專利名稱：類(lèi)人膠原蛋白基因、其不同重復(fù)數(shù)的同向串聯(lián)基因、含有串聯(lián)基因的重組質(zhì)粒及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)涉及一種類(lèi)人膠原蛋白基因，還涉及該 基因的不同重復(fù)數(shù)的串聯(lián)基因，以及含有串聯(lián)基因的重組質(zhì)粒及重組質(zhì)粒的制備方法。
二
背景技術(shù)：
膠原蛋白(也稱膠原)是動(dòng)物體中含量最豐富的一類(lèi)蛋白質(zhì)家族。膠原蛋白具有 很強(qiáng)的生物活性及生物功能，能參與細(xì)胞的遷移、分化和繁殖，使結(jié)締組織具有機(jī)械 強(qiáng)度，同時(shí)膠原蛋白還能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，具有止血、生物相容性和生物降解性能?；?于這些特性，膠原蛋白在燒傷、創(chuàng)傷、眼角膜疾病、保健、美容、矯形、硬組織修復(fù)、 創(chuàng)面止血、藥物傳遞、緩釋技術(shù)等醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。另外，膠原蛋白也 可作為食品添加劑、飼料添加劑、絮凝劑、照相乳膠材料、表面活性劑和固定化酶載 體材料等應(yīng)用于各個(gè)工業(yè)和實(shí)驗(yàn)室領(lǐng)域。
目前，膠原蛋白的生產(chǎn)主要是利用酸、堿法處理動(dòng)物來(lái)源的組織(豬皮、牛皮、 驢皮、魚(yú)皮等)，從中提取膠原蛋白。但所得到的產(chǎn)品成分復(fù)雜，主要應(yīng)用于飼料添加 及微生物發(fā)酵培養(yǎng)基。四川銘讓生物科技有限公司采用生物酶定向剪切技術(shù)，生產(chǎn)的 膠原蛋白組成穩(wěn)定，具有生物活性。但以上這些方法得到的膠原蛋白產(chǎn)品都有一定的 病毒隱患(如瘋牛病、口蹄疫、豬瘟疫、禽流感等)，特別是應(yīng)用于人體時(shí)易引起異體 異種的排異反應(yīng)，從而限制了膠原蛋白在醫(yī)藥方面的應(yīng)用。
隨著DNA重組技術(shù)迅速發(fā)展，為了能充分利用膠原蛋白的優(yōu)良特性，科研工作者 開(kāi)始尋求動(dòng)物本身以外的膠原蛋白來(lái)源。有許多學(xué)者利用基因工程技術(shù)，選用各種宿 主細(xì)胞(包括哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、酵母、大腸桿菌、轉(zhuǎn)基因煙草、轉(zhuǎn)基因鼠、轉(zhuǎn)基因
蠶細(xì)胞等)，生產(chǎn)重組人膠原蛋白，產(chǎn)品具有安全性好、重現(xiàn)性好、質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。 但是，同樣存在著許多不足和困難。如絹絲腺能分泌人膠原蛋白的轉(zhuǎn)基因蠶，生產(chǎn)的
人膠原蛋白長(zhǎng)度僅有真正的人膠原蛋白全長(zhǎng)的1/5，且含量只有1%左右?？傮w來(lái)說(shuō)，
表達(dá)量不高、生產(chǎn)周期長(zhǎng)和培養(yǎng)難度大、成本高是以高等動(dòng)植物細(xì)胞為宿主時(shí)普遍存 在的問(wèn)題，且不能滿足產(chǎn)業(yè)化、大批量生產(chǎn)的要求。而細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)普遍存產(chǎn)生的致 熱原致使表達(dá)產(chǎn)物難以應(yīng)用于臨床；表達(dá)的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，致產(chǎn)物純化困 難；原核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后加工修飾體系不完善，表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低等不足。
三

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種類(lèi)人膠原蛋白基因Gel。
本發(fā)明的目的還在于提供一種類(lèi)人膠原蛋白基因進(jìn)行不同重復(fù)數(shù)同向串聯(lián)所獲的 基因。
本發(fā)明的目的還在于提供一種類(lèi)人膠原蛋白基因不同重復(fù)數(shù)同向串聯(lián)基因的重組 質(zhì)粒。
本發(fā)明的目的還在于提供一種制備上述的不同重復(fù)數(shù)同向串聯(lián)基因重組質(zhì)粒的方法。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)解決方案 一種類(lèi)人膠原蛋白基因，其堿基序列如序列表
中SEQIDNO: 1所示，艮卩
其核酸長(zhǎng)度為322bp。
一種含有上述的類(lèi)人膠原蛋白基因的重組質(zhì)粒。
一種對(duì)上述的類(lèi)人膠原蛋白基因進(jìn)行不同重復(fù)數(shù)同向串聯(lián)所獲的基因。
一種與上述的堿基序列至少有70%同一性的基因。
本發(fā)明類(lèi)人膠原蛋白基因不同重復(fù)數(shù)同向串聯(lián)基因，其堿基序列如序列表中SEQ ID NO: 2所示，或其堿基序列如序列表中SEQIDNO: 3所示，或其堿基序列如序 列表中SEQIDNO: 4所示，其中SEQIDNO: 4編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列 表中SEQIDNO: 5所示。
一種含有上述的類(lèi)人膠原蛋白基因不同重復(fù)數(shù)同向串聯(lián)基因的重組質(zhì)粒。 本發(fā)明的重組質(zhì)粒，它是可在宿主中復(fù)制和生存的表達(dá)質(zhì)粒。 一種制備上述的不同重復(fù)數(shù)同向串聯(lián)基因重組質(zhì)粒的方法，包括以下步驟
① 選擇一對(duì)同尾酶，使其位于目的基因單體的兩端，即堿基序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示的類(lèi)人膠原蛋白基因的兩端；設(shè)計(jì)包含上述同尾酶識(shí)別位點(diǎn)的接頭DNA 片斷；
② 將用上述一對(duì)同尾酶酶切得到的目的基因單體進(jìn)行體外連接；
③ 歩驟②得到的連接產(chǎn)物利用接頭DNA片斷，直接連入己含有目的基因單體的 質(zhì)粒，獲得重復(fù)數(shù)兩個(gè)或兩個(gè)以上的重組質(zhì)粒；
將歩驟③重復(fù)數(shù)的質(zhì)粒進(jìn)行重復(fù)數(shù)翻倍的連接，獲得含有目的基因單體的重復(fù) 數(shù)較高的重組質(zhì)粒；
⑤將歩驟④重復(fù)數(shù)較高的重組質(zhì)粒繼續(xù)進(jìn)行重復(fù)數(shù)翻倍的連接，構(gòu)建含有目的基 因單體的重復(fù)數(shù)更高的重組質(zhì)粒；
◎?qū)?gòu)建好的適當(dāng)重復(fù)數(shù)的串聯(lián)基因克隆到選定的表達(dá)質(zhì)粒中，獲得可以轉(zhuǎn)化宿 主細(xì)胞用于表達(dá)的重組質(zhì)粒。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點(diǎn)是(1)設(shè)計(jì)的類(lèi)人膠原蛋白基因Gd是全 新的序列，且長(zhǎng)度上大大少于天然人膠原蛋白基因(數(shù)Kbp)，實(shí)現(xiàn)了在分子水平的操 作簡(jiǎn)單化，更易實(shí)現(xiàn)膠原蛋白的基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)；(2)該類(lèi)人膠原蛋白基因Gd 同時(shí)包含天然人膠原蛋白基因的特征，其表達(dá)得對(duì)應(yīng)類(lèi)人膠原蛋白將具有天然人膠原 蛋白的優(yōu)良特征；(3)在類(lèi)人膠原蛋白的分子長(zhǎng)度方面，通過(guò)制備不同重復(fù)數(shù)同向串 聯(lián)基因重組質(zhì)粒力求在進(jìn)一步的酵母表達(dá)研究中實(shí)現(xiàn)接近較大的分子量的天然人膠原 蛋白的類(lèi)人膠原蛋白的表達(dá)生產(chǎn)；(4)該種不同重復(fù)數(shù)同向串聯(lián)基因重組質(zhì)粒的制備 方法，僅僅通過(guò)簡(jiǎn)單的體外酶切連接反應(yīng)和具有成熟技術(shù)的原核轉(zhuǎn)化和篩選，實(shí)現(xiàn)了 任意重復(fù)數(shù)的目的基因(類(lèi)人膠原蛋白基因Gd)的串聯(lián)連接；(5)該法比較現(xiàn)有的許 多應(yīng)用PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)重復(fù)更具有可行性和更易獲得成功，避免了達(dá)到重復(fù)串聯(lián)基因目 的PCR操作中需要的高難度的引物設(shè)計(jì)和條件探索工作。
四


圖1是本發(fā)明重復(fù)串聯(lián)類(lèi)人膠原蛋白基因重組質(zhì)粒的酶切電泳圖。 圖2是本發(fā)明重組質(zhì)粒pPIC9KG6的EcoRI和Notl雙酶切電泳圖。
五
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的類(lèi)人膠原蛋白基因，其堿基序列如序列表中SEQIDNO: 1所示，即:
其核酸長(zhǎng)度為322bp，命名為Gel。
結(jié)合圖1，本發(fā)明含有上述的類(lèi)人膠原蛋白基因的重組質(zhì)粒。將類(lèi)人膠原蛋白基因 Gel克隆于質(zhì)粒pUC57的Smal位點(diǎn)，得到的重組質(zhì)粒命名為pUC57Gel。重組質(zhì)粒 pUC57Gel的EcoRI單酶切電泳結(jié)果見(jiàn)附圖1的泳道2，其中泳道l、 5為DNA分子量 標(biāo)準(zhǔn)DL15000 (購(gòu)于大連寶生物工程有限公司)。
對(duì)堿基序列如序列表中SEQIDNO: 1所示的類(lèi)人膠原蛋白基因進(jìn)行兩個(gè)或兩個(gè) 以上的不同重復(fù)數(shù)同向串聯(lián)而獲得的基因。例如重復(fù)數(shù)分別為2， 3， 6的類(lèi)人膠原蛋 白基因同向串聯(lián)基因的堿基序列如序列表中SEQIDNO: 2， 3, 4所示，核酸長(zhǎng)度分 別為619bp， 900bp， 2106bp。
本發(fā)明還包括堿基序列至少與序列表中SEQIDNO: 1， 2, 3， 4所示的堿基序列 有70%同一性的基因。
本發(fā)明類(lèi)人膠原蛋白基因六重復(fù)數(shù)同向串聯(lián)基因，其堿基序列如序列表中SEQID NO: 4所示，它編碼的類(lèi)人膠原蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO: 5所示。 該類(lèi)人膠原蛋白的氨基酸長(zhǎng)度為696個(gè)氨基酸，分子量約為65Ku，等電點(diǎn)為4.5。
本發(fā)明含有類(lèi)人膠原蛋白基因不同重復(fù)數(shù)同向串聯(lián)基因的重組質(zhì)粒。將類(lèi)人膠原 蛋白基因不同重復(fù)數(shù)的同向串聯(lián)基因克隆到各種質(zhì)粒中可以得到不同的重組質(zhì)粒，例 如pPIC9KG6。
上述的重組質(zhì)?？稍谒拗髦袕?fù)制和生存的表達(dá)質(zhì)粒。例如pUC57Gel， pPIC9KG6 等，真核的表達(dá)質(zhì)粒為pPIC9K、 pCDNA3.0等，原核的表達(dá)質(zhì)粒為pUC18、 pET32等。 即將類(lèi)人膠原蛋白基因Gel，類(lèi)人膠原蛋白基因的重復(fù)數(shù)為2， 3， 4， 6等的同向串聯(lián) 基因克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K或pCDNA3.0，原核表達(dá)質(zhì)粒為pUC18或pET32后
得到的重組質(zhì)粒。
以下實(shí)施例說(shuō)明不同重復(fù)數(shù)同向串聯(lián)基因重組質(zhì)粒的制備方法，任何欲進(jìn)行重復(fù) 同向串聯(lián)的DNA片段(基因)都可以通過(guò)這樣的制備方法達(dá)到構(gòu)建含有不同重復(fù)數(shù)基 因、并同向串聯(lián)的重組質(zhì)粒。質(zhì)粒包括任何可以在大腸桿菌、酵母、植物、動(dòng)物細(xì)胞 內(nèi)進(jìn)行克隆和/或表達(dá)的質(zhì)粒。
該制備方法可以實(shí)現(xiàn)任何重復(fù)數(shù)的基因單體的同向串聯(lián)，例如以下步驟中涉及和 得到的重復(fù)數(shù)為2， 3， 4, 6的類(lèi)人膠原蛋白基因的同向串聯(lián)基因，另外，通過(guò)該方法 可以制備重復(fù)數(shù)為5， 8， 12等的其他重復(fù)數(shù)的類(lèi)人膠原蛋白基因的同向串聯(lián)基因。
1、選擇一對(duì)同尾酶，使其位于目的基因單體的兩端，設(shè)計(jì)包含上述同尾酶識(shí)別位 點(diǎn)的接頭DNA片斷；
首先選擇一對(duì)同尾酶，使其存在于目的基因單體的兩端，即欲重復(fù)同向串聯(lián)的DNA 片段的兩端。接頭的設(shè)計(jì)應(yīng)同時(shí)考慮目的基因和欲選用的質(zhì)粒(表達(dá)質(zhì)粒)本身序列 的特點(diǎn)， 一般接頭序列設(shè)計(jì)為一端具有這樣的酶切位點(diǎn)基因本身不具有該酶切位點(diǎn) 而質(zhì)粒具有該限制性內(nèi)切酶的單個(gè)酶切位點(diǎn)；另一端具有己選用的一對(duì)同尾酶中某一 個(gè)的酶切位點(diǎn)。并且考慮接頭序列的長(zhǎng)度，使得目的基因匹配所選質(zhì)粒的開(kāi)放讀碼框。 并且一個(gè)接頭可以附加考慮添加標(biāo)記肽或者蛋白成熟過(guò)程中剪切掉的信號(hào)肽、前導(dǎo)肽 等；另一個(gè)接頭可以考慮添加終止密碼子、標(biāo)記肽(如GST、 His標(biāo)記)等。
具體來(lái)講，設(shè)計(jì)的類(lèi)人膠原蛋白基因單體(Gel)作為目的基因單體，該單體堿基 序列見(jiàn)序列表SEQ ID NO: 1 ，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并克隆在質(zhì)粒pUC57 的Smal位點(diǎn)，得到的重組質(zhì)粒命名為pUC57Gel，質(zhì)粒pUC57Gel的EcoRI單酶切電 泳結(jié)果見(jiàn)附圖1的泳道2，其中泳道1,5為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL15000 (購(gòu)于寶生物工 程有限公司)。選擇的一對(duì)同尾酶為DmlII和Van91I，位于類(lèi)人膠原蛋白基因單體(Gd)
的兩端。設(shè)計(jì)的接頭為A1 (由堿基序列如序列表SEQIDNO: 6與SEQIDNO: 7的 單鏈DNA復(fù)性而得)和A2 (由堿基序列如序列表SEQ ID NO: 8與SEQ ID NO: 9 的單鏈DNA復(fù)性而得)。其中Al含有的酶切位點(diǎn)為EcoRI和DraIII， A2含有的酶切 位點(diǎn)為Notl和Van91I。選擇的表達(dá)質(zhì)粒為pPIC9K。
2、 將用一對(duì)同尾酶酶切得到的目的基因單體進(jìn)行體外連接
將重組質(zhì)粒pUC57Gel采用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，經(jīng)過(guò)含Amp的LB平板 篩選得到含有質(zhì)粒pUC57Gel的重組大腸桿菌，命名為DH5a/pUC57Gel。液體LB培 養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)DH5a/pUC57Gel，提取質(zhì)粒，得到大量的pUC57Gel。以一對(duì)同尾酶DraIII 和Van91I雙酶切質(zhì)粒pUC57Gel，電泳回收約3()0bp的小片段，獲得大量類(lèi)人膠原蛋 白基因單體，將這部分類(lèi)人膠原蛋白基因單體用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，4'C過(guò)夜， 得到含有不同重復(fù)數(shù)膠原蛋白基因單體的連接體，電泳顯示重復(fù)數(shù)集中在2、 3，還有 大量未參與連接的游離類(lèi)人膠原蛋白基因單體。
3、 步驟2得到的連接產(chǎn)物利用接頭，直接連入己含有目的基因單體的質(zhì)粒，獲得重 復(fù)數(shù)較少的重組質(zhì)粒
將歩驟2得到連接產(chǎn)物加入到含有pUC57Gel的EcoRI/Dra111雙酶切后電泳回收 得到的大片段和EcoRI酶切回收的復(fù)性接頭Al的連接體系中，4'C過(guò)夜連接。連接產(chǎn) 物采用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T叩10F，，經(jīng)過(guò)含Amp的LB平板篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)過(guò)提 取篩選到的陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒并進(jìn)行酶切電泳檢驗(yàn)含有質(zhì)粒的長(zhǎng)度判斷得到的重組大腸 桿菌所含有的質(zhì)粒中包含類(lèi)人膠原蛋白基因單體的重復(fù)數(shù)，主要出現(xiàn)包含有2、 3、 4 重復(fù)數(shù)的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。將含有重復(fù)數(shù)為3的質(zhì)粒定名為pUC57AlG3，含有該 pUC57AlG3質(zhì)粒的重組大腸桿菌命名為T(mén)oplOF，/pUC57AlG3。質(zhì)粒pUC57AlG3的 EcoRI單酶切電泳結(jié)果見(jiàn)附圖1的泳道3。
4、 將重復(fù)數(shù)較少的質(zhì)粒進(jìn)行重復(fù)數(shù)翻倍的連接，獲得含有目的基因的重復(fù)數(shù)較高的 重組質(zhì)粒
液體LB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)ToplOF'/pUC57AlG3，提取質(zhì)粒，得大量的pUC57AlG3。 以限制性內(nèi)切酶EcoRI和Van911雙酶切質(zhì)粒pUC57AlG3，電泳回收約900bp的小片 段，獲得大量類(lèi)人膠原蛋白基因三聯(lián)體DNA片段。另外以限制性內(nèi)切酶EcoRI和DmIII 雙酶切質(zhì)粒pUC57AlG3，電泳回收大片段，得到含有3重復(fù)類(lèi)人膠原蛋白基因單體的 pUC57AlG3質(zhì)粒大片段。將上述回收得到的兩種片斷用T4DNA連接酶連接，4'C過(guò) 夜，得到的連接產(chǎn)物直接采用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplOF'，經(jīng)過(guò)含Amp的LB平板 篩選得到含有pUC57 A1G6 (含有6個(gè)類(lèi)人膠原蛋白基因單體重復(fù)的重組質(zhì)粒)的重組 大腸桿菌，命名為T(mén)oplOF7pUC57AlG6。質(zhì)粒pUC57AlG6的EcoRI單酶切電泳結(jié)果 見(jiàn)附圖1的泳道4。
5、 將重復(fù)數(shù)較高的重組質(zhì)粒繼續(xù)進(jìn)行重復(fù)數(shù)翻倍的連接，構(gòu)建含有目的基因的重復(fù) 數(shù)更高的重組質(zhì)粒
此歩驟可以選擇不做或者做一次或者做兩次以上，得到重復(fù)數(shù)為12或更多的類(lèi)人 膠原蛋白基因的同向串聯(lián)基因。具體操作參考步驟4。
6、 將構(gòu)建好的適當(dāng)重復(fù)數(shù)的串聯(lián)基因克隆到選定的表達(dá)質(zhì)粒中，獲得可以轉(zhuǎn)化宿主 細(xì)胞(大腸桿菌、酵母、植物、動(dòng)物細(xì)胞等)用于表達(dá)的重組質(zhì)粒
液體LB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)ToplOF7pUC57AlG6，提取質(zhì)粒，得到大量的 pUC57AlG6。以限制性內(nèi)切酶EcoRI和Van91I雙酶切質(zhì)粒pUC57AlG6，電泳回收約 1800bp的小片段，獲得大量類(lèi)人膠原蛋白基因六聯(lián)體DNA片段。加入到含有pPIC9K 的EcoR固otI雙酶切后電泳回收得到的大片段和Notl酶切回收的復(fù)性接頭A2的連接 體系中，4'C過(guò)夜連接。得到的連接產(chǎn)物直接采用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplOF，，經(jīng) 過(guò)含Amp的LB平板篩選得到含有pPIC9KG6 (含有6個(gè)類(lèi)人膠原蛋白基因單體重復(fù) 以及接頭Al和A2的重組表達(dá)質(zhì)粒)的重組大腸桿菌，命名為T(mén)oplOF'/pPIC9KG6。 在以液體LB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)T叩10F7pPIC9KG6，提取質(zhì)粒，即得到大量可用于轉(zhuǎn)化 畢赤酵母(尸/c/j/a Awto〃、)的pPIC9KG6質(zhì)粒。重組質(zhì)粒pPIC9KG6的￡coRI與iVort 雙酶切電泳結(jié)果見(jiàn)附圖2的泳道2，其中，泳道1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 (購(gòu)于 寶生物工程有限公司)；泳道3為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL15000 (購(gòu)于寶生物工程有限公 司)。
本發(fā)明所最終獲得的表達(dá)載體pPIC9KG6，已經(jīng)完成了類(lèi)人膠原蛋白基因的構(gòu)建工
作，可以直接用于轉(zhuǎn)化酵母，并且所得到的重組酵母可以用于表達(dá)產(chǎn)生類(lèi)人膠原蛋白。 重組酵母所產(chǎn)生的類(lèi)人膠原蛋白將會(huì)是本發(fā)明中的六重復(fù)串聯(lián)類(lèi)人膠原蛋白基因所編 碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列見(jiàn)序列表SEQIDNO: 3。本發(fā)明為利用重組生物反應(yīng)器實(shí) 現(xiàn)工業(yè)化廉價(jià)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的類(lèi)人膠原蛋白提供基因資源。本發(fā)明所提供的不同重復(fù)數(shù)同 向串聯(lián)基因重組質(zhì)粒的制備方法，可以指導(dǎo)其它類(lèi)型的基因構(gòu)建重復(fù)同向串聯(lián)基因重 組質(zhì)粒的工作。序列表
<U0>南京理工大學(xué)
<120>類(lèi)人膠原蛋白基因、其不同重復(fù)數(shù)的同向串聯(lián)基因、含有串聯(lián)基閑的重組質(zhì)粒及制 備方法
<160> 9
<170> Patentln Version3.3
<210> 1 <211>322 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>類(lèi)人膠原蛋白基因Gel
<400> 1
3g3ggtcc3cccggtgagccaggtaacccsggttctccagtcascctggs60
aacaagggttctcctggssaicccaggtcaacctggt33cgagggacsaccaggtcaacct120
ggtcsaaacggtcaaccaggtgagcctggatctaacggtcctcaaggttcccaaggtaac180
ccaggtaagaacggtcaaccaggttctccaggttcccaaggttctcctgg240
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<210>2 <211>619 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>類(lèi)人膠原蛋白基因二重復(fù)同向串聯(lián)基因
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aagggttctcctggaaacccaggtcaacctggtaacgagggsca3CC3ggtcsacctggt420
caaaacggtcasccaggtgagcctggatctaacggtcctcaaggttcccasggtaaccc3480
ggtaagaacggtcsaccaggttctccaggttcccaaggttctcctggaeiaccasggttct540
ccsggtcsaccaggtaacccaggtC33cctggagagcaaggtsagccaggtaaccaaggt600ccagccggtg gttsaagsa 619
<210>3 <211>900 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>類(lèi)人膠原蛋白基因三重復(fù)同向串聯(lián)基因
<400> 3
agaggtccacccggtgagccaggtaacccaggttctccsgg333cc33ggtcaacctgga60
aacaagggttctcctggaaacccaggtcaacctggtaacgsgggaca3ccaggtcaacct120
ggtcaas3cggtcaaccaggtgagcctggatctaacggtcctcaaggttccc33ggt33c180
ccaggtaagaacggtcaaccaggttctccaggttcccaaggttctcctggaaaccaaggt240
tctccaggtccccaggtc3acctggagagcasggta3gccaggtaaccaa300
ggtccsgccggtgagccaggt3sccc3ggttctccaggssaccaaggtcaacctggaaac360
sagggttctcctggsaacccaggtcaacctggtsscgsggtcascctggt420
caaaacggtcaaccaggtgagcctggatctaacggtcctcaaggttcccaaggtaaccca480
ggtaagaacggtcasccaggttctccaggttcccaaggttctcctggaaacc33ggttct540
ccaggtca3Ccaggtsscccsggtcaacctgtaagccaggtaaccaaggt600
ccagccggtgcccaggttctccaggaaaccaaggtcaacc660
ggttctcctggaaacccaggtcaacctggt3acgagggsc33ccaggtcsacctggtcaa720
aacggtcaaccaggtgagcctggatctaacggtcctcaaggttcccaaggtaacccaggt780
3agadcggtcaaccaggttctccaggttcccaaggttctcctggaaaccaaggttctcca840
ggtcaaccaggtsacccsggtcascctggagagcasggtaagccaggtaaccaaggtcca900
<210>4 <2U>2106 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>類(lèi)人膠原蛋白基因六重復(fù)同向串聯(lián)基因
<220> <221>CDS <222>(1)... (2091)
<400> 4
3tgagatttc cttcaatttt tactgcsgtt ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt sscgggttst tgttt3t3ss tsctsctstt
ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60
gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120
gctgttttgc csttttccsa cagcacasat 180
gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240
tctctcgeigstgaagcttacgtsgaattcctcgagasaagaggtccaccc300
ggtgagccaggtaacccaggttctccaggaaacctggaaacaagggttct360
cctggasacccaggtcaacctggtsscgsgggacaaccaggtcaacctggtcaaaacggt420
caaccsggtgagcctggatctsscggtcctcaaggttccc480
ggtcaaccaggttctccaggttcccaaggttctcctggsaaccaaggttctccsggtcsa540
cc3ggta3cccaggtcaacctggagagcadggtaagccsggtaaccaaggtccagccggt600
gagccaggtaacccaggttctccsggassccaaggtcaacctggaaacaagggttctcct660
gg333ccc3ggtcaacctggcaaccaggtcaacctggtca720
ccaggtgagcctggatctaacggtcctcaaggttcccasggtsacccaggtaagaacggt780
caaccsggttctccaggttcccaaggttctcctggaaaccaaggttctccaggtcsacca840
ggtaacccaggtcaacctggagagcaaggtasgccsggtaaccaaggtccagccggtgag900
ccaggtaacccaggttctccggtcaacctggasacaagggttctcctgga960
aacccaggtcaacctggtaacgagggscaaccsggtcaacctggtc3333cggtcascca1020
ggtgsgcctggatctascggtcctcasggttcccsaggtaacccaggtaag33cggtca31080
ccsggttctcc3ggttccc3aggttctcctgttctccaggtcssccsggt1140
sscccaggtcaacctggagagcsaggtaagcc3ggtascca3ggtcc3gccggtgagcca1200
ggtsacccaggttctccaggaaaccaaggtacaagggttctcctggas3c1260
cc3ggtc33cctggtaacgagggacasccaggtcaacctggtcaasacggtcaaccaggt1320
gagcctggatctsacggtcctcaaggttcccaaggtsacccggtcaacca1380
ggttctccaggttcccaaggttctcctggsctccaggtcaacc3ggt33Cl"0
cc3ggtc33cctggagagcaaggtaagccsggt33cca3ggtccagccggtgagccaggt1500
3sccc3ggttcc3sggtcsacctgg33acsagggttctcctggaaacccs1560
ggtcaacctggtaacgagggacaaccaggtcaacctggtcaaaacggtcaaccaggtgag1620
cctgg3tct3acggtcctcaaggttcccaaggtaacccaggtasgsacggtcaaccaggt1680
tctccaggttcccaaggttctcctggaaaccaaggttctccaggtcaaccaggtaaccca1740
ggtcaacctggagagcaaggtaagccaggtaaccaaggtccagccggtgagccaggtaac1,
ccaggttctccaggaaacca3ggtc33cctgttctcctggaaacccaggt1860
cascctggt3scgagggacaaccaggtcaacctggtcssascggtc3sccaggtgagcct1920
ggatctsscggtcctcssggttccc33ggtaacccaggtaagaacggtcaaccaggttct1980
ccaggttcccaaggttctccggttctccaggtcaaccaggtaacccaggt2040
caacctgg3ggccsggtaaccaaggtccagccggtggttasgcggccgcg2100
2106
<210>5 <211>696 <212> PRT <213>人工序列
<220>
<223>重組質(zhì)粒pPIC9KG6中外源基因?qū)?yīng)的類(lèi)人膠原蛋白 <400> 5
Met Arg Phe Pro Ser lie Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 15 10 15
Ala !>eu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin
20 25 30
lie Pro Ala Glu Ala Val lie Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe
35 40 45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
50 55 60
Phe lie Asn Thr Thr lie Ala Ser lie Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80
Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Tyr Val Glu Phe Leu Glu Lys
85 90 95
Arg Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Asn Pro Gly Ser Pro Gly Asn Gin
100 105 110
Gly Gin Pro Gly Asn Lys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Gly Gin Pro Gly
115 120 125
Asn Glu Gly Gin Pro Gly Gin Pro Gly Gin Asn Gly Gin Pro Gly Glu
130 135 140
Pro Gly Ser Asn Gly Pro Gin Gly Ser Gin Gly Asn Pro Gly Lys Asn 145 150 155 160
Gly Gin Pro Gly Ser Pro Gly Ser Gin Gly Ser Pro Gly Asn Gin Gly
165 170 175
Ser Pro Gly Gin Pro Gly Asn Pro Gly Gin Pro Gly Glu Gin Gly Lys
180 185 190
Pro Gly Asn Gin Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly Asn Pro Gly Ser Pro
195 200 205
Gly Asn Gin Gly Gin Pro Gly Asn Lys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Gly
210 215 220
Gin Pro Gly Asn Glu Gly Gin Pro Gly Gin Pro Gly Gin Asn Gly Gin 225 230 235 240
Pro Gly Glu Pro Gly Ser Asn Gly Pro Gin Gly Ser Gin Gly Asn Pro
245 250 255
Gly Lys Asn Gly Gin Pro Gly Ser Pro Gly Ser Gin Gly Ser Pro Gly
260 265 270
Asn Gin Gly Ser Pro Gly Gin Pro Gly Asn Pro Gly Gin Pro Gly Glu
275 280 285
Gin Gly Lys Pro Gly Asn Gin Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly Asn Pro
290 295 300
Gly Ser Pro Gly Asn Gin Gly Gin Pro Gly Asn Lys Gly Ser Pro Gly 305 310 315 320
Asn Pro Gly Gin Pro Gly Asn Glu Gly Gin Pro Gly Gin Pro Gly Gin
325 330 335
Asn Gly Gin Pro Gly Glu Pro Gly Ser Asn Gly Pro Gin Gly Ser Gin
340 345 350
Gly Asn Pro Gly Lys Asn Gly Gin Pro Gly Ser Pro Gly Ser Gin Gly 355 360 365
Ser Pro Gly Asn Gin Gly Ser Pro Gly Gin Pro Gly Asn Pro Gly Gin
370 375 380
Pro Gly Glu Gin Gly Lys Pro Gly Asn Gin Gly Pro Ala Gly Glu Pro 385 390 395 400
Gly Asn Pro Gly Ser Pro Gly Asn Gin Gly Gin Pro Gly Asn Lys Gly
405 410 415
Ser Pro Gly Asn Pro Gly Gin Pro Gly Asn Glu Gly Gin Pro Gly Gin
420 425 430
Pro Gly Gin Asn Gly Gin Pro Gly Glu Pro Gly Ser Asn Gly Pro Gin
435 440 445
Gly Ser Gin Gly Asn Pro Gly Lys Asn Gly Gin Pro Gly Ser Pro Gly
450 455 460
Ser Gin Gly Ser Pro Gly Asn Gin Gly Ser Pro Gly Gin Pro Gly Asn 465 470 475 480
Pro Gly Gin Pro Gly Glu Gin Gly Lys Pro Gly Asn Gin Gly Pro Ala
485 490 495
Gly Glu Pro Gly Asn Pro Gly Ser Pro Gly Asn Gin Gly Gin Pro Gly
500 505 510
Asn Lys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Gly Gin Pro Gly Asn Glu Gly Gin
515 520 525
Pro Gly Gin Pro Gly Gin Asn Gly Gin Pro Gly Glu Pro Gly Ser Asn
530 535 540
Gly Pro Gin Gly Ser Gin Gly Asn Pro Gly Lys Asn Gly Gin Pro Gly 545 550 555 560
Ser Pro Gly Ser Gin Gly Ser Pro Gly Asn Gin Gly Ser Pro Gly Gin
565 570 575
Pro Gly Asn Pro Gly Gin Pro Gly Glu Gin Gly Lys Pro Gly Asn Gin
580 585 590
Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly Asn Pro Gly Ser Pro Gly Asn Gin Gly
595 600 605
Gin Pro Gly Asn Lys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Gly Gin Pro Gly Asn
610 615 620
Glu Gly Gin Pro Gly Gin Pro Gly Gin Asn Gly Gin Pro Gly Glu Pro 625 630 635 640
Gly Ser Asn Gly Pro Gin Gly Ser Gin Gly Asn Pro Gly Lys Asn Gly
645 650 655
Gin Pro Gly Ser Pro Gly Ser Gin Gly Ser Pro Gly Asn Gin Gly Ser
660 665 670
Pro Gly Gin Pro Gly Asn Pro Gly Gin Pro Gly Glu Gin Gly Lys Pro
675 680 685
Gly Asn Gin Gly Pro Ala Gly Gly 690 695
<210> 6 <2U>31 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)開(kāi)放讀碼框和滿足同向串聯(lián)的需要，設(shè)計(jì)接頭序列Al-l <400> 6
cgcgaattcc tcgagaaaag aggtccaccc g 31
<210>7 <211>28 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)開(kāi)放讀碼框和滿足同向串聯(lián)的需要，設(shè)計(jì)接頭序列Al-2 <400> 7
gtggscctct tttctcgsgg 33ttcgcg 28
<210>8 <211>20 <212> DNA
<2i3>人:i:序列
<220>
<223>根據(jù)開(kāi)放讀碼框和滿足同向串聯(lián)的需要，設(shè)計(jì)接頭序列A2-1 <400> 8
gtggttssgc ggccgcstgc 20
<210>9 <2U>23 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)開(kāi)放讀碼框和滿足同向串聯(lián)的需要，設(shè)計(jì)接頭序列A2-2 <400> 9
gcatgcggcc gcttaaccac egg 2權(quán)利要求
1、一種類(lèi)人膠原蛋白基因，其堿基序列如序列表中SEQ ID NO1所示，即agaggtccacccggtgagccaggtaacccaggttctccaggaaaccaaggtcaacctggaaacaagggttctcctggaaacccaggtcaacctggtaacgagggacaaccaggtcaacctggtcaaaacggtcaaccaggtgagcctggatctaacggtcctcaaggttcccaaggtaacccaggtaagaacggtcaaccaggttctccaggttcccaaggttctcctggaaaccaaggttctccaggtcaaccaggtaacccaggtcaacctggagagcaaggtaagccaggtaaccaaggtccagccggtggttaaagaa，其核酸長(zhǎng)度為322bp。
2、 一種含有權(quán)利要求1所述的類(lèi)人膠原蛋白基因的重組質(zhì)粒。
3、 一種對(duì)權(quán)利要求1所述的類(lèi)人膠原蛋白基因進(jìn)行不同重復(fù)數(shù)同向串聯(lián)所獲的基因。
4、 一種與權(quán)利要求1或3所述的堿基序列至少有70%同一性的基因。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的類(lèi)人膠原蛋白基因不同重復(fù)數(shù)同向串聯(lián)基因，其堿基序 列如序列表中SEQIDNO: 2所示，或其堿基序列如序列表中SEQIDNO: 3所示， 或其堿基序列如序列表中SEQIDNO: 4所示，其中SEQIDNO: 4編碼的蛋白質(zhì)的 氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 5所示。
6、 一種含有權(quán)利要求3所述的類(lèi)人膠原蛋白基因不同重復(fù)數(shù)同向串聯(lián)基因的重組 質(zhì)粒。
7、 一種含有權(quán)利要求5所述的類(lèi)人膠原蛋白基因不同重復(fù)數(shù)同向串聯(lián)基因的重組 質(zhì)粒。
8、 根據(jù)權(quán)利要求2、 6或7所述的重組質(zhì)粒，它是可在宿主中復(fù)制和生存的表達(dá) 質(zhì)粒。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組質(zhì)粒，真核的表達(dá)質(zhì)粒為pPIC9K或pCDNA3.0， 原核的表達(dá)質(zhì)粒為pUC18或pET32。
10、 一種制備權(quán)利要求6或7所述的不同重復(fù)數(shù)同向串聯(lián)基因重組質(zhì)粒的方法， 包括以下步驟①選擇一對(duì)同尾酶，使其位于目的基因單體的兩端，即堿基序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示的類(lèi)人膠原蛋白基因的兩端；設(shè)計(jì)包含上述同尾酶識(shí)別位點(diǎn)的接頭DNA片斷；②將用上述一對(duì)同尾酶酶切得到的目的基因單體進(jìn)行體外連接；(D歩驟②得到的連接產(chǎn)物利用接頭DNA片斷，直接連入已含有目的基因單體的質(zhì)粒，獲得重復(fù)數(shù)兩個(gè)或兩個(gè)以上的重組質(zhì)粒； 將歩驟③重復(fù)數(shù)的質(zhì)粒進(jìn)行重復(fù)數(shù)翻倍的連接，獲得含有目的基因單體的重復(fù)數(shù)較高的重組質(zhì)粒； 將步驟④重復(fù)數(shù)較高的重組質(zhì)粒繼續(xù)進(jìn)行重復(fù)數(shù)翻倍的連接，構(gòu)建含有目的基 因單體的重復(fù)數(shù)更高的重組質(zhì)粒；⑥將構(gòu)建好的適當(dāng)重復(fù)數(shù)的串聯(lián)基因克隆到選定的表達(dá)質(zhì)粒中，獲得可以轉(zhuǎn)化宿 主細(xì)胞用于表達(dá)的重組質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種類(lèi)人膠原蛋白基因、其不同重復(fù)數(shù)的同向串聯(lián)基因、含有串聯(lián)基因的重組質(zhì)粒及制備方法。本發(fā)明類(lèi)人膠原蛋白基因Gel，其堿基序列如序列表中SEQ ID NO1所示，并通過(guò)對(duì)該基因的體外酶切和拼接獲得了不同重復(fù)數(shù)的串聯(lián)基因，以及含有該不同重復(fù)數(shù)串聯(lián)基因的重組質(zhì)粒。本發(fā)明是全新的序列，且長(zhǎng)度上大大少于天然人膠原蛋白基因，實(shí)現(xiàn)了在分子水平的操作簡(jiǎn)單化，更易實(shí)現(xiàn)膠原蛋白的基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)；該類(lèi)人膠原蛋白基因Gel同時(shí)包含天然人膠原蛋白基因的特征，其表達(dá)得對(duì)應(yīng)類(lèi)人膠原蛋白將具有天然人膠原蛋白的優(yōu)良特征；其制備方法僅僅通過(guò)簡(jiǎn)單的體外酶切連接反應(yīng)和具有成熟技術(shù)的原核轉(zhuǎn)化和篩選，實(shí)現(xiàn)了任意重復(fù)數(shù)的目的基因的串聯(lián)連接。
文檔編號(hào)C12N15/12GK101200718SQ20061009829
公開(kāi)日2008年6月18日 申請(qǐng)日期2006年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月11日
發(fā)明者儲(chǔ)衛(wèi)華, 唐紅玉, 孟廣榮, 李新柱, 楊樹(shù)林, 薇 沈, 鈕小松, 高力虎 申請(qǐng)人:南京理工大學(xué)