III由序列表中序列I所示的核苷酸序列組成的DNA片段；2)與I)限定的DNA的序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具 有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性；3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交的分子。序列表中序列I的第1-2217位為啟動子、第2218-4089位為Rht-Dlb基因、第4358-5152 位為 polyA。所述嚴(yán)格條件可為如下50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0· 5M Na3PO4和ImMEDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2XSSC，0. I % SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS、0. 5MNa3POjP ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，I X SSC，O. I % SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS,O. 5M Na3PO4和 ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，O. 5X SSC, O. 1% SDS 中漂洗；還可為50°C，在 7% SDS,O. 5M Na3POjP ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，O. I X SSC,
O.1% SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS,O. 5M Na3POjP ImM EDTA的混合溶液中雜交，在65°C，0. I XSSC,O. 1% SDS中漂洗；也可為在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用 2 X SSC, O. 1% SDS 和 I X SSC, O. 1% SDS 各洗膜一次。含有所述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或重組病毒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述DNA分子的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pROKII、pBin438、PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa 或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用所述DNA分子構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動子(如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、玉米的泛素啟動子(Ubiquitin))、組成型啟動子或組織特異表達(dá)啟動子(如種子特異表達(dá)的啟動子)，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的DNA分子構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標(biāo)記基因(如賦予對卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptll基因，賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因,和賦予對methatrexate抗性的dhfr基因,賦予對草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。所述重組載體具體可為pRht-DIb: Rht-Dlb: :pRht_Dlb:Rht_Dlb。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將所述DNA分子導(dǎo)入目的植物中，得到株高低于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。所述目的植物具體可為單子葉植物或雙子葉植物，如小麥。 所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述DNA分子轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該DNA分子，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該DNA分子轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述DNA分子可先進(jìn)行如下修飾，再導(dǎo)入宿主中，以達(dá)到更好的表達(dá)效果I)根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達(dá)；例如，可根據(jù)受體植物所偏愛的密碼子，在保持本發(fā)明所述核苷酸序列編碼的氨基酸的同時(shí)改變其密碼子以符合植物偏愛性；優(yōu)化過程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地實(shí)現(xiàn)植物中導(dǎo)入基因的高水平表達(dá)，其中GC含量可為35 %,優(yōu)選為多于45 %,更優(yōu)選為多于50%，最優(yōu)選多于約60% ；2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列進(jìn)行修飾；3)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明DNA分子的表達(dá)效率；例如來源于CaMV的tml，來源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明DNA分子進(jìn)行連接。4)引入增強(qiáng)子序列，如內(nèi)含子序列(例如來源于Adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序列(例如來源于TMV，MCMV和AMV)。在實(shí)際操作中，也可以將本發(fā)明DNA分子進(jìn)行細(xì)胞靶向定位。可利用本領(lǐng)域現(xiàn)有的技術(shù)實(shí)現(xiàn)。例如，將來源于靶向細(xì)胞器的靶基因序列與本發(fā)明DNA分子序列融合，再導(dǎo)入植物細(xì)胞中，就可定位了?？梢詥覴ht-Dlb基因表達(dá)的啟動子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。該啟動子,是如下a)或b)的DNA分子a)其核苷酸序列是序列表中序列I第1-2217位所示的DNA分子；b)與a)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有啟動子活性的DNA分子。本發(fā)明的小麥矮桿基因串聯(lián)重復(fù)片段形成的DNA分子可以顯著降低小麥株高。實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)入Rht-Dlb: =Rht-Dlb基因的Bobwhite和CB037的T1代植株中純合的Rht-Dlb: :Rht-Dlb植株的株高平均只有12cm，降桿率為78%。


圖I為T1代轉(zhuǎn)基因Bobwhite的株高表型(A)以及Rht-Dlb的表達(dá)量(B)0其中的I為純合的雙拷貝Rht-Dlb (Rht-Dlb: : Rht-Dlb)單株，2為雜合的雙拷貝Rht-Dlb (Rht-Dlb: : Rht-Dlb)單株，3為雜合的單拷貝Rht-Dlb單株，4為野生型的Bobwhite0圖2為矮變一號及其近等基因系的株高。其中，I為矮變一號，2為矮敗/中國春中的矮株，3為矮敗/中國春中的半矮株，4為中國春。圖3為Rht-Dlb分子標(biāo)記與含有Rht-Dlb或Rht-Dlc材料之間的關(guān)系。A圖為Rht-Dlb分子標(biāo)記在含有Rht-Dlb或Rht-Dlc材料中的擴(kuò)增，其中I為矮變一號，2為矮敗/中國春中的矮株，3為矮敗/中國春中的半矮株，4為中國春，5為蚰包；B圖為Rht-Dlb分 子標(biāo)記與矮敗/中國春近等基因系中株高為60cm左右的矮桿表型共分離；C圖為Rht-Dlb分子標(biāo)記與矮敗/中國春近等基因系中株高為85cm左右的半矮桿表型共分離。圖4為Rht-Dlb在矮變一號及其近等基因系等材料中的拷貝數(shù)。A圖為通過EcoRV酶切，Rht-Dlb為探針的Southern blotting(箭頭所指的為4D條帶)，其中的I為矮變一號，2為矮敗/中國春中的矮株，3為矮敗/中國春中的半矮株，4為中國春，5為農(nóng)林10號，6 為 CS N4AT4B，7 為 CS mono4BT24A，8 為 CS N4DT4B ；B 圖為通過 real-timePCR 檢測矮變一號等材料中Rht-Dlb的拷貝數(shù)，其中以500701ike gene序列為內(nèi)參基因，其中的I為矮變一號，2為矮敗/中國春中的矮株，3為矮敗/中國春中的半矮株，4為中國春。圖5為Southern blot結(jié)果檢測出的大片段重復(fù)區(qū)域。圖6為以中國春為參照的Rht-Dlb基因的表達(dá)差異。其中的I為矮變一號，2為矮敗/中國春近等基因系中的矮株，3為矮敗/中國春近等基因系中的半矮株，4為中國春。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I、利用串聯(lián)的兩個(gè)Rht-Dlb即Rht-Dlb: :Rht-Dlb培育矮桿轉(zhuǎn)基因小麥I、構(gòu)建轉(zhuǎn)小麥的表達(dá)載體(含有單拷貝Rht-Dlb的表達(dá)載體pRht-D IbiRht-Dlb和含有雙拷貝Rht-Dlb的表達(dá)載體pRht-Dlb:Rht-Dlb: :pRht_Dlb:Rht-Dlb的構(gòu)建)將Rht-Dlb基因序列前面連接其啟動子區(qū)域后面連接來自pJIT163載體(http://www. pgreen, ac. uk/JIT/pJIT163. gb)的 polyA 整合成一個(gè) Rht-Dlb 表達(dá)單元。我們一共構(gòu)建了兩個(gè)載體，都是將片段整合在PCAMBIA2200 (CAMBIA)載體上，其中一個(gè)稱為單拷貝載體，只含有一個(gè)上述的單元，另一個(gè)稱為雙拷貝載體，含有兩個(gè)上述的單元，以串聯(lián)的形式連接在一起。構(gòu)建單拷貝載體時(shí)，首先在啟動子(2217bp)的上游引物接上一個(gè)Kpn I的接頭，在Rht-Dlb基因(1872bp)下游引物接上一個(gè)SbfI的接頭，在polyA(795bp)的上游引物接上一個(gè)SbfI接頭，下游引物接上一個(gè)Kpn I的接頭。在啟動子和Rht-Dlb基因的連接處存在一個(gè)Hindi 11酶切位點(diǎn)，通過這個(gè)酶切位點(diǎn)，將擴(kuò)增的啟動子和基因連接在一起，并整合到同時(shí)被Kpn I和SbfI雙酶切的載體pCAMBIA2200中，通過質(zhì)粒在大腸桿菌中的擴(kuò)增而富集。再通過Kpn I和SbfI雙酶切將上述載體中的啟動子和基因的片段切下來，再與polyA的片段相連，成為一個(gè)含有啟動子，Rht-Dlb基因和polyA的大片段，除去大片段兩端的Kpn I的接頭該片段的長度為5152bp (其核苷酸序列如序列表中的序列I)。將序列I的5152bp連同兩端Kpn I的接頭插入pCAMBIA2200的Kpn I位點(diǎn)得到含有單拷貝Rht-Dlb的表達(dá)載體pRht-Dlb = Rht-Dlb。序列表中序列I的第1-2217位為啟動子、第2218-4089位為Rht-Dlb基因、第4358-5152位為polyA。表達(dá)載體pRht_DIb:Rht-Dlb構(gòu)建的具體方法如下(I)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室篩選的矮敗/中國春BAC文庫中的1J9上Rht2 (Rht-Dlb)上游序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增Rht2 (Rht-Dlb)基因的啟動子序列，并在該上游引物加上一個(gè)Kpn I的接頭，產(chǎn)物長度2229bp。
上游引物L(fēng)9GGTACCTACGCGTTGGAATGCTGGACAA Tm60. 5 °C下游引物L(fēng)7O-R CTTCATGATCCGCGAGCTATm55°C(2)根據(jù)BAC 1J9上Rht2 (Rht-Dlb)附近的序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增Rht2 (Rht-Dlb)基因的全長序列，并在該下游引物加上一個(gè)SbfI的接頭，產(chǎn)物長度2212bp (此處擴(kuò)增的是包含 Rht-Dlb 1872bp 的片段)。上游引物L(fēng)71-F GGAACCGAGGCAAGCAATm 57°C下游引物L(fēng)13-R CCTGCAGGGGATTACATTACTACATGCCGGT Tm 59 V(3)根據(jù)PJIT163載體的polyA的序列設(shè)計(jì)，并在該上游引物加上一個(gè)SbfI的接頭，在下游引物上加上一個(gè)Kpn I的接頭，產(chǎn)物長度809bp(含接頭)。上游引物Sbfl-polyA-F CCTGCAGGATGGCGTGCAGGTCGACT Tm 53°C下游引物DpnI-po IyA-R GGTACCGATCTCTCGAGGATATCGC Tm 50 V(4)回收上述三種片段(全式金EG101)。(5)連接上述三種片段的回收產(chǎn)物到T載體上，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(全式金 CB111)。(6)提質(zhì)粒，分別測序上述三種片段的單克隆，選取序列完全正確的單克隆。(7)將啟動子區(qū)用 Kpn I 和 HindIII 雙酶切，Rht2 (Rht-Dlb)用 SbfI 和 HindIII雙酶切，polyA用Kpn I和SbfI雙酶切。(8)回收酶切片段。(9)將回收的啟動子與Rht2 (Rht-Dlb)連接。(10)再將(9)中這個(gè)大約4500bp的片段連接在已經(jīng)被Kpn I和Sbf I雙酶切的載體pCAMBIA2200上，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中。(11)大量提取(10)中的質(zhì)粒，Kpn I和Sbf I雙酶切該質(zhì)粒，回收酶切片段，使酶切片段的量達(dá)到連接的水平。(12)連接(11)中的片段和Kpn I和Sbf I雙酶切后的polyA，形成一個(gè)5kb大小左右的大片段，將連接的片段回收，再與Kpn I單酶切的載體PCAMBIA2200再連接，得到含有單拷貝Rht-Dlb的表達(dá)載體pRht-Dlb:Rht-Dlb。該載體pRht_Dlb:Rht-Dlb含有由啟動子、Rht-Dlb基因和polyA組成的長度為5152bp (其核苷酸序列如序列I)的大片段。將該5152bp的DNA片段命名為單拷貝Rht-Dlb表達(dá)盒用“Rht-Dlb”表示。將載體pRht-Dlb: Rht-Dlb 轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5 α。序列表中的序列I的第1-2217位為啟動子、第2218-4089位為Rht-Dlb基因、第4358-5152 位為 polyA。
構(gòu)建雙拷貝載體pRht-DIb:Rht-Dlb: :pRht-DIb:Rht-Dlb時(shí)，一方面將上述的單拷貝載體pRht-DIb = Rht-Dlb用Kpn I完全酶切，回收含有啟動子、Rht-Dlb基因和polyA的大片段，另一方面將單拷貝載體pRht-Dlb: Rht-Dlb用Kpn I不完全酶切，即只將單拷貝載體pRht-D lb: Rht-Dlb由環(huán)形的質(zhì)粒切成帶有Kpn I粘性末端的線性質(zhì)粒,最后將回收的大片段與這線性的質(zhì)粒連接起來，獲得的載體含有兩個(gè)串聯(lián)的5152bp片段，該載體為pRht-DIb: Rht-Dlb: : pRht-DIb: Rht-Dlb。將pRht-Dlb: Rht-Dlb: : pRht-DIb: Rht-Dlb 中所含的由兩個(gè)5152bp DNA片段(其核苷酸序列如序列I)通過Kpn I位點(diǎn)串聯(lián)形成的雙拷貝命名為雙拷貝 Rht-Dlb 表達(dá)盒用 “Rht-Dlb::Rht-Dlb” 表示。2、小麥的農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化將構(gòu)建好的載體pRht-DIb: Rht-Dlb 和 pRht-Dlb: Rht-Dlb: :pRht_Dlb:Rht_DIb 分別轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens strain C58C1) (Ashby A. Μ.,Watson M. D. ,Loake GJ. ,et al. , Ti plasmid-specified chemotaxis of Agrobacterium tumefaciens C58Cltoward vir—inducing phenolic compounds and soluble factorsfrom monocotyledonous anddicotyledonous plants. J Bacteriol,1988. 170(9)4181-7.),以農(nóng)桿菌侵染的方式轉(zhuǎn)入普通小麥Bobwhite (Weeks JT, Anderson OD, BlechlAE. Rapid Production of MultipleIndependent Lines of Fertile TransgenicWheat(Triticum aestivum). Plant Physiol. 1993,102(4) 1077-1084. http://genbank.vurv. cz/wheat/pedigree/krizeni2. asp id = 8104)(本身不含 Rht-Dlb)和 CBO37 (韓曉峰，葉興國，劉曉蕾，魏亦勤，杜麗璞，王軻，佘茂云，樊明，晏月明.小麥花藥培養(yǎng)后代和雜交后代中高分子量麥谷蛋白亞基變異分析.植物遺傳資源學(xué)報(bào)2010，11 (6) :6712677.)(自身帶有Rht-Dlb)中。表達(dá)載體構(gòu)建完成后，經(jīng)過酶切與測序驗(yàn)證其正確性后，取1μ I構(gòu)建好的表達(dá)載體質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入20μ 1C58C1農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，然后用ImlYEB液體培養(yǎng)基28 V 250rpm恢復(fù)培養(yǎng)3h，取10 μ I菌液涂布于YEB抗性平板上(氯霉素50mg/L，利福平Rif 50mg/L)，于28°C培養(yǎng)2 3天。提取農(nóng)桿菌的質(zhì)粒進(jìn)行目標(biāo)基因的PCR檢測，陽性菌液保存于-70°C超低溫冰箱中備用。將陽性菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，然后侵染小麥品種Bobwhite和CB037的幼胚愈傷組織，用G418抗性篩選愈傷，并進(jìn)一步培養(yǎng)分化成幼苗，然后移栽大田。3、陽性轉(zhuǎn)化植株的鑒定及后代株高表型調(diào)查通過PCR檢測得知，127株Ttl代Bobwhite中有15株(12% )為陽性植株，107株TtlRCBOS 中有24株(22% )為陽性單株(表I)。結(jié)果表明，Ttl代中，Rht-Dlb:: Rht-Dlb所形成降桿效應(yīng)大約為33-34%，大大降低了株高。鑒定Ttl 和 T1 是通過弓丨物 polyA :5’ -ATGGCGTGCAGGTCGACT-3’ 和5’ -GATCTCTCGAGGATATCGC-3’ 鑒定。表I Ttl代植株的株高
權(quán)利要求
1.DNA分子，是由兩個(gè)以上的DNA片段串聯(lián)而成的分子，其特征在于所述DNA片段為如下I)或2)或3)的片段 1)是如下I或II或III的DNA片段 I由序列表中序列I的第2218-4089位所示的核苷酸序列組成的DNA片段； II由序列表中序列I的第1-4089位所示的核苷酸序列組成的DNA片段； III由序列表中序列I所示的核苷酸序列組成的DNA片段； 2)與I)限定的DNA的序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交的分子。
2.含有權(quán)利要求I所述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或重組病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為將所述DNA分子插入pCAMBIA2200得到的重組表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的重組載體，其特征在于所述重組載體中，啟動權(quán)利要求I所述DNA分子轉(zhuǎn)錄的啟動子為如下a)或b)的啟動子 a)其核苷酸序列是序列表中序列I第1-2217位所示的DNA分子； b)與a)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有啟動子活性的DNA分子。
5.ー種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求I所述的DNA分子導(dǎo)入目的植物中，得到株高低于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述單子葉植物為小麥。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于權(quán)利要求I所述的DNA分子通過權(quán)利要求2-4中任一所述的重組載體導(dǎo)入目的植物中。
9.ー種DNA分子，是如下a)或b)的DNA分子 a)其核苷酸序列是序列表中序列I第1-2217位所示的DNA分子； b)與a)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有啟動子活性的DNA分子。
10.含有權(quán)利要求9所述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或重組病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小麥矮稈基因串聯(lián)重復(fù)片段及其應(yīng)用。該DNA分子是由兩個(gè)以上的如下I或II或III的DNA片段串聯(lián)而成的分子I由序列表中序列1的第2218-4089位(Rht-D1b基因)所示的核苷酸序列組成的DNA片段；II由序列表中序列1的第1-4089位(Rht-D1b啟動子和Rht-D1b基因)所示的核苷酸序列組成的DNA片段；III由序列表中序列1所示的核苷酸序列組成的DNA片段。本發(fā)明的小麥矮稈基因串聯(lián)重復(fù)片段形成的DNA分子可以顯著降低小麥株高。
文檔編號C12N5/10GK102776179SQ20111012313
公開日2012年11月14日 申請日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月12日
發(fā)明者孔秀英, 李異媛, 肖建會, 賈繼增 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所