專利名稱：一種檢測兔i型膠原蛋白基因的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測兔I型膠原蛋白基因的方法及試劑
背景技術(shù)：
膠原蛋白是人體和動物的結(jié)締組織的主要蛋白，是哺乳動物含量最多，分布最廣的蛋白質(zhì)，含量能夠占總蛋白的25% 35%，體內(nèi)具有廣泛的生物學(xué)活性。在肌肉組織中它是肌內(nèi)膜的主要成份，I型膠原蛋白是人體中含量最多的膠原蛋白，瘢痕組織中含量豐富，它也是組織愈合和修復(fù)的產(chǎn)物。肌腱、皮膚、動脈血管壁、軟骨以及部分的器官和牙齒中也含有I型膠原蛋白。I型膠原蛋白合成紊亂會導(dǎo)致骨折、輕微脊柱彎曲、關(guān)節(jié)松弛、皮膚彈性過度綜合征(cutis hyperelastica)、嬰兒骨外層肥厚(infantile corticalhyperostosis)等疾病。 目前，基因表達(dá)水平檢測主要是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction, PCR)來完成，PCR是一項廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的實(shí)驗技術(shù)，通過熱穩(wěn)定的TaqDNA polymerase,能夠使模板中的單個或幾個拷貝的基因片斷在經(jīng)過幾十個熱循環(huán)后進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，達(dá)到數(shù)以百萬計的拷貝。PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳檢測目的基因的表達(dá)量。這種方法是目前比較常用的基因表達(dá)相對定量檢測方法，這種方法屬于終點(diǎn)檢測方法，由于不能夠?qū)崟r的監(jiān)測反應(yīng)的進(jìn)行，所以實(shí)驗的重復(fù)性、可靠性相對較差。 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，以及光電子技術(shù)的進(jìn)步，近些年來實(shí)時熒光定量PCR(Realtime PCR)技術(shù)得到了很大的發(fā)展。此技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，對起始模板進(jìn)行定量分析的方法。應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)來檢測基因的表達(dá)水平比以往的技術(shù)有了很大的進(jìn)步，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)能夠全程實(shí)時檢測PCR反應(yīng)的進(jìn)行，因此具有良好的實(shí)驗可靠性，重復(fù)性。實(shí)時熒光定量PCR有分為熒光染料摻入法和探針法。熒光染料摻入法是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料SYBR Green， SYBR Green只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。變性時，DNA雙鏈分開，無熒光信號，因此必須在延伸結(jié)束階段采集熒光信號。SYBR Green也能和非特異的雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光，所以必須在反應(yīng)結(jié)束時做熔解曲線分析產(chǎn)物的特異性。 T叫man探針法T叫man探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)，此時5'端熒光基團(tuán)吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的3'端熒光淬滅基團(tuán)(發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET)，因此探針完整時，檢測不到該探針5'端熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光。隨著引物的退火，產(chǎn)物的不斷擴(kuò)增，報告熒光基團(tuán)能夠被DNA聚合酶從探針上剪切下來，探針被打碎，這樣報告熒光基團(tuán)不再被淬滅，從而不斷發(fā)射出熒光信號。因此應(yīng)用T叫man探針法能夠快速準(zhǔn)確的檢測組織和細(xì)胞中基因的表達(dá)變化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測兔I型膠原蛋白基因的方法。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案 —種檢測兔I型膠原蛋白基因的方法，包括如下步驟 (i)用核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的下游引物擴(kuò)增生物樣品； (ii)用探針對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，所述探針序列如SEQ ID NO. 3所示。
優(yōu)選地，步驟(i)所述擴(kuò)增與步驟(ii)所述檢測同時進(jìn)行。 更優(yōu)選地，采用實(shí)時熒光定量PCR法進(jìn)行步驟(i)所述擴(kuò)增與步驟(ii)所述檢測。所述實(shí)時熒光定量PCR法反應(yīng)程序優(yōu)選為95。C lOmin ;95。C 30sec ;58。C lmin ;72。Clmin為一個循環(huán)，設(shè)定45個循環(huán)。 更優(yōu)選地，步驟(ii)所述探針為T叫Man探針。所述T叫Man探針其5'端標(biāo)記6-FAM、 TET、 HEX、 TAMRA、 R0X、 CY5、 CY3、 J0E、 Texas Red其中一種，3'端標(biāo)記TAMRA、 BHQ-1、Eclipse、 IowaBlack其中——禾中。 本發(fā)明還提供一種檢測兔I型膠原蛋白基因的試劑盒，包含用于擴(kuò)增核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示的核酸片段的引物。 優(yōu)選地，本發(fā)明所述試劑盒中的引物為核苷酸序列如SEQ ID NO. l所示的核酸片段、核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的核酸片段中的至少一種。 更優(yōu)選的，本發(fā)明所述試劑盒還包含核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的探針。
更優(yōu)選的，本發(fā)明所述試劑盒還包含用于檢測兔GAPDH基因的引物和探針；其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，探針序列如SEQ ID NO. 6所示。 本發(fā)明還提供一種用于檢測兔I型膠原蛋白基因的引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO. l所示。 本發(fā)明還提供一種用于檢測兔I型膠原蛋白基因的引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO. 2所示。 本發(fā)明的術(shù)語"引物"指作為合成引物延伸產(chǎn)物的起始位點(diǎn)的單鏈寡核苷酸序列，其與待復(fù)制的核酸鏈互補(bǔ)，長度和序列必須適合于延伸產(chǎn)物的合成。 本發(fā)明術(shù)語"探針"指單鏈寡核苷酸，用于與核酸片段特異性雜交。"特異性雜交"
指所述探針與核酸的整個區(qū)域或一部分在特定的實(shí)驗條件下形成雙鏈體，且在這些條件
下，所述探針不與待檢測樣品中存在的其他核酸或核酸的其他區(qū)域形成雙鏈體。 本發(fā)明所述"T叫Man探針"是一種寡核苷酸探針，是在寡核苷酸兩端分別標(biāo)記一個
報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)，報告熒光基團(tuán)連接在探針的5'末端，而淬滅熒光基團(tuán)
則在3'末端。 所述TaqMan探針的5，端標(biāo)記6_FAM、 TET、 HEX、 TAMRA、 R0X、 CY5、 CY3、 JOE、 Texas
Red其中一種，探針的3'端標(biāo)記TAMRA、BHQ-l、Eclipse、 Iowa Black其中一種 探針和核酸片段雜交后，可以通過任意合適的方式，進(jìn)行雜交的檢測，例如可以檢
測的標(biāo)記探針和/或核酸片段，為了輔助檢測，優(yōu)選實(shí)時熒光PCR法擴(kuò)增。 本發(fā)明試劑盒還包含PCR緩沖液、dNTPs、 Taq酶、R0X、對照品。對照品分陰性對
照和陽性對照，陰性對照為無菌三蒸水，陽性對照為兔肌肉組織的cDNA樣品。
本發(fā)明所述試劑盒保存條件為-20°〇，盡量避免反復(fù)凍融。
本發(fā)明所述試劑盒的使用方法是 將待測樣品兔組織或體外培養(yǎng)細(xì)胞用Trizol提取總RNA，提取的總RNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，建立25ii 1的PCR反應(yīng)體系如下2. 5ii 1 10XPCR Buffer、0. 3ii 1的R0X、2ii 1的10mM dNTPs、0. 5ii 1的5 y M上游引物0. 5 y 1的5 y M下游引物、兔cDNA2 y 1、0. 5iU的5iiM特異性Taqman探針、Taq酶lU、補(bǔ)充無核酶水至25ii1。反應(yīng)條件為95。C 30sec ;58。Clmin ;72°C lmin ;45個循環(huán)。 每個樣品分別做3個骨形態(tài)蛋白2和GAPDH反應(yīng)，并且每次實(shí)驗做兔I型膠原蛋白基因和GAPDH陰性對照和陽性對照實(shí)驗，將兔cDNA模板以5倍稀釋不同濃度梯度，繪制骨形態(tài)蛋白2兔實(shí)時定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及實(shí)驗所用的相應(yīng)軟件相對定量樣品中兔I型膠原蛋白基因。 術(shù)語"Ct值":為了便于對所檢測樣本進(jìn)行比較，在實(shí)時熒光PCR反應(yīng)的指數(shù)期，首先需設(shè)定一定熒光信號的域值， 一般這個域值是以PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是3 15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。如果檢測到熒光信號超過域值被認(rèn)為是真正的信號，它可用于定義樣本的域值循環(huán)數(shù)(Ct)。 Ct值的含義是每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 本發(fā)明所述檢測兔I型膠原蛋白基因的方法，對比現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于 (1)檢測速度快，效率高，能夠?qū)崟r檢測PCR反應(yīng)的結(jié)果，不需要電泳和染色過程，
比普通的PCR方法相比步驟簡單、實(shí)驗周期短、重復(fù)性好； (2)靈敏度高，靈敏度范圍是10-1(^拷貝，可檢測到基因的最小濃度為IO個拷貝； (3)特異性強(qiáng)，與SYBR Green熒光染料嵌入式Real-time PCR方法相比，Taqman探針法能夠特異性與目的基因結(jié)合，不會與非特異性PCR產(chǎn)物和引物二聚體結(jié)合，因此具有良好的特異性和可靠性；
(4)操作簡單，結(jié)果穩(wěn)定。


圖1為本發(fā)明所述實(shí)時定量PCR方法檢測兔I型膠原蛋白基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖2為本發(fā)明所述實(shí)時定量PCR方法檢測兔GAPDH基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖3為對實(shí)施例3標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定的電泳 泳道1 :標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增產(chǎn)物(488bp)
泳道2 :100bp DNA Marker 圖4為本發(fā)明所述方法檢測不同接枝率骨修復(fù)材料中的兔I型膠原基因的柱形圖； 圖5為本發(fā)明所述方法檢測不同接枝率骨修復(fù)材料兔成骨細(xì)胞中的兔I型膠原基因的柱形圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :設(shè)計和制備引物、探針序列 兔I型膠原蛋白基因的GENEBANK登錄號為gi_984641，應(yīng)用引物設(shè)計軟件Beacon
designer 7設(shè)計了兔I型膠原蛋白基因和兔GAPDH基因的實(shí)時定量PCR引物和探針，經(jīng)過
軟件Beacon designer 7分析排除了引物間/內(nèi)二聚體以及發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并經(jīng)BLAST驗證引
物的特異性和與相近基因的同源性，設(shè)計出下列引物和探針。 兔I型膠原蛋白基因特異性引物分為上游引物和下游引物 上游引物序列5' -CCACTGGCAAACATGGAAACC-3'(其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1
所示) 下游引物序列5' -GGATGCCTTGTGGACCACTAG-3'(其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示) 兔I型膠原蛋白基因特異性Taqman探針序列為5' 6-FAMCCTCTTG-GACCAGCAGCACCGACG 3' TAMRA(其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示)。 為了避免由于樣品間加入的核酸總量的差別，以及樣品在RNA抽提以及逆轉(zhuǎn)錄過程中效率的不同而導(dǎo)致的樣品間基因表達(dá)量的差別，通常采用管家基因進(jìn)行校正來消除這些客觀的差異。 一些基因在外界因素改變時表達(dá)相對比較恒定，我們把這些基因用來實(shí)時定量PCR的校正，GAPDH是最通用的管家基因，本發(fā)明采用GAPDH基因作為管家基因?qū)γ總€待測樣品進(jìn)行校正。 以兔GAPDH基因為內(nèi)參，GAPDH基因GENEBANK登錄號為NM-001082253，設(shè)計上游引物為 5' -GATGGTGAAGGTCGGAGTG-3'(其核苷酸序列如SEQ IDNO. 4所示)
兔GAPDH基因下游引物為 5' -TGTAGTGGAGGTCAATGAATGG-3'(其核苷酸序列如SEQ IDNO. 5所示)
兔GAPDH特異性Taqman探針序列 5' 6-FAM CAGCCTTGACCGTGCCGTGGAACT 3' TAMRA (其核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示)。 實(shí)施例2 : 制備本發(fā)明所述試劑盒本發(fā)明所述試劑盒組成為1. 25ml 10 X PCR Buffer、200ii 1的2 y M的ROX、 lml的
10mM dNTPs、250 的5 y M上游引物、250 的5 y M下游引物、250 的5 y M熒光標(biāo)記
的Taqman探針、Taq酶500U、無核酶水2ml，標(biāo)準(zhǔn)品(IO1?？截?20 iU。 所述引物包括實(shí)施例1制備的兔I型膠原蛋白基因的上游引物和下游引物、兔
GAPDH基因的上游引物和下游引物；所述探針包括兔I型膠原蛋白基因的探針和兔GAPDH
基因的探針。 對照品分陰性對照和陽性對照，陰性對照為無核酶水，陽性對照為兔肌肉組織的cDNA樣品。 應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，如將試劑盒的組分等比例增加，也應(yīng)視為在本發(fā)明要求保護(hù)的范圍之內(nèi)。
實(shí)施例3 : 本發(fā)明所述方法檢測不同接枝率骨修復(fù)材料中的兔I型膠原基因的表達(dá) 骨修復(fù)材料從兔腿部取出，稱取lOOmg材料，在研缽中加入液氮搗碎，用Trizol提
取材料中的總RNA，取lug總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用這些cDNA和實(shí)施例1所述I型膠
原引物和GAPDH引物進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，實(shí)驗設(shè)置GAPDH為內(nèi)參組，用以校正每個樣
品起始模板量的差異對實(shí)驗帶來的誤差。反應(yīng)組份如表1 : 表1
名稱體積
lOXPCRBuffer2. 5u 1
ROX (2 u M)0. 3u 1
dNTPs(10mM)2u 1
上游引物(5uM)0. 5u 1
下游引物(5uM)0. 5u 1
Taqman探針(5 u M)0. 5u 1
cDNA2u 1
T叫酶(4U/ u 1)0. 25u 1
H2016. 45 u 1 兔I型膠原蛋白基因的GENEBANK登錄號為gi_984641，根據(jù)NCBI搜索選取其特異性基因序列為兔I型膠原蛋白基因的253-740片段，共488bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。以兔I型膠原蛋白基因的253-740片段為標(biāo)準(zhǔn)品，兔I型膠原蛋白基因的253-740片段核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為10"拷貝/iU，將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后，分為10"拷貝/111、108拷貝/111、106拷貝/111、104拷貝/111、102拷貝/yl，104考貝/iU進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件是95。C預(yù)變性10min，然后95。C 30秒、58。C 60秒、72。C 60秒共進(jìn)行45個循環(huán)，結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。將標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，紫外燈檢測并拍照，結(jié)果見圖3，可見在接近400bp出有一明顯的條帶，即為目的基因兔I型膠原蛋白基因的253-740片段(488bp)。可知本發(fā)明所述方法可擴(kuò)增兔I型膠原蛋白基因，靈敏度范圍是10-l(T拷貝。 本發(fā)明所用Trizol試劑購自Invitrogen， 01igo-dT、 dNTP、 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶和RNA酶抑制劑購自Promega公司，Brilliant QPCRMaster Mix和ROX購自Stratagene公司。
7
設(shè)定Real-time PCR反應(yīng)條件95。C預(yù)變性10min，然后95°C 30秒、58。C 60秒、72°C 60秒共進(jìn)行45個循環(huán)，樣品在Stratagen Mx3005P機(jī)器上運(yùn)行，結(jié)束后軟件分析結(jié)果見圖4。 實(shí)施例4 : 實(shí)時熒光定量法檢測種植在不同接枝率HA與PLGA共混材料上的兔成骨細(xì)胞中兔I型膠原蛋白基因的表達(dá)。 取3天新生兔的顱骨，顱骨剪碎后加DMEM+10% FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)兔成骨細(xì)胞。單純的PLGA和不同接枝率HA與PLGA共混材料，共混材料中HA與PLGA質(zhì)量百分比分別是80 %和20 % 。用于成骨細(xì)胞培養(yǎng)的復(fù)合材料分別為PLGA、 PLGA+HA、 PLGA+HA (1 % )、PLGA+HA (3% ) PLGA+HA (5% ) 、 PLGA+HA (7% ) 、 PLGA+HA (10% )。材料用氯仿溶解后在硅化的蓋玻片上鋪膜。成骨細(xì)胞種植于涂有不同復(fù)合材料的薄膜上。培養(yǎng)l周后，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，Real-time PCR檢測I型膠原蛋白表達(dá)。
材料、引物合成、檢測方法同實(shí)施例3。 成骨細(xì)胞用Trizol提取總RNA，取lug總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用這些cDNA和I型膠原引物和GAPDH引物進(jìn)行Real-timePCR反應(yīng)，反應(yīng)組份如表2 :
表2
名稱體積
lOXPCRBuffer2. 5u 1
ROX(2 u M)0. 3u 1
dNTPs(10mM)2u 1
上游引物(5uM)0. 5u 1
下游引物(5uM)0. 5u 1
T叫man探針(5 u M)0. 5u 1
cDNA2u 1
Taq酶(4U/ u 1)0. 25u 1
H2016. 45u 1 Real-time PCR反應(yīng)條件是，95 °C預(yù)變性10min，然后95。C 30秒、58。C 60秒、72°C 60秒共進(jìn)行45個循環(huán)，樣品在Stratagen Mx3005P機(jī)器上運(yùn)行，結(jié)束后軟件分析結(jié)果見圖5。從圖5可以看出成骨細(xì)胞在不同復(fù)合材料上培養(yǎng)1周后，材料PLGA+HA(5% )中I型膠原蛋白基因表達(dá)量最高，因此材料PLGA+HA(5% )更有利于體外培養(yǎng)的兔成骨細(xì)胞中I型膠原蛋白基因的表達(dá)。 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
0080]SEQUENCE LISTING
0081]〈110〉中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所
0082]〈120〉 一種檢測兔I型膠原蛋白基因的方法及試劑盒
0083]〈130>MP097633
0084]〈160>7
0085]〈170>PatentIn version 3.3
0086]〈210>1
0087]〈211>21
0088]〈212>DNA
0089]〈213〉兔I型膠原蛋白基因的上游引物
0090]〈400>1
0091]CC3CtggC朋3C3tgg朋3C c
0092]〈210>2
0093]〈211>21
0094]〈212>DNA
0095]〈213〉兔I型膠原蛋白基因的下游引物
0096]〈400>2
0097]ggatgccttg tggaccacta g
0098]〈210>3
0099]〈211>24
0100]〈212>DNA
0101]〈213〉兔I型膠原蛋白基因探針
0102]〈400>3
0103]cctcttggac cagcagcacc gacg
0104]〈210>4
0105]〈211>19
0106]〈212>DNA
0107]〈213〉兔GAPDH基因上游引物
0108]〈400>4
0109]g3tggtg朋g gtCgg3gtg
0110]〈210>5
0111 ]〈211>22
0112]〈212>DNA
0113]〈213〉兔GAPDH基因下游引物
0114]〈400>5.0115] tgtagtggag gtcaatgaat gg 22
:0116] 〈210>6
:0117] 〈211>24
:0118] 〈212>DNA
:0119] 〈213〉兔GAPDH基因探針
:0120] 〈400>6
.0121] cagccttgac cgtgccgtgg aact 24 〈210>7 〈211>488 〈212>DNA 〈213〉兔I型膠原蛋白基因序列的253-740片斷 〈400>7
.0127] ggtcgtgatg gcaaccctgg gagcgatggt cctccaggtc gcgatggtca gcctggacac
:0128] 60
.0129] aagggagaac gtggttaccc tggcaatgct ggtcctgttg gtgctgcagg agcacctggt
:0130] 120
.0131] cctcaaggct ccgtgggccc cactggcaaa catggaaacc gtggtgaacc tggccctgct
:0132] 180
.0133] ggttctattg gtcccgtcgg tgctgctggt ccaagaggcc ctagtggtcc acaaggcatc
:0134] 240
.0135] cggggtgaca agggagagcc tggtgacaag gggcccagag gtcttcctgg cataaaggga
:0136] 300
.0137] cacaacggat tgcaaggtct tcccggtctc gctggtcaac atggtgatca aggtgctccc
:0138] 360
.0139] ggcgctgtgg gtcccgctgg ccccaggggc cctgctggtc ctaccggccc tgctggcaaa
:0140] 420
.0141] gacggccgct ctggacatcc cggcacagtt ggacctgctg gccttcgagg ttctcagggt
:0142] ■
.0143] agccaagg
:0144] 488
權(quán)利要求
一種檢測兔I型膠原蛋白基因的方法，包括如下步驟(i)用核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQID NO.2所示的下游引物擴(kuò)增生物樣品；(ii)用探針對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，所述探針序列如SEQ ID NO.3所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(i)所述擴(kuò)增與步驟(ii)所述檢測同時進(jìn)行。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，采用實(shí)時熒光定量PCR法進(jìn)行步驟(i)所述擴(kuò)增與步驟(ii)所述檢測。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l-3任一項所述的方法，其特征在于，步驟(ii)所述探針為T叫Man探針。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)程序為95°ClOmin ;95。C 30sec ;58。C lmin ;72。C lmin為一個循環(huán)，設(shè)定45個循環(huán)。
6. —種檢測兔I型膠原蛋白基因的試劑盒，其特征在于，包含核苷酸序列如SEQ IDNO. 1所示的引物和核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的引物中的至少一種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包含核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示的探針。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，還包含用于檢測兔GAPDH基因的引物和探針；其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，探針序列如SEQ ID NO. 6所示。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于，所述探針為TaqMan探針，其5'端標(biāo)記6-FAM、 TET、 HEX、 TAMRA、 ROX、 CY5、 CY3、 JOE、 Texas Red其中一種，3'端標(biāo)記TAMRA、BHQ-l、Eclipse、 Iowa Black其中一種。
10. 檢測兔I型膠原蛋白基因的引物，上游引物核苷酸序列如SEQ IDNO. l所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體提供一種檢測兔I型膠原蛋白基因的方法，包括用核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQID NO.2所示的下游引物擴(kuò)增生物樣品，以及用序列如SEQ ID NO.3所示的探針進(jìn)行檢測步驟。本發(fā)明還提供一種檢測兔I型膠原蛋白基因的試劑盒。本發(fā)明所述方法檢測兔I型膠原蛋白基因靈敏度高，可檢測到基因的最小濃度為10個拷貝，特異性強(qiáng)，操作簡單，樣本范圍廣，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/11GK101775438SQ200910266200
公開日2010年7月14日 申請日期2009年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日
發(fā)明者崔立國, 王宇, 王宗良, 章培標(biāo), 陳學(xué)思 申請人:中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所