專利名稱：基因重組融合蛋白k1－en的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基因重組融合蛋白K1-EN的制備方法。
背景技術：
惡性腫瘤即癌癥，是威脅人類健康的最嚴重的疾病之一。惡性實體腫瘤的常規(guī)治療包括手術摘除、化學治療、放射治療等，這些治療方法存在易復發(fā)，對人體的毒副作用大，會誘導抗藥性產生等不理想之處。生命科學基礎研究的突破和生物技術的發(fā)展，為惡性腫瘤的最終攻克提供了其他更加有效和可行的手段。
20世紀70年代初，F(xiàn)olkman博士提出“腫瘤增殖具有血管依賴性”的觀點，即體積超過1mm3～2mm3的腫瘤需要新生血管維持營養(yǎng)和氧氣的供給并且排出代謝產物，還需要新生血管提供轉移的通道。從這個觀點出發(fā)，提出一種治療腫瘤的新策略，即不直接從正面攻擊腫瘤，而是阻斷腫瘤的營養(yǎng)供應，間接地抑制腫瘤生長，使其處于休眠狀態(tài)。這就是抗血管生成療法，也被形象地稱為腫瘤的“餓死療法”。
抗血管生成療法是近幾年來腫瘤生物治療研究的熱點，與以往的方法相比，有著顯著的優(yōu)越性①廣泛的抑瘤譜；②不易產生耐藥性；③無明顯毒副作用；④藥物易于到達靶部位；⑤可同時治療腫瘤的轉移；⑥與化療和放療有協(xié)同作用。目前已發(fā)現(xiàn)了多種血管生成抑制劑，有數百種藥物進入了臨床試驗階段，大多數處于二期臨床，有十幾種藥物進入了三期臨床，它們都顯示出了初步療效和光明的治療前景。
Angiostatin(血管抑素)是人纖溶酶原(Plasminogen)的kringle1-kringle4區(qū)域，具有抑制血管內皮細胞增殖的能力。目前血管抑素已進入一期臨床試驗。其中K1(Kringle 1)不僅能有效抑制內皮細胞的增殖，還具有結合賴氨酸的能力(可以用賴氨酸親和柱純化蛋白)。
Endostatin(內皮抑素，EN)是膠原蛋白XVIII C未端片段，根據人膠原蛋白XVIII得到的人Endostatin有183個氨基酸。Endostatin含有Zn結合位點，參與結合的氨基酸殘基是位于第1，3，11位的組氨酸和第76位的天冬氨酸，其N端環(huán)繞Zn形成二聚體結構。Endostatin含有11個精氨酸，與肝素有很高的親和力。Endostatin在癌癥的臨床治療方面具有廣闊的應用前景。一是它具有很強的抑制血管生成的作用，即使是腫瘤已發(fā)生轉移，也可以抑制其進一步發(fā)展。二是Endostatin具有高特異性。對正常細胞及其它組織無明顯影響，在觀察期內沒有發(fā)現(xiàn)對機體的毒害作用。三是不誘導杭藥性產生。四是可實現(xiàn)對腫瘤的休眠療法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種基因重組融合蛋白K1-EN的制備方法，該方法利用畢赤酵母真核表達系統(tǒng)對重組基因K1-EN進行表達，從而得到一種多靶點、多功能、高效的抗腫瘤血管生成基因重組融合蛋白K1-EN。
為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案一種基因重組融合蛋白K1-EN的制備方法，其特征在于該方法，包括以下步驟a.重組質粒pPICZαA-K1-EN的構建重組質粒pPICZαA-K1-EN包括2個功能域片段和1段連接臂，2個功能域片段分別是K1基因和EN基因；1段連接臂是連接K1基因和EN基因的柔性連接臂(Gly)3；b.重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-EN/GS115的構建；c.重組融合蛋白K1-EN的表達；d.重組融合蛋白K1-EN的純化。
上述的重組質粒pPICZαA-K1-EN的構建方法為以K1基因為模板進行PCR擴增，得到約300bp的K1基因。K1片段用EcoRI和Kpn I雙酶切后插入質粒pPICZαA的EcoRI/Kpn I之間，構成重組質粒pPICZαA-K1。轉化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽性克隆。
上述的重組質粒pPICZαA-K1-EN的構建的方法為以EN基因為模板進行PCR擴增，得到約560bp的EN基因，EN片段用Kpn I和NotI雙酶切后插入重組質粒pPICZαA-K1的Kpn I/NotI之間，構成重組質粒pPICZαA-K1-EN；轉化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽性克隆。
上述的重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-EN/GS115的構建的方法為重組質粒pPICZαA-K1-EN用Sac I線性化后，電擊轉化畢赤酵母GS115，點擊參數為700V，5ms，將電擊后的混合液涂布在Zeocin濃度分別為100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培養(yǎng)2～4天，待克隆長出。
上述的重組融合蛋白K1-EN的表達方法為將重組酵母接種在BMGY中，振蕩培養(yǎng)使菌增殖至O.D.＝5～6，離心收集菌體，將菌體重懸在BMMY中，使其O.D.值達到5.0，在28℃下進行甲醇誘導。每隔24小時補加甲醇至甲醇終濃度為1.0％，發(fā)酵至第96小時時停止發(fā)酵，收獲蛋白。
上述的重組融合蛋白K1-EN的純化為用環(huán)氧氯丙烷法制備Sepharose-4B-Lys親和柱，發(fā)酵上清液首先用0.002M PBS，PH＝7.4，4℃充分透析，然后加入用0.002MPBS，PH＝7.4平衡好的親和柱，0.01M PBS，PH＝7.4洗去雜蛋白，0.2M EACA(6-氨基正己酸)/0.002M PBS，PH＝7.4洗脫，洗脫產物經0.002M PBS，PH＝7.4，4℃，2×24小時透析后凍存在-20℃。
畢赤酵母是真核表達系統(tǒng)，能以甲醇為唯一碳源，pPICZαA是分泌型表達質粒，含有醇氧化酶的強啟動子(PAOX1)，在甲醇的誘導下能表達外源蛋白，并能分泌到胞外，方便蛋白的提取與純化。畢赤酵母能通過發(fā)酵罐發(fā)酵生產大量的目的蛋白，不需要外加熱源，成本低，規(guī)模大。


圖1為重組質粒pPICZαA-K1-EN的構建流程2為K1-EN蛋白對PIEC細胞生長的抑制率曲線圖具體實施方式
本發(fā)明主要包括三大部分重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-EN/GS115的構建，重組融合蛋白K1-EN的表達與純化，重組融合蛋白K1-EN生物活性的測定。
具體方案敘述如下1 重組質粒pPICZαA-K1-EN的構建和鑒定1.1構建重組質粒pPICZαA-K1根據K1的核苷酸序列設計K1的上下游引物上游引物5’-GGG GAA TTC GTG TAT CTC TCA GAG-3’；下游引物5’-TTT GGT ACC GCC ACC TTC CTC TTC ACA C-3’。
在K1的下游引物中引入連接臂(Gly)3的核苷酸序列，這樣在PCR擴增之后就能直接得到約300bp的COOH端帶有連接臂(Gly)3的K1片段?；厥占兓瘮U增產物。
K1片段用EcoRI和Kpn I雙酶切后插入質粒pPICZαA的EcoRI/Kpn I之間，構成重組質粒pPICZαA-K1。轉化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽性克隆。重組質粒pPICZαA-K1用EcoRI和Kpn I雙酶切，得到300bp和3.6kb兩個片段，與預期結果相符。DNA序列測定表明，K1基因的序列正確。
1.2構建重組質粒pPICZαA-PFK-EN根據EN的核苷酸序列設計EN的上下游引物上游引物5’-TTT GAA TTC CAC AGC CAC CGC GAC TTC-3’；
下游引物5’-TTC GCG GCC GCT CAT TAC TTG GAG GCA-3’。以EN的cDNA為模板進行PCR擴增，得到約560bp的EN基因。EN片段用Kpn I和NotI雙酶切后插入重組質粒pPICZαA-K1的Kpn I/NotI之間，構成重組質粒pPICZαA-K1-EN。轉化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽性克隆。
重組質粒pPICZαA-K1-EN用EcoRI和NotI雙酶切，得到約860bp和3.6kb兩個片段，與預期結果相符。DNA序列測定表明，K1-EN基因的序列正確。
2 重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-EN/GS115的構建和鑒定重組質粒pPICZαA-K1-EN用Sac I線性化后，電擊轉化畢赤酵母GS115，點擊參數為700V，5ms，將電擊后的混合液涂布在Zeocin濃度分別為100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培養(yǎng)2～4天，待克隆長出。挑選Zeocin濃度為1000ug/ml平板上長出的克隆。用玻璃珠法提取重組酵母的染色體組，以其為模板，以K1-EN的上下游引物進行PCR擴增，得到約860bp大小的片段，說明融合基因K1-EN成功地整合到了酵母染色體上。
3 重組融合蛋白K1-EN的表達將重組酵母接種在BMGY中，振蕩培養(yǎng)使菌增殖至O.D.＝5～6，離心收集菌體，將菌體重懸在BMMY中，使其O.D.值達到5.0，在28℃下進行甲醇誘導。每隔24小時補加甲醇至甲醇終濃度為1.0％，并且每隔24小時(0，24，48，72，96小時)取出1ml菌液，將取出來的菌液離心，把上清液和菌體分別保存在-80℃。
將甲醇誘導不同時間(0，24，48，72，96小時)的發(fā)酵上清液濃縮后用SDS-PAGE分析，觀察到在39KD處有特異性蛋白條帶；并且隨誘導時間延長，重組酵母表達目的產物的量也隨之增加。Bradford法測定發(fā)酵液中總蛋白含量并用凝膠圖像掃描測定目的蛋白所占的比例，計算出

4 重組融合蛋白K1-EN的純化融合蛋白K1-EN中的K1具有結合賴氨酸的能力，因此可以用Sepharose 4B-Lys親和柱純化。用環(huán)氧氯丙烷法制備Sepharose-4B-Lys親和柱，發(fā)酵上清液首先用0.002MPBS，PH＝7.4，4℃充分透析，然后加入用0.002M PBS，PH＝7.4平衡好的親和柱，0.01MPBS，PH＝7.4洗去雜蛋白，0.2M EACA(6-氨基正己酸)/0.002M PBS，PH＝7.4洗脫，洗脫產物經0.002M PBS，PH＝7.4，4℃，2×24小時透析后凍存在-20℃。
SDS-PAGE電泳圖經凝膠圖像密度掃描表明，純化的重組融合蛋白K1-EN的純度到達92.3％。本發(fā)明保留進一步提高純度的可能。
5 12.8升發(fā)酵罐生產重組融合蛋白K1-EN在優(yōu)化了的發(fā)酵條件下，重組融合蛋白K1-EN的表達量達到145mg/L。
6 MTT法測定重組融合蛋白K1-EN的生物活性將純化得到的重組融合蛋白K1-EN，分別以終濃度100，50，25ng/ml加入豬髖動脈內皮細胞(PIEC)培養(yǎng)液中，用MTT比色分析法測定K1-EN蛋白對PIEC細胞生長的抑制率。圖2的抑制率曲線表明K1-EN能抑制豬髖動脈內皮細胞的生長，ID50≈85ng/ml。
7 重組菌株的遺傳穩(wěn)定性將重組酵母菌pPICZαA-K1-EN/GS115傳代10次以上后，PCR分析表明目的基因仍穩(wěn)定地整合在染色體上，SDS-PAGE結果說明目的蛋白仍然表達，Bradford法測定和凝膠圖像密度掃描證實目的蛋白的表達量基本維持不變。
重組融合基因K1-EN的核苷酸序列為GTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAAGGTGGCGGTACCCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGGTGCTCCACCTGGTTGCGCTCAACAGCCCCCTGTCAGGCGGCATGCGGGGCATCCGCGGGGCCGACTTCCAGTGCTTCCAGCAGGCGCGGGCCGTGGGGCTGGCGGGCACCTTCCGCGCCTTCCTGTCCTCGCGCCTGCAGGACCTGTACAGCATCGTGCGCCGTGCCGACCGCGCAGCCGTGCCCATCGTCAACCTCAAGGACGAGCTGCTGTTTCCCAGCTGGGAGGCTCTGTTCTCAGGCTCTGAGGGTCCGCTGAAGCCCGGGGCACGCATCTTCTCCTTTGACGGCAAGGACGTCCTGAGGCACCCCACCTGGCCCCAGAAGAGCGTGTGGCATGGCTCGGACCCCAACGGGCGCAGGCTGACCGAGAGCTACTGTGAGACGTGGCGGACGGAGGCTCCCTCGGCCACGGGCCAGGCCTCCTCGCTGCTGGGGGGCAGGCTCCTGGGGCAGAGTGCCGCGAGCTGCCATCACGCCTACATCGTGCTCTGCATTGAGAACAGCTTCATGACTGCCTCCAAG最終獲得的重組融合蛋白K1-EN的氨基酸序列為VYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPE
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權利要求
1.一種基因重組融合蛋白K1-EN的制備方法，其特征在于該方法，包括以下步驟a.重組質粒pPICZαA-K1-EN的構建重組質粒pPICZαA-K1-EN包括2個功能域片段和1段連接臂，2個功能域片段分別是K1基因和EN基因；1段連接臂是連接K1基因和EN基因的柔性連接臂(Gly)3；b.重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-EN/GS115的構建；c.重組融合蛋白K1-EN的表達；d.重組融合蛋白K1-EN的純化。
2.根據權利要求1所述的基因重組融合蛋白K1-EN的制備方法，其特征在于所述的重組質粒pPICZαA-K1的構建方法為根據K1的核苷酸序列設計K1的上下游引物上游引物5’-GGG GAA TTC GTG TAT CTC TCA GAG-3’；下游引物5’-TTT GGT ACC GCC ACC TTC CTC TTC ACA C-3’。在K1的下游引物中引入連接臂(Gly)3的核苷酸序列，用來連接K1基因和EN基因。以K1的cDNA為模板，通過PCR直接得到約300bp的COOH端帶有連接臂(Gly)3的K1片段?；厥占兓瘮U增產物。K1片段用EcoRI和Kpn I雙酶切后插入質粒pPICZαA的EcoRI/Kpn I之間，構成重組質粒pPICZαA-K1。轉化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽性克隆。
3.根據權利要求1所述的基因重組融合蛋白K1-EN的制備方法，其特征在于所述的重組質粒pPICZαA-K1-EN的構建方法為根據EN的核苷酸序列設計EN的上下游引物上游引物5’-TTT GAA TTC CAC AGC CAC CGC GAC TTC-3’；下游引物5’-TTC GCG GCC GCT CAT TAC TTG GAG GCA-3’。以EN的cDNA為模板進行PCR擴增，得到約560bp的EN基因。EN片段用Kpn I和NotI雙酶切后插入重組質粒pPICZαA-K1的Kpn I/NotI之間，構成重組質粒pPICZαA-K1-EN。轉化大腸桿菌TOP10F’，挑選出抗Zeocin的陽性克隆。
4.根據權利要求1所述的基因重組融合蛋白K1-EN的制備方法，其特征在于所述的重組酵母基因工程菌pPICZαA-K1-EN/GS115的構建的方法為重組質粒pPICZαA-K1-EN用Sac I線性化后，電擊轉化畢赤酵母GS115，點擊參數為700V，5ms，將電擊后的混合液涂布在Zeocin濃度分別為100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培養(yǎng)2～4天，待克隆長出。
5.根據權利要求1所述的基因重組融合蛋白K1-EN的制備方法，其特征在于所述的重組融合蛋白K1-EN的表達方法為將重組酵母接種在BMGY中，振蕩培養(yǎng)使菌增殖至O.D.＝5～6，離心收集菌體，將菌體重懸在BMMY中，使其O.D.值達到5.0，在28℃下進行甲醇誘導。每隔24小時補加甲醇至甲醇終濃度為1.0％，發(fā)酵至第96小時時停止發(fā)酵，收獲蛋白。
6.根據權利要求1所述的基因重組融合蛋白K1-EN的制備方法，其特征在于所述的重組融合蛋白K1-EN的純化為用環(huán)氧氯丙烷法制備Sepharose-4B-Lys親和柱，發(fā)酵上清液首先用0.002M PBS，PH＝7.4，4℃充分透析，然后加入用0.002M PBS，PH＝7.4平衡好的親和柱，0.01M PBS，PH＝7.4洗去雜蛋白，0.2M EACA(6-氨基正己酸)/0.002M PBS，PH＝7.4洗脫，洗脫產物經0.002M PBS，PH＝7.4，4℃，2×24小時透析后凍存在-20℃。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基因重組融合蛋白K1－EN的制備方法。該方法包括以下步驟重組質粒pPICZαA－K1－EN的構建、重組酵母基因工程菌pPICZαA－K1－EN/ GS115的構建、重組融合蛋白K1－EN的表達、重組融合蛋白K1－EN的純化。畢赤酵母是真核表達系統(tǒng)，能以甲醇為唯一碳源，pPICZαA是分泌型表達質粒，含有醇氧化酶的強啟動子(P
文檔編號C07K1/00GK1896245SQ20061002620
公開日2007年1月17日 申請日期2006年4月28日 優(yōu)先權日2006年4月28日
發(fā)明者黃筱穎, 陳宇光 申請人:上海大學