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基于基因沉默技術(shù)的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylationfactor及其dsRNA的制作方法

文檔序號:395819閱讀:219來源:國知局
專利名稱:基于基因沉默技術(shù)的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylation factor及其dsRNA的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域,涉及基于基因沉默技術(shù)的灰飛虱致死基因片段 ADP-r ibosy Iat ion factor 及其 dsRNA。
背景技術(shù)
在我國,化學藥劑連續(xù)單一長期使用已導致灰飛虱對多種農(nóng)藥產(chǎn)生了不同程度的抗性,需要不斷加大農(nóng)藥使用量才能達到滿意的防治效果,造成了更為嚴重的環(huán)境污染,形成惡性循環(huán)。另外灰飛虱傳播條紋病毒引起的水稻條紋葉枯病,發(fā)病后藥劑控制效果較差, 只能依靠治蟲防病。因此,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中,急需化學農(nóng)藥之外的替代防治手段。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是一種由雙鏈RNA介導的基因沉默現(xiàn)象,雙鏈RNA最終被加工大小約為22nt的小RNA (siRNA),通過序列配對的方式與蛋白編碼基因結(jié)合,根據(jù)序列配對的程度降解靶標基因mRNA或抑制基因的蛋白翻譯過程。RNAi廣泛地存在于真菌、植物和動物中。2006年Andre Fire和Craig Mello因發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象被授予諾貝爾醫(yī)學與生理獎。在生物體中,一些重要的基因?qū)S持生命是必須的。因此,從理論上而言,如果利用RNA干擾技術(shù)將農(nóng)業(yè)害蟲中重要基因的表達進行干擾,則會引起害蟲的致畸或致死,從而達到控制害蟲的目的。本專利發(fā)明就是利用實驗室改進的dsRNA喂食法從灰飛虱中篩選出經(jīng)干擾后能夠?qū)е禄绎w虱死亡的重要基因,為建立利用RNA干擾技術(shù)控制害蟲的新策略提供序列和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足,提供一種灰飛虱致死基因片段 ADP-r ibosy Iat ion factor 及其克隆方法。本發(fā)明的另一方法是提供該致死基因片段ADP-ribosylation factor的dsRNA及其合成方法。本發(fā)明的又一目的是提供一種用于篩選致死基因的dsRNA喂食法。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylation factor,序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylation factor的克隆方法,包括如下步驟(1)取灰飛虱,提取總RNA,以提取的灰飛虱總RNA合成cDNA第一條鏈;(2)以步驟(1)合成的灰飛虱cDNA第一條鏈為模板,以序列為SEQ ID N0. 2的上游引物Pl、序列為SEQ ID N0. 3的下游引物P2進行RT-PCR擴增;(3) PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離,回收目標DNA片段;(4)將回收的目標DNA片段在T3連接酶作用下插入至pEASY_T3載體中,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Tl,涂于含有x-gal、IPTG以及氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基,37°C培養(yǎng),過夜;(5)通過挑選白 色單菌落,篩選陽性重組子;(6)用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液將重組子擴增,提取克隆質(zhì)粒;(7)全自動序列儀進行測序,得到SEQ ID NO. 1所示的ADP-ribosylation factor 基因片段。其中,所述的RT-PCR擴增體系為反應緩沖液5μ L,Mg2+4y L,dNTP 4μ L,cDNA模板 2yL,上游引物 Pl lyL,下游引物 P2 1 μ L,R-Tag 酶 0. 5 μ L,ddH20 32. 5 μ L,共 50 μ L。灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylationfactor 的 dsRNA,序列如 SEQ ID Ν0· 4所不。所述的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylation factor的dsRNA的合成方法, 是以灰飛虱cDNA第一條鏈為模板,以序列為SEQ ID W). 5的上游引物P3、序列為SEQ ID N0. 6的下游引物P4進行PCR擴增得到灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylation factor的 dsRNA。所述的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylation factor的dsRNA的合成方法優(yōu)選包含如下步驟(1)根據(jù)已經(jīng)驗證的ADP-ribosylation factor基因片段序列,設計并合成序列為SEQ ID N0. 5的引物3和序列為SEQ ID N0. 6的引物4,以灰飛虱cDNA第一條鏈為模板 PCR擴增得到灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylation factor的dsRNA,PCR體系為反應緩沖液 5 μ L,Mg2+4 μ L,dNTP 4 μ L,cDNA 模板 2 μ L ;上游引物 Ρ3 2 μ L,下游引物 P4 2 μ L, ExTap 酶 0. 25 μ L, ddH20 30. 75 μ L,共 50 μ L ;PCR 條件為94°C 變性 2min,94°C 30sec, 55-62°C 30sec,72°C 30sec,38 個循環(huán),72°C延伸。(2)PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為的低熔點瓊脂糖凝膠電泳分離;(3)回收目標DNA產(chǎn)物。一種灰飛虱的dsRNA喂食方法,包含如下步驟(1)將玻璃管的一端封好,用吸蟲器吸取二齡的灰飛虱加入玻璃管內(nèi),用紗布將玻
璃管另一端封好;(2)將蟲子拍打至玻璃管封口端,將另一端的紗布取下,將已經(jīng)準備好的封口膜, 貼紙的一面朝上,蓋到玻璃管管口上,將管豎立放置;(3)用移液槍吸取含dsRNA的飼料滴在膜的中央,用一個新的封口膜,貼紙的一面朝下,貼在玻璃管管口上,將飼料和dsRNA封在兩層封口膜之間;(4)將加好飼料和dsRNA的玻璃管放回養(yǎng)蟲室的養(yǎng)蟲架上,房間溫度為26°C,利用灰飛虱的趨光習性僅在飼料端給予光照,使其趨食飼料,每24h換一次含dsRNA的飼料。其中所述的dsRNA優(yōu)選所述的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylation factor的 dsRNA。有益效果利用RNAi技術(shù)沉默ADP-ribosylation factor基因,對灰飛虱具有明顯的致死效果,說明該基因可作為利用RNA干擾技術(shù)控制害蟲的有效靶點。本發(fā)明合成的ADP-ribosylation factor基因dsRNA能有效沉默 ADP-ribosylation factor基因,更好地抵抗RNA酶的降解,同時合成成本較低,便于大量實驗或商業(yè)化使用。本發(fā)明采用改進的喂食法進行RNAi干擾實驗,相對注射法,減少了蟲體的機械損傷,更加便于實驗操作。最終通過喂食實驗驗證了 ADP-ribosylation factor基因的RNAi 對灰飛虱具有致死效果,為建立利用RNA干擾技術(shù)控制害蟲的新策略提供新的實驗手段。


圖 IdsRNA 合成電泳圖,泳道 1 =Marker,泳道 2 ADP-ribosylation factor 的 dsRNA。圖2dsRNA喂食實驗致死率統(tǒng)計圖?!?”表示該系數(shù)在0. 05顯著性水平上是可以接受的,也就是說,該系數(shù)的可靠度在95%以上;“**”表示該系數(shù)在0. 01的顯著性水平上可以接受,即它的可靠度在99%以上。
具體實施例方式實施例11. ADP-ribosylation factor 基因片段的克隆方法(1)取灰飛虱10-20頭,用TRIzoI法提取總RNA ;
(2)合成cDNA第一條鏈;(3)從灰飛虱轉(zhuǎn)錄組中獲取基因片段序列,在http://www. ncbi. nlm. nih. gov/進行同源性比對之后,預測為灰飛虱ADP-ribosylation factor基因,利用Primer premier 5. 0軟件設計Pl和P2,以RT-PCR方法進行擴增;上游引物(Pl)5' TGAAGGCAGTCAGGAAA 3' (SEQ ID N0. 2),下游引物(P2)5' TAGGCTTATTATCACCACAAC 3' (SEQ ID N0. 3);PCR 條件為94°C變性 2min,94°C 30sec,55°C 30sec,72°C 30sec,35 個循環(huán),72°C 延伸PCR 反應體系(50 μ L)
反應緩沖液
Mg2+4μL
dNTP4μL
cDNA 模板
上游引物PlΙμ
下游引物P 2Ιμ
R- Tag 酶0.5μ
ddH2032.5μ
總體積50μ
(4) PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離,回收目標DNA片段;(5)將回收的目標片段在T3連接酶作用下插入至PEASY-T3載體中,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Tl,涂于含x-gal 0. 02g/ml、IPTGO. 2g/ml以及氨芐青霉素50ng/ml的LB培養(yǎng)基,37°C 培養(yǎng),過夜;(6)通過挑選白色單菌落,篩選陽性重組子;(7)用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液將重組子擴增,提取克隆質(zhì)粒;(8)全自動序列儀進行測序(由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司完成),即可得到SEQ IDN0. 1所示的核苷酸序列的ADP-ribosylation factor基因片段。實施例2. dsRNA合成及回收(1)根據(jù)已經(jīng)驗證的ADP-ribosylation factor基因片段序列,采用 Primer Premier 5. 0軟件設計P3和P4,在上下游引物5,端加入T7啟動子序列 TAATACGACTCACTATAGGG ;上游引物(P4):5'TAATACGACTCACTATAGGGTGAAGGCAGTCAGGAAA 3' (SEQ ID NO. 5)上游引物(P5):5'TAATACGACTCACTATAGGGTAGGCTTATTATCACCACAAC 3 ‘ (SEQ IDN0. 6)
反應緩沖液5 μιMg2+4μLdNTP4μLcDNA模板2μL上游引物P32μL下游引物P42μLEx Tap 酶0.25μ ddH2030.75μ 總體積50μ PCR 條件94°C變性 2min,94°C 30sec,60°C 30sec,72°C 30sec,38 個循環(huán),72°C延伸。(2) PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為的低熔點瓊脂糖凝膠電泳分離并在紫外燈下進行觀察, 結(jié)果見圖1,其序列見SEQ ID N0. 4。(3)采用 Promega 公司的Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System 試劑盒進行回收①對分離得到的目標片段切膠,并放入稱量過重量(a)的1. 5ml微量離心管中,再次稱量(b),b-a算得所切膠重;②根據(jù)膠重,每IOmg凝膠加入10 μ L Membrane Binding Solution。凝膠重量不超過350mg ;③將凝膠放入50_65°C水浴鍋中水浴IOmin或者直到凝膠完全融化;
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④將試劑盒中的濾管放置在配套的收集管中,轉(zhuǎn)移融化的凝膠液體至濾管中,室溫放置Imin ;⑤16,000 Xg (14,OOOrpm)離心lmin,棄去收集管中的液體;⑥力口入 700 μ 1 Membrane Wash Solution (已力口入 95 % 酒精), 16, 000 Xg (14, OOOrpm)離心lmin,棄去收集管中的液體;⑦力口入 500 μ 1 Membrane Wash Solution (已力口入 95 % 酒精), 16, 000 Xg (14, OOOrpm)離心5min,棄去收集管中的液體;⑧不加液體空轉(zhuǎn)Imin ;⑨轉(zhuǎn)移濾管到1. 5ml微量離心管中,加入50 μ 1 Nuclease-Free Water,室溫放置 lmin, 16,000 Xg (14,OOOrpm)離心 Imin ;⑩收集到的DNA產(chǎn)物保存在4°C或_20°C。實施例3. dsRNA喂食實驗(1)將玻璃管的一端用封口膜封好,用吸蟲器吸取二齡的灰飛虱加入玻璃管內(nèi),用紗布將另一端封好;(2)將蟲子輕輕用手拍打至一端,將另一端的紗布取下,將已經(jīng)準備好的封口膜貼紙的一面朝上,均勻用力向兩側(cè)拉,拉成正方形,然后蓋到玻璃管管口上,將管豎立放置在超凈臺面上;(3)用移液槍吸取飼料100 μ 1滴在封口膜的中央,對照只加飼料(配方見表1), 處理組在飼料中加入ADP-ribosylation factor基因的dsRNA,dsRNA的濃度為4337ng/ μ 1,用一個新的封口膜,貼紙的一面朝下,貼在玻璃管管口上,將飼料和dsRNA封在兩層封口膜之間;(4)將加好飼料和dsRNA的玻璃管放回養(yǎng)蟲室的養(yǎng)蟲架上,房間溫度為26°C,利用灰飛虱的趨光習性僅在飼料端給予光照,使其趨食飼料,每24h換一次飼料和dsRNA ;(5)連續(xù)喂食五天,每24h統(tǒng)計一次死亡率,結(jié)果見圖2,由圖2可見喂食致死基因 ADP-ribosylation factor的dsRNA能夠達到很好的致死效果。表 1組分mg / IOOml組分mg / 100mlI.氨基酸L-Leu (亮)240L-Gln (谷氨酰胺)240L-Cyss (胱)20L-His (組)80L-Tyr (酪)10L-Met (甲硫)70L-Glu (谷)250L-Ilc (異亮)100L-Gly (甘)30L-Pro (脯)10 L-Ala (丙)130L-Lys (賴)200L-Arg (精)175L-Phe (苯丙)20 L-Asn (天冬酰胺)220L-Ser (絲)400L-Asp (天冬氨酸)100L-Thr (蘇)130L-Cys (半胱)80L-Trl (色)105L-val (纈氨酸)300L-GABA (氨基丁酸)10II.維生素ΠΙ.無機鹽生物索0.05CaCl2 2H203.115泛酸鈣5CuCl2 2H200.268氯化膽堿60FeCl3 GR2O2.228葉酸2.5MnCl2. 4H200.793肌醇50ZnCl20.396煙酸15MgCl2. 6H2020 VB62.5KH2PO4500核黃素2IV.其它硫胺素2.5蔗糖(g)9Vc100PH6.8
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權(quán)利要求
1.灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylationfactor,其特征在于序列如SEQ ID NO. 1 所示。
2.權(quán)利要求1所述的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylationfactor的克隆方法,其特征在于包括如下步驟(1)取灰飛虱,提取總RNA,以提取的灰飛虱總RNA合成cDNA第一條鏈;(2)以步驟(1)合成的灰飛虱cDNA第一條鏈為模板,以序列為SEQID NO. 2的上游引物Pl、序列為SEQ ID NO. 3的下游引物P2進行RT-PCR擴增;(3)PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離,回收目標DNA片段;(4)將回收的目標DNA片段在T3連接酶作用下插入至PEASY-T3載體中,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Tl,涂于含有X-gal、IPTG以及氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基,37°C培養(yǎng),過夜;(5)通過挑選白色單菌落,篩選陽性重組子;(6)用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液將重組子擴增,提取克隆質(zhì)粒;(7)全自動序列儀進行測序,得到SEQID NO. 1所示的ADP-ribosylation factor基因片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylationfactor的克隆方法,其特征在于所述的RT-PCR擴增體系為反應緩沖液5 μ L,Mg2+4 μ L,dNTP 4 μ L,cDNA模板 2μ L,上游引物 1μ L,下游引物 1μ L,R-Tag 酶 0. 5μ L,ddH20 32. 5 μ L,共 50 μ L ; PCR 條件為94°C變性 2min,94°C 30sec,55_62°C 30sec,72°C 30sec,38 個循環(huán),72°C延伸。
4.權(quán)利要求1所述的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylationfactor的dsRNA,其特征在于序列如SEQ ID NO. 4所示。
5.權(quán)利要求4所述的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylationfactor的dsRNA的合成方法,其特征在于以灰飛虱cDNA第一條鏈為模板,以序列為SEQ ID NO. 5的上游引物P3、序列為SEQ ID N0.6的下游引物P4進行PCR擴增得到灰飛虱致死基因片段 ADP-ribosylation factor 白勺 dsRNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylationfactor的dsRNA的合成方法,其特征在于包含如下步驟(1)根據(jù)已經(jīng)驗證的ADP-ribosylationfactor基因片段序列,設計并合成序列為SEQ ID NO. 5的P3和序列為SEQ ID NO. 6的P4,以灰飛虱cDNA第一條鏈為模板PCR擴增得到灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylation factor的dsRNA,PCR體系為反應緩沖液5 μ L, Mg2+4 μ L,dNTP 4 μ L,cDNA 模板 2 μ L ;上游引物 2 μ L,下游引物 2 μ L,Ex Tap 酶 0. 25 μ L, ddH20 30. 75 μ L,共 50 μ L ;PCR 條件為94 "C 變性 2min,94 "C 30sec,55-62 "C 30sec, 72°C 30sec,38 個循環(huán),72°C延伸;(2)PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為的低熔點瓊脂糖凝膠電泳分離;(3)回收目標DNA產(chǎn)物。
7.一種灰飛虱的dsRNA喂食方法,其特征在于包含如下步驟(1)將玻璃管的一端封好,用吸蟲器吸取二齡的灰飛虱加入玻璃管內(nèi),用紗布將玻璃管另一端封好;(2)將蟲子拍打至玻璃管封口端,將另一端的紗布取下,將已經(jīng)準備好的封口膜,貼紙的一面朝上,蓋到玻璃管管口上,將管豎立放置;(3)用移液槍吸取含dsRNA的飼料滴在膜的中央,用一個新的封口膜,貼紙的一面朝下,貼在玻璃管管口上,將飼料和dsRNA封在兩層封口膜之間;(4)將加好飼料和dsRNA的玻璃管放回養(yǎng)蟲室的養(yǎng)蟲架上,房間溫度為26°C,利用灰飛虱的趨光習性僅在飼料端給予光照,使其趨食飼料,每24h換一次含dsRNA的飼料。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的dsRNA喂食方法,其特征在于所述的dsRNA為權(quán)利要求4所述的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylation factor的dsRNA。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域,涉及基于基因沉默技術(shù)的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylation factor及其dsRNA。本專利發(fā)明就是利用實驗室改進的dsRNA喂食法從灰飛虱中篩選出經(jīng)干擾后能夠?qū)е禄绎w虱死亡的序列如SEQ ID NO.1所示的灰飛虱致死基因片段ADP-ribosylation factor,利用該基因片段的dsRNA喂養(yǎng)灰飛虱,能夠達到很好的致死效果,為建立利用RNA干擾技術(shù)控制害蟲的新策略提供序列和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/113GK102220342SQ20111012301
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月12日
發(fā)明者姜衛(wèi)華, 李國清, 李飛, 董雙林, 韓召軍 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學
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