專利名稱：用于dna介導(dǎo)基因沉默的組合物的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總體上涉及轉(zhuǎn)錄后基因沉默，特別是涉及DNA介導(dǎo)的通過(guò)RNA干擾進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。
背景信息去除一個(gè)基因的表達(dá)可以提供給研究者有關(guān)該基因功能的信息。在蛋白水平這可以通過(guò)運(yùn)用特異性抑制劑抑制蛋白質(zhì)功能而實(shí)現(xiàn)或者在RNA水平通過(guò)阻止mRNA翻譯成蛋白質(zhì)來(lái)完成。用于RNA水平抑制的傳統(tǒng)方法包括反義寡核苷酸和核酶。這些抑制基因表達(dá)的方法也提供了對(duì)人類疾病的潛在治療方法。
新近在mRNA水平沉默基因表達(dá)的方法，稱為RNA干擾或RNAi，已經(jīng)成為較以前的技術(shù)而言非常有力的備選方法。它通過(guò)大量未知然而卻比反義機(jī)制更加有效的機(jī)制起作用。雙鏈RNA(“dsRNA”)參與這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默，轉(zhuǎn)錄后基因沉默在植物和真菌中是天然存在的現(xiàn)象(Cogoni和Macino，Curr.Opin.Microbiol.6657-62.1999)。當(dāng)導(dǎo)入蠕蟲、蒼蠅、或早期小鼠胚胎時(shí)，dsRNA可誘導(dǎo)降解與dsRNA的一條鏈具相同序列的mRNA的細(xì)胞反應(yīng)(Fire，Trends Genet.9358-363，1999)。在一些系統(tǒng)中，少量dsRNA拷貝能誘導(dǎo)靶mRNA全面降解(Fire等，Nature 6669806-811，1998)。RNAi可與mRNA中幾乎任何序列非常成功高效地作用(Caplen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 179742-9747，2001)。
RNAi作為基因功能研究工具非常有前途，如果能夠?qū)⑵涑晒Φ赜糜诓溉閯?dòng)物細(xì)胞或有機(jī)體，RNAi則是人類疾病的潛在治療方式。RNAi在大多數(shù)哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中基本上是不成功的，這一狀況直到最近由于與用于蠕蟲和果蠅的dsRNA相似的dsRNA的導(dǎo)入，通過(guò)有PKR和干擾素參與的哺乳動(dòng)物抗病毒系統(tǒng)誘導(dǎo)了基因表達(dá)的普遍阻斷而得以改變(Caplen等，Gene 1-295-105.2000；Oates等，Devel.Biol.120-8.2000)。然而，通過(guò)使用一個(gè)短的21到23個(gè)核苷酸的dsRNA，Elbashir等和其他研究者的研究表明小的干擾RNA(siRNA)能夠降低或敲低(knock-down)特異基因的表達(dá)，而不至于引起基因表達(dá)的普遍關(guān)閉(Caplen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 179742-7.2001；Elbashir等，Nature 6836494-8.2001)。
聚合酶III啟動(dòng)子的使用能夠有效地在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA。例如，象U6啟動(dòng)子一樣，同樣是聚合酶III的III類啟動(dòng)子的H 1-RNA啟動(dòng)子已用于質(zhì)粒載體中，以直接轉(zhuǎn)錄出一短的發(fā)夾RNA，隨后該發(fā)夾RNA在細(xì)胞內(nèi)被加工產(chǎn)生siRNA(Brummelkamp等，Science 296550-553.2002)。同樣U6啟動(dòng)子也用于產(chǎn)生短的發(fā)夾RNA(Paddison等，Genes Devel.8948-958.2002；Paul等，Nat.Biotechnol.5505-508.2002；Sui等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85515-20.2002；Yu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96047-6052.2002)，或有意和反義siRNAs(Lee等，Nat.Biotechnol.5500-505，2002；Miyagishi和Taira，Nat.Biotechnol.5497-500，2002；Yu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96047-52，2002)。短的發(fā)夾RNAs(shRNAs)能夠模擬天然存在的可能與RNAi相關(guān)的小RNA(micro-RNAs；miRNAs)。然而，當(dāng)前有關(guān)設(shè)計(jì)和將此類人工shRNA加工成RNAi誘導(dǎo)者功能的資料仍然相互矛盾。例如，一篇報(bào)道發(fā)現(xiàn)發(fā)夾環(huán)的大小(如多于7個(gè)核苷酸)和序列非常重要(Brummelkamp等，見上文，2002)，而其他人采用較短的環(huán)(1，4或6個(gè)核苷酸)也成功了(Paddison等，見上文，2002；Paul等，見上文，2002；Sui等，見上文，2002；Yu等，見上文，2002)。基因沉默的效應(yīng)在一些情況下依賴于發(fā)夾中有意鏈和反義鏈的次序和方向(Paddison等，見上文，2002)，但是在其他人看來(lái)是不重要的或不相干的(Paul等，見上文，2002)(Yu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96047-52.2002)。所有上述的研究都利用了短的III類聚合酶III啟動(dòng)子和其簡(jiǎn)單的終止子產(chǎn)生了高拷貝數(shù)量的短轉(zhuǎn)錄物。盡管觀察到了具有誘導(dǎo)非特異性表達(dá)關(guān)閉潛能的較長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，簡(jiǎn)單的天然終止子可能不足以在預(yù)期位置終止所有轉(zhuǎn)錄(Lee等，見上文，2002)。在用水動(dòng)力學(xué)轉(zhuǎn)染方法將合成的siRNA或從U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的shRNA導(dǎo)入成年小鼠內(nèi)后能夠有效地使轉(zhuǎn)基因或病毒基因沉默(McCaffrey等，Nature 41838-39，2002)。
將長(zhǎng)的或短的通過(guò)體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄分離的、在可溶性細(xì)胞提取物中加工得到的或化學(xué)合成的dsRNA分子導(dǎo)入細(xì)胞的方法具有嚴(yán)重的局限性。一個(gè)局限是分離的dsRNA所介導(dǎo)的基因沉默，也稱作基因敲低，只是暫時(shí)的，因?yàn)橛蒖NA分子所攜帶的遺傳信息不能整合到宿主細(xì)胞的染色體上，所以dsRNA的效應(yīng)只在有限次的細(xì)胞分裂過(guò)程中維持。另一個(gè)局限是RNA分子特別不穩(wěn)定，易于被環(huán)境中大量存在的RNase降解。因此操作RNA分子需要格外小心。將RNA分子用于治療目的是不切實(shí)際的。經(jīng)修飾的RNA，如在核苷酸上加入保護(hù)基團(tuán)或改變多核苷酸鏈的骨架能夠提高穩(wěn)定性，就象在許多反義研究中那樣。然而，經(jīng)修飾RNA分子的幾種形式雖然較天然RNA相比能夠?qū)Nase的降解作用具有更強(qiáng)的抵抗性但會(huì)出現(xiàn)RNAi能力的減弱或丟失，而用DNA替換dsRNA中的一條鏈根本不能誘導(dǎo)產(chǎn)生RNAi(Parish等，Mol.Cell 51077-87.2000)。此外，制備RNA分子的費(fèi)用很高并且方法繁瑣而復(fù)雜。
由于存在這些局限性，能夠提供永久的導(dǎo)入細(xì)胞或生物體(如哺乳動(dòng)物，例如小鼠或人)，和/或不依賴于使用RNA分子作為載體的用于基因沉默的材料和方法具有巨大的經(jīng)濟(jì)利益。另一方面，DNA分子比RNA分子更加穩(wěn)定且成本效率更高。DNA分子可以被整合到宿主細(xì)胞基因組并且在宿主細(xì)胞內(nèi)具有長(zhǎng)期的效應(yīng)。DNA分子相對(duì)容易合成和操作。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于靶基因表達(dá)抑制和利用DNA作為工具降解靶RNA的方法和組合物。這種方法是指“DNA介導(dǎo)的基因沉默”(“DMSG”“De-message”)。這樣，本發(fā)明提供了通過(guò)對(duì)靶細(xì)胞(例如，預(yù)對(duì)其中特定RNA進(jìn)行降解的細(xì)胞)用RNA干擾效應(yīng)進(jìn)行的諸如真核細(xì)胞或生物體內(nèi)(包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞或有機(jī)體在內(nèi))基因特異的干擾。本發(fā)明提供了不必要在靶細(xì)胞外操作RNA分子而實(shí)現(xiàn)RNAi的好處?？梢哉T導(dǎo)RNAi用于短暫的基因敲低，還可以用于永久的基因敲低，因?yàn)榫幋aRNAi的DNA分子可以插入到靶細(xì)胞內(nèi)的染色體上。相應(yīng)的，DMSG也可以用于產(chǎn)生遺傳學(xué)上修飾的動(dòng)物，它是通過(guò)將DMSG摻入生殖系統(tǒng)，從而能夠提供根據(jù)設(shè)計(jì)組成型表達(dá)或使用誘導(dǎo)試劑誘導(dǎo)表達(dá)編碼RNAi的下一代動(dòng)物。這樣，本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是基因特異的沉默可以限定在一種或少數(shù)幾種細(xì)胞類型，或限定在特定時(shí)間，而不導(dǎo)致在機(jī)體其它細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生全面的基因關(guān)閉。
本發(fā)明涉及含有編碼中間體小干擾核糖核酸(RNA)分子(siRNA)的至少約16個(gè)核苷酸的可表達(dá)的模板核苷酸序列的分離脫氧核糖核酸(DNA)，這種干擾核糖核酸分子能夠介導(dǎo)靶RNA的RNA干擾。在一個(gè)實(shí)施方案中，中間體siRNA包含與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的至少約15個(gè)核苷酸的5’部分和任選地包含約1-5個(gè)核苷酸的3’端部分，并且這種中間體siRNA被設(shè)計(jì)成能夠與靶RNA有意鏈進(jìn)行選擇性雜交。在另一個(gè)實(shí)施方案中，中間體siRNA包含與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的至少約15個(gè)核苷酸的5’部分和任選地包含約1-5個(gè)核苷酸的3’端部分，并且這種中間體siRNA被設(shè)計(jì)成能夠與靶RNA反義鏈進(jìn)行選擇性雜交。在上述實(shí)施方案的一個(gè)方面，中間體siRNA包括1-5個(gè)核苷酸的3’端部分，在一個(gè)進(jìn)一步的方面中，這種3’端部分不能夠分別與靶RNA的有意鏈或反義鏈互補(bǔ)。
本發(fā)明還提供了DNA介導(dǎo)基因表達(dá)沉默(DMSG)盒(也叫做LineSilenceTM盒)，它包括可操作地連接到至少一個(gè)異源核苷酸序列上的上述分離的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，DMSG盒包括可操作連接的RNA聚合酶III(pol III)啟動(dòng)子和可表達(dá)的模板核苷酸序列和末端，或者能夠在特定核苷酸位置切開成為末端，以至于預(yù)定長(zhǎng)度和組成的“脫落式(run-off)”中間體siRNA能夠被表達(dá)，其中可表達(dá)的模板核苷酸序列相對(duì)于聚合酶III啟動(dòng)子而言是異源的，并且由能夠編碼中間體siRNA的至少約16個(gè)核苷酸組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，LineSilenceTM盒包括可操作連接的RNA聚合酶III(pol III)啟動(dòng)子和可表達(dá)的模板核苷酸序列和至少一個(gè)聚合酶III終止子，其中可表達(dá)的模板核苷酸序列相對(duì)于聚合酶III啟動(dòng)子而言是異源的，并且由能夠編碼中間體siRNA的至少約16個(gè)核苷酸組成。中間體siRNA可以包括至少約15個(gè)核苷酸的5’部分，它能夠與靶RNA的有意鏈互補(bǔ)，和任選地包括約1-5個(gè)核苷酸的3’端部分，其中中間體siRNA選擇性地與靶RNA的有意鏈進(jìn)行雜交；或者中間體siRNA可以包括至少約15個(gè)核苷酸的5’部分，它能夠與靶RNA的反義鏈互補(bǔ)，和任選地包括約1-5個(gè)核苷酸的3’端部分，其中中間體siRNA選擇性地與靶RNA的反義鏈進(jìn)行雜交。例如，中間體siRNA可以是長(zhǎng)度約為21-23個(gè)核苷酸，它可包括長(zhǎng)度約為1-4個(gè)核苷酸的3’端部分。
當(dāng)本發(fā)明的DMSG盒中存在聚合酶III啟動(dòng)子或聚合酶III終止子或這兩者時(shí)，它們可以是哺乳動(dòng)物U6基因聚合酶III啟動(dòng)子或聚合酶III終止子，例如人U6基因聚合酶III啟動(dòng)子或終止子(或兩者)或小鼠U6基因聚合酶III啟動(dòng)子或終止子或兩者。例如，LineSilenceTM盒可包括可操作連接的下述有意多核苷酸序列，所述序列包含SEQ ID NO1中的核苷酸6-13、SEQ ID NO1中的核苷酸19-38、SEQ ID NO1中的核苷酸66-69、模板核苷酸序列和至少一個(gè)包含TTTT四核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄終止子；反義多核苷酸，它與上述的核苷酸序列互補(bǔ)；或包括可以選擇性地彼此雜交的上述有意多核苷酸和反義多核苷酸的雙鏈多核苷酸。當(dāng)此種雙鏈DMSG編碼的中間體siRNA分子包括任選的1-5個(gè)核苷酸的3’端部分時(shí)，通過(guò)DMSG盒表達(dá)形成siRNA分子，并且所述中間體siRNA分子選擇性雜交形成在雙鏈siRNA的每一條鏈上包含1-5個(gè)核苷酸的3′突出端。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，DMSG盒包含編碼第一中間體siRNA的可表達(dá)模板核苷酸序列，且該可表達(dá)的模板核苷酸序列進(jìn)一步可操作地連接到編碼第二中間體siRNA的第二個(gè)可表達(dá)模板核苷酸序列上。在該實(shí)施方案的另一方面，第二中間體siRNA的5’部分與第一中間體siRNA的5’部分互補(bǔ)，于是當(dāng)表達(dá)時(shí)第一中間體siRNA的5’部分選擇性地與第二中間體siRNA的5’部分雜交，從而形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
當(dāng)存在DMSG盒的轉(zhuǎn)錄終止子時(shí)，其可以包括天然聚合酶III終止子的核苷酸序列，例如包含SEQ ID NO48的人U6基因終止子或包含SEQID NO49的小鼠U6基因終止子；或可以包含設(shè)計(jì)用來(lái)在特定核苷酸處終止聚合酶III轉(zhuǎn)錄的經(jīng)修飾聚合酶III終止子，例如如SEQ ID NO50或SEQ ID NO51所列的那些經(jīng)修飾的聚合酶III終止子。此外，DMSG盒可進(jìn)一步包括可操作連接的增強(qiáng)子，它可以是組成型的活化增強(qiáng)子或可誘導(dǎo)的增強(qiáng)子。
當(dāng)DMSG盒為雙鏈DNA分子時(shí)，一條鏈能夠編碼與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的第一中間體siRNA，且第二鏈能夠編碼與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的第二中間體siRNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼的第一中間體siRNA和第二中間體siRNA能夠選擇性地雜交，形成能夠介導(dǎo)RNA干擾的雙鏈siRNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，此種雙鏈siRNA在每個(gè)3′末端具有1-5個(gè)核苷酸的3′突出。也提供了包含本發(fā)明DMSG盒的載體，以及含有存在于載體中的DMSG盒的細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及介導(dǎo)靶RNA的RNA干擾的方法，通常在細(xì)胞中，通過(guò)表達(dá)至少一種中間體siRNA，并一般往往表達(dá)至少第一中間體siRNA和第二中間體siRNA，其中第一和第二siRNA的5’部分選擇性地彼此雜交。因此，本發(fā)明涉及細(xì)胞中介導(dǎo)靶RNA的RNA干擾的方法，例如，通過(guò)將至少一種DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞，從而表達(dá)DMSG盒編碼的siRNA(包括中間體siRNA)，激發(fā)靶RNA的降解，于是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)RNA干擾。此外，本發(fā)明還提供了敲低樣本中靶基因表達(dá)的方法，例如，通過(guò)使樣本與至少一種DMSG盒接觸，從而表達(dá)DMSG盒編碼的siRNA(包括中間體siRNA)，激發(fā)靶基因編碼的靶RNA分子的降解，從而敲低樣本中靶基因的表達(dá)。
本發(fā)明還涉及在細(xì)胞群體中，示蹤經(jīng)歷DNA介導(dǎo)的基因沉默的特定細(xì)胞或特定細(xì)胞組群的方法。此種方法可通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)將至少一種可檢測(cè)的標(biāo)記DMSG盒導(dǎo)入特定細(xì)胞或特定細(xì)胞組群中的每個(gè)細(xì)胞；和監(jiān)測(cè)可檢測(cè)的標(biāo)記，從而在細(xì)胞群體中示蹤特定細(xì)胞或特定細(xì)胞組群。此外，本發(fā)明還涉及鑒定發(fā)生DNA介導(dǎo)的基因沉默的細(xì)胞的方法，例如，在足以將DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞的條件下，通過(guò)將至少一個(gè)細(xì)胞與至少一種可檢測(cè)的標(biāo)記DMSG盒接觸；和檢測(cè)細(xì)胞中可檢測(cè)標(biāo)記的存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法是通過(guò)將相同的或不同的DMSG盒的陣列在適于將DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞的條件下與細(xì)胞接觸，從而通過(guò)反向轉(zhuǎn)染將陣列的DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及評(píng)價(jià)測(cè)試細(xì)胞中基因功能的方法。該方法可以通過(guò)以下步驟完成，例如，通過(guò)將至少一種DMSG盒導(dǎo)入測(cè)試細(xì)胞，和觀察當(dāng)DMSG盒編碼的siRNA(包括中間體siRNA)表達(dá)時(shí)測(cè)試細(xì)胞的表型，從而測(cè)試細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞的表型的比較可以指示靶基因的功能，從而評(píng)價(jià)測(cè)試細(xì)胞中基因的功能。此種方法特別適合于高通量分析，例如，如可能的話，利用細(xì)胞微陣列方法檢測(cè)多種基因的功能，其中不同的DMSG盒定位于固體支持物如載玻片或硅片上的陣列上，特別是可尋址陣列，并且在適于將陣列的DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞的條件下將陣列與細(xì)胞接觸。在陣列某一位置上細(xì)胞表型變化的鑒定允許評(píng)價(jià)與點(diǎn)在陣列位置上的特定DMSG盒相關(guān)的基因。
此外，本發(fā)明還涉及測(cè)定一種試劑是否能作用或影響在測(cè)試細(xì)胞中某個(gè)特異基因的方法，特別是作用或影響特異基因的表達(dá)的方法。此種方法可按以下進(jìn)行，例如，通過(guò)在測(cè)試細(xì)胞中表達(dá)被至少一種DMSG盒編碼的包括中間體siRNA的siRNA，其中siRNA的中間體siRNA包括與測(cè)試細(xì)胞中特異基因編碼的RNA分子互補(bǔ)的5′部分；將測(cè)試細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞與試劑接觸；和比較測(cè)試細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞的表型，從而評(píng)價(jià)是否該試劑能作用或影響測(cè)試細(xì)胞中的特異基因。
本發(fā)明還涉及通過(guò)導(dǎo)入針對(duì)介導(dǎo)疾病的靶RNA的RNAi來(lái)改善個(gè)體中RNA介導(dǎo)的疾病的方法。此種方法可按以下進(jìn)行，例如，通過(guò)將表現(xiàn)出RNA介導(dǎo)的疾病個(gè)體的細(xì)胞與至少一種DMSG盒接觸，其中由DMSG盒的模板核苷酸序列編碼的包含一種或多種中間體siRNA分子的siRNA的表達(dá)能夠介導(dǎo)針對(duì)靶RNA的RNAi。個(gè)體的細(xì)胞可離體地(ex vivo)與DMSG盒相接觸，然后再回施至受試者體內(nèi)，或可將DMSG施用于受試者使它在體內(nèi)與含有靶RNA的細(xì)胞接觸。靶RNA可以是內(nèi)源RNA，包括編碼RNA(如mRNA)或非編碼RNA(如X染色體調(diào)節(jié)子或結(jié)構(gòu)RNA)，或可以是外源RNA，例如，由于個(gè)體感染而存在于細(xì)胞中的細(xì)菌或病毒RNA。
本發(fā)明還涉及一種試劑盒，它包括至少一種包含可表達(dá)的模板核苷酸序列的分離的DNA分子和/或至少一種DMSG盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒包括含有，如果期望可在可尋址的位置上影印在其上的多個(gè)DMSG盒的固體支持物，其中多個(gè)DMSG盒可以是相同的或不同的或它們的組合。此外，多個(gè)DMSG盒可以是相關(guān)的多個(gè)DMSG盒，例如，代表基因相關(guān)家族如TGF-β家族成員、免疫球蛋白家族成員、生長(zhǎng)因子或生長(zhǎng)因子受體家族成員的DMSG盒；或代表能對(duì)特定刺激物起反應(yīng)而誘導(dǎo)(或抑制)的基因如對(duì)生長(zhǎng)因子、毒素或感染劑起反應(yīng)而誘導(dǎo)的基因的DMSG盒；或代表在特殊細(xì)胞或細(xì)胞類型表達(dá)的基因如以組織特異性或發(fā)育階段特異性方式表達(dá)的基因、或在異常細(xì)胞如癌細(xì)胞中表達(dá)的基因的DMSG盒。還提供了非人類轉(zhuǎn)基因生物，它為經(jīng)遺傳學(xué)修飾而在其基因組中含有DMSG盒。
本發(fā)明還提供了分離的經(jīng)修飾U6基因啟動(dòng)子，特別是縮短的增強(qiáng)子，包括DSE可操作地連接到PSE(對(duì)照天然存在的U6基因5′端上游調(diào)節(jié)序列；SEQ ID NO36)。本發(fā)明的經(jīng)修飾U6基因增強(qiáng)子以5′-ATTGCAT-N(10-60)-CTTACCGTAACTTGAAAGTA-3′(SEQ ID NO38)和5′-ATTGCAT-N(10-60)-CTCACCCTAACTGTAAAGTA-3′(SEQ ID NO39)為例，其中N(10-60)是指任意10-60個(gè)核苷酸可定位于DSE(ATTGCAT)和PSE(人，SEQ ID NO34；或小鼠，SEQ ID NO35所示)之間。此種經(jīng)修飾的U6基因增強(qiáng)子以其中DSE和PSE由大約10個(gè)核苷酸分開的下述DSE和PSE為例闡述，-5′-ATTGCAT-N(13)-CTTACCGTAACTTGAAAGTA-3′(SEQ ID NO40)；和5′-ATTGCAT-N(13)-CTCACCCTAACTGTAAAGTA-3′(SEQ ID NO41)-，并且更特別地是由SEQ ID NO1的核苷酸6-46分開的DSE和PSE。在一個(gè)實(shí)施方案中，縮短的U6基因增強(qiáng)子可操作地連接到啟動(dòng)子元件上，特別是TATA元件。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以可操作地連接到啟動(dòng)子上的經(jīng)修飾增強(qiáng)子包含于載體中，該載體可包括可操作連接的模板克隆位點(diǎn)。此外，本發(fā)明還提供了經(jīng)修飾的哺乳動(dòng)物U6基因聚合酶III終止子，例如，以SEQ IDNO50和51為例的經(jīng)修飾聚合酶III終止子。
本發(fā)明還提供了多種分離的DNA分子，其中每種DNA分子都固定在固體支持物上，并且其中每種DNA分子都包含編碼介導(dǎo)靶RNA的RNA干擾的中間小干擾核糖核酸(RNA)分子(siRNA)的至少約16個(gè)核苷酸的可表達(dá)模板核苷酸序列，其中中間體siRNA包含含有與靶RNA的有意鏈互補(bǔ)的至少約15個(gè)核苷酸的5’部分和含有與靶RNA的有意鏈不互補(bǔ)的約1-5個(gè)核苷酸的3’端部分，其中siRNA選擇性地與靶RNA的有意鏈雜交；或者其中中間體siRNA包含含有與靶RNA的反義鏈互補(bǔ)的至少約15個(gè)核苷酸的5’部分和含有與靶RNA的反義鏈不互補(bǔ)的約1-5個(gè)核苷酸的3’端部分，其中siRNA選擇性地與靶RNA的反義鏈雜交。多種DNA分子中的一種或多種DNA分子可進(jìn)一步包括可操作地連接到可表達(dá)的模板核苷酸序列上的異源聚合酶III啟動(dòng)子，例如，哺乳動(dòng)物U6基因啟動(dòng)子，特別是人U6基因啟動(dòng)子。
在一個(gè)實(shí)施方案中，多種DNA分子中每一DNA分子，都包含可操作連接的聚合酶III啟動(dòng)子、可表達(dá)的模板核苷酸序列和至少一個(gè)聚合酶III終止子，其中可表達(dá)的模板核苷酸序列相對(duì)于聚合酶III啟動(dòng)子是異源的。例如，多種DNA分子中每一DNA分子，可包括可操作連接的哺乳動(dòng)物U6基因聚合酶III啟動(dòng)子、可表達(dá)的模板核苷酸序列和至少一個(gè)聚合酶III終止子，并且其中可表達(dá)的模板核苷酸序列相對(duì)于聚合酶III啟動(dòng)子是異源的。一方面，多種的DNA分子，都包括可操作連接的包含SEQ ID NO1的核苷酸6-13、SEQ ID NO1的核苷酸19-38、SEQ ID NO1的核苷酸66-69、模板核苷酸序列、和至少一個(gè)含有TTTT四核苷酸序列轉(zhuǎn)錄終止子的有意多核苷酸序列。另一方面，多種的DNA分子包括與含有SEQ IDNO1的核苷酸6-13、SEQ ID NO1的核苷酸19-38、SEQ ID NO1的核苷酸66-69、模板核苷酸序列、和至少一個(gè)含有TTTT四核苷酸序列轉(zhuǎn)錄終止子的有意多核苷酸序列互補(bǔ)的反義多核苷酸。又在另一方面，多種的DNA分子包含含有如上所述的有意多核苷酸和反義多核苷酸的雙鏈多核苷酸。在本發(fā)明的多種DNA分子中，當(dāng)存在轉(zhuǎn)錄終止子時(shí)，轉(zhuǎn)錄終止子可以包含SEQ ID NO48或SEQ ID NO49，或可以包含SEQ ID NO50或SEQ ID NO51。
在另一實(shí)施方案中，多種的DNA分子的可表達(dá)模板核苷酸序列編碼第一中間體siRNA，其中可表達(dá)模板核苷酸序列被可操作地連接到包含編碼第二中間體siRNA的至少約16個(gè)核苷酸長(zhǎng)的第二個(gè)可表達(dá)模板核苷酸序列的核苷酸序列上，并且其中第二中間體siRNA的5’部分與第一中間體siRNA的5’部分互補(bǔ)，因此，在表達(dá)時(shí)，第一中間體siRNA的5’部分選擇性地與第二中間體siRNA的5’部分雜交，從而形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，多種DNA分子的每一DNA分子都被固定在固體支持物上的特定位置，例如，在陣列中，并且優(yōu)選地為可尋址陣列。多種的DNA分子可以被固定使它們?cè)谕ǔ２唤到釪NA的條件下保持吸附于固體支持物上，或者可以被可逆固定。一方面，利用諸如明膠這樣的試劑將作為DMSG盒成分的DNA分子可逆固定于固體支持物上，其中，當(dāng)與適當(dāng)?shù)娜芤航佑|時(shí)，DNA分子從支持物上釋放出來(lái)。
另一方面，多種DNA分子中的DNA分子(其可包含多種DMSG盒)被可操作地連接于作為膜內(nèi)剪切蛋白酶底物的跨膜結(jié)構(gòu)域肽上，其中所述DNA分子(或DMSG盒)可通過(guò)跨膜結(jié)構(gòu)域肽固定于固體支持物上?？缒そY(jié)構(gòu)域肽可以是任意此類作為膜內(nèi)蛋白酶或肽酶底物的肽，包括，例如，β-淀粉狀前體蛋白質(zhì)的肽、果蠅sevenless蛋白質(zhì)或其哺乳動(dòng)物同系物的肽、果蠅torso蛋白質(zhì)或其哺乳動(dòng)物同系物的肽、果蠅δ蛋白質(zhì)或其哺乳動(dòng)物同系物的肽、或人血型糖蛋白-A蛋白質(zhì)的肽；或者作為諸如早衰因子1或早衰因子2的早衰因子的底物的肽。多種的DNA分子單獨(dú)或者與跨膜肽結(jié)構(gòu)域結(jié)合后也可以包含可操作性連接的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域有利于DNA分子(或DMSG盒)跨細(xì)胞膜的脂雙層的轉(zhuǎn)運(yùn)。此類蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可用以下例子闡明，人免疫缺陷病毒TAT結(jié)構(gòu)域、果蠅觸角足同源異型域、單純皰疹病毒VP22轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
具有如此處公開的一種或多種DNA分子(或DMSG盒)固定于其上的固體支持物提供了便利，使在移動(dòng)和操作DNA分子時(shí)，其所附著的固體支持物是穩(wěn)定的，并且提供了進(jìn)一步的便利，當(dāng)需要時(shí)可以使多種的DNA分子能夠從支持物上釋放出來(lái)，例如，通過(guò)使支持物暴露于改變了的條件或通過(guò)將支持物與細(xì)胞接觸。固體支持物可以是任意通常用于固定DNA的材料，包括，例如，硅微芯片、載玻片、或塑料珠。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了含有此類多種的DNA分子的試劑盒，其中所述多種的DNA分子例如固定于可尋址陣列中的固體支持物上，并且特別是固定于固體支持物的多種DMSG盒，優(yōu)選的是在可尋址陣列中。
本發(fā)明還涉及將DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞的方法。此種方法可按以下進(jìn)行，例如，通過(guò)在足以使DMSG盒進(jìn)入細(xì)胞的條件下將固定于固體支持物上的DMSG盒與細(xì)胞相接觸。優(yōu)選地是，DMSG盒是多種DMSG盒之一，其中多種DMSG盒中的DMSG盒被固定于固體支持物上，例如，在陣列中，它可以是但不需要是可尋址陣列。利用諸如明膠的基質(zhì)材料，或通過(guò)接頭，特別是作為膜內(nèi)剪切蛋白酶或肽酶的底物的跨膜結(jié)構(gòu)域，可以將DMSG盒固定于支持物上，從而僅當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞膜和被膜內(nèi)剪切蛋白酶接觸時(shí)才使DMSG盒從支持物上釋放出來(lái)。如果期望，DMSG盒可以進(jìn)一步包括蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，因此可以促進(jìn)DMSG盒進(jìn)入細(xì)胞膜的脂雙層。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案，在含有DMSG盒的細(xì)胞中，DMSG盒的可表達(dá)核苷酸序列的表達(dá)可以降低或抑制細(xì)胞中基因的表達(dá)，因此提供了鑒定能夠敲低基因表達(dá)的DMSG盒的方法。當(dāng)利用此處所述的DMSG盒陣列進(jìn)行時(shí)，此種方法提供了RNAi技術(shù)的微陣列，該微陣列允許具有預(yù)期基因敲低活性的DMSG盒的鑒定，例如，對(duì)編碼轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)因子受體、蛋白激酶或G蛋白的基因敲低的DMSG盒的鑒定?；虻慕档捅磉_(dá)或抑制表達(dá)可以通過(guò)測(cè)定基因表達(dá)水平的任意方法而檢測(cè)出來(lái)，包括如檢測(cè)細(xì)胞的表型改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法提供了在表現(xiàn)出病理性疾病的細(xì)胞中，而不是在相應(yīng)的未表現(xiàn)出病理性疾病的細(xì)胞中鑒定基因表達(dá)的方法，通過(guò)檢測(cè)其中一種細(xì)胞而不是另外細(xì)胞的表型變化，例如在諸如乳腺癌細(xì)胞的癌細(xì)胞中而不是在相應(yīng)的諸如正常乳房上皮細(xì)胞的正常細(xì)胞中。相應(yīng)地，RNAi微陣列方法提供了在多種DMSG盒中鑒定能降低或抑制含有DMSG盒的細(xì)胞中基因表達(dá)的DMSG盒的方法。同樣，該方法可以進(jìn)一步包括分離DMSG盒并且，所以，本發(fā)明還提供了由此種方法鑒定并分離DMSG盒，此類DMSG盒是有用的，例如，可作為治療劑。因此，本發(fā)明還進(jìn)一步提供了包含用于敲低病理性疾病相關(guān)基因的表達(dá)的DMSG盒的藥物。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A和1B以線性形式圖示2種DMSG盒。DMSG-TM盒(圖1A)中顯示了增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、模板序列、2個(gè)終止序列(“Term”；“TM”)，圖1B為突然終止的脫落型盒(“RO”)。
圖2以環(huán)狀(如質(zhì)粒)形式圖示DMSG盒。
圖3以組裝的線性形式圖示DMSG盒(見實(shí)施例3)。寡核苷酸被表示為形成具有切口的雙鏈(“ds”)DNA的粗線。
圖4圖表說(shuō)明DMSG對(duì)lacZ表達(dá)的影響(見實(shí)施例4)。包括siRNA作為對(duì)照。僅編碼正鏈、僅編碼負(fù)鏈、或編碼正負(fù)鏈的DMSG盒被用于沉默報(bào)告基因的表達(dá)。在最后兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中將DMSG正盒與組裝的DMSG負(fù)盒共轉(zhuǎn)染，其中以合成的正義DNA(s1s2)或反義DNA(a1a2)用作這兩種寡核苷酸。每一s2和a2的3′端堿基用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記。
圖5圖示載體pDMSG1上的DMSG盒(見實(shí)施例6)。圖的上部代表質(zhì)粒，顯示了模板克隆位點(diǎn)周圍的序列(“TCS接頭”)。下部描述將模板序列插入克隆位點(diǎn)。
圖6表示第二種載體pDMSG2上的DMSG盒，該載體與pDMSG1(圖5)相似除了它含有一個(gè)可留下4個(gè)核苷酸突出端的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(見實(shí)施例6)。圖的上部代表質(zhì)粒，顯示了模板克隆位點(diǎn)周圍的序列(“TCS接頭”)。下部描述將模板序列插入克隆位點(diǎn)。
發(fā)明詳述RNA干擾(RNAi)是dsRNA(小干擾RNA；siRNA)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默過(guò)程，并且已經(jīng)用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)。通常，通過(guò)將細(xì)胞與雙鏈siRNA相接觸已經(jīng)可以實(shí)施RNAi。然而，由于RNA易于降解，細(xì)胞外RNA操作是非常繁瑣的。通過(guò)提供編碼小干擾RNA(siRNA)分子或含有siRNA一條鏈的中間體siRNA分子的脫氧核糖核酸(DNA)組合物，本發(fā)明免除了操作RNA的需要。因此，本發(fā)明提供了分離的DNA分子，它包括編碼中間體siRNA的至少約16個(gè)核苷酸的可表達(dá)模板核苷酸序列，其中中間體siRNA作為siRNA的組分可介導(dǎo)對(duì)靶RNA進(jìn)行RNA干擾(RNAi)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，中間體siRNA是核糖核苷酸序列，它包括含有與靶RNA的有意鏈或反義鏈互補(bǔ)的至少約15個(gè)核苷酸的5’部分，和含有不分別與靶RNA的有意鏈或反義鏈互補(bǔ)的約1-5個(gè)核苷酸的3’端部分，其中與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的siRNA可選擇性地與靶RNA有意鏈雜交，并且其中與靶RNA序列有意鏈互補(bǔ)的第一中間體siRNA和與同一靶RNA序列反義鏈互補(bǔ)的第二中間體siRNA可以選擇性地彼此雜交。在另一實(shí)施方案中，siRNA包括含有與靶RNA的有意鏈或反義鏈互補(bǔ)的至少約15個(gè)核苷酸的5’部分，和任選地3’端部分，當(dāng)存在3’端部分時(shí)，其可以是長(zhǎng)度為約1-5個(gè)核苷酸，并且可以但不必分別與靶RNA的有意鏈或反義鏈互補(bǔ)，其中與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的siRNA可以選擇性地與靶RNA有意鏈雜交，并且其中與靶RNA序列有意鏈互補(bǔ)的第一中間體siRNA和與同一靶RNA序列反義鏈互補(bǔ)的第二中間體siRNA可以選擇性地彼此雜交。當(dāng)這兩種siRNA分子，每一siRNA分子包含一個(gè)3’端部分，選擇性雜交形成雙鏈siRNA時(shí)，該雙鏈siRNA在每個(gè)末端都包含3′突出端。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“模板”或“模板核苷酸序列”是指本發(fā)明DNA分子的核苷酸序列(或DMSG盒的核苷酸序列；見下)，它們編碼的核糖核苷酸序列含有與靶RNA的有意鏈或反義鏈互補(bǔ)的5’部分，和任選地能夠，但不必要，分別與靶核苷酸序列的有意鏈或反義鏈互補(bǔ)的3’端部分。照這樣，模板核苷酸序列編碼含有雙鏈siRNA中的一條鏈的中間體siRNA。
術(shù)語(yǔ)“中間體”，當(dāng)用于指siRNA時(shí)，意思是指雙鏈siRNA中的一條鏈，或者是有意鏈或者是反義鏈或其部分。為了便于討論，術(shù)語(yǔ)“有意”鏈(或“正”鏈)和“反義”鏈(或“負(fù)”鏈)在此處如它們所相關(guān)的mRNA那樣使用，其中，有意(正)鏈包含編碼肽的信息并且反義(負(fù))鏈與它們互補(bǔ)。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，實(shí)際上在細(xì)胞中通常不產(chǎn)生反義mRNA序列。然而，應(yīng)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到siRNA不是必須針對(duì)mRNA分子，其可以針對(duì)任意RNA分子，包括細(xì)胞或樣本中任意內(nèi)源或外源RNA。例如，siRNA可以針對(duì)結(jié)構(gòu)RNA分子，例如諸如那些參與剪接復(fù)合體的核糖體RNA或小核RNA(snRNA)；已轉(zhuǎn)錄的內(nèi)含子的核苷酸序列，其存在于核不均一RNA(hnRNA)；X-染色體調(diào)節(jié)物；或微小RNA；或可針對(duì)RNA病毒的核苷酸序列或DNA病毒(它含有正鏈和負(fù)鏈)RNA形式的核苷酸序列，后者包括編碼或非編碼RNA序列；或可針對(duì)能夠與帶菌的宿主共生的細(xì)菌或具有感染性的細(xì)菌特別是致病菌所表達(dá)的RNA。
中間體siRNA一般是長(zhǎng)度為16-30個(gè)核苷酸，通常約20-25個(gè)核苷酸，特別是21、22或23個(gè)核苷酸。為了便于討論，談到了中間體siRNA的5’部分和3’端部分。術(shù)語(yǔ)“5’部分”是指這樣的中間體siRNA的核苷酸序列(通常長(zhǎng)度約15-29個(gè)核苷酸，通常長(zhǎng)度約18-25個(gè)核苷酸，特別的是20-23個(gè)核苷酸長(zhǎng))，該核苷酸序列與靶RNA的有意鏈或反義鏈序列互補(bǔ)；術(shù)語(yǔ)“3′端部分”是指這樣的中間體siRNA的任選核苷酸序列(當(dāng)其存在時(shí)，通常長(zhǎng)度為1-5個(gè)核苷酸，特別是2、3或4個(gè)核苷酸長(zhǎng))，它包括3′端核苷酸。通常，siRNA包括3′端部分，以至于當(dāng)中間體siRNA與互補(bǔ)siRNA選擇性雜交形成siRNA時(shí)，中間體siRNA的3′端部分可以形成3′突出端。為了便于討論本發(fā)明的組合物，文中往往談到了與靶RNA相應(yīng)序列不互補(bǔ)的、含有1-5個(gè)核苷酸的3’端部分的模板核苷酸序列。像這樣，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的分離DNA分子不包含諸如天然存在的多核苷酸的任何已分離的核苷酸序列或限制性片段(如基因序列)，并且也應(yīng)該認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的DMSG盒不包含連接到任何異源核苷酸序列的任一上述核苷酸序列。
本發(fā)明的分離DNA分子可以是單鏈或雙鏈。如果分離的DNA分子是單鏈，它能夠編碼有意鏈或反義鏈中間體siRNA；或者能夠編碼有意鏈和反義鏈這兩種中間體siRNA，當(dāng)表達(dá)時(shí)，這兩種中間體siRNA能夠選擇性雜交以形成siRNA。如果分離的DNA分子是雙鏈時(shí)，它可以在一條鏈上編碼有意或反義的中間體siRNA；或可以在一條鏈上編碼有意和反義的中間體siRNA這兩條鏈，當(dāng)表達(dá)時(shí)，這兩條鏈可以選擇性雜交以形成siRNA；或在一條鏈上編碼有意的中間體siRNA而在第二條鏈上編碼反義的中間體siRNA，當(dāng)表達(dá)時(shí)，它們能夠選擇性雜交以形成siRNA。本發(fā)明的分離DNA分子能夠編碼兩種或多種中間體siRNA分子，它們中的兩種或多種分子能夠選擇性地彼此雜交以形成siRNA，或者能夠特異針對(duì)兩種或多種不同的靶RNA分子。
分離的DNA分子還可以是線性DNA分子，它具有第一個(gè)末端和第二個(gè)末端，或著是環(huán)狀的。此外，分離的DNA分子可以是例如在溶液中的游離形式，以冷凍干燥形式，或以沉淀形式；或者包含于載體中，例如，表達(dá)載體。此類分離DNA，它可以，但不是必須，存在于載體上，它還可以存在于細(xì)胞中，例如宿主細(xì)胞、靶細(xì)胞、或經(jīng)遺傳學(xué)修飾含有整合到其基因組中的該DNA分子的細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了多種分離DNA分子。正如此處所應(yīng)用的那樣，當(dāng)用于指DNA分子、DMSG盒、或siRNA或中間體siRNA分子時(shí)，術(shù)語(yǔ)“多種”指兩種或多種(例如2、3、4、5、6、7、8種等)不同的分子，包括兩種或多種不同的此類分子群。照這樣，本發(fā)明的多種DNA分子包括至少兩種此類分離的DNA分子。例如，多種DNA分子可以包括第一種分離的DNA分子，該分子編碼包含與靶RNA的有意鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA；和至少第二種分離的本發(fā)明DNA分子(例如第二種；第二種和第三種；第二種、第三種和第四種；等)。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，術(shù)語(yǔ)“第一種”、“第二種”、“第三種”等等僅被用于區(qū)別本發(fā)明不同的分離DNA分子而并非指，例如順序或重要性或其他此類特性。
當(dāng)本發(fā)明中的多種DNA分子包括第一種分離的DNA分子，該分子編碼包含與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA(“第一中間體siRNA”)，并還包括，例如，至少第二種分離的DNA分子，該分子編碼包含與第一中間體siRNA所針對(duì)的靶RNA反義鏈互補(bǔ)的5’部分的第二中間體siRNA，其中，在表達(dá)時(shí)，第一和第二中間體siRNA分子能選擇性雜交形成siRNA。作為選擇，或另外，該多種DNA分子可至少包括第二(或第三)分離的DNA分子，該分子編碼包括與第二靶RNA有意鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA，并且還可至少包括第三(或第四)分離的DNA分子，該分子編碼包括與第二靶RNA反義鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA。
多種分離的DNA分子還可包括第一分離的DNA分子，該分子編碼具有與靶RNA的反義鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA；和至少包括第二分離的DNA分子，該分子編碼具有與靶RNA的有意鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA，其中編碼的第一和第二中間體siRNA可以但非必須彼此互補(bǔ)，這樣在表達(dá)時(shí)，它們可以選擇性雜交形成siRNA。此外，還考慮到其它的成分組合，這些成分是諸如那些編碼針對(duì)一種或多種其它靶RNA分子或第一靶RNA其他區(qū)域的中間體siRNA的成分。
如此處所公開，本發(fā)明的DNA分子編碼可表達(dá)的模板核苷酸序列。術(shù)語(yǔ)“可表達(dá)的”，當(dāng)用于指模板核苷酸序列時(shí)，是指模板核苷酸序列可以被轉(zhuǎn)錄成RNA分子，特別是中間體siRNA。這樣，可表達(dá)的模板核苷酸序列通常，或可以，被可操作連接于一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包括例如，一個(gè)或多個(gè)包含轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的啟動(dòng)子；分別可以增強(qiáng)或降低可表達(dá)核苷酸序列轉(zhuǎn)錄水平的增強(qiáng)子或沉默子；沉默子；或含有轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)的終止子。
相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了DNA介導(dǎo)的基因沉默(DMSG)盒，它包括可操作地連接到至少一個(gè)異源核苷酸序列上的本發(fā)明分離的DNA分子(其編碼中間體siRNA)。異源核苷酸序列可以是，例如，一個(gè)或多個(gè)可操作連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子、或其組合；克隆位點(diǎn)如限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)、重組酶識(shí)別位點(diǎn)、拓?fù)洚悩?gòu)酶識(shí)別位點(diǎn)、或其組合；或一個(gè)或多個(gè)其它部分。例如，本發(fā)明的DMSG盒可以包括可操作連接的啟動(dòng)子、編碼中間體siRNA的模板核苷酸序列、和終止子，并且此外還可包括增強(qiáng)子。此種DMSG盒在此處以含有可操作連接于人U6基因增強(qiáng)子、啟動(dòng)子和終止子元件上的模板核苷酸序列的DMSG盒為例證，它由RNA聚合酶III(pol III)直接轉(zhuǎn)錄。此外，DMSG盒也可包含于載體中，并且相同的或不同的兩個(gè)或多個(gè)DMSG盒可被可操作地連接到一起，并且可以是線性的或環(huán)狀的并且可以，但非必須，包含于載體中。
可以用于驅(qū)動(dòng)有意中間體siRNA或反義中間體siRNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子可以是組成型的(例如病毒啟動(dòng)子諸如巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子或SV40啟動(dòng)子)、可誘導(dǎo)的(例如金屬硫蛋白啟動(dòng)子)、可抑制的、組織特異性的、發(fā)育階段特異性的等等。因此，例如2個(gè)不同的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子可以用于驅(qū)動(dòng)有意中間體siRNA和反義中間體siRNA的轉(zhuǎn)錄。在此種例子中，如所預(yù)期的，啟動(dòng)子活化可用于誘導(dǎo)有意中間體siRNA、反義中間體siRNA或兩者的產(chǎn)生。此外，可以選擇轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件以至于它們可指導(dǎo)由真核RN A聚合酶I、II或III(pol I、II或III)轉(zhuǎn)錄或由原核RNA聚合酶，如α-pol、β-pol或γ-pol轉(zhuǎn)錄。調(diào)控元件諸如真核RNA聚合酶III啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和終止子，例如存在于人U6基因的這些元件，能夠在表達(dá)中間體siRNA時(shí)尤其有用，因?yàn)榫酆厦窱II能夠產(chǎn)生大量的轉(zhuǎn)錄子拷貝。
正如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接的”是指調(diào)控元件定位于與可表達(dá)核苷酸序列相關(guān)的位置，從而元件可以發(fā)揮它的調(diào)控作用。具有增強(qiáng)子活性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可以位于一定的距離，例如相鄰或相距長(zhǎng)達(dá)數(shù)千核苷酸的距離、和位于啟動(dòng)子和預(yù)轉(zhuǎn)錄核苷酸序列的上游或下游，并且仍能對(duì)編碼的報(bào)告分子的表達(dá)水平施加可檢測(cè)的增強(qiáng)效應(yīng)。轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包括真核和原核啟動(dòng)子、終止子、增強(qiáng)子和沉默子，這在本領(lǐng)域是熟知的，并且能夠化學(xué)合成、從天然存在的核酸分子得到、或從商業(yè)渠道購(gòu)得。
啟動(dòng)子包括，例如來(lái)源于巨細(xì)胞病毒、莫洛尼鼠白血病病毒和皰疹病毒的啟動(dòng)子，還有來(lái)源于編碼金屬硫蛋白、骨骼肌動(dòng)蛋白、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸甘油酸、二氫葉酸還原酶和胸苷激酶基因的啟動(dòng)子，還有來(lái)源于病毒長(zhǎng)末端重復(fù)(LTRs)如勞斯肉瘤病毒LTR的啟動(dòng)子。增強(qiáng)子包括，例如組成型激活增強(qiáng)子如免疫球蛋白增強(qiáng)子，或可誘導(dǎo)增強(qiáng)子如SV40增強(qiáng)子；等等。金屬硫蛋白啟動(dòng)子是組成型激活啟動(dòng)子，當(dāng)存在金屬離子，如銅、鎳或鎘離子時(shí)，它也可以被誘導(dǎo)至較高水平表達(dá)。作為比較，四環(huán)素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子是啟動(dòng)子的一個(gè)例子，它被存在的四環(huán)素或四環(huán)素類似物誘導(dǎo)，否則就沒有活性。轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件也可以是組織特異性調(diào)控元件，例如肌細(xì)胞特異性調(diào)控元件，從而使所編碼產(chǎn)物的表達(dá)限制于個(gè)體的肌細(xì)胞，或培養(yǎng)例如器官培養(yǎng)中的混合細(xì)胞群中的肌細(xì)胞。肌細(xì)胞特異的調(diào)控元件包括，如肌肌酸激酶啟動(dòng)子(Sternberg等，Mol.Cell.Biol.82896-2909，1988，此處引用作為參考)和肌球蛋白輕鏈增強(qiáng)子/啟動(dòng)子(Donoghue等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 885847-5851，1991，此處引用作為參考)在本領(lǐng)域是熟知的。其它組織特異的啟動(dòng)子，還有只在細(xì)胞或有機(jī)體特定發(fā)育階段表達(dá)的調(diào)控元件，在本領(lǐng)域是熟知的。
此類調(diào)控元件或者是組成型的或者是可調(diào)節(jié)的(即可誘導(dǎo)的或可去抑制的)。組成型啟動(dòng)子的例子包括噬菌體λ的啟動(dòng)子int、pBR322上β-內(nèi)酰胺酶基因序列的啟動(dòng)子bla、pPR325上氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因序列的啟動(dòng)子CAT、等等。可誘導(dǎo)的原核啟動(dòng)子的例子包括噬菌體主要的右和左啟動(dòng)子(PL和PR)、大腸桿菌(E.coli)trp，recA，LacZ，LacI和gal啟動(dòng)子、枯草桿菌(B.subtilis)α淀粉酶(Ulmanen等，J.Bacteriol.162176-182，1985)和σ-28-特異啟動(dòng)子(Gilman等，Gene 3211-20，1984)、芽孢桿菌屬噬菌體啟動(dòng)子(Gryczan，The Molecular Biology of the Bacilli(AcademicPress，Inc.，NY 1982))、鏈霉菌啟動(dòng)子(Ward等，Mol.Gen.Genet.203468-478，1986)、等等。Glick(J Ind.Microbiol.1277-282，1987)；Cenatiempo(Biochimie 68505-516，1986)和Gottesman(Ann.Rev.Genet.18415-442，1984)綜述了原核啟動(dòng)子范例。
轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子可以是組成型活化元件，該元件以相對(duì)穩(wěn)定的活性水平維持著可操作性地連接的可表達(dá)核苷酸序列的表達(dá)，或者是可誘導(dǎo)的調(diào)控元件。組成型活化調(diào)控元件包括，例如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子如肌動(dòng)蛋白2啟動(dòng)子，或延伸因子(EF)啟動(dòng)子如EF1α啟動(dòng)子，其中每一啟動(dòng)子在大范圍的不同細(xì)胞類型中是活化的；或者是在一種或少數(shù)幾種細(xì)胞類型中表達(dá)的組織特異調(diào)控元件，或者是只在有機(jī)體特定發(fā)育或生長(zhǎng)中表達(dá)的發(fā)育階段特異性調(diào)控元件。當(dāng)談及調(diào)控元件特別是啟動(dòng)子或增強(qiáng)子時(shí)，術(shù)語(yǔ)“組織特異性”或“發(fā)育階段特異性”時(shí)是指能夠只在一種或少數(shù)幾種細(xì)胞類型、或只在一種細(xì)胞類型或有機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育或分化的一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)階段指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。
象此處使用的那樣，術(shù)語(yǔ)“可誘導(dǎo)的調(diào)控元件”是指這樣一種調(diào)控元件，當(dāng)暴露于誘導(dǎo)劑時(shí)，能夠?qū)崿F(xiàn)可操作性地連接的核苷酸序列，特別是編碼中間體siRNA的模板核苷酸序列提高的轉(zhuǎn)錄水平，使其與在不存在誘導(dǎo)劑時(shí)的，轉(zhuǎn)錄水平相比有所提高?？烧T導(dǎo)的調(diào)控元件可以是那些沒有基礎(chǔ)活性或組成型活性，并且只在暴露于誘導(dǎo)劑的情況下才有效轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件，或者是那些有基礎(chǔ)活性或組成型活性，但當(dāng)暴露于誘導(dǎo)劑的情況下能提高轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控元件。有基礎(chǔ)水平或組成型水平表達(dá)的可誘導(dǎo)調(diào)控元件在如下情況下有特別的用途，即誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)錄水平顯著地高于基礎(chǔ)或組成型表達(dá)水平，例如至少提高約2倍，或至少提高約5倍。特別有用的可誘導(dǎo)調(diào)控元件不具有基礎(chǔ)或組成型表達(dá)活性，或與調(diào)控元件相關(guān)的基礎(chǔ)或組成型轉(zhuǎn)錄水平相比轉(zhuǎn)錄水平提高至少約10倍。
當(dāng)使用術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)劑”時(shí)是指通過(guò)可誘導(dǎo)調(diào)控元件能夠影響轉(zhuǎn)錄的化學(xué)的、生物的或物理的試劑。對(duì)暴露于誘導(dǎo)劑時(shí)的反應(yīng)，從可誘導(dǎo)調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄通常為從頭開始轉(zhuǎn)錄或比基礎(chǔ)或組成型表達(dá)水平有所提高。此種誘導(dǎo)可用此處公開的方法進(jìn)行鑒定，包括檢測(cè)編碼生物發(fā)光多肽的mRNA水平的增高?？烧T導(dǎo)調(diào)控元件在本發(fā)明重組核酸分子中的應(yīng)用提供了一種只在預(yù)定時(shí)間表達(dá)生物發(fā)光多肽的方法，因此阻止了植物細(xì)胞中無(wú)關(guān)的轉(zhuǎn)錄或翻譯活性。
用于調(diào)控特定的可誘導(dǎo)元件表達(dá)的誘導(dǎo)劑可以基于特定的可誘導(dǎo)調(diào)控元件進(jìn)行選擇。例如，可誘導(dǎo)調(diào)控元件可以是金屬硫蛋白(MT)調(diào)控元件諸如MT2B調(diào)控元件，銅誘導(dǎo)的調(diào)控元件，或?yàn)樗沫h(huán)素誘導(dǎo)的調(diào)控元件，從這些調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄可以通過(guò)分別對(duì)各種金屬離子、銅或四環(huán)素做出反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)(Furst等，Cell 55705-717，1988；Mett等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 904567-4571，1993；Gatz等，Plant J.2397-404，1992；Roder等，Mol.Gen.Genet.24332-38，1994，每一個(gè)在此處引用作為參考)。可誘導(dǎo)調(diào)控元件還可以是蛻皮素調(diào)控元件或糖皮質(zhì)激素調(diào)控元件，從這些調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄可以通過(guò)對(duì)蛻皮素或其它類固醇做出反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)(Christopherson等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 896314-6318，1992；Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，8810421-10425，1991，每一個(gè)在此處引用作為參考)。此外，調(diào)控元件可以是冷應(yīng)答調(diào)控元件或熱休克調(diào)控元件，從這些調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄可以分別通過(guò)對(duì)暴露于冷或熱做出反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)(Takahashi等，PlantPhysiol.99383-390，1992，此處引用作為參考)。
此處使用的術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”在談及諸如限制性核酸內(nèi)切酶或重組酶識(shí)別的克隆位點(diǎn)時(shí)，在每種情況下，該術(shù)語(yǔ)是指這樣的克隆位點(diǎn)，它定位于第一核苷酸序列例如模板核苷酸序列，從而使第二核苷酸序列能夠被與其連接并實(shí)現(xiàn)它的與第一核苷酸序列相關(guān)的功能。例如，第一核苷酸序列，如可表達(dá)模板核苷酸序列，可以含有可操作地與其連接的克隆位點(diǎn)，從而使第二或更多核苷酸序列，如具有相似克隆位點(diǎn)的啟動(dòng)子和終止子，可以通過(guò)克隆位點(diǎn)被連接于第一核苷酸序列，其中連接單元的每一成分都維持其功能并且兩個(gè)或多個(gè)連接單元共同起作用。同樣地，含有增強(qiáng)子、啟動(dòng)子和終止子的表達(dá)載體可以包含位于啟動(dòng)子和終止子元件之間的模板克隆位點(diǎn)，從而使含有合適終止的模板核苷酸序列可以可操作地插入克隆位點(diǎn)，也就是插入后使得模板核苷酸序列的表達(dá)由增強(qiáng)子、啟動(dòng)子和終止子調(diào)控(見，例如圖5和6)。本發(fā)明組合物的模式特性特別適合于含有便于進(jìn)行可操作連接的成分的試劑盒的生產(chǎn)，一個(gè)或多個(gè)不同的或組合的調(diào)控元件、檢測(cè)標(biāo)記、靶向部分等的可操作連接包括插入、替代或缺失，從而使可表達(dá)模板核苷酸序列能夠在預(yù)期的一種或多種特定細(xì)胞類型中表達(dá)。
限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)以及它們相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶在本領(lǐng)域中是孰知的并且是商業(yè)可得的。本發(fā)明的組合物中有用的限制性位點(diǎn)包括那些存在3′或5′突出端的位點(diǎn)，從而使得具有這些位點(diǎn)的兩個(gè)或多個(gè)核苷酸序列便于進(jìn)行可操作性連接。例如，在模板核苷酸序列側(cè)翼加上限制位點(diǎn)，從而使啟動(dòng)子和終止子能夠可操作地與其連接，在每一個(gè)模板的末端使用不同的限制性位點(diǎn)有利于將啟動(dòng)子和終止子以正確的位置和方向可操作性地連接到編碼中間體siRNA的核苷酸序列上，從而使連接在單一反應(yīng)混合物中完成。在本領(lǐng)域重組酶識(shí)別位點(diǎn)也是熟知的，它包括如可被Cre重組酶有效連接的lox識(shí)別位點(diǎn)，可被λInt和IHF蛋白質(zhì)有效連接的att序列。
此處所用術(shù)語(yǔ)“可操作性連接”在談及含有模板核苷酸序列的DNA分子如DMSG盒和與其連接的分子時(shí)，在每種情況下，該術(shù)語(yǔ)是指能夠使DNA分子或DMSG盒和所述分子的功能得以維持的連接。因此，DNA分子或DMSG盒能夠可操作性地連接到可檢測(cè)標(biāo)記或諸如多核苷酸、肽、模擬肽、小的有機(jī)分子等能在DNA分子或DMSG盒上賦予預(yù)期特性的其它分子。例如，DMSG可以被可操作性地連接到諸如細(xì)胞區(qū)室化結(jié)構(gòu)域的部分上，它能夠靶向DMSG盒進(jìn)入細(xì)胞或特定的細(xì)胞區(qū)室。在本領(lǐng)域細(xì)胞區(qū)室化結(jié)構(gòu)域是熟知的并且包括如質(zhì)膜定位結(jié)構(gòu)域、核定位信號(hào)、線粒體膜定位信號(hào)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜定位信號(hào)等等，或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域如人免疫缺陷病毒TAT蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，它們利于與其連接的肽轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞(見Schwarze等，Science 2851569-1572，1999；Derossi等，J.Biol.Chem.27118188，1996；Hancock等，EMBOJ.104033-4039，1991；Buss等，Mol.Cell.Biol.83960-3963，1988；U.S.專利號(hào)5,776,689此處引用作為參考)。
使易于鑒定本發(fā)明組合物或含有該組合物的樣本或細(xì)胞的可檢測(cè)標(biāo)記可以是便于檢測(cè)的肽、多肽、或化學(xué)分子或小的有機(jī)或無(wú)機(jī)分子。例如，可檢測(cè)標(biāo)記可以是諸如生物素的分子，它可以用親和素或鏈親和素檢測(cè)；熒光化合物(如Cy3、Cy5、Fam、熒光素或羅丹明)；放射性核素(如硫35、锝99、磷32、或氚)；順磁旋轉(zhuǎn)標(biāo)記(如碳13)；生物發(fā)光物如蟲螢光素；酶如堿性磷酸酶；或化學(xué)發(fā)光化合物。如果期望，熒光化合物如AAN、JOE、FAM、或TET可單獨(dú)或與淬滅劑如BHQ組合(見例如Molecular Probes，Eugene)，用于進(jìn)行熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)反應(yīng)，由此例如可以檢測(cè)由此處公開的DMSG盒表達(dá)的發(fā)夾siRNA的形成。
將可檢測(cè)標(biāo)記或其它分子可操作連接于核苷酸序列的方法在本領(lǐng)域是熟知的(見，例如，Hermanson，″Bioconjugate Techniques″(AcademicPress 1996)，此處引用作為參考)。除了提供例如檢測(cè)含有DMSG盒的細(xì)胞的方法，可檢測(cè)標(biāo)記或其它分子也可用于分離此種細(xì)胞。例如，當(dāng)DMSG含有熒光化合物時(shí)，通過(guò)諸如熒光激活細(xì)胞分選(FACS)方法，能夠容易地將含有DMSG盒的細(xì)胞從不含DMSG盒的細(xì)胞中分離出來(lái)。同樣的，當(dāng)可檢測(cè)標(biāo)記是肽標(biāo)簽，如myc表位、FLAG表位等時(shí)，本身可以被標(biāo)記的標(biāo)簽特異的抗體或其它結(jié)合伙伴可用于分離或鑒定DMSG盒，包括例如含有該盒的細(xì)胞。
DMSG盒，或兩個(gè)或多個(gè)連接后的DMSG盒，可以是線性表達(dá)盒或環(huán)狀表達(dá)盒形式，任意一種形式都可以但非必需含有載體序列。此外，可以存在于載體中的DMSG盒還可以存在于細(xì)胞中，該細(xì)胞可以是用于維持和/或擴(kuò)增DMSG盒的宿主細(xì)胞，并且DMSG盒可以是在細(xì)胞中游離存在的或整合到細(xì)胞基因組DNA中的。
本發(fā)明分離的DNA分子或DMSG盒可以包含于載體，這有利于核酸分子的操作，包括將其導(dǎo)入靶細(xì)胞。載體可以是克隆載體，它有利于維持DMSG盒的DNA分子，或者可以是表達(dá)載體，它含有用于表達(dá)多核苷酸的調(diào)控元件并且，根據(jù)需要，有利于連接到載體的DNA分子或DMSG盒或核苷酸序列所編碼的肽的翻譯。表達(dá)載體可以包含一些實(shí)現(xiàn)例如編碼中間體siRNA的可表達(dá)模板核苷酸序列持續(xù)轉(zhuǎn)錄的表達(dá)元件，或者在其被克隆進(jìn)載體之前，可操作連接于模板核苷酸序列的調(diào)控元件，即通過(guò)構(gòu)建DMSG盒的全部或一部分而連接。
表達(dá)載體(或多核苷酸)通常含有或編碼可以提供編碼的寡核苷酸的組成型或，如果期望，可誘導(dǎo)或組織特異或發(fā)育階段特異表達(dá)的啟動(dòng)子序列、多聚A識(shí)別序列或其它轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)、其它轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件如增強(qiáng)子(可以是組織特異性的)，并且，如果期望，還包括核糖體識(shí)別位點(diǎn)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)。如果期望，載體還可以包含在原核或真核宿主系統(tǒng)或兩者中復(fù)制所必需的元件。此類載體包括質(zhì)粒載體和病毒載體，如噬菌體、桿狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、痘苗病毒、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)和腺伴隨病毒載體，是眾所周知的并且可以從商業(yè)供應(yīng)(Promega，Madison WI；Stratagene，La Jolla CA；GIBCO/BRL，Gaithersburg MD)中買到或由本領(lǐng)域的技術(shù)人員構(gòu)建(見，例如，Meth.Enzymol.，Vol.185，Goeddel編輯(Academic Press，Inc.，1990)；Jolly，Canc.Gene Ther 151-64，1994；Flotte，J Bioenerg.Biomemb.2537-42，1993；Kirshenbaum等，J.Clin.Invest.92381-387，1993；每篇文獻(xiàn)此處引用作為參考)。
病毒表達(dá)載體，對(duì)于將一種或多種位于相同或不同載體上的DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞，特別是受試者體內(nèi)的細(xì)胞，是特別有用的。這些病毒載體為它們相對(duì)高效地感染宿主細(xì)胞和感染特異細(xì)胞類型提供了便利。病毒載體也可以來(lái)源于感染目的生物的細(xì)胞的病毒，例如，諸如哺乳動(dòng)物、禽類或魚類宿主細(xì)胞的脊椎動(dòng)物宿主細(xì)胞。病毒載體對(duì)于將DMSG盒導(dǎo)入靶細(xì)胞以實(shí)踐本發(fā)明的方法是特別有用的。已經(jīng)研發(fā)出用于特定宿主系統(tǒng)特別是哺乳動(dòng)物系統(tǒng)的病毒載體，并且包括例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、其它慢病毒載體如那些基于人免疫缺陷病毒(HIV)的載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、皰疹病毒載體、痘苗病毒載體等等(見Miller和Rosman，BioTechniques 7980-990，1992；Anderson等，Nature 39225-30 Suppl.，1998；Verma和Somia，Nature 389239-242，1997；Wilson，New Engl.J Med.3341185-1187，1996，每篇文獻(xiàn)此處引用作為參考)。
例如，當(dāng)將逆轉(zhuǎn)錄病毒用于基因轉(zhuǎn)移時(shí)，由于在用來(lái)產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝細(xì)胞系中將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和病毒基因序列重組，從而理論上可以產(chǎn)生復(fù)制性逆轉(zhuǎn)錄病毒。包裝細(xì)胞系，其中通過(guò)重組復(fù)制性病毒的產(chǎn)生已經(jīng)被降低或去除，可以被用于降低產(chǎn)生復(fù)制性逆轉(zhuǎn)錄病毒的可能性。用標(biāo)準(zhǔn)方法，如PCR和逆轉(zhuǎn)錄酶分析，對(duì)用于感染細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上清進(jìn)行復(fù)制性病毒篩選。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體允許將異源基因整合入宿主細(xì)胞基因組，這就允許基因隨著細(xì)胞分裂而傳遞給子代細(xì)胞。
使用本領(lǐng)域熟知的各種方法中的任何一種，可以將包含于載體中的多核苷酸如DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞(Sambrook等，“Molercular CloningALabortory Manual”(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)；Ausubel等，“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley和Sons，Baltimore，MD(1987，和1995的增刊)，每篇文獻(xiàn)此處引用作為參考)。此類方法包括，例如，轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、微注射、電穿孔和用病毒載體的感染；還可能包括脂質(zhì)體、微乳劑等的使用，此類物質(zhì)能夠促進(jìn)將多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞并且能保護(hù)多核苷酸在導(dǎo)入細(xì)胞前不被降解。具體方法的選擇依賴于，例如，欲將多核苷酸導(dǎo)入的細(xì)胞，以及細(xì)胞是在培養(yǎng)基中獨(dú)立培養(yǎng)，還是在培養(yǎng)的或原位的組織或器官中培養(yǎng)。
通過(guò)使用病毒載體感染將多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞是特別有利的，因?yàn)樗軌蛴行У卦隗w外或體內(nèi)將核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞(見，例如，美國(guó)專利號(hào)5,399,346，此處引用作為參考)。而且，病毒是非常特異的并且可以根據(jù)它對(duì)一種或少數(shù)幾種特定細(xì)胞類型的感染并在其中增殖的能力而選擇用作載體。因此，它們這種天然特異性可以用于將包含于載體的核酸分子靶向進(jìn)入特定細(xì)胞類型。照這樣，基于HIV的載體可以用于感染T細(xì)胞，基于腺病毒的載體可以用于如感染呼吸道上皮細(xì)胞，基于皰疹病毒的載體可以用于感染神經(jīng)細(xì)胞，等等。其他載體，諸如腺伴隨病毒可以具有較廣的宿主細(xì)胞范圍并且，因此，可以用于感染多種細(xì)胞類型，雖然病毒或非病毒載體也可以用特異受體或配體進(jìn)行修飾以通過(guò)受體介導(dǎo)事件改變靶向特異性。
本發(fā)明的DMSG盒此處以“脫落式”DMSG盒進(jìn)行例證，“脫落式(run off)”DMSG盒缺乏轉(zhuǎn)錄終止子元件(見圖1B)，例如針對(duì)靶RNA正鏈(如編碼鏈)的DMSG盒序列(如SEQ ID NO1和2所示)或針對(duì)靶RNA負(fù)鏈(如非編碼鏈)的DMSG盒序列(如SEQ ID NO5和6所示；也見實(shí)施例1)。此外，本發(fā)明的DMSG盒以含有一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子的DMSG盒序列(見圖1A)進(jìn)行例證，例如針對(duì)靶RNA正鏈的DMSG盒序列(SEQ ID NO3和4)或針對(duì)靶RNA負(fù)鏈的DMSG盒序列(SEQID NO7和8；也見實(shí)施例1)。盡管作為例證的DMSG盒含有針對(duì)綠色熒光蛋白(GFP)的靶有意鏈或反義鏈的模板核苷酸序列，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明包括編碼中間體siRNA的模板核苷酸序列，其中所述中間體siRNA針對(duì)由任一基因或cDNA等編碼的RNA分子，或針對(duì)任一靶RNA分子。
于是，本發(fā)明還提供了例如這樣的DMSG盒，它包括可操作連接的含有SEQ ID NO1的6-13位核苷酸、SEQ ID NO1的27-46位核苷酸、SEQ ID NO1的66-69位核苷酸和編碼中間體siRNA的至少約16個(gè)核苷酸的模板核苷酸序列的有意多核苷酸序列；與上述有意多核苷酸互補(bǔ)的反義多核苷酸；或通過(guò)上述有意或反義多核苷酸雜交形成的雙鏈多核苷酸。此類DMSG盒可缺乏終止子(見，例如，圖1B)，或進(jìn)一步在可操作連接中包括至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子，例如在有意多核苷酸中至少一個(gè)四胸腺嘧啶核苷(TTTT)或至少一個(gè)五胸腺嘧啶核苷(TTTTT)序列；或在反義多核苷酸中至少一個(gè)四腺嘌呤核苷(AAAA)或至少一個(gè)五腺嘌呤核苷(AAAAA)序列。
應(yīng)該注意到人U6基因終止子的天然序列包括五胸腺嘧啶核苷序列(TTTTT)，它的最開始的兩個(gè)胸腺嘧啶核苷殘基與編碼序列(見SEQ IDNO48)的最后兩個(gè)T重疊。由于當(dāng)3’端部分含有UU突出端時(shí)siRNA是非常有效的，并且pol III轉(zhuǎn)錄通常在五胸腺嘧啶核苷終止子序列的第二或第三胸腺嘧啶核苷后終止，所以如公開的那樣，DMSG盒的轉(zhuǎn)錄提供了一種產(chǎn)生幾乎完美的siRNA分子的方法。
在許多情況下，期望例如在一個(gè)細(xì)胞中表達(dá)兩種DMSG盒，從而使有意和反義中間體siRNA能夠選擇性雜交形成功能性雙鏈siRNA。然而，也可以構(gòu)建這樣的DMSG盒，以產(chǎn)生有意和反義中間體siRNA這兩者，在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)有意和反義中間體siRNA序列含有單一轉(zhuǎn)錄本，其中有意和反義序列能夠選擇性雜交形成可加工成功能性雙鏈siRNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。此外，本發(fā)明還提供了這樣的DMSG盒，它包括編碼第一中間體siRNA的第一模板核苷酸序列，并且其中DMSG盒的異源核苷酸序列包括編碼第二中間體siRNA的至少約16個(gè)核苷酸的第二可表達(dá)模板核苷酸序列，其中第二中間體siRNA的5′部分與第一中間體siRNA的5′部分互補(bǔ)，從而，當(dāng)表達(dá)時(shí)，第一中間體siRNA的5′部分選擇性地與第二中間體siRNA的5′部分雜交形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。此類DMSG盒可以進(jìn)一步包括至少一個(gè)RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，例如，至少一個(gè)人U6基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子、或它們的組合。
考慮到本發(fā)明所公開的內(nèi)容，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的組合物，特別是DMSG盒，可以被整合進(jìn)入細(xì)胞基因組并且，因此，本發(fā)明的組合物對(duì)于產(chǎn)生遺傳修飾細(xì)胞或含有此類細(xì)胞的非人轉(zhuǎn)基因生物是有用的。此類遺傳修飾細(xì)胞和非人轉(zhuǎn)基因生物是有用的，例如，作為以基因表達(dá)降低或缺乏為特征的疾病的動(dòng)物模型，或作為鑒定試劑對(duì)影響基因表達(dá)是否有用的工具。例如，可以制備轉(zhuǎn)基因嚙齒類動(dòng)物如轉(zhuǎn)基因小鼠、大鼠、或倉(cāng)鼠，或者其他轉(zhuǎn)基因動(dòng)物如轉(zhuǎn)基因綿羊或山羊或其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，從而通過(guò)表達(dá)來(lái)自DMSG盒的特異于靶基因的siRNA敲低一種或多種靶基因，并且可以直接檢查非人轉(zhuǎn)基因生物以測(cè)定基因敲低產(chǎn)生的效果，并且檢測(cè)某種試劑的效果，其中該試劑被懷疑能夠改善生物體中基因敲低所產(chǎn)生的效果。盡管轉(zhuǎn)基因有機(jī)體此處是以非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行例證的，但應(yīng)該認(rèn)識(shí)到含有一種或多種DMSG盒的轉(zhuǎn)基因植物也同樣被考慮到。
對(duì)于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物有多種已知的方法。在一種方法中，從雌性收獲處于前核期的胚胎(“單細(xì)胞胚胎”)并將轉(zhuǎn)基因微注射入胚胎，在這種情況下，轉(zhuǎn)基因?qū)⒈蝗旧w性整合進(jìn)入生殖細(xì)胞或所得到的成熟動(dòng)物的體細(xì)胞。在另一種方法中，分離胚胎干細(xì)胞并通過(guò)電穿孔、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或微注射將轉(zhuǎn)基因摻入干細(xì)胞；然后將干細(xì)胞再次導(dǎo)入胚胎，在那里它們進(jìn)行克隆化并形成生殖系。將多核苷酸微注射入哺乳類動(dòng)物的方法被敘述于如美國(guó)專利號(hào)4,873,191中，此處引用作為參考。又在另一種方法中，用含有轉(zhuǎn)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞，從而使胚胎的生殖細(xì)胞具有整合于染色體中的轉(zhuǎn)基因。
當(dāng)制備轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物是禽類時(shí)，微注射入受精卵的前核存在問(wèn)題，因?yàn)榍蓊愂芫淹ǔＴ谳斅压軆?nèi)頭20小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞分裂并且因此前核是難以得到的。因此對(duì)于制備轉(zhuǎn)基因禽類物種，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染方法是優(yōu)選的(見美國(guó)專利號(hào)5,162,215，此處引用作為參考)。然而，如果打算將微注射用于禽類物種，可以從前次產(chǎn)卵大約2.5小時(shí)后的供體母雞中獲得胚胎，轉(zhuǎn)基因被微注射入胚盤的細(xì)胞質(zhì)并且胚胎被培養(yǎng)于宿主殼內(nèi)直至成熟(Love等，BioTechnology 12，1994)。當(dāng)被轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物是牛或豬時(shí)，卵不透明可能妨礙微注射，因此通過(guò)常規(guī)的鑒別性干擾-相差顯微術(shù)很難辨別細(xì)胞核。為了克服該問(wèn)題，首先將卵離心以分離前核以便更好的觀察。
非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以是小鼠、牛、豬、羊、禽或其它動(dòng)物?？梢栽诓煌陌l(fā)育階段將轉(zhuǎn)基因?qū)肱咛グ屑?xì)胞，并且不同方法的選擇依賴于胚胎靶細(xì)胞的發(fā)育階段。對(duì)于微注射受精卵是最好的靶。受精卵用作基因轉(zhuǎn)移的靶具有的主要優(yōu)點(diǎn)為注射的DNA能夠在第一次分裂前摻入宿主基因(Brinster等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 824438-4442，1985)。作為結(jié)果，轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的所有細(xì)胞都攜帶所摻入的轉(zhuǎn)基因，因此有助于轉(zhuǎn)基因從起始轉(zhuǎn)基因動(dòng)物向其后代有效傳遞，因?yàn)?0％的生殖細(xì)胞攜有轉(zhuǎn)基因。
通過(guò)兩個(gè)嵌合動(dòng)物的交配可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中在每一個(gè)嵌合動(dòng)物的用于生殖的細(xì)胞中含有外源遺傳物質(zhì)。所得后代的25％將是帶有純合子外源遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，50％將是雜合子，剩余的25％缺乏外源遺傳物質(zhì)并具有野生型的表型。
在微注射方法中，消化轉(zhuǎn)基因并例如通過(guò)凝膠電泳純化，使不含任何的載體DNA。轉(zhuǎn)基因可以包括可操作連接的啟動(dòng)子，它與參與轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用，并提供組成性表達(dá)、組織特異性表達(dá)、發(fā)育階段特異性表達(dá)等等。此類啟動(dòng)子包括那些來(lái)源于巨細(xì)胞病毒(CMV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)和皰疹病毒的啟動(dòng)子，還包括那些來(lái)源于編碼金屬硫蛋白、骨骼肌動(dòng)蛋白、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPCK)、磷酸甘油酸(PGK)、二氫葉酸還原酶(DHFR)和胸苷激酶(TK)的基因的啟動(dòng)子。來(lái)源于病毒長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)如勞氏肉瘤病毒LTR的啟動(dòng)子也可以被應(yīng)用。當(dāng)用于轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物是禽類時(shí)，優(yōu)選的啟動(dòng)子包括那些針對(duì)雞β-珠蛋白基因、雞溶菌酶基因、和禽類造白細(xì)胞組織增生病毒的啟動(dòng)子。用于對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的構(gòu)建體使用了額外的調(diào)控元件，包括，例如，刺激轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子元件、剪接受體、終止密碼子和多聚腺苷酸信號(hào)、允許翻譯的核糖體進(jìn)入位點(diǎn)等等。
在逆轉(zhuǎn)錄病毒感染方法中，處于發(fā)育期的非人胚胎可以在體外培養(yǎng)至囊胚泡期。在這段時(shí)間內(nèi)，卵裂球可以作為逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的靶(Jaenich，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 731260-1264，1976)。通過(guò)酶處理去除透明帶以得到對(duì)卵裂球的有效感染(Hogan等，″Manipulating the MouseEmbryo″(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1986)。用于導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因的病毒載體系統(tǒng)一般是攜帶轉(zhuǎn)基因的復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒(Jahner等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 826927-6931，1985；Van der Putten等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 826148-6152，1985)。通過(guò)在單層產(chǎn)病毒細(xì)胞上培養(yǎng)卵裂球?qū)崿F(xiàn)簡(jiǎn)單有效的轉(zhuǎn)染(Van der Putten等，supra，1985；Stewart等，EMBO J.6383-388，1987)。此外，還可以在較后的時(shí)期進(jìn)行感染。可以將病毒或產(chǎn)病毒細(xì)胞注射進(jìn)入囊胚腔(Jahner等，Nature 298623-628，1982)。大多數(shù)起始轉(zhuǎn)基因個(gè)體將是轉(zhuǎn)基因嵌合體因?yàn)閾饺雰H僅發(fā)生于形成轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的一部分細(xì)胞。而且，起始轉(zhuǎn)基因個(gè)體可含有在基因組不同位點(diǎn)的多種轉(zhuǎn)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒的插入，這些插入的轉(zhuǎn)基因通常會(huì)在子代中發(fā)生分離。此外，通過(guò)對(duì)妊娠中期胚胎進(jìn)行子宮內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，將轉(zhuǎn)基因?qū)肷诚狄彩强赡艿模m然效率較低(Jahner等，見上文，1982)。
胚胎干細(xì)胞(ES)也可以作為導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因的靶細(xì)胞。ES細(xì)胞可以從體外培養(yǎng)的植入前胚胎得到并且與胚胎進(jìn)行融合(Evans等，Nature 292154-156，1981；Bradley等，Nature 309255-258，1984；Gossler等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 839065-9069，1986；Robertson等，Nature 322445-448，1986)。通過(guò)DNA轉(zhuǎn)染或逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)可以將轉(zhuǎn)基因有效地導(dǎo)入ES細(xì)胞。此類轉(zhuǎn)化了的ES細(xì)胞此后可以與來(lái)源于非人動(dòng)物的胚囊胚泡結(jié)合。此后，ES細(xì)胞克隆化形成胚胎并且有助于所得到的嵌合動(dòng)物的生殖系形成(見Jaenisch，Science 2401468-1474，1988)。
本發(fā)明還提供了多種DMSG盒，其包括至少兩種本發(fā)明的DMSG盒。其中第一DMSG盒的可表達(dá)模板核苷酸序列可以編碼含有與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的5’部分的第一中間體siRNA。在多種DMSG盒中，此種第一DMSG盒含有至少第二DMSG，其中第二DMSG盒的可表達(dá)模板核苷酸序列編碼例如含有與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的5’部分的第二中間體siRNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一DMSG盒的可表達(dá)模板核苷酸序列編碼的第一中間體siRNA的5’部分可以與第二中間體siRNA的5’部分互補(bǔ)，其中第一和第二中間體siRNA分子選擇性雜交形成活性siRNA，它能夠介導(dǎo)RNAi。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，多種DMSG盒中至少第二DMSG盒的可表達(dá)模板核苷酸序列編碼含有與第二靶RNA有意鏈互補(bǔ)的5’部分的第二中間體siRNA。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，多種DMSG盒中至少第二DMSG盒的可表達(dá)模板核苷酸序列編碼含有與第二靶RNA反義鏈互補(bǔ)的5’部分的第二中間體siRNA，由此第一和第二經(jīng)編碼的中間體siRNA分子能夠選擇性雜交形成功能雙鏈siRNA。
還提供了這樣的多種DMSG盒，其中第一DMSG盒的可表達(dá)模板核苷酸序列編碼含有與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA，并且其中至少第二DMSG盒的可表達(dá)模板核苷酸序列編碼含有與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的5’部分的siRNA。在另一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的多種DMSG盒，其中，第一DMSG盒編碼的siRNA的5’部分與第二DMSG盒編碼的siRNA的5’部分互補(bǔ)。在另一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在多種DMSG盒中，至少第二DMSG盒的可表達(dá)模板核苷酸序列編碼含有與第二靶RNA的反義鏈互補(bǔ)的5’部分的siRNA，并且至少第二DMSG盒的可表達(dá)模板核苷酸序列編碼含有與第二靶RNA的有意鏈互補(bǔ)的5’部分的siRNA。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了這樣的多種DMSG盒，其中DMSG盒被印刷在、固定在、或者以其他方式放置在固體支持物上。固體支持物可以是一般用作核酸分子支持物的任一材料，包括，例如，微芯片如硅片；載玻片；或珠子。多種的DMSG盒可以被放置在固體支持物上從而使多種DMSG盒的單一群體(即編碼相同siRNA)基本上彼此分開。此外，通常將樣本排列成陣列或其它可重復(fù)的模式，從而使每個(gè)樣本都被賦予一個(gè)地址(即陣列上的位置)，因此通過(guò)鑒定特定位置上的信號(hào)、表型等等，允許使用常規(guī)的方法鑒定DMSG盒。將多種DMSG盒點(diǎn)印在陣列特別是可尋址陣列上的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是自動(dòng)系統(tǒng)可用于在不同的時(shí)間點(diǎn)從一個(gè)或多個(gè)位置上添加或去除試劑，或用于將不同的試劑添加在特定位置上。除了便于在同一時(shí)間檢測(cè)多樣本，此類高通量測(cè)定法提供了一種這樣的方法，該方法用于檢測(cè)兩份、三份或多份的單一樣本，從而增加所得到的結(jié)果的可靠性，并且該方法用于在與測(cè)試樣本相同的條件下檢測(cè)對(duì)照樣本，從而提供了內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)以比較來(lái)源于不同分析方法的結(jié)果。
如此處所公開，DMSG盒的微陣列可以用于反向轉(zhuǎn)染細(xì)胞，從而提供了一種鑒定能夠通過(guò)RNAi多樣化地影響細(xì)胞表型的DMSG盒的方法。此種方法在此處稱為“RNAi的微陣列”(MAR)，此類方法是基于使本發(fā)明方法和組合物適用于細(xì)胞微陣列(反向轉(zhuǎn)染)方法(Ziauddin和Sabatini，Nature 411107-110，2001；美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)朥S 2002/0006664 A1，2002年1月17日，每篇文獻(xiàn)此處引用作為參考)，其中將核酸分子置于固體支持物上，在允許核酸分子進(jìn)入細(xì)胞的條件下，將細(xì)胞與支持物上含有該核酸分子的位置相接觸(見實(shí)施例8)。如此處所公開，使用多種DMSG盒可以實(shí)施MAR，其中，當(dāng)細(xì)胞與含有DMSG盒的支持物相接觸時(shí)，對(duì)于表型的改變可以通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的一種或多種表型。當(dāng)檢測(cè)到表型改變了的細(xì)胞(即表型不同于與支持物/DMSG盒接觸之前細(xì)胞的表型)時(shí)，就可得知在該位點(diǎn)的DMSG盒，從而鑒定出該DMSG盒影響參與該表型的基因的表達(dá)。
能夠根據(jù)MAR方法檢測(cè)的細(xì)胞的表型可以是任意表型，并且可以是基于敲低參與該表型的基因的表達(dá)的由DMSG盒編碼的siRNA。照這樣，多種的DMSG盒可以代表多種基因中的任意一種基因，包括，例如，基因家族如生長(zhǎng)因子或生長(zhǎng)因子受體基因家族，或G蛋白基因家族；具有共同功能的一組基因如編碼蛋白激酶的一組基因(例如蛋白激酶A基因、蛋白激酶C基因、鈣-鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶基因等等，還有此類基因的組合)，或編碼轉(zhuǎn)錄因子的一組基因；以特殊方式被調(diào)控的一組基因，如以組織特異方式或發(fā)育階段特異方式被調(diào)控的基因，或當(dāng)細(xì)胞與刺激物如毒素(例如有毒金屬離子或化學(xué)治療試劑)接觸時(shí)，或受到環(huán)境條件刺激時(shí)(例如熱、紫外線或電離輻射)所誘導(dǎo)的一組基因。
DMSG盒的陣列可以在固體支持物上的兩個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上包括相同或不同的DMSG盒。當(dāng)在兩個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上的DMSG盒相同時(shí)(即編碼相同的siRNA)，每一個(gè)位點(diǎn)可以與不同的細(xì)胞類型接觸或與具有不同表型的相似細(xì)胞類型接觸，從而允許該方法用于鑒定不同細(xì)胞中RNAi的不同效應(yīng)。例如，在含有相同DMSG盒的陣列的兩個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上所接觸的細(xì)胞可以是正常細(xì)胞(即從健康個(gè)體如人來(lái)源的細(xì)胞)和相應(yīng)的異常細(xì)胞(即與正常細(xì)胞為相同類型的細(xì)胞，但是是來(lái)自患有病理性疾病的個(gè)體的細(xì)胞如癌細(xì)胞、病毒或細(xì)菌感染細(xì)胞、來(lái)自患有先天性疾病、自身免疫疾病的個(gè)體的細(xì)胞等等)，其中該方法允許鑒定能夠差異影響異常細(xì)胞而不是相應(yīng)的正常細(xì)胞(或反之亦然)表型的DMSG盒，此種具有這種潛能的DMSG盒可用作治療劑。相比較而言，當(dāng)在兩個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上DMSG盒不同(即編碼不同的siRNA分子)時(shí)，每個(gè)位點(diǎn)可能，但非必需，與相同細(xì)胞類型接觸，細(xì)胞可以是上面例舉的正?；虍惓＜?xì)胞，因此提供了鑒定沉默一個(gè)或多個(gè)目的基因的DMSG盒的方法。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供了含有點(diǎn)印于固體支持物優(yōu)選地是在陣列中，特別是在可尋址陣列中的多種DMSG盒的組合物，其中多種的DMSG盒可以是相同的或不同的或它們的組合(即它們的一些，但不是全部，是一樣的)，并且其中不同的多種DMSG盒可以是隨機(jī)的(即編碼任意序列的siRNA-例如利用所有四種脫氧核糖核苷酸通過(guò)組合方法而產(chǎn)生的序列)、偏性的(即編碼具有優(yōu)選序列的siRNA-例如僅利用三種脫氧核糖核苷酸通過(guò)組合方法而產(chǎn)生的序列)、或富于變化的(即編碼基于已知siRNA序列，但在一個(gè)或幾個(gè)特定位點(diǎn)上變化了的siRNA；見，例如美國(guó)專利號(hào)5,571,698；美國(guó)專利號(hào)5,998,142，每個(gè)專利此處引用作為參考)。在一個(gè)實(shí)施方案中，多種的DMSG盒被點(diǎn)印在微芯片或載玻片上，優(yōu)選的是在可尋址陣列上。在一方面，此種微陣列中的多種DMSG盒被點(diǎn)印，從而，當(dāng)與適當(dāng)?shù)脑噭?例如轉(zhuǎn)染試劑)和細(xì)胞相接觸時(shí)，DMSG盒能夠穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，從而允許反向轉(zhuǎn)染。另一方面，提供了含有此種微陣列的試劑盒。
如此處所公開的，本發(fā)明的組合物被用于通過(guò)靶向一種或多種RNA分子介導(dǎo)RNAi，其中所述RNA分子可以是核糖體RNA分子、mRNA分子、病毒RNA分子等等。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了在細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)靶RNA的RNA干擾(RNAi)的方法。通過(guò)將至少一種DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)此種方法，由于含有被該至少一種DMSG盒編碼的中間體siRNA的siRNA的表達(dá)引發(fā)靶RNA的降解，從而在所述細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)RNA干擾。在一個(gè)實(shí)施方案中，該至少一種DMSG盒編碼與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的中間體siRNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少兩種DMSG盒被導(dǎo)入細(xì)胞，其中該至少兩種DMSG盒的第一DMSG盒編碼含有與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的5’部分的第一中間體siRNA，并且其中該至少兩種DMSG盒的第二DMSG盒編碼含有與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的5’部分的第二中間體siRNA。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的第一中間體siRNA的5’部分與與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的第二中間體siRNA的5’部分互補(bǔ)，由此第一中間體siRNA和第二中間體siRNA選擇性雜交形成siRNA。
如此處所公開，靶RNA可以是存在于樣本或細(xì)胞中的任意RNA分子，包括內(nèi)源或外源RNA和編碼或非編碼RNA。例如，當(dāng)RNA病毒已經(jīng)感染細(xì)胞時(shí)，可以設(shè)計(jì)siRNA使其靶向RNA病毒的編碼或非編碼部分，從而介導(dǎo)病毒RNA的RNAi。靶RNA也可以是snRNA、hnRNA或mRNA分子，由此siRNA能夠敲低編碼hnRNA和mRNA的靶基因的表達(dá)，或阻止hnRNA到mRNA的加工。照這樣，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的方法能夠用于介導(dǎo)細(xì)胞中內(nèi)源基因表達(dá)的RNA分子或外源RNA分子的RNAi。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了通過(guò)RNAi在樣本或細(xì)胞中敲低靶基因表達(dá)的方法。如此處所應(yīng)用，當(dāng)談及RNAi對(duì)于基因表達(dá)的效果時(shí)，術(shù)語(yǔ)“敲低”是指基因表達(dá)的水平被抑制、或降低至低于通常在基本上相同但缺乏RNAi的條件下檢測(cè)時(shí)所觀察到的水平。
例如將樣本與至少一種本發(fā)明的DMSG盒接觸，可以進(jìn)行敲低基因表達(dá)的方法，其中表達(dá)含有由DMSG盒編碼的中間體siRNA的siRNA引發(fā)靶基因編碼的靶RNA分子的降解，從而敲低樣本中靶基因的表達(dá)。靶基因可以是內(nèi)源基因或者可以是被導(dǎo)入細(xì)胞并在細(xì)胞中瞬時(shí)或穩(wěn)定存在的外源基因。
用于實(shí)踐此種方法的樣本可以是反應(yīng)混合物，其中RNAi是利用基本上純化的試劑如純化的靶RNA分子和酶以及需要的話還有為中間體siRNA分子表達(dá)所需的其它因子在體外進(jìn)行的，其中所述靶RNA分子可以是分離的天然存在的RNA分子(如細(xì)胞提取物中的RNA分子)，或者可以是化學(xué)合成的或重組產(chǎn)生的RNA分子，其中所述酶包括例如適當(dāng)?shù)腞NA聚合酶。例如，反應(yīng)混合物可以是體外偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)，其中含有由DMSG盒編碼的中間體siRNA的siRNA能夠減少所產(chǎn)生的翻譯產(chǎn)物的量。樣本也可以是細(xì)胞樣本，它可以是分離的細(xì)胞如培養(yǎng)基中的細(xì)胞或生物組織或器官樣本中的細(xì)胞，或者是生物體中原位的細(xì)胞。當(dāng)樣本含有一個(gè)細(xì)胞時(shí)，可以將DMSG盒與該細(xì)胞相接觸從而將DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞，從而表達(dá)所編碼的中間體siRNA。當(dāng)細(xì)胞在生物體原位時(shí)，例如可以通過(guò)將含有DMSG盒的組合物施用于細(xì)胞的位點(diǎn)或給該細(xì)胞群提供循環(huán)的血管內(nèi)將該DMSG盒靶向特定細(xì)胞或細(xì)胞群。
例如通過(guò)將至少兩種DMSG盒與樣本相接觸，如導(dǎo)入含有靶基因的細(xì)胞，可以實(shí)施敲低靶基因表達(dá)的方法，其中至少兩種DMSG盒的第一DMSG盒編碼含有與靶RNA(由靶基因編碼)有意鏈互補(bǔ)的5’部分的第一中間體siRNA，并且其中至少兩種DMSG盒的第二DMSG盒編碼含有與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的5’部分的第二中間體siRNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的第一中間體siRNA的5’部分與與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的第二中間體siRNA的5’部分互補(bǔ)，從而第一中間體siRNA和第二中間體siRNA選擇性雜交形成siRNA。
本發(fā)明還涉及在個(gè)體內(nèi)通過(guò)誘導(dǎo)針對(duì)介導(dǎo)疾病的靶RNA的RNAi改善RNA介導(dǎo)的疾病的方法。如此處所使用，“RNA介導(dǎo)的疾病”是指以存在參與這種疾病相關(guān)的跡象或癥狀的RNA分子為特點(diǎn)的病理性疾病。通過(guò)舉例的方式，RNA介導(dǎo)的疾病可以是遺傳性疾病，其中內(nèi)源基因的突變或其他變化導(dǎo)致編碼異常多肽的mRNA的產(chǎn)生。通過(guò)細(xì)菌感染例舉RNA介導(dǎo)的疾病，其中從感染性細(xì)菌表達(dá)的RNA編碼對(duì)被感染個(gè)體具有有害作用的多肽。本發(fā)明的方法能夠通過(guò)分別降低或抑制異常多肽或細(xì)菌多肽的表達(dá)改善此類RNA介導(dǎo)的疾病。進(jìn)一步通過(guò)病毒感染例舉RNA介導(dǎo)的疾病，其中病毒表達(dá)的RNA編碼病毒復(fù)制和/或感染所需的多肽。本發(fā)明的方法能夠通過(guò)降低或抑制病毒的復(fù)制和/或擴(kuò)散改善由于此種感染性病毒引起的RNA介導(dǎo)的疾病。由這些例子應(yīng)該認(rèn)識(shí)到根據(jù)本發(fā)明的方法可以改善多種疾病。
例如通過(guò)將表現(xiàn)出(或敏感于)RNA介導(dǎo)的疾病的個(gè)體細(xì)胞與至少一種DMSG盒相接觸，可以實(shí)施改善RNA介導(dǎo)的疾病的方法，其中含有由DMSG盒的模板核苷酸序列編碼的一種或多種中間體siRNA分子的siRNA的表達(dá)能夠介導(dǎo)針對(duì)靶RNA的RNAi。個(gè)體可以是患有此類疾病的任意一種生物，包括脊椎動(dòng)物有機(jī)體，例如哺乳動(dòng)物，諸如寵物的家養(yǎng)動(dòng)物或諸如牛、馬、豬或綿羊的商業(yè)重要?jiǎng)游?，并且特別是人。
可以離體(ex vivo)將個(gè)體細(xì)胞與DMSG盒相接觸，然后回施至受試者體內(nèi)。此種方法可能是有用的，例如，對(duì)于雜合型疾病如鐮狀細(xì)胞性貧血，其中疾病是由于一個(gè)或兩個(gè)血紅蛋白基因突變引起的，并且其中患有疾病的個(gè)體雜合型表達(dá)一種正常血紅蛋白和一種缺陷型血紅蛋白。通過(guò)從此種雜合子個(gè)體獲得骨髓細(xì)胞，將細(xì)胞與編碼針對(duì)突變RNA序列的siRNA的DMSG盒離體接觸，并且將細(xì)胞返回性重新導(dǎo)入病人，其中異常血紅蛋白分子的表達(dá)將被敲低。如果期望，可以將DMSG盒可操作連接于熒光化合物，從而可以選擇含有DMSG盒的骨髓細(xì)胞。此種方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，當(dāng)骨髓細(xì)胞群體中的白細(xì)胞前體細(xì)胞和紅細(xì)胞前體細(xì)胞是經(jīng)遺傳修飾而含有DMSG盒時(shí)，編碼的siRNA的任一表達(dá)如果對(duì)來(lái)源于經(jīng)此種經(jīng)遺傳修飾的白細(xì)胞前體細(xì)胞的成熟白細(xì)胞中有影響的話，影響也是很小的，因?yàn)榘准?xì)胞不表達(dá)血紅蛋白基因。
還可以通過(guò)將DMSG盒施與受試者從而在體內(nèi)使它接觸到含有靶RNA的細(xì)胞的方式，將個(gè)體細(xì)胞與DMSG盒接觸。靶RNA可以是內(nèi)源RNA，包括編碼RNA(如hnRNA或mRNA)或非編碼RNA(如X-染色體調(diào)節(jié)子，或其它結(jié)構(gòu)或功能RNA如snRNA)，或者靶RNA可以是外源RNA，例如，由于個(gè)體的感染而存在于細(xì)胞中的細(xì)菌或病毒RNA。本發(fā)明的體內(nèi)基因治療的方法的優(yōu)點(diǎn)是靶向異常RNA或個(gè)體細(xì)胞中非正常表達(dá)的RNA，并且因此沒必要考慮如DMSG盒進(jìn)入正常(健康)細(xì)胞并在其中表達(dá)的影響，因?yàn)楹蠨MSG編碼的中間體siRNA的siRNA在缺乏靶RNA的細(xì)胞中是沒有效果的。
為了施用于個(gè)體，通常將DMSG盒制劑為適于施用于個(gè)體的組合物。因此本發(fā)明還提供了含有至少一種DMSG盒并適合施用于活的個(gè)體的組合物。照這樣，DMSG盒可用作治療患有RNA介導(dǎo)疾病的受試者的藥物。
用于制備施用于個(gè)體的組合物的可藥用載體是熟知的，并且包括，例如，水溶液如水或生理性緩沖鹽水，或其它溶劑或介質(zhì)如乙二醇、甘油、油如橄欖油或可注射的有機(jī)酯類?？伤幱幂d體可以包括生理可接受化合物，它們具有如穩(wěn)定或增加DMSG盒的吸收的作用。此類生理可接受化合物包括，例如糖類(如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)，抗氧化劑如抗壞血酸或谷胱甘肽，螯合劑，低分子量蛋白質(zhì)或其它穩(wěn)定劑或賦形劑。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到可藥用載體包括生理可接受化合物的選擇依賴于，例如，組合物的施用方式，它可以是諸如口服的或腸胃外施用如靜脈內(nèi)注射，和注射、插管、體表涂藥或本領(lǐng)域已知的其它此類方法。含有該DMSG盒，或多種DMSG盒的組合物也可含有第二種試劑，如診斷試劑、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、毒素或治療劑，例如，當(dāng)DMSG盒被施用用于治療癌癥時(shí)第二種試劑為癌癥化療劑(例如，DSMG盒通過(guò)敲低癌基因如Ras或p53的表達(dá))。
可以將DMSG盒摻入包封材料中，如摻入水包油乳劑、微乳劑、微膠粒、混合微膠粒、脂質(zhì)體、微球體或其它多聚體基質(zhì)(見，例如，Gregoriadis，Liposome Technology，Vol.1(CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L 1984)；Fraley等，Trends Biochem.Sci.，677(1981)，每篇文獻(xiàn)此處引用作為參考)。例如，脂質(zhì)體由磷脂或其它脂類組成，是無(wú)毒的，對(duì)于制造和施用者而言脂質(zhì)體是相對(duì)簡(jiǎn)單的生理可接受并可代謝的載體。“隱形(stealth)”脂質(zhì)體(見，例如，美國(guó)專利號(hào)5,882,679；5,395,619和5,225,212，每一專利此處引用作為參考)是此類包封材料的例子，特別是用于制備實(shí)踐本發(fā)明方法的組合物，并且其它“masked”脂質(zhì)體同樣可以被使用，此類脂質(zhì)體延長(zhǎng)了DMSG盒在循環(huán)中存留的時(shí)間。例如，還可以用特異受體或配體對(duì)陽(yáng)離子脂質(zhì)體進(jìn)行修飾(Morishita等，J.Clin.Invest.，912580-2585，1993，此處引用作為參考)。此外，利用如腺病毒-多聚賴氨酸DNA復(fù)合物，可以將DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞(見，例如，Michael等，J.Biol.Chem.2686866-6869，1993，此處引用作為參考)。
此處公開的組合物可以分別通過(guò)多種途徑施用于個(gè)體，包括例如口服或腸胃外施用，如靜脈內(nèi)施用、肌肉內(nèi)施用、皮下施用、眼內(nèi)施用、囊內(nèi)施用、腹腔內(nèi)施用、直腸內(nèi)施用、池內(nèi)施用，或通過(guò)被動(dòng)的易于通過(guò)皮膚吸收的方式施用，如皮膚貼片或經(jīng)皮離子電滲。此外，組合物還可以通過(guò)注射、插管、口服或體表途徑被施用，其中后者可以是被動(dòng)的，例如通過(guò)軟膏直接施用，或者是主動(dòng)的，例如使用鼻噴霧器或吸入器，其中組合物中的一種成份是適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑。藥物組合物也可以施用于RNA介導(dǎo)的疾病部位，例如，靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)施用入供給腫瘤的血管。
在進(jìn)行本發(fā)明方法時(shí)施用的DMSG盒的總量可以作為單一劑量、或作為大丸劑或通過(guò)輸液在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)施用于受試者，或者應(yīng)用分步治療法施用，其中在延長(zhǎng)的時(shí)間期間施用多劑量。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到用于治療個(gè)體中RNA介導(dǎo)的疾病的藥物組合物的量依賴于多種因素，包括受試者的年齡和總體健康情況以及施用途徑和被施用的治療次數(shù)?？紤]到這些因素，熟練的技術(shù)人員將調(diào)整所需的特定劑量。一般而言，最初是利用一期和二期臨床試驗(yàn)來(lái)確定組合物的劑型和施用的途徑和頻率。
組合物可以制成口服制劑的形式，如片劑，或溶液或懸液形式；或者組合物可以包含與適于腸道或非腸道應(yīng)用的有機(jī)或無(wú)機(jī)載體或賦形劑的混合物，并且組合物可以與如通常無(wú)毒的、可藥用的載體混合制成片劑、丸劑、膠囊劑、栓劑、溶液、乳劑、懸液或其它可使用形式。除了上述的載體外，載體還包括葡萄糖、乳糖、甘露糖、阿拉伯樹膠、明膠、D-甘露醇、淀粉糊、三硅酸鎂、滑石、玉米淀粉、角蛋白、膠體硅、馬鈴薯淀粉、脲、中等鏈長(zhǎng)甘油三酯、葡聚糖，以及其它適合用于生產(chǎn)固體、半固體或液體形式制品的載體。此外可使用輔劑、穩(wěn)定劑、增稠劑或著色劑以及香料，例如穩(wěn)定干燥劑如triulose(見，例如，美國(guó)專利號(hào)5,314,695)。
本發(fā)明還提供在細(xì)胞群中示蹤經(jīng)歷DNA介導(dǎo)的基因沉默的特異細(xì)胞或特異細(xì)胞群。此種方法可通過(guò)如下進(jìn)行，例如通過(guò)將含有可檢測(cè)標(biāo)記的至少一種DMSG盒導(dǎo)入特異細(xì)胞(或特異細(xì)胞群中的每一個(gè)細(xì)胞)，并且檢測(cè)可檢測(cè)標(biāo)記，從而在細(xì)胞群體中示蹤經(jīng)歷DNA介導(dǎo)基因沉默的特異細(xì)胞或特異細(xì)胞群。在一個(gè)實(shí)施方案中，將第一DMSG盒和第二DMSG盒導(dǎo)入特異細(xì)胞或特異細(xì)胞群，其中第一DMSG盒編碼含有與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的5’部分的第一中間體siRNA，其中第二DMSG盒編碼含有與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的5’部分的第二中間體siRNA，并且其中第一DMSG盒編碼的第一中間體siRNA的5’部分與第二中間體siRNA的5’部分互補(bǔ)。
本發(fā)明還提供了鑒定經(jīng)歷DNA介導(dǎo)的基因沉默的細(xì)胞的方法。此種方法可通過(guò)如下進(jìn)行，例如在足以將DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞的條件下將至少一個(gè)細(xì)胞與至少一個(gè)可操作連接到可檢測(cè)標(biāo)記上面的DMSG盒接觸，并且檢測(cè)細(xì)胞中至少一個(gè)DMSG盒的可檢測(cè)標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括將至少一個(gè)細(xì)胞與第一DMSG盒和第二DMSG盒接觸，其中第一DMSG盒編碼含有與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的5’部分的第一中間體siRNA，其中第二DMSG盒編碼含有與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的5’部分的第二中間體siRNA，并且其中第一DMSG盒編碼的第一中間體siRNA的5’部分與第二中間體siRNA的5’部分互補(bǔ)。在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，第一DMSG盒的可檢測(cè)標(biāo)記不同于第二DMSG盒的可檢測(cè)標(biāo)記，并且檢測(cè)步驟包括監(jiān)測(cè)第一DMSG盒的可檢測(cè)標(biāo)記和/或第二DMSG盒的可檢測(cè)標(biāo)記。當(dāng)在單個(gè)細(xì)胞中鑒定出第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記時(shí)，該細(xì)胞被鑒定為經(jīng)歷DNA介導(dǎo)基因沉默的細(xì)胞。示蹤和/或鑒定包含含有可檢測(cè)標(biāo)記的DMSG盒的細(xì)胞的方法提供了選擇含有一種或多種DMSG盒的細(xì)胞，或鑒定當(dāng)施用DMSG盒(或細(xì)胞)于受試者后含有一種或多種DMSG盒的細(xì)胞的一種手段。
本發(fā)明還提供了評(píng)價(jià)測(cè)試細(xì)胞中基因功能的方法。此種方法可通過(guò)如下進(jìn)行，例如將至少一個(gè)DMSG盒導(dǎo)入測(cè)試細(xì)胞，并且觀察當(dāng)由DMSG盒編碼的siRNA表達(dá)時(shí)測(cè)試細(xì)胞的表型，由此將測(cè)試細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞的表型進(jìn)行比較而指示靶基因的功能，從而評(píng)估測(cè)試細(xì)胞中靶基因的功能。測(cè)試細(xì)胞可以是能夠預(yù)期表達(dá)siRNA以確定通過(guò)siRNA介導(dǎo)的RNAi如何影響基因表達(dá)的任何細(xì)胞。所檢測(cè)的表型一般是靶基因介導(dǎo)的表型，通常是由基因編碼的RNA介導(dǎo)的表型，并且特別是由基因編碼的多肽所介導(dǎo)的表型。照這樣，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到待檢測(cè)的表型將依賴于特定靶基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法提供了鑒定靶基因賦予的表型的一種手段。
本發(fā)明還提供了鑒定一種試劑是否有效應(yīng)或影響測(cè)試細(xì)胞中特異基因的方法。用于此處的術(shù)語(yǔ)“影響”和“效應(yīng)”是指由試劑引起的作用(“效應(yīng)”)和此種作用的結(jié)果(“影響”)。雖然在此處一般是指由于試劑引起的效應(yīng)，還應(yīng)該認(rèn)識(shí)到確定為“效應(yīng)物”試劑的試劑影響靶基因的表達(dá)。確定一種試劑是否對(duì)細(xì)胞中特異基因有效應(yīng)的方法可以按如下方法進(jìn)行，例如，通過(guò)在測(cè)試細(xì)胞中表達(dá)含有由本發(fā)明的至少一個(gè)DMSG盒編碼的中間體siRNA的siRNA，其中中間體siRNA含有與測(cè)試細(xì)胞中特異基因編碼的RNA分子互補(bǔ)的5’部分，將測(cè)試細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞與試劑相接觸，并且比較測(cè)試細(xì)胞的表型和對(duì)照細(xì)胞的表型，從而評(píng)價(jià)該試劑是否對(duì)測(cè)試細(xì)胞中的特異基因有效應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)第一DMSG盒編碼的第一中間體siRNA和第二DMSG盒編碼的第二中間體siRNA，其中第一中間體siRNA含有與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的5’部分，其中第二中間體siRNA含有與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的5’部分，并且其中第一中間體siRNA的5’部分與第二中間體siRNA的5’部分互補(bǔ)。與對(duì)照細(xì)胞的表型相比測(cè)試細(xì)胞表型的變化可鑒定該試劑是否能作為影響特異基因的試劑。
本發(fā)明的篩選方法提供了下述優(yōu)點(diǎn)，即它能夠用于高通量分析并且，因此，可被用于篩選測(cè)試制劑的組合文庫(kù)以鑒定那些對(duì)靶基因表達(dá)有效應(yīng)的試劑。制備用于預(yù)期活性測(cè)定的分子的組合文庫(kù)的方法在本領(lǐng)域是已知的并且包括，例如，制備肽的噬菌體展示文庫(kù)的方法，其中所述肽可以是限制肽(見，例如，美國(guó)專利號(hào)5,622,699和5,206,347；Scott和Smith，Science 249386-390，1992；Markland等，Gene 10913-19，1991；每篇文獻(xiàn)此處引用作為參考)；肽文庫(kù)(美國(guó)專利號(hào)5,264,563，此處引用作為參考)；肽模擬物文庫(kù)(Blondelle等，Trends Anal.Chem.1483-92，1995)；核酸文庫(kù)(O′Connell等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 935883-5887，1996；Tuerk和Gold，Science 249505-510，1990；Gold等，Ann.Rev.Biochem.64763-797，1995；每篇文獻(xiàn)此處引用作為參考)；寡糖文庫(kù)(York等，Carb.Res.28599-128，1996；Liang等，Science 2741520-1522，1996；Ding等，Adv.Expt.Med.Biol.376261-269，1995；每篇文獻(xiàn)此處引用作為參考)；脂蛋白文庫(kù)(de Kruif等，F(xiàn)EBS Lett.399232-236，1996，此處引用作為參考)；糖蛋白和糖脂文庫(kù)(Karaoglu等，J.Cell Biol.130567-577，1995，此處引用作為參考)；或包括例如藥物或其它藥用試劑的化學(xué)文庫(kù)(Gordon等，J.Med.Chem.371385-1401，1994；Ecker和Crooke，BioTechnology13351-360，1995，每篇文獻(xiàn)此處引用作為參考)。多核苷酸作為能夠影響基因表達(dá)的試劑是特別有用的，因?yàn)楹怂岱肿訉?duì)細(xì)胞內(nèi)的靶具有結(jié)合特異性，其中所述細(xì)胞內(nèi)的靶包括天然存在的細(xì)胞多肽，并且因?yàn)榫哂写朔N特異性的合成分子能夠容易地制備和鑒定(見，例如美國(guó)專利號(hào)5,750,342，此處引用作為參考)。
本發(fā)明還提供了試劑盒，它們含有至少一個(gè)本發(fā)明分離的DNA分子、至少一個(gè)本發(fā)明的DMSG盒、或者它們的組合。本發(fā)明的試劑盒還可以含有，例如，用于將此種核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞的試劑，例如，轉(zhuǎn)染輔助劑，或者可以含有對(duì)于擴(kuò)增核酸分子或?qū)⒑怂岱肿?例如，一種或多種DMSG盒)導(dǎo)入特定細(xì)胞類型有用的一個(gè)或供選擇的不同載體。當(dāng)試劑盒含有至少一個(gè)這樣的DMSG盒時(shí)，所述DMSG盒包括含有限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)或重組酶識(shí)別位點(diǎn)或它們的組合的異源核苷酸序列，該試劑盒可進(jìn)一步包括至少一個(gè)啟動(dòng)子或終止子，或它們的組合，其中啟動(dòng)子或終止子含有足以可操作連接至編碼中間體siRNA的核苷酸序列上的末端。照這樣，本發(fā)明的一種試劑盒可以包含多種不同的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等等，例如，允許在細(xì)胞內(nèi)或特定細(xì)胞類型、或在特定條件下如暴露于誘導(dǎo)劑時(shí)，以預(yù)期水平表達(dá)編碼的中間體siRNA的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子等。
在另一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該試劑盒含有DMSG盒，其中異源核苷酸序列包括至少一個(gè)啟動(dòng)子、至少一個(gè)終止子、或它們的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源核苷酸序列包含人U6基因啟動(dòng)子或RNA聚合酶III啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，異源核苷酸序列包含至少一個(gè)增強(qiáng)子元件。
在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒含有至少兩種本發(fā)明的DNA分子或DMSG盒，其中由兩種核酸分子編碼的中間體siRNA分子能夠選擇性雜交形成功能雙鏈siRNA分子。照這樣，該試劑盒可以含有用于介導(dǎo)RNAi的試劑。
在本發(fā)明公開之前，由于化學(xué)合成RNA的高成本和低穩(wěn)定性，RNA介導(dǎo)的基因沉默曾經(jīng)是困難的并且是昂貴的。本發(fā)明通過(guò)提供DNA介導(dǎo)的基因沉默克服了以前RNA介導(dǎo)的基因沉默的局限，其中如此處所公開的DNA分子被用作運(yùn)載工具以攜帶用于RNAi的序列信息，并且DNA分子還作為介導(dǎo)子被導(dǎo)入細(xì)胞用于特異基因的沉默。包括dsDNA分子在內(nèi)的DNA分子提供了另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即它們能夠整合入宿主細(xì)胞的染色體，從而產(chǎn)生穩(wěn)定的并且基本上永久的效應(yīng)。此種特性允許產(chǎn)生具有永久RNAi效應(yīng)的轉(zhuǎn)基因生物，包括植物和動(dòng)物，因此提供了這樣的模型系統(tǒng)，它允許研究例如基因或基因組合的功能，并且它能夠模擬病理性疾病，特別是與基因或基因產(chǎn)物的功能異常缺乏相關(guān)的疾病。DNA分子比RNA易于產(chǎn)生和操作并且是廉價(jià)的。盡管對(duì)RNA的修飾冒喪失RNAi功能的危險(xiǎn)，但對(duì)DNA的修飾，如用熒光標(biāo)記物標(biāo)記或在末端或不改變DNA分子功能的其它位點(diǎn)連接用于靶向遞送的多肽，不改變編碼的中間體RNA分子或，因此，不改變介導(dǎo)RNAi的能力。此類修飾使得可選擇已經(jīng)接受RNAi處理的細(xì)胞而與沒有接受RNAi處理的細(xì)胞分開，或者使得可靶向生物體中的特定細(xì)胞類型。
如此處所公開，編碼靶RNA分子有意鏈和相應(yīng)的反義鏈的DNA分子，如DMSG盒，可介導(dǎo)基因沉默(見實(shí)施例)。通常，編碼的siRNA分子具有短于約30個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，因此使非特異性抑制被活化的可能性降到最低，并且通常是長(zhǎng)度約為20-25個(gè)核苷酸，特別是約21個(gè)核苷酸，它能夠有效地誘導(dǎo)RNAi(Elbashir等，EMBO J.，236877-88，2001)。同樣，siRNA鏈和靶RNA鏈之間的錯(cuò)配通常被最小化，從而使選擇性最大化；通常，在RNAi的兩條RNA鏈之間或反義鏈與靶mRNA之間沒有錯(cuò)配。
含有增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子、編碼有意或反義RNA鏈的模板序列、和兩個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子的DMSG盒示例于圖1A。根據(jù)設(shè)計(jì)為能夠在靶細(xì)胞內(nèi)從DMSG盒轉(zhuǎn)錄出短RNA的RNA聚合酶(在該例子中為pol III)的需求設(shè)計(jì)這些元件。通過(guò)利用強(qiáng)或弱的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子元件、多重增強(qiáng)子元件、或其它能夠調(diào)節(jié)RNA聚合酶活性的元件能夠達(dá)到預(yù)期的表達(dá)水平。在如圖1所描述的例子中，選擇人RNA聚合酶III用于從DMSG盒轉(zhuǎn)錄短RNA，并且使用人U6基因啟動(dòng)子。當(dāng)天然位于距離U6基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)約224個(gè)核苷酸的位置時(shí)可通過(guò)聚合酶III刺激轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子即人遠(yuǎn)側(cè)序列元件(“DSE”；ATTGCAT)在作為例子的DMSG盒中定位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游大約79核苷酸處。在人U6基因中DSE下游是近側(cè)序列元件(“PSE”；CTTACCGTAACTTGAAAGTA；SEQ ID NO34；比較小鼠PSE；CTCACCCTAACTGTAAAGTA；SEQ ID NO35，它也可用于DMSG盒)和如在U6基因中那樣的TATA盒(也見，SEQ ID NO36，人U6基因上游調(diào)控序列，包括DSE、PSE和TATA調(diào)控元件)。U6基因啟動(dòng)子的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它完全處于編碼中間體siRNA的模板核苷酸序列的外部，并且使用聚合酶III系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于聚合酶III能夠從基因的僅僅幾個(gè)拷貝轉(zhuǎn)錄出大約100,000個(gè)RNA拷貝(Weinberg和Penman，J.Mol.Biol.3289-304，1968)。
如此處所公開，中間體siRNA可以通過(guò)下面方法由DMSG盒產(chǎn)生，可以通過(guò)將終止子序列包含于盒中從而使中間體siRNA具有合適的長(zhǎng)度并且含有預(yù)期的3′突出端，或者通過(guò)構(gòu)建使轉(zhuǎn)錄本從模板上“脫落”的DMSG盒而產(chǎn)生?？梢酝ㄟ^(guò)下述“脫落式”機(jī)制終止轉(zhuǎn)錄，例如，通過(guò)將DMSG盒構(gòu)建成線性表達(dá)盒(見圖1B)，其中該盒在模板序列的最后一個(gè)核苷酸處終止。同樣地，通過(guò)將限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)引入盒中的預(yù)期的位置并且，用適當(dāng)?shù)南拗菩悦讣羟邪珼MSG盒的核酸分子(例如含有所述盒的環(huán)狀載體)能夠?qū)崿F(xiàn)脫落。以這樣的方式，正在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶在到達(dá)模板末端之后將脫離模板，因此產(chǎn)生預(yù)期的中間體siRNA轉(zhuǎn)錄本。此類方法與使用如噬菌體RNA聚合酶如T7、T3或Sp6 RNA聚合酶或細(xì)菌RNA聚合酶如大腸桿菌RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄的標(biāo)準(zhǔn)方法相似。
含有位于模板序列之后的終止子元件的DMSG盒圖示于圖1A。U6基因的聚合酶III終止子元件是一段可以在一個(gè)胸腺嘧啶(“T”)堿基處有效終止轉(zhuǎn)錄的短序列。與利用這種終止元件相關(guān)的是，可以選擇用于基因沉默的RNA序列以至于最后幾個(gè)堿基是與終止子重疊的尿嘧啶(“U”)。為了防止?jié)B漏終止事件發(fā)生而得到長(zhǎng)的RNA，第二個(gè)終止子可以位于第一個(gè)終止子之后(下游)(圖1A)。含有終止子元件的DMSG盒可以方便地串聯(lián)放置在線性或環(huán)狀核酸分子如載體上(見圖2)。
含有三到五個(gè)連續(xù)胸腺嘧啶核苷殘基的核苷酸序列可以作為RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄的終止子。例如，人U6基因RNA聚合酶III(polIII)終止子包括核苷酸序列TTTTTACATCA(SEQ ID NO48)，盡管終止子的末端還沒有清楚的定義，并且含有非T的序列可以影響終止。同樣地，小鼠U6基因聚合酶III終止子含有核苷酸序列TTTTgTTcc(SEQ ID NO49)。如以上所討論，畢竟這些天然存在的終止子可能被滲漏，以至于終止不總是在特定堿基處發(fā)生。如此處所公開，已經(jīng)設(shè)計(jì)出經(jīng)修飾的聚合酶III終止子以更加有效地終止聚合酶III轉(zhuǎn)錄，以至于在終止子區(qū)域內(nèi)終止事件發(fā)生的百分率更高。具體而言，從天然存在的人U6基因終止子設(shè)計(jì)的經(jīng)修飾聚合酶III終止子具有核苷酸序列TTTTTacagTTTTTg(SEQ IDNO50；也見，實(shí)施例1，和SEQ ID NO3)，并且從天然存在的小鼠U6基因終止子設(shè)計(jì)的經(jīng)修飾聚合酶III終止子具有核苷酸序列TTTTGTTcgTTTTTg(SEQ ID NO51；也見，實(shí)施例4，和SEQ ID NO18)。
為了廣泛應(yīng)用，期望將DMSG盒的所有元件以與那些用于基因轉(zhuǎn)移例如轉(zhuǎn)染和感染相似的方式放置在一個(gè)載體上。在一個(gè)實(shí)施方案中，DMSG盒被設(shè)計(jì)于具有一個(gè)或多個(gè)下面特性的載體骨架上。載體可有模板克隆位點(diǎn)以至于對(duì)應(yīng)于特定靶基因的模板序列的dsDNA寡核苷酸常規(guī)地被插入到載體中而不干擾盒的整體功能。可以設(shè)計(jì)限制性位點(diǎn)從而使，當(dāng)消化時(shí)，不從啟動(dòng)子或終止子添加或刪除額外的核苷酸。此外，在使用聚合酶III啟動(dòng)子的情況下，第一個(gè)堿基是鳥嘌呤(“G”)或腺嘌呤(“A”)，酶需要它作為起始核苷酸(Goomer和Kunkel，Nucleic Acids Res.，184903-4912，1992)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，BsmI限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)在啟動(dòng)子和終止子之間被串聯(lián)使用，并且是以相反方向串聯(lián)(圖3和實(shí)施例6)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子和/或終止子兩側(cè)是限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)以至于不同的啟動(dòng)子/終止子可被插入，從而代替例舉的啟動(dòng)子/終止子。當(dāng)用限制酶消化時(shí)，用于插入模板序列、啟動(dòng)子、終止子等等的選擇性設(shè)計(jì)的粘性末端保持完整。通過(guò)這種設(shè)計(jì)，如果鳥嘌呤和胞嘧啶被分別選擇作為模板序列的第一個(gè)和最后一個(gè)堿基，可避免“額外堿基”并達(dá)到最大的RNAi效應(yīng)。
使用其它限制酶位點(diǎn)也可以實(shí)現(xiàn)相似的設(shè)計(jì)。啟動(dòng)子和終止子可以是任意天然或人工的序列，它攜帶能被任意天然或人工設(shè)計(jì)的聚合酶轉(zhuǎn)錄的預(yù)期特征。載體可以是任意可商業(yè)獲得的載體或特別設(shè)計(jì)的質(zhì)粒、病毒、噬菌體、噬菌粒、線性表達(dá)載體、或任意其它類型的用于轉(zhuǎn)移遺傳信息的運(yùn)載工具。
DMSG盒可以通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)遞送，轉(zhuǎn)染技術(shù)包括但不限于鈣沉淀、電穿孔、陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物、DEAE-葡聚糖復(fù)合物、多聚季胺(polybrene)試劑等等。使用機(jī)械方法如通過(guò)微注射或使用生物彈道射擊顆粒，也可以將DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞。通過(guò)病毒感染可以將攜帶于病毒載體上的DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞。通過(guò)連接DNA分子于轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞的信號(hào)肽上也能遞送DMSG盒。例如，可以將DMSG分子偶聯(lián)到指導(dǎo)DNA進(jìn)入細(xì)胞的HIVTAT轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域或細(xì)胞滲透肽上(Becker-Hapak等，Methods 3247-256，2001；Gallouzi和Steitz，Science 55481895-1901，2001)。
DNA分子可以被修飾而不影響基因沉默的介導(dǎo)RNA。一些應(yīng)用可以來(lái)源于此類修飾，其包括但不限于鑒定和選擇已經(jīng)獲得了一個(gè)或多個(gè)基因沉默信號(hào)的細(xì)胞、將DMSG試劑靶向特定細(xì)胞群、與DMSG分子一起遞送其它信號(hào)或效應(yīng)分子等等。
通過(guò)將DNA分子直接與有顏色的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，如熒光素(FITC)、藻紅蛋白、Cy3、Cy5、得克薩斯紅、或其它可得的標(biāo)記物，或間接與能夠通過(guò)偶聯(lián)其它有色標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記的標(biāo)記試劑如生物素或地高辛配基進(jìn)行標(biāo)記，以實(shí)現(xiàn)對(duì)DMSG處理細(xì)胞群的選擇。直接標(biāo)記適合用熒光輔助的細(xì)胞分選(FACS)或熒光顯微鏡的方法追蹤活細(xì)胞。間接標(biāo)記則要求在第二次標(biāo)記之前對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行固定。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼有意或反義RNA分子的dsDNA的單鏈或雙鏈的3′末端在合成時(shí)用FITC進(jìn)行標(biāo)記。當(dāng)將此類DNA分子導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，可以通過(guò)熒光跟蹤那些接收DMSG分子并且經(jīng)受基因沉默效應(yīng)的細(xì)胞。這使得能夠選擇特異細(xì)胞群、組織、或有機(jī)體以進(jìn)行基因功能研究，而可以避免通過(guò)混合的細(xì)胞群產(chǎn)生的假象并因此得到可靠的數(shù)據(jù)。DNA分子的修飾可以在雙鏈核DNA分子3′末端、5′末端、或兩者、和任意一條鏈上，或者可以使用此處公開的或本領(lǐng)域已知的方法在任何一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部核苷酸上進(jìn)行修飾。
用不同的標(biāo)記物標(biāo)記不同的DMSG盒而不影響它們的RNA編碼能力的潛能和導(dǎo)入多種DMSG盒的便利可以用于產(chǎn)生多基因敲低。基因經(jīng)常在多基因產(chǎn)物參與的途徑和網(wǎng)絡(luò)中起作用。一個(gè)基因的敲低僅能夠揭示部分或有限的基因功能，而相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)的敲低能夠?qū)е聦?duì)基因功能和關(guān)系的更系統(tǒng)的理解。多基因敲低也被用于治療的實(shí)際應(yīng)用中。
DMSG分子可以用于靶向特異細(xì)胞類型。這種細(xì)胞特異的靶向可以通過(guò)將DMSG分子偶聯(lián)到能夠指導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)入或內(nèi)吞入特異細(xì)胞群的肽或多肽或其它靶向分子而實(shí)現(xiàn)。
用于偶聯(lián)的DNA分子的簡(jiǎn)單性和可進(jìn)入性也使將DMSG分子與一個(gè)或多個(gè)效應(yīng)分子連接成為可能，所述效應(yīng)分子如能夠在細(xì)胞內(nèi)引起效應(yīng)的放射性同位素、化學(xué)試劑、肽或多肽、其它多核苷酸分子等等。這些與DMSG共遞送的分子的效應(yīng)可以獲得并且與一個(gè)細(xì)胞中的基因沉默聯(lián)合進(jìn)行研究。
本發(fā)明提供了研究真核系統(tǒng)特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞或生物體中一個(gè)或多個(gè)基因功能的方法。將靶向目的基因的DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞或生物體，即測(cè)試細(xì)胞或測(cè)試生物體。根據(jù)需要，將對(duì)照DMSG盒、緩沖液或者其它空白處理應(yīng)用于對(duì)照細(xì)胞或生物體。將測(cè)試或?qū)φ占?xì)胞或生物體維持在基因沉默發(fā)生的條件下。觀察測(cè)試細(xì)胞或生物體的表型，并將其與適當(dāng)?shù)膶?duì)照細(xì)胞或生物體的表型相比較。此種與對(duì)照細(xì)胞或生物體的比較可以在上述的經(jīng)選擇的細(xì)胞群之間進(jìn)行。對(duì)于此種比較，對(duì)照細(xì)胞是用對(duì)照DMSG盒處理的，對(duì)照DMSG盒與非對(duì)照DMSG盒在包括標(biāo)記物標(biāo)記的所有方面是相同的，除了對(duì)照分子中的模板序列不針對(duì)靶基因外。對(duì)照分子中的模板序列可以針對(duì)相關(guān)的或不相關(guān)的具有相同或不同物種特異性的第二個(gè)基因，或者針對(duì)非天然存在的基因。測(cè)試和對(duì)照細(xì)胞或生物體表型間的不同提供了關(guān)于靶基因功能的信息。這些信息單獨(dú)是有價(jià)值的，或者可以與從其它鑒定或定義基因功能的測(cè)定或分析中獲得的信息聯(lián)合使用。
本發(fā)明還包括確定一個(gè)基因產(chǎn)物是否是藥物發(fā)明或研發(fā)的靶的方法。將能夠誘導(dǎo)基因沉默的DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞或生物體。細(xì)胞或生物體被維持在基因沉默發(fā)生的條件下，并且可以通過(guò)導(dǎo)入的DMSG分子上攜帶的標(biāo)記物選擇被靶向的細(xì)胞或生物體。確定基因表達(dá)的降低是否對(duì)細(xì)胞或生物體具有影響，其中如果基因表達(dá)的降低有影響，那么該基因產(chǎn)物可作為藥物發(fā)明或研發(fā)的靶。效應(yīng)可以是細(xì)胞死亡、分化、細(xì)胞分裂變化、或任何其它細(xì)胞反應(yīng)。靶基因可以是，任意細(xì)胞來(lái)源的天然基因，例如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或細(xì)胞周期控制中的基因，或病毒或其它致病原的天然基因，例如參與肝炎病毒、HIV或其它病毒生命周期的基因等。
還提供了用于產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的生物體的方法，其中一種或多種DMSG盒通過(guò)染色體的復(fù)制從一代傳到下一代。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)微注射可以將針對(duì)任意特定基因或多個(gè)基因的DMSG分子導(dǎo)入早期胚胎并且成為其染色體的一部分。源于該具有整合的DMSG分子的生殖細(xì)胞的動(dòng)物能夠?qū)⑥D(zhuǎn)基因DMSG DNA作為其染色體的整合部分傳遞給后代，從而建立具有由所述DNA插入物所編碼的中間體RNA干擾的靶基因的動(dòng)物。與目前基因敲除方法相比較，DMSG敲低不依賴于同源重組并且以極高的成功率進(jìn)行。值得注意地是，由于通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行的多基因敲低若不是不可能的話，實(shí)際上是非常困難的，而多重DMSG基因的敲低是可行的。DMSG基因敲低沒必要克隆基因組序列和如傳統(tǒng)基因敲低方法所需要的那樣操作較大DNA構(gòu)建體。原則上，可以將編碼中間體dsRNA有意鏈和反義鏈的小DMSG盒插入染色體的任意位置用于每個(gè)基因敲低。此外，由于存在一些對(duì)于轉(zhuǎn)錄而言失活或難以進(jìn)入的染色體區(qū)域(Izumi和Gilbert，J Cell Biochem.2280-289，1999)，隔離元件(insulator element)(能夠阻斷位于其中的序列受到相鄰染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域或元件的調(diào)節(jié)效應(yīng)的結(jié)構(gòu)域邊界)可以被包含于DMSG中以保證所編碼的中間體dsRNA分子的連續(xù)轉(zhuǎn)錄。
可以將DMSG盒微注射進(jìn)入前核胚胎。具有整合的DMSG分子的被注射胚胎中的一些細(xì)胞將發(fā)育形成生殖系細(xì)胞。來(lái)源于這些生殖系細(xì)胞的第二代動(dòng)物將攜帶DMSG盒作為它們的染色體的部分。其它動(dòng)物如具有整合的DMSG分子的蠅、蠕蟲、或斑馬魚也可以通過(guò)適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)基因方法產(chǎn)生，同樣也可以產(chǎn)生植物。
本發(fā)明還提供了控制基因敲低的方法?；蚯玫偷臅r(shí)間和水平可以通過(guò)控制DMSG DNA的轉(zhuǎn)錄來(lái)操縱。在一個(gè)實(shí)施方案中，DMSG盒處于外源RNA聚合酶的控制之下，例如轉(zhuǎn)基因的T7、T3、Sp6、或大腸桿菌RNA聚合酶。編碼聚合酶的基因反過(guò)來(lái)被可誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制，如當(dāng)存在誘導(dǎo)制劑(誘導(dǎo)劑)如四環(huán)素或蛻皮素時(shí)僅通過(guò)內(nèi)源聚合酶II轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。實(shí)際上，當(dāng)在特異的時(shí)間點(diǎn)如某個(gè)發(fā)育階段期望基因敲低時(shí)加入誘導(dǎo)劑使外源RNA聚合酶被表達(dá)，它隨后轉(zhuǎn)錄DMSG盒編碼的中間體RNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，外源RNA聚合酶處于組織特異性啟動(dòng)子的控制之下，并且因此僅在特異的組織或器官，例如胰腺外分泌細(xì)胞、心臟成肌細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)果，DMSG基因沉默僅在特異組織或器官中被激活。該方法可以與可誘導(dǎo)的和多種DMSG基因敲低聯(lián)合使用。
本發(fā)明還提供了用于治療性或預(yù)防性治療疾病的組合物和方法?？梢詫MSG分子導(dǎo)入生物體以沉默靶基因，從而逆轉(zhuǎn)或阻止異?；蚣膊??？梢酝ㄟ^(guò)直接施用于生物體表面或通過(guò)諸如基因槍的方法施用于表面下的細(xì)胞來(lái)遞送單獨(dú)或包含于治療組合物如適當(dāng)緩沖劑和其它試劑中的DMSG分子。遞送也可以是內(nèi)部施用，例如通過(guò)注射或以適當(dāng)?shù)慕M合物口服遞送，從而保護(hù)DNA分子的完整性并且產(chǎn)生基因沉默效應(yīng)。如果DNA分子被整合入宿主染色體，DMSG分子通過(guò)生殖系的治療可以是永久的。
鑒定已知功能的基因傳統(tǒng)上是通過(guò)遺傳篩選或通過(guò)生物化學(xué)方法分離基因產(chǎn)物進(jìn)行的。然而，此類鑒定也可以通過(guò)“分子進(jìn)化”實(shí)現(xiàn)，即從DNA或RNA分子庫(kù)中富集和選擇預(yù)期的遺傳信息，或者通過(guò)反向遺傳學(xué)實(shí)現(xiàn)，即改變所有或一組基因并檢測(cè)在研究條件下具有功能的基因。一個(gè)實(shí)例是用于從RNA或DNA序列變體庫(kù)中選擇靶蛋白的高親和力配體的SELEX(通過(guò)指數(shù)富集而系統(tǒng)進(jìn)化配體)方法(Gold，Harvey Lect，47-57，1995；Wang等，J Bol Chem.3522227-22235，1997；White等，J Clin.Invest.8929-934，2000)。通過(guò)如用于從隨機(jī)或優(yōu)選的庫(kù)中選擇具有預(yù)期結(jié)合能力的蛋白質(zhì)的噬菌體展示和核糖體展示的例子也可以證明這種概念(Crameri和Kodzius，Comb.Chem.High Throughput Screen 2145-155a，2001；Schaffitzel等，J.Immunol.Methods 1-2119-125，1999)。DMSG盒上的基因沉默信號(hào)是以短的模板序列的形式存在的并，因此，適于作為可以進(jìn)行選擇的簡(jiǎn)并庫(kù)而變化。為了產(chǎn)生隨機(jī)DMSG盒庫(kù)，具有簡(jiǎn)并模板序列的經(jīng)化學(xué)合成的單鏈DNA寡核苷酸被DNA聚合酶(如T7 DNA聚合酶；T7聚合酶啟動(dòng)子以5′-TAATACGACTCACTAT-3′(SEQ ID NO37)為例)轉(zhuǎn)換成dsDNA。該dsDNA模板序列或者被連接到DMSG盒上，此時(shí)兩條鏈都可用于轉(zhuǎn)錄時(shí)，或者以相反的方向被克隆進(jìn)入雙盒DMSG分子上的每個(gè)盒。與RNA介導(dǎo)的RNAi的dsRNA相反，DMSG盒的dsDNA本質(zhì)有利于任意所選擇序列的分子克隆。因此，涉及設(shè)計(jì)和使用DMSG盒的方法實(shí)際上可以被應(yīng)用于鑒定這樣的基因，即當(dāng)它們被敲低時(shí)能夠改變細(xì)胞事件并因此產(chǎn)生特異表型，如阻滯細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、癌樣轉(zhuǎn)化和對(duì)藥物的反應(yīng)或抗性等。
因此本發(fā)明涉及鑒定具有特異功能并且當(dāng)被敲低時(shí)表現(xiàn)出特異表型的基因的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，模板核苷酸序列的每個(gè)堿基都是4個(gè)天然堿基即A、C、G或T中的任意一個(gè)，因此產(chǎn)生具有與細(xì)胞中任意基因匹配的潛能DMSG盒的庫(kù)。然后將除了模板區(qū)域(隨機(jī)寡核苷酸合成的區(qū)域)外其它區(qū)域相同的DNA分子轉(zhuǎn)染進(jìn)入足夠數(shù)量的細(xì)胞。可以進(jìn)行一步或多步驟的細(xì)胞選擇以分離表現(xiàn)出所尋找表型的細(xì)胞?？梢詮倪@些細(xì)胞中獲得雙鏈DNA分子，并且或擴(kuò)增用于下一輪富集和選擇或克隆并測(cè)序。從分離的DMSG盒上的模板序列可以鑒定具有目的功能的候選基因。然后將此類基因通過(guò)分子克隆方法克隆或者利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行鑒定。
本發(fā)明還提供了分離具有特定功能的RNA分子的方法。與上面所述的基因鑒定方法相似，可以將編碼候選RNA庫(kù)或組合的DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞群或生物體，并從它們當(dāng)中選擇在研究條件下具有表型的細(xì)胞。通過(guò)克隆dsDNA和測(cè)序模板區(qū)域獲得了功能RNA序列?？梢砸赃@種手段選擇的功能RNA包括，但不限于，具有高效性和特異性siRNA分子、除了能產(chǎn)生RNAi效應(yīng)的siRNA分子之外的RNA(如那些具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的分子)、反義RNA、和功能復(fù)合體如染色體失活復(fù)合體的RNA成分(Meller等，Cell4445-457，1997)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及研究真核細(xì)胞中非編碼RNA的生物學(xué)功能的方法。已經(jīng)報(bào)道在許多動(dòng)物中存在天然小RNA(microRNA；miRNA)分子，它們通過(guò)與RNAi相關(guān)的途徑被加工(Grishok等，Cell 123-34，2001；Hutvagner等，Science 5531834-838，2001；Ketting等，Genes Devel.202654-2659，2001；Lagos-Quintana等，Science 5543853-858，2001；Lau等，Science 5543858-862，2001；Lee和Ambros，Science 5543862-864，2001)。編碼此類RNA(或它們的反義鏈或變體)的DMSG盒可以用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以研究這些RNA的功能。在這方面，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，象任意RNA一樣，miRNA能夠做為siRNA的靶。此外，miRNA和siRNA是相似的，因?yàn)樗鼈冎械拿恳环N都是缺乏多聚(A)尾并被參與RNAi過(guò)程的因子識(shí)別的短RNA分子。因?yàn)镈MSG盒被設(shè)計(jì)用于轉(zhuǎn)錄短的、確定的RNA，包括如可操作連接于增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、終止子或它們的組合的模板克隆位點(diǎn)的此類盒的框架適于通過(guò)用miRNA模板代替siRNA模板來(lái)表達(dá)miRNA。
DNA介導(dǎo)的RNAi被用于在人或其它真核細(xì)胞中敲低基因特異表達(dá)。如此處公開，通過(guò)DNA介導(dǎo)物所實(shí)現(xiàn)的基因沉默在等摩爾的基礎(chǔ)上比相應(yīng)的通過(guò)RNA介導(dǎo)物即siRNA所實(shí)現(xiàn)的基因沉默效率要高，這可能是由于靶基因的正義和反義序列的中間體siRNA分子的持續(xù)產(chǎn)生，從而能夠在細(xì)胞內(nèi)形成功能雙鏈siRNA并活化針對(duì)特異基因的RNAi。相應(yīng)地，本發(fā)明涉及含有用于特異基因抑制的遺傳信息的DNA分子。含有對(duì)應(yīng)于靶基因的模板序列的DNA分子能夠通過(guò)RNAi介導(dǎo)基因抑制。雖然本發(fā)明的DNA分子使用天然存在的核苷酸進(jìn)行了例證，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到核苷酸類似物，包括非天然存在的合成核苷酸或經(jīng)修飾的天然存在的核苷酸，也能夠被用于構(gòu)建核酸分子，如DMSG盒。此類核苷酸類似物在本領(lǐng)域是熟知的并可經(jīng)商業(yè)獲得，含有此類核酸類似物的多核苷酸也是這樣(Lin等，Nucl.Acids Res.225220-5234，1994；Jellinek等，Biochemistry 3411363-11372，1995；Pagratis等，Nature Biotechnol.1568-73，1997，每篇文獻(xiàn)此處引用作為參考)。同樣地，雖然連接多核苷酸的核苷酸的共價(jià)鍵通常是磷酸二酯鍵，該共價(jià)鍵也可以是大量其它鍵中的任意一種，包括硫代二酯鍵、硫代磷酸酯鍵、肽樣鍵或任意其它在本領(lǐng)域用于連接核苷酸以產(chǎn)生合成多核苷酸的鍵(見，例如Tam等，Nucl.Acids Res.22977-986，1994；Eclcer和Crooke，BioTechnology 13351-360，1995，每篇文獻(xiàn)此處引用作為參考)。當(dāng)DMSG盒處于含有核酸水解活性的環(huán)境中，包括例如組織培養(yǎng)基或當(dāng)施用于活的受試者時(shí)，非天然存在的核苷酸類似物或連接核苷酸的鍵的摻入可能是特別有用的，因?yàn)榻?jīng)修飾的核酸分子對(duì)降解較不敏感。
模板核苷酸序列是本發(fā)明對(duì)應(yīng)于靶基因序列至少一部分的分離DNA分子(或DMSG盒)的元件。照這樣，模板編碼能夠形成siRNA并通過(guò)細(xì)胞RNAi機(jī)械復(fù)合體激發(fā)RNA的降解的中間體siRNA分子。靶mRNA和靶RNA此處是指那些通過(guò)導(dǎo)入DMSG分子被阻止功能的RNA。此種RNA能夠從內(nèi)源或外源基因轉(zhuǎn)錄，或通過(guò)轉(zhuǎn)染或其它從細(xì)胞或生物體外部向內(nèi)部轉(zhuǎn)移的方法作為RNA被導(dǎo)入，并且能夠，但非必需，編碼多肽。從DMSG盒轉(zhuǎn)錄的中間體siRNA能夠形成部分或全部指導(dǎo)RNA，它能夠與靶RNA進(jìn)行堿基配對(duì)并指導(dǎo)靶RNA降解。
本發(fā)明涉及含有設(shè)計(jì)的模板序列的DNA分子，模板序列能夠被轉(zhuǎn)錄成短于30個(gè)核苷酸的RNA。使用DNA介導(dǎo)的基因特異沉默的一個(gè)主要的關(guān)注點(diǎn)是將表達(dá)的RNA(有意或反義)控制在有限的長(zhǎng)度內(nèi)，例如短于30個(gè)核苷酸，這樣在產(chǎn)生RNAi的條件下不導(dǎo)致宿主細(xì)胞內(nèi)干擾素和PKR介導(dǎo)的普遍關(guān)閉。在哺乳動(dòng)物RNA聚合酶中，聚合酶III通過(guò)轉(zhuǎn)錄終止結(jié)束RNA延伸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，天然來(lái)源的或經(jīng)修飾的聚合酶III終止位點(diǎn)被用于DMSG盒，以獲得RNA長(zhǎng)度的有限性。該機(jī)制可以用于線性或環(huán)狀形式的盒中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，DMSG盒被設(shè)計(jì)成線性形式，其中模板序列后部不跟隨其它序列。結(jié)果，靶細(xì)胞內(nèi)的正在轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶將“脫離”模板而產(chǎn)生短RNA。對(duì)于此種脫離DMSG盒的正在轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶可以是任何內(nèi)源的或外源性導(dǎo)入的RNA聚合酶。
本發(fā)明還涉及編碼靶基因區(qū)域的有意或反義序列的DMSG盒。為了在適于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)RNAi的水平和形式將模板序列轉(zhuǎn)錄成RNA，此種DMSG盒可以包括特定RNA聚合酶的增強(qiáng)子，特定RNA聚合酶包括但不限于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的RNA聚合酶I、II、和III。為了轉(zhuǎn)錄模板序列，該盒還可以包括RNA聚合酶的啟動(dòng)子。增強(qiáng)子幫助驅(qū)動(dòng)從啟動(dòng)子起始的模板序列的轉(zhuǎn)錄。模板序列前面的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子可以作為獨(dú)立的盒以線性順序排列，或者是攜帶于環(huán)狀載體上，如質(zhì)?；虿《净蚱渌軌蛟鲋车妮d體。
本發(fā)明涉及在線性形式中包含所有必需DMSG元件的DMSG盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，每條有意或反義中間體RNA鏈被含有優(yōu)選的DMSG盒的dsDNA編碼。該盒含有最少量的元件，為啟動(dòng)子、模板序列，隨后是終止子或突然終止。DMSG盒可以含有在靶細(xì)胞中幫助產(chǎn)生預(yù)期水平轉(zhuǎn)錄本的增強(qiáng)子。在該實(shí)施方案中，從兩條合成的DNA鏈的復(fù)性產(chǎn)生dsDNA，其中合成的DNA鏈?zhǔn)怯没瘜W(xué)合成法產(chǎn)生的一個(gè)連續(xù)的分子。
本發(fā)明還涉及編碼有意或反義中間體RNA而不是連續(xù)DNA鏈的線性形式的DMSG盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)復(fù)性合成的DNA寡核苷酸組裝線性盒，它們中的每一個(gè)是DMSG dsDNA的兩條鏈中的任意一條鏈的一部分。通過(guò)其它方法也可以產(chǎn)生此種DMSG的dsDNA，它包括，但不限于，產(chǎn)生連續(xù)dsDNA分子的此類寡核苷酸的連接(用連接酶)或用分子生物學(xué)方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(“PCR”)進(jìn)行的擴(kuò)增。通過(guò)分子克隆或重組技術(shù)也可以產(chǎn)生此類dsDNA分子，這些技術(shù)包括加工或剪接DNA片斷，其中所述這些DNA片段如果經(jīng)轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞或生物體它們自身不能介導(dǎo)RNAi。
進(jìn)一步，本發(fā)明還涉及編碼有意和反義中間體RNA這兩者的線性形式的DMSG盒。此種dsDNA可以被描述成具有兩套盒的dsDNA的一個(gè)組裝體(具有或不具有切口)，其中每一套盒編碼有意或反義中間體RNA。此種“雙盒”DNA可以由化學(xué)合成(或重組合成)的長(zhǎng)DNA寡核苷酸退火形成，或者從較短的寡核苷酸退火形成的，這些短的寡核苷酸隨后被組裝和連接并通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。
本發(fā)明還涉及攜帶于載體上的DMSG盒，載體可以是質(zhì)粒、噬菌體、病毒、或能夠用于攜帶遺傳信息進(jìn)入靶細(xì)胞的任意其它類型的載體，還涉及攜帶于能攜帶插入的DNA部分的任意通用設(shè)計(jì)或特殊設(shè)計(jì)的DNA構(gòu)建體上的DMSG盒。這可以使用分子方法(包括但不限于連接和重組)，通過(guò)將所述的盒插入載體得以進(jìn)行。相應(yīng)地，本發(fā)明還涉及經(jīng)修飾的載體和修飾載體的方法，其中插入了編碼有意或反義siRNA序列的模板序列。這可以通過(guò)首先將上述的DMSG元件，即增強(qiáng)子或啟動(dòng)子，插入載體而實(shí)施，其中DMSG元件后面是模板克隆位點(diǎn)，在那里限制性酶位點(diǎn)可用于線性化載體以進(jìn)行模板序列的插入。模板克隆序列的后面是終止子區(qū)域。具體而言，如此處公開，位點(diǎn)是經(jīng)過(guò)選擇和設(shè)計(jì)的以至于插入到該位點(diǎn)的模板序列將在靶細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄，其中沒有任何或僅有有限數(shù)量的非模板序列編碼的核苷酸。不期望非模板序列編碼的核苷酸，因?yàn)樗鼈兡軌蚪档突蚱茐奶禺怰NAi效應(yīng)(Elbashir等，EMBO J.236877-6888，2001；Parrish等，MolCell 51077-1087，2000)。
本發(fā)明還涉及在細(xì)胞或生物體或組織，包括例如生物體的心臟、肺、結(jié)腸、腎、或皮膚中，介導(dǎo)基因的RNA干擾的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，將DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞或生物體，其中所述該DMSG盒具有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄能夠激發(fā)靶mRNA降解的有意和反義RNA的能力。細(xì)胞或生物體被維持在靶mRNA降解發(fā)生的條件下，從而在細(xì)胞或生物體介導(dǎo)RNAi。
本發(fā)明還涉及靶基因部分地或全部地敲低的方法，該方法提供了基因敲除方法或先前使用RNA分子進(jìn)行基因敲低方法的可選擇的方法。術(shù)語(yǔ)敲低或敲除還用來(lái)指當(dāng)與相應(yīng)的正常(即未被修飾)的細(xì)胞或生物體相比基因功能被消除(抑制)或減弱(降低)對(duì)細(xì)胞或生物體的影響。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生敲低細(xì)胞或生物體的方法，該方法包括向其中有欲敲低靶基因的細(xì)胞或生物體導(dǎo)入編碼能靶向所述基因的RNA的DMSG盒，在基因沉默發(fā)生的條件下維持細(xì)胞或生物體，和產(chǎn)生敲低或敲除的細(xì)胞或生物體。
本發(fā)明還涉及從一群細(xì)胞中追蹤經(jīng)歷DMSG處理的特異細(xì)胞群。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼有意或反義RNA的dsDNA的一條或兩條鏈用標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。當(dāng)將此種DNA分子導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，那些接受DMSG并隨后發(fā)生基因沉默效應(yīng)的細(xì)胞可以通過(guò)標(biāo)記物被追蹤。該方法能夠選擇特異的細(xì)胞群或部分組織或生物體，而由細(xì)胞的混合群體產(chǎn)生的假象可以避免。通過(guò)這種方法選擇的基因沉默效應(yīng)隨后發(fā)生的細(xì)胞群或組織也是本發(fā)明的主題。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及研究進(jìn)一步選擇的細(xì)胞群體中基因沉默效應(yīng)的方法，其中一個(gè)以上的基因分別作為單獨(dú)的DMSG盒的靶，而DMSG盒的DNA分子用可區(qū)別的標(biāo)記物進(jìn)行了標(biāo)記。多基因被敲低的選擇的細(xì)胞群或組織或生物體也是本發(fā)明的主題。
此外，本發(fā)明還涉及檢測(cè)或評(píng)價(jià)含有DMSG盒的細(xì)胞或生物體中基因功能的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，將含有特異模板序列并誘導(dǎo)基因沉默的DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞或生物體。細(xì)胞或生物體是指測(cè)試細(xì)胞或生物體。測(cè)試細(xì)胞或生物體被維持在基因沉默發(fā)生的條件下。然后觀察測(cè)試細(xì)胞或生物體的表型并與適當(dāng)?shù)挠孟嗤珼MSG盒不產(chǎn)生靶向的對(duì)照細(xì)胞或生物體的表型相比較。測(cè)試與對(duì)照細(xì)胞或生物體表型之間的不同提供了關(guān)于靶基因功能的信息。
本發(fā)明還涉及確定一種試劑對(duì)特異基因是否有作用的方法。在該方法中，將誘導(dǎo)基因沉默的DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞或生物體。細(xì)胞或生物體被維持在基因沉默發(fā)生的條件下并通過(guò)攜帶于導(dǎo)入的DNA分子上的標(biāo)記物選擇所靶向的細(xì)胞或生物體?？梢允侨我夥肿踊蚪M合物的測(cè)試試劑包括但不限于肽、蛋白質(zhì)、化學(xué)試劑或組合物、基因治療載體或組合物，將測(cè)試試劑導(dǎo)入測(cè)試細(xì)胞或生物體，并將其導(dǎo)入不發(fā)生基因沉默的對(duì)照細(xì)胞或生物體中。試劑處理后，測(cè)試細(xì)胞或生物體和對(duì)照細(xì)胞或生物體的表型用于確定試劑和靶基因之間的功能關(guān)系。
本發(fā)明還涉及從一隨機(jī)序列庫(kù)中鑒定具有特異功能的RNA分子的方法。對(duì)于從簡(jiǎn)并庫(kù)中進(jìn)行的任一選擇方法，高回收率是關(guān)鍵的。然而，短RNA如siRNA的直接克隆需要多步較難的步驟，包括RNA分離和與結(jié)頭連接，和逆轉(zhuǎn)錄PCR，它們一起導(dǎo)致了低的回收率。DMSG盒的dsDNA的本質(zhì)利于選擇后短RNA分子序列的高效回收?？梢赃x擇的具有特異功能的RNA分子包括但不限于siRNA分子、諸如那些含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)并具有RNAi效應(yīng)的非siRNA分子的RNA分子、反義RNA分子、諸如染色體失活復(fù)合體的功能復(fù)合體中的RNA成分。本發(fā)明還包括鑒定特別適用于DMSG盒的在靶RNA內(nèi)的區(qū)域的方法，以及評(píng)估攜帶于DMSG盒上的任意序列的介導(dǎo)基因沉默能力的方法。因此，本發(fā)明還提供了用此種方法鑒定的DMSG盒。
本發(fā)明還涉及使用含有此類DNA分子的DNA分子或組合物用于研究和治療性或預(yù)防性治療的方法，例如產(chǎn)生疾病狀態(tài)的研究模型、尋找藥物發(fā)明和研發(fā)的靶、或治療與蛋白質(zhì)或非編碼的功能RNA存在相關(guān)的疾病。它們包括但不限于使用DMSG盒、含有DMSG盒的組合物、施用此種盒的試劑盒、和用于研究或治療目的的含有此種盒和適當(dāng)載體的藥用組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)特異的將DMSG盒遞送入所選擇的靶細(xì)胞在特異細(xì)胞群或組織類型中誘導(dǎo)基因沉默的方法。dsDNA可以與信號(hào)分子偶聯(lián)，其中所述信號(hào)分子如肽或多肽(如細(xì)胞因子)、抗體、或僅僅對(duì)靶細(xì)胞表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)具有特異親和性的化學(xué)基團(tuán)。該細(xì)胞表面蛋白質(zhì)可以是受體、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)、或其它細(xì)胞表面分子。當(dāng)結(jié)合在表面分子上后，信號(hào)分子可通過(guò)內(nèi)吞或其它機(jī)制轉(zhuǎn)移入靶細(xì)胞。偶聯(lián)的DMSGdsDNA分子與信號(hào)分子一起被內(nèi)化。其它不表達(dá)特異表面分子的細(xì)胞不經(jīng)歷DMSG介導(dǎo)的基因沉默效應(yīng)。DMSG盒一旦進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，就表達(dá)能夠誘導(dǎo)基因沉默的中間體RNA。此類方法具有用于研究和治療的潛能。本發(fā)明還包括通過(guò)對(duì)DMSG盒上模板序列進(jìn)行序列測(cè)定所鑒定的基因，其中所述DMSG盒為當(dāng)其導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生特異表型。此外，本發(fā)明還提供了對(duì)不同基因的細(xì)胞或組織功能的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行繪圖的方法。
以下實(shí)施例意在闡明本發(fā)明但不用于限制本發(fā)明。
實(shí)施例由于RNAi在敲低靶向基因表達(dá)方面的有效性和特異性，它已經(jīng)成為功能基因組研究的受歡迎技術(shù)。目前的方法包括dsRNA或siRNA(21-23個(gè)核苷酸的小干擾RNA)介導(dǎo)的基因沉默，并且長(zhǎng)dsRNA分子似乎表現(xiàn)出更強(qiáng)的效應(yīng)。然而，在較高等的動(dòng)物中，RNAi介導(dǎo)的基因沉默可能僅能通過(guò)短dsRNA分子完成，因?yàn)殚L(zhǎng)dsRNA可引起PKR活化和干擾素效應(yīng)。此處公開的系統(tǒng)通過(guò)特異設(shè)計(jì)的DNA盒利用了活細(xì)胞中靶基因區(qū)域的兩條鏈的連續(xù)轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明的有效性是在實(shí)施例1中使用綠色熒光蛋白(“GFP”)作為靶基因的形式進(jìn)行證明的；組合物和方法的特異性是在實(shí)施例2中證明的。實(shí)施例3證明了將DMSG技術(shù)與組裝的表達(dá)盒聯(lián)合的可行性。由于長(zhǎng)的寡核苷酸(如＞80個(gè)核苷酸)難以合成，這種變化使產(chǎn)生盒更加實(shí)際可行。實(shí)施例4舉例說(shuō)明了在小鼠細(xì)胞系中用lacZ作為靶基因的經(jīng)修飾DMSG盒。實(shí)施例5和6證明了可以被攜帶于常規(guī)環(huán)狀載體上的DMSG盒。
實(shí)施例1通過(guò)線性DMSG盒降解靶mRNADMSG盒特異于編碼綠色熒光蛋白(GFP)的核苷酸序列的寡核苷酸在Core Faciltiy of Allele Biotechnology and Pharmaceuticals公司(SanDiego CA)合成。一般而言，表達(dá)盒(從5’到3’)由增強(qiáng)子區(qū)域、U6基因(人)聚合酶III的遠(yuǎn)側(cè)序列元件(DSE，對(duì)于盒中的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)而言為-79到-72)、人U6基因聚合酶III的近側(cè)序列元件(PSE，-66到-47)、TATA盒(-31到-26)、后面是模版序列(21個(gè)核苷酸)、U6基因終止子、和人工終止子(“TM”或“Term”)組成。對(duì)于RO盒，省略終止子。單一表達(dá)盒由復(fù)性結(jié)合到一起的兩條DNA鏈(有意鏈和反義鏈)組成。通過(guò)將兩條DNA鏈在復(fù)性緩沖液(50mM NaCl和50mMTris-HCl，pH7.4)中90℃孵育1分鐘，然后室溫15分鐘進(jìn)行復(fù)性。
表達(dá)有意或反義轉(zhuǎn)錄本的DMSG盒分別指定為(+)或(-)。為了便于以后的克隆，將Bgl II和Nhe I限制性酶切位點(diǎn)的粘末端分別加入到“TM”盒(122bp)的5′和3′末端，并加到RO盒(109bp)的5′末端(Bgl II)。對(duì)于TM DMSG(+)，將編碼GFP基因部分序列有意RNA的dsDNA的有意鏈hP3GFP(+)TMs與編碼同一有意RNA的dsDNA的反義鏈hP3GFP(+)TMas一起復(fù)性。將編碼GFP靶序列的反義RNA的兩條DNA鏈復(fù)性產(chǎn)生TM DMSG(-)。這兩個(gè)TM DMSG盒被一起用于誘導(dǎo)基因沉默。同樣地，應(yīng)用各自的DNA鏈(hP3GFP(+)s與hP3GFP(+)as復(fù)性，hP3GFP(-)s與hP3GFP(-)as復(fù)性)產(chǎn)生RO DMSG(+)和(-)盒并用于敲低GFP表達(dá)。
使用以下寡核苷酸hP3GFP(+)ROs5′-gatcTATTTGCATggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccGAACGGCATCAAGGTGAACTT-3′(SEQ ID NO1；113個(gè)核苷酸)；hP3GFP(+)ROas5′-AAGTTCACCTTGATGCCGTTCggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaagaaatcgaaatactttcaagttacggtaagcatatgatagtccATGCAAATA-3′(SEQ ID NO2；109個(gè)核苷酸)；hP3GFP(+)TMs5′-gatcTATTTGCATggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccGAACGGCATCAAGGTGAACTTtttacaGTTTTTg-3′(SEQ ID NO3；126個(gè)核苷酸)；hP3GFP(+)TMas5′-CTAGcAAAAACtgtaaaAAGTTCACCTTGATGCCGTTCggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaagaaatcgaaatactttcaagttacggaagcatatgatagtccATGCAAATA-3′(SEQ ID NO4；126個(gè)核苷酸)；hP3GFP(-)ROs5′5′-gatcTATTTGCATggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccGTTCACCTTGATGCCGTTCTT-3′(SEQ ID NO5；113個(gè)核苷酸)；
hP3GFP(-)ROas5′-AAGAACGGCATCAAGGTGAACggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaagaaatcgaaatactttcaagttacggtaagcatatgatagtccATGCAAATA-3′(SEQ ID NO6；109個(gè)核苷酸)；hP3GFP(-)TMs5′5′-gatcTATTTGCATggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccGTTCACCTTGATGCCGTTCTTtttacaGTTTTTg-3′(SEQ ID NO7；126個(gè)核苷酸)；和hP3GFP(-)TMas5′-CTAGcAAAAACtgtaaaAAGAACGGCATCAAGGTGAACggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaagaaatcgaaatactttcaagttacggtaagcatatgatagtccATGCAAATA-3′(sEQ ID NO8).
細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染293T(人胚腎)細(xì)胞生長(zhǎng)于添加了10％FBS、100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的Dulbecco′s改良Eagle培養(yǎng)基(Life Technologies，Rockville，Maryland)中CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。細(xì)胞常規(guī)傳代以維持生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，胰蛋白酶消化細(xì)胞并將其鋪在含上述培養(yǎng)基不含抗生素的24-孔板中(500μl/孔)。使用LIPOFECTIN 2000轉(zhuǎn)染試劑按照進(jìn)行了較小修改的制造商提供的方法(INVITROGEN，Carlsbad)轉(zhuǎn)染70-80％匯片的細(xì)胞對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)染反應(yīng)，將2μl LIPOFECTAMINE 2000轉(zhuǎn)染試劑與50μl無(wú)血清、無(wú)抗生素DMEM混合，并室溫孵育5分鐘。DMSG DNA或siRNA連同GFP編碼質(zhì)粒一起也與50μl無(wú)血清、無(wú)抗生素DMEM混合。然后將稀釋的LIPOFECTAMINE 2000轉(zhuǎn)染試劑逐滴加入稀釋的DNA或RNA中，并在室溫孵育20分鐘后加入細(xì)胞。每孔使用1μgpEGFP載體質(zhì)粒(CLONTECH)。用熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。用不同濃度(3pmole或45pmole)的線性表達(dá)盒(“RO”或“TM”)與pEGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。用GFP siRNA作為陽(yáng)性對(duì)照。本試驗(yàn)的對(duì)照還包括用無(wú)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或無(wú)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，在倒置熒光顯微鏡(Zeiss)下分析細(xì)胞。
為了評(píng)估產(chǎn)生于DMSG盒的針對(duì)GFP表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本是否能特異性阻斷基因表達(dá)，在共轉(zhuǎn)染研究中將pEGFP質(zhì)粒用作報(bào)告子。在GFP siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中GFP表達(dá)降低。重要的是，在用3pmole(+)和(-)DMSG盒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中都能觀察到可比水平的GFP下調(diào)。而且，用45pmole兩種盒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞GFP表達(dá)完全是陰性的。在這些細(xì)胞中GFP的表達(dá)被檢測(cè)超過(guò)2周并且在這段時(shí)間內(nèi)DMSG的基因沉默作用是持續(xù)的。用pEGFP和兩種盒轉(zhuǎn)染的一些細(xì)胞僅在20天后出現(xiàn)綠色熒光，推測(cè)來(lái)自于通過(guò)細(xì)胞分裂維持的共轉(zhuǎn)染pEGFP質(zhì)粒。這可能是由于這樣一個(gè)事實(shí)，線性dsDNA比質(zhì)粒DNA更易于降解，這表明在mRNA水平GFP表達(dá)的沉默與其他效應(yīng)如pEGFP質(zhì)粒的重排或缺失相反。
通過(guò)siRNA的基因沉默效果低于DMSG盒，盡管GFP siRNA的摩爾量大約比所用的低濃度DMSG盒的摩爾量(3pmole)高10倍。這些觀察表明線性DMSG盒更有效并且能產(chǎn)生比siRNA更深遠(yuǎn)的基因沉默效果，這可能是由于DMSG盒介導(dǎo)持續(xù)產(chǎn)生dsRNA。值得注意的是，編碼相應(yīng)GFP基因dsRNA的正鏈或負(fù)鏈的DMSG盒能輕微降低GFP表達(dá)，這可能是由于在其他物種如真菌中觀察到的未知“共抑制”作用(Cogoni和Macino，Nature 6732166-169，1999)，或關(guān)于負(fù)鏈盒的反義作用。還可以觀察到，用無(wú)關(guān)DNA或RNA共轉(zhuǎn)染延遲了靶基因的表達(dá)，這可能是通過(guò)干擾轉(zhuǎn)染和異位表達(dá)過(guò)程中的某些步驟。這也對(duì)用(+)或(-)盒在觀察期間降低基因表達(dá)起作用。
利用表達(dá)靶向編碼dsRed熒光蛋白多核苷酸的siRNA的DMSG盒也得到了相似的結(jié)果。當(dāng)通過(guò)熒光缺失測(cè)定時(shí)，用編碼有意和反義dsRedsiRNA的DMSG盒處理細(xì)胞能抑制dsRed表達(dá)。此外，利用DMSG介導(dǎo)的RNA干擾，已經(jīng)獲得了對(duì)外源基因，包括如GsαG蛋白、β-連環(huán)蛋白、SRPK1和T-盒l(wèi)9不超過(guò)90％的表達(dá)。結(jié)果證明dsDNA分子(即DMSG盒)能在真核細(xì)胞中介導(dǎo)基因沉默。
實(shí)施例2DMSG盒反義鏈上的錯(cuò)配影響基因沉默編碼有意RNA鏈的dsDNA與實(shí)施例1中的相同(SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)。編碼反義RNA鏈的dsDNA的有意鏈也與實(shí)施例1中的相同(SEQ ID NO7)，而與GFP序列相比dsDNA的反義鏈含有錯(cuò)配。如實(shí)施例1中通過(guò)將DNA寡核苷酸hP3GFPTM(+)s和hP3GFPTM(+)as復(fù)性產(chǎn)生了編碼GFP部分序列的有意RNA的TM DMSG(+)盒。通過(guò)將hP3GFPTM(-)s分別與hP3GFPTM(-)as M1、M2、M3或M4復(fù)性產(chǎn)生了編碼靶GFP序列反義RNA的具有不同突變的DMSG(-)盒。轉(zhuǎn)染操作如其中錯(cuò)配堿基為粗體并斜體的寡核苷酸如下hP3GFPTMasM15′-CTAGcAAAAACtgtaaaAAGAACGGCATgAAGGTGAACggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaagaaatcgaaatactttcaagttacggtaagcatatgatagtccATGCAAATA-3′(SEQ ID NO9；126個(gè)核苷酸)；hP3GFPTMasM25′-CTAGcAAAAACtgtaaaAAGAACGGgATgAAGGTGAACggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaagaaatcgaaatactttcaagttacggtaagcatatgatagtccATGCAAATA-3′(SEQ ID NO10；126個(gè)核苷酸)；bP3 GFPTMasM35′-CTAGcAAAAACtgtaaatAGAACGGCATCAAGGTGAAgggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaagaaatcgaaatactttcaagttacggtaagcatatgatagtccATGCAAATA-3′(SEQ ID NO11；126個(gè)核苷酸)；和hP3GFPTMasM45′-CTAGcAAAAACtgtaaaAAGAACGGCATCAAGGTGAtgggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaagaaatcgaaatactttcaagttacggtaagcatatgatagtccATGCAAATA-3′(SEQ ID NO12；126個(gè)核苷酸)。
為了評(píng)估DMSG的機(jī)制和特異性，將單一或雙點(diǎn)突變?cè)诰€性DMSG盒反義鏈上的不同位置導(dǎo)入模板序列區(qū)域。觀察到了基因沉默程度與突變數(shù)量之間的緊密相關(guān)性。同樣，模板序列中間附近的突變可能比末端附近的突變對(duì)基因沉默具有更強(qiáng)的作用。這些結(jié)果表明靶向識(shí)別過(guò)程是序列特異性的而且并非模板序列上的所有位置對(duì)靶向識(shí)別作用都是等同的。
實(shí)施例3
由短寡核苷酸組裝的DMSG盒介導(dǎo)基因沉默實(shí)驗(yàn)方法如前面的實(shí)施例，除了dsDNA是由較短的寡核苷酸組裝(圖3)。與從連續(xù)的長(zhǎng)序列相比，從較短的寡核苷酸能更容易地制備DMSG盒。從短的寡核苷酸組裝DMSG盒具有實(shí)際意義，因?yàn)椋瑢?duì)于每一基因沉默，可能僅需要合成一對(duì)對(duì)應(yīng)于模板序列的短寡核苷酸，然后將它與DMSG盒其他成分的其他通用寡核苷酸組裝。
短的寡核苷酸，hP3GFPTM(-)s1、s2、s3、as1、和as2，用于組裝靶向GFP的TM DMSG(-)盒。將等摩爾的這些寡核苷酸混合并如實(shí)施例1復(fù)性，然后用于與pEGFP和靶向GFP的TM DMSG(+)盒共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染和細(xì)胞培養(yǎng)方法同實(shí)施例1。
寡核苷酸如下hP3GFPTM(-)s15′-gatcTATTTGCATggactatcatatgcttaccgtaacttgaa-3′(SEQ ID NO13)；hP3GFPTM(-)s25′-agtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacga-3′(SEQ ID NO14)；hP3GFPTM(-)s35′-aacaccGTTCACCTTGATGCCGTTCTTtttacaGTTTTTg-3′(SEQ ID NO15)；hP3GFPTM(-)as15′-CTAGcAAAAACtgtaaaAAGAACGGCATCAAGGTGAACggtgtttcgtcctttccacaagata-tat-3′(SEQ ID NO16)；和hP3GFPTM(-)as25′-aaagccaagaaatcgaaatactttcaagttacggtaagcatatgatagtccATGCAAATA-3′(SEQ ID NO17).
由這些短寡核苷酸組裝的DMSG盒與實(shí)施例1中合成的連續(xù)盒產(chǎn)生相似水平的基因沉默結(jié)果。本實(shí)施例的結(jié)果表明不連續(xù)的寡核苷酸，當(dāng)設(shè)計(jì)合理時(shí)，可以用作基因沉默的轉(zhuǎn)錄本模板。
實(shí)施例4標(biāo)記的DMSG盒在小鼠細(xì)胞和人細(xì)胞中引起基因沉默等同于那些用于實(shí)施例1中hp3GFPTm DMSG盒的元件，小鼠U6基因元件被設(shè)計(jì)到靶向lacZ基因的連續(xù)或組裝的盒上。將DNA寡核苷酸復(fù)性并且，或轉(zhuǎn)染入穩(wěn)定表達(dá)lacZ基因的NIH3T3細(xì)胞系，或與lacZ報(bào)告質(zhì)粒pCMVβ(Clontech)共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞。DSE、PSE、TATA盒和終止子在小鼠和人U6基因之間高度保守。
轉(zhuǎn)然后48-72小時(shí)，用PBS洗滌細(xì)胞，室溫用1％戊二醛溶液(溶于PBS)固定15分鐘。用溶于PBS的1mM MgCl2溶液洗細(xì)胞2次，然后加入X-GAL染色液(1mg/ml N，N-二甲基甲酰胺、5mM K3Fe(CN)6、5mMK4Fe(CN)6·3H2O、1mM MgCl2溶于PBS、24孔板中0.3ml/孔)。將反應(yīng)混合物與經(jīng)固定細(xì)胞37℃孵育10分鐘到3小時(shí)直到顏色變?yōu)轭A(yù)期的水平。用水將細(xì)胞洗3次并于4℃貯于暗處。然后在顯微鏡下觀察蓋玻片上藍(lán)色的細(xì)胞。對(duì)于FITC標(biāo)記的DNA，也在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。
將DNA寡核苷酸mP3LacTM(+)s和MP3LacTM(+)as如實(shí)施例1復(fù)性以產(chǎn)生靶向lacZ的TM DMSG(+)盒。將DNA寡核苷酸mP3LacTM(-)s和mP3LacTM(-)as復(fù)性以產(chǎn)生靶向lacZ的TM DMSG(-)盒。在為組裝的TM DMSG(-)盒的情況下，將mP3LacTM(-)s1和s2F與mP3LacTM(-)as復(fù)性，或mP3LacTM(-)as1和as2F與mP3LacTM(-)s復(fù)性?！癋”表示在標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)反應(yīng)中使用FITC-CPG進(jìn)行DNA合成而將FITC標(biāo)記在寡核苷酸的3’末端。
寡核苷酸如下mP3LacTM(+)s5′-gatcTATTTGCATacaaaaggaaactcaccctaactgtaaagtaattgtgtgttttgagactataaatatcccttggagaaaagccttgtttGGTAAACAGTTGATTGAACTTttgttcGTTTTFg-3′(SEQ ID NO18；126個(gè)核苷酸)；mP3LacTM(-)s5′-gatcTATTTGCATacaaaaggaaactcaccctaactgtaaagtaattgtgtgttttgagactataaatatcccttggagaaaagccttgtttGTTCAATCAACTGTTTACCTTttgttcGTTTTTg-3′(SEQ ID NO19；126個(gè)核苷酸)；
mP3LacTM(+)as5′-CTAGcAAAAACgaacaaAAGTTCAATCAACTGTTTACCaaacaaggcttttctccaagggatatttatagtctcaaaacacacaattactttacagttagggtgagtttccttttgtATGCAAATa-3′(SEQ ID NO20；126個(gè)核苷酸)；mP3LacTM(-)as5′-CTAGcAAAAACgaacaaAAGGTAAACAGTTGATTGAACaaacaaggcttttctccaagggatatttatagtctcaaaacacacaattactttacagttagggtgagtttccttttgtATGCAAATa-3′(SEQ ID NO21；126個(gè)核苷酸)；mP3LacTM(-)s15′-gatTATTTGCATacaaaaggaaactcaccctaactgtaaagtaattgtgtgttttgagacta-3′(SEQ IDNO22)；mP3LacTM(-)s2F5′-taaatatcccttggagaaaagccttgtttGTTCAATCAACTGttTACCTTttgttcGTTTTTt-FTTC-3′(SEQ ID NO23)；mP3LacTM(-)as15′-CTAGcAAAAACgaacaaAAGGTAAACAGTTGATTGAACaaacaaggcttttctccaagggat-3′(SEQ ID NO24)；和mP3LacTM(-)as2F5′-tttatagtctcaaaacacacaattactttacagttagggtgagtttccttttgtATGCAAAt-FITC-3′(SEQ IDNO25)；mP3LacTM(-)s1和mP3LacTM(-)s2是mP3LacTM(-)s的兩個(gè)部分；mP3LacTM(-)as1和mP3LacTM(-)as2是mP3LacTM(-)as的兩個(gè)部分。跟在寡核苷酸名稱后面的“F”表示寡核苷酸3′端用FITC標(biāo)記。
與將GFP基因在人細(xì)胞中用作靶標(biāo)的實(shí)驗(yàn)相似，上述mP3DMSG盒在lacZ報(bào)告基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的小鼠細(xì)胞中或與報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中降低相匹配的lacZ基因的表達(dá)。圖4顯示共轉(zhuǎn)染的結(jié)果。與實(shí)施例1的觀察結(jié)果一致，編碼相應(yīng)lacZ基因dsRNA的正鏈或負(fù)鏈的DMSG盒輕微降低lacZ基因的表達(dá)，這可能是由于在其他情況如真菌中觀察到的未知“共抑制”作用(Cogoni和Macino，Nature 6732166-169，1999)，或在只有負(fù)鏈盒情況下的反義作用。然而，當(dāng)使用編碼RNA兩條鏈的DMSG盒時(shí)，基因沉默效果是更加顯著的。
這些結(jié)果顯示FITC標(biāo)記的DMSG DNA分子具有引起基因沉默的功能。當(dāng)FITC標(biāo)記的DNA寡核苷酸用于組裝盒時(shí)，一些細(xì)胞具有綠色熒光，同時(shí)它們不被染成藍(lán)色。這證明導(dǎo)致靶細(xì)胞具有綠色熒光的DMSG分子轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)lacZ基因沉默。帶有標(biāo)記DNA分子的DMSG提供了跟蹤轉(zhuǎn)染細(xì)胞以觀察基因沉默效果的方法。
實(shí)施例5環(huán)狀載體上的DMSG盒DMSG盒可以存在于環(huán)狀載體。將具有Bgl II和Nhe I突出端的hP3GFPTM(+)盒插入pIND/V5-HisA載體(Invitrogen)的Bgl II和Nhe I位點(diǎn)之間。將具有Bgl II和Nhe I突出端的hP3GFPTM(-)盒插入到相同載體Bam HI和Xba I限制酶的可兼容位點(diǎn)之間。該質(zhì)粒，pDMSGGFP(+/-)，帶有hP3GFPTM(+)盒和hP3GFPTM(-)盒并可用于以GFP表達(dá)沉默為目的的轉(zhuǎn)染。僅將一個(gè)盒(+或-)插入到Bgl II和Nhe I位點(diǎn)之間建立pDMSGGFP(+)或pDMSGGFP(-)。如果僅將一個(gè)盒(編碼(+)或(-)RNA鏈)插入到Bgl II和Nhe I位點(diǎn)之間，則產(chǎn)生含有任一盒的質(zhì)粒，稱為pDMSGGFP(+)或pDMSGGFP(-)。
在與實(shí)施例1相似的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，不用線性DMSG盒，而是pDMSGGFP(+/-)單獨(dú)或pDMSGGFP(+)和pDMSGGFP(-)一起用于沉默GFP的表達(dá)。由于環(huán)狀dsDNA通常比線性盒更穩(wěn)定，所以基因沉默的作用預(yù)期比線性盒的作用持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。
實(shí)施例6DMSG載體的一般用途本實(shí)施例描述可以被用于導(dǎo)入和表達(dá)用于基因沉默的多種模板核苷酸序列的DMSG載體的構(gòu)建。
如實(shí)施例5中的質(zhì)粒pDMSGGFP(+)用于例證說(shuō)明DMSG載體。用核苷酸序列CATTCN25GAATGC(SEQ.ID.NO26；只顯示有意鏈，N代表A、T、C和G四個(gè)堿基中的任意一個(gè))代替質(zhì)粒pDMSGGFP(+)的啟動(dòng)子最后一個(gè)堿基和5′終止子的第一個(gè)堿基之間的序列，以產(chǎn)生載體pDMSG1(也見，SEQ ID NO44；圖5)。為了將針對(duì)靶基因的模板序列插入載體，用Bsm I消化pDMSG1并且將相應(yīng)于正義或反義靶RNA序列的dsDNA寡核苷酸(具有Bsm I粘性末端)連接入載體(見圖5)以產(chǎn)生含有單一盒的質(zhì)粒(也見SEQ ID NO45)。可以將兩個(gè)此類編碼正義或反義中間體siRNA的質(zhì)粒組合共轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，以沉默siRNA特異的任意靶基因。靶基因的模板序列(正義方向)可以是約15-30個(gè)核苷酸(例如17個(gè)核苷酸)區(qū)域，它以AAG開始以C結(jié)尾，并且一般跟著約1-5個(gè)核苷酸的突出端，例如1、2、3、4或5個(gè)胸腺嘧啶核苷殘基。
其他限制性位點(diǎn)可以用于制備其它具有不同序列需求的載體。例如，可以用核苷酸序列GAGACG-N25-CGTCTC(SEQ.ID.NO27；僅顯示有意鏈)代替質(zhì)粒pDMSGGFP(+)(實(shí)施例5)的啟動(dòng)子最后一個(gè)堿基和5′終止子第一個(gè)堿基之間的序列，以產(chǎn)生載體pDMSG2(見圖6；也見，SEQID NO46)。當(dāng)將針對(duì)靶基因的模板序列插入載體時(shí)，用BsmB I(同切點(diǎn)酶如ESPI3，它具有相同的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)ACCTGC(N)4/8，SEQID NO33)消化DMSG2并且將具有BsmB I粘性末端相應(yīng)于正意或反義RNA的dsDNA寡核苷酸，它們不支持自連，連接于載體(圖4)以產(chǎn)生含有單一盒的質(zhì)粒(也見，SEQ ID NO47)。通過(guò)使用兩種不同的插入位點(diǎn)，可以將正盒和負(fù)盒都被一個(gè)載體所攜帶。
實(shí)施例7T7啟動(dòng)子控制下的DMSG盒利用例如含有特異于T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的DMSG盒可以在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生足量siRNA，其中所述T7 RNA聚合酶可以由與DMSG盒共轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞的編碼質(zhì)粒來(lái)表達(dá)，并且它利用“脫落式”機(jī)制。
按照實(shí)施例1中描述的方法并利用下面顯示的包含GFP特異的模板核苷酸序列的寡核苷酸可以制備含有T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子的DMSG盒
T7GFP(+)ROs5′-taatacgactcactataGGAACGGCATCAAGGTGAACTT-3′(SEQ ID NO28；39個(gè)核苷酸)；T7GFP(+)ROa5′-AAGTTCACCTTGATGCCGTTCCtatagtgagtcgtatta-3′(SEQ ID NO29；39個(gè)核苷酸)；T7GFP(-)ROs5′-taatacgactcactataGGTTCACCTTGATGCCGTTCTT-3′(SEQ ID NO30；38個(gè)核苷酸)；T7GFP(-)ROa5′-AAGAACGGCATCAAGGTGAACCtatagtgagtcgtatta-3′(SEQ ID NO31；38個(gè)核苷酸)。
備選地，通過(guò)T7聚合酶的siRNA的轉(zhuǎn)錄可以由一個(gè)或串聯(lián)的多個(gè)II類終止子(ATCTGTT，SEQ ID NO32；(He等，J Biol.Chem.3018802-18811，1998))終止。由于實(shí)際終止通常發(fā)生于該信號(hào)下游的3-7個(gè)核苷酸，這將產(chǎn)生與靶mRNA正意或反義序列不匹配的3′部分。然而，當(dāng)通過(guò)發(fā)夾中間體產(chǎn)生siRNA時(shí)，3′末端的突出端不影響RNAi效應(yīng)(Paul等，Nat.Biotechnol.5505-508，2002)。由噬菌體RNA聚合酶如Sp6和T7聚合酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄也終止于含有阻滯位點(diǎn)的多聚(T)處，其中阻滯位點(diǎn)如位點(diǎn)Ia(GGGACGTTTTTTTCCC；SEQ ID NO42)或相關(guān)位點(diǎn)II(TTTTTTC；SEQ ID NO43)(Mote和Reines，J；Biol.Chem.2716843-16852，1998)，這種特點(diǎn)適合用于產(chǎn)生siRNA或shRNA。利用此處公開的構(gòu)建體和方法，可通過(guò)從諸如組織特異性或發(fā)育階段特異性啟動(dòng)子表達(dá)T7聚合酶進(jìn)一步控制T7聚合酶的表達(dá)，從而使DMSG盒介導(dǎo)的RNAi可成功地以時(shí)間的、空間的和細(xì)胞類型特異的方式起作用。
實(shí)施例8RNAi微陣列本實(shí)施例描述了RNAi微陣列(MAR)方法學(xué)，其中公開的基于DNA的RNAi技術(shù)適用于細(xì)胞微陣列形式，由此允許高通量基因功能研究和藥物篩選測(cè)定。
微陣列技術(shù)已經(jīng)改革了多種生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，包括監(jiān)測(cè)基因表達(dá)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)基因分型和測(cè)序。已經(jīng)研發(fā)出幾種類型的微陣列，其中特殊分子(如DNA、抗體、重組蛋白質(zhì))被物理性連接于固體支持物上的確定位置。此類微陣列允許高通量測(cè)定和高分辨率分析。DNA微陣列包括那些點(diǎn)在芯片上的cDNA分子，其中所述cDNA分子可以通過(guò)如PCR方法產(chǎn)生并且能代表大量基因產(chǎn)物中的任意一種，并且還包括那些在支持物表面如硅表面合成的寡核苷酸，它們的序列是特異的或是隨機(jī)的、偏性的或富于變化的。后一方法可用于生產(chǎn)高密度微陣列，以GeneChipTM微陣列(Affymetrix)為例。此類DNA分子通常以特定的方式(陣列)排列于支持物表面上，從而通過(guò)對(duì)例如雜交于支持物上特定位置的未知核酸分子的檢測(cè)提供關(guān)于未知核酸分子識(shí)別的指示。此類可尋址陣列提供了鑒定樣本中特定核酸分子，或鑒定特定細(xì)胞類型中基因表達(dá)模式的適合方法，例如包括，當(dāng)與標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ漳Ｊ较啾葧r(shí)，提供鑒定特定疾病的模式。
最近已經(jīng)確立了細(xì)胞微陣列的原理(Ziauddin和Sabatini，見上文，2001；美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)朥S 2002/0006664 A1)，其中在允許將寡核苷酸導(dǎo)入與微陣列特定位置相接觸的細(xì)胞的條件下，將寡核苷酸(如cDNA分子)陣列與細(xì)胞簇相接觸。此類微陣列對(duì)于鑒定藥物靶點(diǎn)和表達(dá)克隆改變細(xì)胞生理的基因是有用的。這些方法的成功需要將寡核苷酸點(diǎn)在固體支持物上使它們可以從支持物上被移開，還需要處理寡核苷酸從而使它們可以被與它們相接觸的細(xì)胞內(nèi)化。Ziauddin和Sabatini所描述的方法在將寡核苷酸點(diǎn)在玻片上之前先用明膠溶液與cDNA分子混合。干燥后，將DNA斑點(diǎn)暴露于轉(zhuǎn)染試劑，然后將玻片放置于培養(yǎng)皿中并用培養(yǎng)基中的貼壁哺乳動(dòng)物細(xì)胞覆蓋(Ziauddin和Sabatini，見上文，2001)。由于DNA分子和細(xì)胞的加入是顛倒順序的，所以該方法被稱為反向轉(zhuǎn)染。
如此處所公開，細(xì)胞微陣列可適用于本發(fā)明的LineSilenceTM盒。最初，通過(guò)制備穩(wěn)定且均一表達(dá)熒光蛋白質(zhì)，如GFP、EGFP、dsRed或短半壽期的d2EGFP變體，可以產(chǎn)生模型系統(tǒng)。已經(jīng)制備得到了表達(dá)中等水平EGFP的Hela細(xì)胞系，并且單獨(dú)或同時(shí)永久表達(dá)dsRed、d2EGFP的Hela和293正在用雙藥物篩選進(jìn)行選擇。可以篩選多核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)，包括含有編碼相關(guān)多肽如轉(zhuǎn)錄因子的多核苷酸的數(shù)據(jù)庫(kù)，以選擇可以用此處公開的DNA介導(dǎo)的基因表達(dá)沉默進(jìn)行RNAi的靶序列。
按照本發(fā)明的方法所使用的細(xì)胞類型的例子包括如Hela細(xì)胞和293細(xì)胞，在這些細(xì)胞中RNAi已經(jīng)被驗(yàn)證(見實(shí)施例1)。象293細(xì)胞一樣，Hela細(xì)胞表現(xiàn)出高的RNAi效率，所述細(xì)胞為表達(dá)提供了額外的好處，因?yàn)樗愿咚奖磉_(dá)目的基因p53。因?yàn)镽NAi實(shí)驗(yàn)的目的是以從一定的可檢測(cè)水平降低基因的表達(dá)，并且理想上降低到零，所以以高水平穩(wěn)定表達(dá)諸如GFP、dsRed等等的蛋白質(zhì)的細(xì)胞對(duì)于微陣列斑點(diǎn)中的定量評(píng)價(jià)是特別有用的。在此類細(xì)胞中表達(dá)的任何稍微的不均衡可以通過(guò)對(duì)每一個(gè)靶基因多點(diǎn)數(shù)據(jù)的平均來(lái)降低。而且，隨后的內(nèi)部對(duì)照系統(tǒng)允許校正靶基因的表達(dá)誤差，并且還能夠監(jiān)測(cè)和校準(zhǔn)非特異的RNAi效應(yīng)。
對(duì)于內(nèi)部對(duì)照和數(shù)據(jù)分析，采用了能夠穩(wěn)定表達(dá)GFP和dsRED這兩者的細(xì)胞系。這些細(xì)胞用編碼不針對(duì)GFP和dsRED、針對(duì)兩者之一、或針對(duì)兩者的siRNA的LineSilenceTM盒進(jìn)行反向轉(zhuǎn)染。在不同時(shí)間點(diǎn)，用激光熒光掃描儀檢測(cè)綠色和紅色熒光強(qiáng)度，并且對(duì)樣品進(jìn)行照相以便用適當(dāng)?shù)能浖M(jìn)行分析。用針對(duì)兩者之一的基因特異LineSilenceTM盒處理所獲得的細(xì)胞中綠/紅熒光比值用于評(píng)估沉默效應(yīng)的特異性。處理和未處理細(xì)胞之間的熒光強(qiáng)度比提供了有關(guān)沉默效率的數(shù)據(jù)。對(duì)同一玻片上多點(diǎn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行采集，并且用幾張玻片進(jìn)行重復(fù)采集以得出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)論。
方法使用轉(zhuǎn)染試劑如FuGene6(Roche)，用pDsRED-N1和pd2EGFP、或pEGFP轉(zhuǎn)染Hela或293細(xì)胞，然后用潮霉素B(pEGFP)或G418(pDsRED-N1)篩選細(xì)胞。按標(biāo)準(zhǔn)方法挑取表達(dá)預(yù)期熒光蛋白質(zhì)的單克隆，并增殖，然后，選擇細(xì)胞之間表達(dá)水平差異最小的克隆。
按此處所公開的方法或使用商業(yè)可得的試劑盒(LineSilenceTM試劑盒；Allele Biotechnology)并使用制造商提供的方法產(chǎn)生LineSilenceTM盒，然后純化、定量并貯存于TE緩沖液中。制備三種劑量的含大約0.17％明膠的LineSilenceTM盒DNA溶液(Ziauddin和Sabatini，見上文，2001)，0.1、0.033或0.001μg/μl，并且使用自動(dòng)陣列儀點(diǎn)在玻片上。將玻片干燥并用轉(zhuǎn)染試劑如FuGene6轉(zhuǎn)染試劑或EffecteneTM轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen)處理，然后將細(xì)胞鋪在玻片上(Ziauddin和Sabatini，見上文，2001)。
轉(zhuǎn)染效率很大程度上可以決定使用RNAi技術(shù)沉默基因的有效性。一些細(xì)胞系，特別是培養(yǎng)基中的原代細(xì)胞，對(duì)如鈣沉淀、陽(yáng)離子脂質(zhì)體、DEAE-葡聚糖和多聚季胺等傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑有相當(dāng)?shù)目剐?。雖然電穿孔在一些情況下會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，但它對(duì)于一些細(xì)胞類型而言能夠提高轉(zhuǎn)染效率。微注射能夠提供一種將DNA直接遞送到細(xì)胞或細(xì)胞核的手段，然而，該方法不方便使用，許多實(shí)驗(yàn)室不能夠開展，并且也不適于產(chǎn)生大量的改變細(xì)胞。
蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)是通過(guò)非受體依賴的機(jī)制橫跨生物膜的短肽，并且可以遞送大量生物分子進(jìn)入細(xì)胞(Becker等，Methods 24247-256，2001，此處引用作為參考)。PTD來(lái)源于HIV Tat蛋白質(zhì)(命名為TAT)、果蠅轉(zhuǎn)錄因子觸角足的同源結(jié)構(gòu)域、HSV蛋白質(zhì)VP22和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Becker等，supra，2001)。此外，通過(guò)設(shè)計(jì)一些肽可以具有相似的特性，所述肽包括例如MPG、Pep-1和L-或D-精氨酸、賴氨酸和組氨酸的寡聚體。TAT已經(jīng)用于遞送大的融合蛋白質(zhì)進(jìn)入各種細(xì)胞和成體動(dòng)物，并可以高效地穿過(guò)血-腦屏障。照這樣，PTD對(duì)于將DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞是有用的，因此這就提供了一種在實(shí)際上所有細(xì)胞類型和動(dòng)物模型中完成RNAi的方法。
由于DMSG盒可以線性形式產(chǎn)生，例如通過(guò)PCR或全長(zhǎng)DNA合成，所以本發(fā)明的RNAi表達(dá)盒特別適用于與PTD結(jié)合，因此允許大范圍和高效地轉(zhuǎn)染。如果期望，在寡核苷酸合成過(guò)程中或之后，可以將氨基、巰基或生物素基團(tuán)連接于DMSG盒末端，然后利用化學(xué)交聯(lián)劑通過(guò)功能基團(tuán)將PTD肽連接于DMSG盒。
本發(fā)明的DMSG盒也可以連接于雙功能肽，其中所述雙功能肽含有PTD結(jié)構(gòu)域和第二種“貨物”結(jié)合結(jié)構(gòu)域。通過(guò)將載體肽與貨物分子如DMSG盒混合，可以形成可直接應(yīng)用于細(xì)胞的復(fù)合體，因此繞過(guò)結(jié)合步驟。該方法可用于此處公開的DNA-介導(dǎo)的RNAi，并且特別適用于低成本快速地進(jìn)行高通量測(cè)定以產(chǎn)生穩(wěn)定且可測(cè)量的效應(yīng)。已經(jīng)研發(fā)出大量人工肽如KALA和ppTGl，它們?cè)诼菪囊粋?cè)是疏水的，以透過(guò)膜，并且在另一側(cè)是具正電的，以結(jié)合多核苷酸(Rittner等，Mol.Ther.5104-114，2002，此處引用作為參考)。這些人工肽的兩個(gè)缺點(diǎn)是它們是pH依賴的(質(zhì)子化態(tài)影響帶電氨基酸和DNA之間主要的靜電相互作用)，并且它們不能從單鏈DNA、RNA或其它帶電分子中區(qū)別出雙鏈DNA，因此理論上可作為相對(duì)非特異的載體遞送非預(yù)計(jì)貨物分子進(jìn)入細(xì)胞。
以非靜電相互作用結(jié)合dsDNA的一種短肽是噬菌體HK022 Nun蛋白質(zhì)的C-末端9個(gè)氨基酸區(qū)域(Watnick等，Genes Devel.14731-739，2000，此處引用作為參考)。該肽區(qū)域與dsDNA直接相互作用，并且Nun蛋白質(zhì)不能夠使聚合酶停滯在單鏈DNA模板上，這表明它的DNA結(jié)合基序僅結(jié)合雙鏈DNA。C-末端區(qū)域的點(diǎn)突變已經(jīng)證明它在結(jié)合雙鏈DNA方面是有作用的，并且精確地指出倒數(shù)第二個(gè)殘基色氨酸(W108)對(duì)于此種結(jié)合是最關(guān)鍵的殘基。W108僅僅能夠被其它芳香族氨基酸(如酪氨酸)進(jìn)行功能替代的事實(shí)表明結(jié)合發(fā)生在色氨酸殘基插入雙鏈DNA時(shí)。所述結(jié)合似乎沒有任何可檢測(cè)的序列偏好。
將九個(gè)殘基的Nun C-末端肽(NCP)與TAT融合，之間只間隔一個(gè)甘氨酸殘基。如此處所公開，融合蛋白質(zhì)(稱為TAN)結(jié)合雙鏈DNA形成多聚體，解離常數(shù)大約為1×10-5M。將0.1μg雙鏈DNA與遞增量(0.05、0.1、0.2或0.4μg)TAN肽(或0.1、0.2或0.4μg對(duì)照肽，Ht31)在20μl 0.9％NaCl溶液中進(jìn)行孵育。室溫孵育20分鐘后，取一小份液體用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行分析。條帶遷移凝膠分析顯示TAN肽以相對(duì)濃度依賴的方式結(jié)合雙鏈DNA(即隨著TAN量的增加結(jié)合的DNA的量也增加)。
快速擴(kuò)大的蛋白酶和肽酶家族被描述為能夠水解膜脂雙層疏水環(huán)境中的底物蛋白質(zhì)和肽。此類酶稱為膜內(nèi)剪切蛋白酶(I-CliPs)，并且將它們的底物稱為跨膜結(jié)構(gòu)域(TMDs；見Wolfe和Selkoe，Science 2962156-2157，2002，此處引用作為參考)。如此處所公開，對(duì)于MAR利用載體蛋白質(zhì)如明膠將LineSilenceTM盒點(diǎn)在固體支持物上而言，作為備選的是通過(guò)TMD肽將盒連接到支持物的表面，這樣當(dāng)與細(xì)胞接觸時(shí)，TMD肽能夠被細(xì)胞膜中的I-CliP水解，從而允許LineSilenceTM盒移動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞。I-CliP以早老因子(早老因子1和早老因子2)為例，它們能夠剪切細(xì)胞膜內(nèi)的TMD肽，因此釋放底物的胞質(zhì)部分入細(xì)胞質(zhì)(見Wolfe和Selkoe，見上文，2002)。當(dāng)將TMD肽連接到DMSG盒上時(shí)，肽的剪切釋放所述盒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，以至于DMSG盒能夠隨后進(jìn)入細(xì)胞核。使用能夠被早老因子剪切的TMD肽的優(yōu)點(diǎn)是早老因子在所有組織和細(xì)胞類型中普遍表達(dá)，因此允許基于早老因子剪切的LineSilenceTM盒的MAR適用于各種各樣的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(見Lee等，J.Neurosci.16P7513-7525，1996，此處引用作為參考)。
作為早老因子底物的TMD肽的例子包括β-淀粉樣前體蛋白的TMD；果蠅蛋白質(zhì)notch、Sevenless、Torso和δ，以及它們的哺乳動(dòng)物同系物的TMD；人血型糖蛋白-A的TMD(Struhl和Adachi，Mol.Cell 6625-635，2000，此處引用作為參考)。照這樣，這些或其它TMD可以被結(jié)合在固體支持物表面，DMSG盒可以被連接到它們上面，并且，如果期望，還可以將PTD結(jié)構(gòu)域(如TAN)進(jìn)一步連接到DMSG盒上，因此有利于進(jìn)行MAR分析。
如上所述的表達(dá)熒光蛋白質(zhì)的細(xì)胞的用途允許RNAi微陣列(MAR)方法學(xué)的優(yōu)化，然后可以應(yīng)用于功能基因的分析，特別是那些當(dāng)敲低時(shí)表現(xiàn)出可檢測(cè)效應(yīng)的基因。兩個(gè)級(jí)別的實(shí)驗(yàn)次序進(jìn)行，一個(gè)使用已知的系統(tǒng)用于方法的驗(yàn)證，第二個(gè)用于篩選鑒定先前未描述的基因功能。
系統(tǒng)驗(yàn)證Fas介導(dǎo)的凋亡途徑基因可用作靶基因檢測(cè)基因功能，因?yàn)樵撏緩缴婕暗脑S多基因是已知的(例如FADD和caspase 8)，因此它們可被點(diǎn)樣至玻片上的LineSilenceTM盒靶向。Fas介導(dǎo)的凋亡是可誘導(dǎo)過(guò)程并且適于MAR，因?yàn)檎＜?xì)胞能夠在玻片上生長(zhǎng)、能夠內(nèi)化DNA和在刺激前達(dá)到預(yù)期的密度。通過(guò)用Fas配體或活化抗體處理來(lái)激活凋亡。能夠?qū)as介導(dǎo)的信號(hào)發(fā)生反應(yīng)的細(xì)胞是可得的并且易于轉(zhuǎn)染，如Hela-Fas細(xì)胞。凋亡反應(yīng)是快速的并且能夠在約24小時(shí)之內(nèi)檢測(cè)到。重要的是，使用這種方法刺激細(xì)胞在以前開展過(guò)，用于篩選核酶文庫(kù)(Kawasaki和Taira，NucleicAcids Res.303609-3614，2002，此處引用作為參考)。照這樣，已經(jīng)建立了誘導(dǎo)和檢測(cè)的條件，并且鑒定了新的靶點(diǎn)。
按如下方法產(chǎn)生Fas途徑LS微陣列。針對(duì)如下的每一基因設(shè)計(jì)4個(gè)靶位點(diǎn)，其中所述基因是先前已知的或由Kawasaki和Taira(supra，2002)鑒定的-Fas、FADD、easpase 8、Bik、caspase 3、caspase 9、apaf-1和CAD。如上述的方法將LineSilenceTM盒DNA點(diǎn)印來(lái)制備MAR玻片。Hela-Fas細(xì)胞在所制備的MAR玻片上生長(zhǎng)并且24小時(shí)之后用Fas特異的抗體處理細(xì)胞。36小時(shí)后固定細(xì)胞(Kawasaki和Taira，supra，2002)。用TUNEL法檢測(cè)凋亡；熒光信號(hào)作為數(shù)據(jù)讀出。作為選擇，使用如ApoAlert凋亡試劑盒(Clontech)通過(guò)GFP偶聯(lián)的annexin V檢測(cè)凋亡。進(jìn)入凋亡途徑的進(jìn)程的減緩(以TUNEL-陽(yáng)性細(xì)胞減少為證據(jù))和已知的前凋亡Fas途徑介導(dǎo)物表達(dá)降低之間的相關(guān)性(或負(fù)相關(guān))表明MAR適于此類功能分析。
該系統(tǒng)的三個(gè)條件對(duì)于實(shí)驗(yàn)的成功是至關(guān)重要的。第一，RNAi介導(dǎo)的基因沉默的成功率必須高，意思是說(shuō)選擇作為靶的大多數(shù)位點(diǎn)能夠發(fā)生RNAi。當(dāng)前來(lái)自于本領(lǐng)域研究和本發(fā)明實(shí)驗(yàn)的一致意見表明大約50-80％的靶提供了明確可以檢測(cè)的近乎完全沉默的效果?？梢赃x擇最佳的靶位點(diǎn)，例如通過(guò)設(shè)計(jì)編碼siRNA的DMSG盒，其中所述該siRNA能夠與靶基因中RNA結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)外的區(qū)域相互作用。此外，對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)錄本使用多于1個(gè)，如2、3、4或更多靶點(diǎn)能夠增加每一基因在至少一個(gè)設(shè)計(jì)的點(diǎn)上產(chǎn)生沉默的可能性。因?yàn)殛幮缘狞c(diǎn)不能夠解釋為無(wú)關(guān)基因，通過(guò)針對(duì)每一個(gè)siRNA同時(shí)設(shè)計(jì)一個(gè)錯(cuò)配對(duì)照，在錯(cuò)配對(duì)照中21個(gè)核苷酸的siRNA的中間核苷酸是突變的，來(lái)控制假陽(yáng)性的發(fā)生。通過(guò)觀察一致發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的錯(cuò)配導(dǎo)致siRNA無(wú)功能。
對(duì)于本發(fā)明系統(tǒng)成功的第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是需要細(xì)胞高效攝入DNA。上面討論的并用上述方法進(jìn)行優(yōu)化的條件，包括使用Hela-Fas細(xì)胞，將有助于決定如何最大地獲得有效的DNA攝入。然而，如果轉(zhuǎn)染效率極其低，可以將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)偶聯(lián)到DMSG盒上以增加轉(zhuǎn)染效率。PTD已顯示出有利于試劑跨細(xì)胞膜高效率轉(zhuǎn)移并且同樣可用于增強(qiáng)LineSilenceTM盒攝取進(jìn)入細(xì)胞。
對(duì)于最好地實(shí)現(xiàn)當(dāng)前敘述的MAR系統(tǒng)的第三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是需要可清楚檢測(cè)的表型以測(cè)定RNAi。使用上述的模型系統(tǒng)作為例子，F(xiàn)as活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡需要測(cè)定MAR數(shù)據(jù)的信號(hào)對(duì)背景的比率。從使用相同途徑的瞬時(shí)核酶文庫(kù)篩選試驗(yàn)相關(guān)的報(bào)告可以得到有關(guān)該課題的大量信息(見Kawasake和Taira，supra，2002)。然而，如果實(shí)驗(yàn)被Fas介導(dǎo)的凋亡途徑的內(nèi)在困難所阻礙，其它可選擇的途徑如TNF和TNFR相關(guān)的細(xì)胞死亡途徑或生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的增殖可以基于相似的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行使用。
作為功能性篩選影響啟動(dòng)子活性基因的工具，MAR方法特別有用。照這樣，該方法提供了功能性選擇基因的手段，這些基因包括先前未知的參與改變細(xì)胞表型或特定基因表達(dá)的基因，特別是那些先前未知的具有此功能的基因。通過(guò)在靶向大約2000個(gè)已知人轉(zhuǎn)錄因子(其序列可由數(shù)據(jù)庫(kù)獲得)的微陣列上建立基因沉默盒，并篩選調(diào)節(jié)目的啟動(dòng)子活性的基因，可以進(jìn)行利用RNAi微陣列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)分析。對(duì)于這種篩選，MAR微陣列是基于如上述建立的條件且以容納所有候選基因的較高密度而制備的。如果必要，可以使用多個(gè)玻片。
已進(jìn)行了廣泛研究的基因的相對(duì)簡(jiǎn)單的啟動(dòng)子可用來(lái)證實(shí)MAR測(cè)定結(jié)果的有效性。照這樣，可以使用人p53基因啟動(dòng)子，這是因?yàn)樗欢x為位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)5’部分的大約85個(gè)堿基對(duì)序列(對(duì)于本研究也可以使用該5′序列的300個(gè)堿基對(duì)區(qū)域)，還因?yàn)榻Y(jié)合到該區(qū)域并參與調(diào)控p53基因表達(dá)的因子，包括p53本身，是已知的(Tuck和Crawford，Mol.Cell.Biol.92163-2172，1989；Albor等，Mol.Carc.11176-183，1994；Hudson等，DNA Cell Biol.14759-766，1995，每一文獻(xiàn)此處引用作為參考)。作為DNA損傷的反應(yīng)，p53蛋白質(zhì)可起增強(qiáng)G1期細(xì)胞周期阻斷的作用，這是預(yù)防腫瘤的重要過(guò)程。然而，通過(guò)何種方法調(diào)控p53基因并不是完全清楚的。例如，最近的研究表明參與細(xì)胞周期進(jìn)程和增殖的轉(zhuǎn)錄因子E2F出乎意料地調(diào)控p53，而與p53啟動(dòng)子區(qū)域沒有明顯的結(jié)合位點(diǎn)(Ren等，Genes Devel.15245-256，2002，此處引用作為參考)。此外，其它因子可以在轉(zhuǎn)錄水平直接或間接調(diào)控p53的表達(dá)。
PCR和標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)用于設(shè)計(jì)報(bào)告基因上游所定義的p53啟動(dòng)子區(qū)域?？梢允褂脼閱?dòng)子研究設(shè)計(jì)的質(zhì)粒如pd2EGFP-Basic(Clontech)。按如上所述的方法建立表達(dá)所述構(gòu)建體的穩(wěn)定細(xì)胞系，并生長(zhǎng)于點(diǎn)了LineSilenceTM盒的玻片上。根據(jù)它們?cè)诓Ｆ系淖鴺?biāo)確定引起報(bào)告物表達(dá)顯著改變的基因，并通過(guò)獨(dú)立的試驗(yàn)，使用標(biāo)準(zhǔn)的過(guò)表達(dá)或RNAi介導(dǎo)基因沉默的方法以證實(shí)對(duì)內(nèi)源性p53表達(dá)有影響，來(lái)確定它們的功能。
對(duì)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析將利用現(xiàn)有的慣例，這些慣例來(lái)源于對(duì)其他使用熟知的或先前描述的方法的微陣列如ChIPTM陣列或GeneChipTM陣列的分析。如果期望，可以進(jìn)行額外的實(shí)驗(yàn)以提高該方法的靈敏性和可靠性。例如，在較后的階段，可以建立基于β-內(nèi)酰胺酶系統(tǒng)的報(bào)告子系統(tǒng)并利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)，從而提供比熒光蛋白質(zhì)報(bào)告物靈敏性更高的系統(tǒng)(Zlokarnik等，Science 27984-88，1998，此處引用作為參考)。
盡管已經(jīng)以上述實(shí)施例作為參考對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，仍然可以理解對(duì)其進(jìn)行的修飾和改變?nèi)园诒景l(fā)明的精神和范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明僅由下述權(quán)利要求所限制。
序列表<110>美國(guó)綠陽(yáng)生物技術(shù)及醫(yī)藥公司<120>用于DNA介導(dǎo)基因沉默的組合物<130>ALLELE1100-2WO<140>PCT/US 02/41642<141>2002-12-26<150>US 10/217,564<151>2002-08-12<150>US 10/202,479<151>2002-07-23<150>US 60/343,697<151>2001-12-27<160>51<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>113<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>1gatctatttg catggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg60ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaaca ccgaacggca tcaaggtgaa ctt 113<210>2<211>109<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>2aagttcacct tgatgccgtt cggtgtttcg tcctttccac aagatatata aagccaagaa60atcgaaatac tttcaagtta cggtaagcat atgatagtcc atgcaaata 109<210>3<211>126<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>3gatctatttg catggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg60ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaaca ccgaacggca tcaaggtgaa ctttttacag 120tttttg 126<210>4<211>126<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>4ctagcaaaaa ctgtaaaaag ttcaccttga tgccgttcgg tgtttcgtcc tttccacaag60atatataaag ccaagaaatc gaaatacttt caagttacgg taagcatatg atagtccatg 120caaata 126<210>5<211>113<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>5gatctatttg catggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg60ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaaca ccgttcacct tgatgccgtt ctt 113<210>6<211>109<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>6aagaacggca tcaaggtgaa cggtgtttcg tcctttccac aagatatata aagccaagaa60atcgaaatac tttcaagtta cggtaagcat atgatagtcc atgcaaata 109<210>7<211>126<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>7gatctatttg catggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg60ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaaca ccgttcacct tgatgccgtt ctttttacag 120tttttg 126<210>8<211>126<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>8ctagcaaaaa ctgtaaaaag aacggcatca aggtgaacgg tgtttcgtcc tttccacaag60atatataaag ccaagaaatc gaaatacttt caagttacgg taagcatatg atagtccatg 120caaata 126<210>9<211>126<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>9ctagcaaaaa ctgtaaaaag aacggcatga aggtgaacgg tgtttcgtcc tttccacaag60atatataaag ccaagaaatc gaaatacttt caagttacgg taagcatatg atagtccatg 120caaata 126<210>10<211>126<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>10ctagcaaaaa ctgtaaaaag aacgggatga aggtgaacgg tgtttcgtcc tttccacaag60atatataaag ccaagaaatc gaaatacttt caagttacgg taagcatatg atagtccatg 120caaata 126
<210>11<211>126<212>DNA<213>人工序列<220>
<22>合成的寡核苷酸<400>11ctagcaaaaa ctgtaaatag aacggcatca aggtgaaggg tgtttcgtcc tttccacaag60atatataaag ccaagaaatc gaaatacttt caagttacgg taagcatatg atagtccatg 120caaata 126<210>12<211>126<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>12ctagcaaaaa ctgtaaaaag aacggcatca aggtgatggg tgtttcgtcc tttccacaag60atatataaag ccaagaaatc gaaatacttt caagttacgg taagcatatg atagtccatg 120caaata 126<210>13<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>13gatctatttg catggactat catatgctta ccgtaacttg aa 42
<210>14<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>14agtatttcga tttcttggct ttatatatct tgtggaaagg acga 44<210>15<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>15aacaccgttc accttgatgc cgttcttttt acagtttttg 40<210>16<211>66<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>16ctagcaaaaa ctgtaaaaag aacggcatca aggtgaacgg tgtttcgtcc tttccacaag60atatat 66<210>17<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>17aaagccaaga aatcgaaata ctttcaagtt acggtaagca tatgatagtc catgcaaata60<210>18<211>126<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>18gatctatttg catacaaaag gaaactcacc ctaactgtaa agtaattgtg tgttttgaga60ctataaatat cccttggaga aaagccttgt ttggtaaaca gttgattgaa cttttgttcg 120tttttg 126<210>19<211>126<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>19gatctatttg catacaaaag gaaactcacc ctaactgtaa agtaattgtg tgttttgaga60ctataaatat cccttggaga aaagccttgt ttgttcaatc aactgtttac cttttgttcg 120tttttg 126<210>20<211>126<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>20ctagcaaaaa cgaacaaaag ttcaatcaac tgtttaccaa acaaggcttt tctccaaggg60atatttatag tctcaaaaca cacaattact ttacagttag ggtgagtttc cttttgtatg 120caaata 126<210>21<211>126<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>21ctagcaaaaa cgaacaaaag gtaaacagtt gattgaacaa acaaggcttt tctccaaggg60atatttatag tctcaaaaca cacaattact ttacagttag ggtgagtttc cttttgtatg 120caaata 126<210>22<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>22gattatttgc atacaaaagg aaactcaccc taactgtaaa gtaattgtgt gttttgagac60ta 62<210>23<211>63<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>23taaatatccc ttggagaaaa gccttgtttg ttcaatcaac tgtttacctt ttgttcgttt60ttt 63<210>24<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>24ctagcaaaaa cgaacaaaag gtaaacagtt gattgaacaa acaaggcttt tctccaaggg60at 62<210>25<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>25tttatagtct caaaacacac aattacttta cagttagggt gagtttcctt ttgtatgcaa60at 62<210>26<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(36)<223>n為任一種核苷酸<400>26cat tcnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gaatgc 36<210>27<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(37)<223>n為任一種核苷酸<400>27gagacgnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ncgtctc 37<210>28<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>28taatacgact cactatagga acggcatcaa ggtgaactt 39<210>29<211>39<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>29aagttcacct tgatgccgtt cctatagtga gtcgtatta 39<210>30<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>30taatacgact cactataggt tcaccttgat gccgttctt 39<210>31<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>31aagaacggca tcaaggtgaa cctatagtga gtcgtatta 39<210>32<211>7<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>32atctgtt 7
<210>33<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(14)<223>n為任一種核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(11)..(14)<223>核苷酸11-14任選地存在<400>33acctgcnnnn nnnn 14<210>34<211>20<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>34cttaccgtaa cttgaaagta20<210>35<211>20<212>DNA<213>鼠<400>35ctcaccctaa ctgtaaagta20<210>36<211>265<212>DNA<213>人
<400>36aaggtcgggc aggaagaggg cctatttccc atgattcctt catatttgca tatacgatac60aaggctgtta gagagataat tagaattaat ttgactgtaa acacaaagat attagtacaa 120aatacgtgac gtagaaagta ataatttctt gggtagtttg cagtttttaa aattatgttt 180taaaatggac tatcatatgc ttaccgtaac ttgaaagtat ttcgatttct tggctttata 240tatcttgtgg aaaggacgaa acacc 265<210>37<211>16<212>DNA<213>T7噬菌體<400>37taatacgact cactat16<210>38<211>87<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>經(jīng)修飾的U6基因增強(qiáng)子<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(67)<223>n為任一種核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(67)<223>核苷酸18-67位任選地存在<400>38attgcatnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn60nnnnnnnctt accgtaactt gaaagta87
<210>39<211>87<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>經(jīng)修飾的U6基因增強(qiáng)子<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(67)<223>n為任一種核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(67)<223>核苷酸18-67位任選地存在<400>39attgcatnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn60nnnnnnnctc accctaactg taaagta87<210>40<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>經(jīng)修飾的U6基因增強(qiáng)子<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(40)<223>n為任一種核苷酸<400>40attgcatnnn nnnnnnnnnn cttaccgtaa cttgaaagta 40<210>41
<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>經(jīng)修飾的U6基因增強(qiáng)子<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(40)<223>n為任一種核苷酸<400>41attgcatnnn nnnnnnnnnn ctcaccctaa ctgtaaagta 40<210>42<21>16<212> DNA<213>SP6噬菌體<400>42gggacgtttt tttccc16<210>43<211>7<212>DNA<213>SP6噬菌體<400>43ttttttc 7<210>44<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(43)<223>n為任一種核苷酸<400>44accgcattcn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngaatgc ttt 43<210>45<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(20)<223>n為任一種核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(19)..(20)<223>核苷酸19-20位任選地存在<400>45accgnnnnnn nnnnnnnnnn cttt 24<210>46<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(47)<223>n為任一種核苷酸<400>46acaccgagac gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnncgtc tcttttt 47
<210>47<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(22)<223>n為任一種核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(21)..(22)<223>核苷酸21-22位任選地存在<400>47acaccgnnnn nnnnnnnnnn nncttttt 28<210>48<211>11<212>DNA<213>人<400>48tttttacatc a 11<210>49<211>9<212>DNA<213>Mouse<400>49ttttgttcc 9<210>50<211>15
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>經(jīng)修飾的人RNA聚合酶III終止子<400>50tttttacagt ttttg 15<210>51<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>經(jīng)修飾的小鼠RNA聚合酶III終止子<400>51ttttgttcgt ttttg 1權(quán)利要求
1.分離的脫氧核糖核酸(DNA)分子，其包含編碼中間體小干擾核糖核酸(RNA)分子(siRNA)的至少約16個(gè)核苷酸的可表達(dá)模板核苷酸序列，所述分離的DNA分子介導(dǎo)靶RNA的RNA干擾，所述中間體siRNA包含a)含有與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的至少約15個(gè)核苷酸的5′部分和含有不與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的約1-5個(gè)核苷酸的3’端部分，其中該siRNA選擇性地與靶RNA有意鏈雜交；或b)含有與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的至少約15個(gè)核苷酸的5’部分和含有不與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的約1-5個(gè)核苷酸的3’端部分，其中該siRNA選擇性地與靶RNA反義鏈雜交。
2.權(quán)利要求1的分離的DNA分子，其中中間體siRNA長(zhǎng)度約為16-30個(gè)核苷酸。
3.權(quán)利要求1的分離的DNA分子，其中中間體siRNA長(zhǎng)度約為20-25個(gè)核苷酸。
4.權(quán)利要求1的分離的DNA分子，其中中間體siRNA長(zhǎng)度約為21個(gè)核苷酸。
5.權(quán)利要求1的分離的DNA分子，其中中間體siRNA的3′端部分長(zhǎng)度約為2-4個(gè)核苷酸。
6.權(quán)利要求1的分離的DNA分子，其中中間體siRNA的3′端部分長(zhǎng)度約為2或3個(gè)核苷酸。
7.權(quán)利要求1的分離的DNA分子，其為雙鏈DNA分子。
8.權(quán)利要求7的分離的DNA分子，其中雙鏈DNA分子的一條鏈編碼與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的第一中間體siRNA，并且其中雙鏈DNA分子的第二條鏈編碼與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的第二中間體siRNA。
9.權(quán)利要求1的分離的DNA分子，它是具有第一末端和第二末端的線性DNA分子。
10.載體，其包含權(quán)利要求1的分離的DNA分子。
11.權(quán)利要求10的載體，其為表達(dá)載體。
12.細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1的分離的DNA分子。
13.多種分離的DNA分子，其包含至少兩種權(quán)利要求1的分離的DNA分子。
14.權(quán)利要求13的多種分離的DNA分子，其中第一分離的DNA分子編碼包含與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA。
15.權(quán)利要求14的多種分離的DNA分子，其中至少第二分離的DNA分子編碼包含與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA。
16.權(quán)利要求15的多種分離的DNA分子，其中第一分離的DNA分子編碼的中間體siRNA的5’部分與第二分離的DNA分子編碼的中間體siRNA的5’部分互補(bǔ)。
17.權(quán)利要求14的多種分離的DNA分子，其中至少第二分離的DNA分子編碼包含與第二靶RNA的有意鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA。
18.權(quán)利要求14的多種分離的DNA分子，其中至少第二分離的DNA分子編碼包含與第二靶RNA的反義鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA。
19.權(quán)利要求13的多種分離的DNA分子，其中第一分離的DNA分子編碼包含與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA。
20.權(quán)利要求19的多種分離的DNA分子，其中至少第二分離的DNA分子編碼包含與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA。
21.權(quán)利要求20的多種分離的DNA分子，其中第一分離的DNA分子編碼的中間體siRNA的5’部分與第二分離的DNA分子編碼的中間體siRNA的5’部分互補(bǔ)。
22.權(quán)利要求19的多種分離的DNA分子，其中至少第二分離的DNA分子編碼包含與第二靶RNA的反義鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA。
23.權(quán)利要求19的多種分離的DNA分子，其中至少第二分離的DNA分子編碼包含與第二靶RNA的有意鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA。
24.DNA介導(dǎo)的基因沉默(DMSG)盒，其包含可操作地連接于至少一個(gè)異源核苷酸序列的權(quán)利要求1的分離DNA分子。
25.權(quán)利要求24的DMSG盒，其中異源核苷酸序列包含限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)、重組酶識(shí)別位點(diǎn)、或它們的組合。
26.權(quán)利要求24的DMSG盒，其中異源核苷酸序列包含至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。
27.權(quán)利要求26的DMSG盒，其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包含啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子、或它們的組合。
28.權(quán)利要求24的DMSG盒，其包含可操作連接的啟動(dòng)子、權(quán)利要求1的DNA分子和終止子。
29.權(quán)利要求26的DMSG盒，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包含RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。
30.權(quán)利要求29的DMSG盒，其中RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包含人U6基因RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。
31.權(quán)利要求27的DMSG盒，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型增強(qiáng)子、組成型的活化啟動(dòng)子、組成型的活化增強(qiáng)子、或它們的組合。
32.權(quán)利要求27的DMSG盒，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是組織特異性啟動(dòng)子或發(fā)育階段特異性啟動(dòng)子。
33.權(quán)利要求24的DMSG盒，其中可表達(dá)的模板核苷酸序列編碼第一中間體siRNA，并且其中異源核苷酸序列包含編碼第二中間體siRNA的至少約16個(gè)核苷酸的第二可表達(dá)模板核苷酸序列，其中第二中間體siRNA的5’部分與第一中間體siRNA的5’部分互補(bǔ)，因此，當(dāng)表達(dá)時(shí)，第一中間體siRNA的5’部分選擇性地與第二中間體siRNA的5’部分雜交，從而形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
34.權(quán)利要求33的DMSG盒，其進(jìn)一步包含至少一個(gè)RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。
35.權(quán)利要求33的DMSG盒，其進(jìn)一步包含至少一個(gè)人U6基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。
36.權(quán)利要求24的DMSG盒，其包含可操作連接的a)有意多核苷酸序列，所述有意多核苷酸序列包含SEQ ID NO1的核苷酸6-13、SEQ ID NO1的核苷酸19-38、SEQ ID NO1的核苷酸66-69、和編碼中間體siRNA的至少約16個(gè)核苷酸的模板核苷酸序列；b)與a)的核苷酸序列互補(bǔ)的反義多核苷酸；或c)包含a)的有意多核苷酸和b)的反義多核苷酸的雙鏈多核苷酸。
37.權(quán)利要求36的DMSG盒，其中a)的有意多核苷酸進(jìn)一步包含可操作連接的至少一個(gè)含有TTTTT五核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄終止子；其中b)的反義多核苷酸進(jìn)一步包含可操作連接的AAAAA五核苷酸序列；或其中a)的有意多核苷酸進(jìn)一步包含可操作連接的至少一個(gè)含有TTTTT五核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄終止子，并且b)的反義多核苷酸進(jìn)一步包含可操作連接的AAAAA五核苷酸序列。
38.權(quán)利要求24的DMSG盒，它是線性表達(dá)盒。
39.權(quán)利要求24的DMSG盒，它是環(huán)狀表達(dá)盒。
40.權(quán)利要求24的DMSG盒，其進(jìn)一步包含可檢測(cè)標(biāo)記。
41.權(quán)利要求40的DMSG盒，其中可檢測(cè)標(biāo)記是熒光標(biāo)記、放射性核素、酶、順磁性標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。
42.權(quán)利要求41的DMSG盒，其中所述的熒光標(biāo)記是熒光素、R-藻紅素、Cy3、Cy5、或德克薩斯紅。
43.權(quán)利要求24的DMSG盒，其進(jìn)一步包含靶向部分。
44.權(quán)利要求43的DMSG盒，其中靶向部分是多核苷酸、肽、肽模擬物、或小的有機(jī)分子。
45.權(quán)利要求43的DMSG盒，其中靶向部分包括細(xì)胞受體的配體、細(xì)胞配體的受體、或抗體。
46.載體，其包含權(quán)利要求24的DMSG盒。
47.細(xì)胞，其包含權(quán)利要求24的DMSG盒。
48.多種DMSG盒，其包含至少兩種權(quán)利要求24的DMSG盒。
49.權(quán)利要求48的多種DMSG盒，其中第一DMSG盒的可表達(dá)模板核苷酸序列編碼包含與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA。
50.權(quán)利要求49的多種DMSG盒，其中至少第二DMSG盒的可表達(dá)模板核苷酸序列編碼包含與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA。
51.權(quán)利要求50的多種DMSG盒，其中由第一DMSG盒的可表達(dá)核苷酸序列編碼的中間體siRNA的5’部分與第二DMSG盒的可表達(dá)核苷酸序列編碼的中間體siRNA的5’部分互補(bǔ)。
52.權(quán)利要求49的多種DMSG盒，其中至少第二DMSG盒的可表達(dá)模板核苷酸序列編碼包含與第二靶RNA的有意鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA。
53.權(quán)利要求50的多種DMSG盒，其中至少第二DMSG盒的可表達(dá)模板核苷酸序列編碼包含與第二靶RNA的反義鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA。
54.權(quán)利要求48的多種DMSG盒，其中第一DMSG盒的可表達(dá)模板核苷酸序列編碼包含與靶RNA的反義鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA。
55.權(quán)利要求54的多種DMSG盒，其中至少第二DMSG盒的可表達(dá)模板核苷酸序列編碼包含與靶RNA的有意鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA。
56.權(quán)利要求55的多種DMSG盒，其中由第一DMSG盒編碼的中間體siRNA的5’部分與第二DMSG盒編碼的中間體siRNA的5’部分互補(bǔ)。
57.權(quán)利要求54的多種DMSG盒，其中至少第二DMSG盒的可表達(dá)模板核苷酸序列編碼包含與第二靶RNA的反義鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA。
58.權(quán)利要求54的多種DMSG盒，其中至少第二分離的DNA分子的可表達(dá)模板核苷酸序列編碼包含與第二靶RNA的有意鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA。
59.細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)靶RNA的RNA干擾的方法，該方法包括將至少一種權(quán)利要求24的DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞，因此包含由DMSG盒編碼的中間體siRNA的siRNA的表達(dá)引發(fā)靶RNA的降解，從而在所述的細(xì)胞中介導(dǎo)RNA干擾。
60.權(quán)利要求59的方法，其中至少一種DMSG盒編碼與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的中間體siRNA。
61.權(quán)利要求59的方法，其包括將至少兩種DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞。
62.權(quán)利要求61的方法，其中至少兩種DMSG盒中的第一DMSG盒編碼包含與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的5’部分的第一中間體siRNA，并且其中至少兩種DMSG盒中的第二DMSG盒編碼包含與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的5’部分的第二中間體siRNA。
63.權(quán)利要求62的方法，其中與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的第一中間體siRNA的5’部分與與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的第二中間體siRNA的5’部分互補(bǔ)，由此第一中間體siRNA和第二中間體siRNA選擇性雜交形成siRNA。
64.權(quán)利要求59的方法，其中靶RNA是信使RNA(mRNA)。
65.權(quán)利要求64的方法，其中mRNA是由細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源基因編碼的。
66.權(quán)利要求59的方法，其中靶RNA是病毒RNA。
67.權(quán)利要求66的方法，其中病毒RNA是雙鏈RNA。
68.樣本中敲低靶基因表達(dá)的方法，該方法為將樣本與至少一種權(quán)利要求24的DMSG盒接觸，其中包含由DMSG盒編碼的中間體siRNA的siRNA的表達(dá)引發(fā)靶基因編碼的靶RNA分子的降解，從而部分或完全敲低樣本中靶基因的表達(dá)。
69.權(quán)利要求68的方法，其包括將樣本與至少兩種DMSG盒接觸。
70.權(quán)利要求69的方法，其中至少兩種DMSG盒的第一DMSG盒編碼包含與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的5’部分的第一中間體siRNA，并且其中至少兩種DMSG盒的第二DMSG盒編碼包含與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的5’部分的第二中間體siRNA。
71.權(quán)利要求70的方法，其中第一中間體siRNA的5’部分與第二中間體siRNA的5’部分互補(bǔ)，由此第一中間體siRNA和第二中間體siRNA選擇性雜交形成siRNA。
72.權(quán)利要求68的方法，它是在體外進(jìn)行的。
73.權(quán)利要求68的方法，其中樣本包括細(xì)胞，所述的方法包括將至少一種DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞，由此包含由DMSG盒編碼的中間體siRNA的siRNA的表達(dá)引發(fā)RNA分子的降解，從而敲低細(xì)胞中靶基因的表達(dá)。
74.權(quán)利要求73的方法，其中細(xì)胞是培養(yǎng)的細(xì)胞。
75.權(quán)利要求73的方法，其中細(xì)胞包含原位細(xì)胞。
76.權(quán)利要求73的方法，其中靶基因是細(xì)胞中的內(nèi)源基因。
77.權(quán)利要求73的方法，其中細(xì)胞是生殖細(xì)胞。
78.在細(xì)胞群中跟蹤經(jīng)歷DNA介導(dǎo)的基因沉默的特異細(xì)胞或特異細(xì)胞群的方法，該方法包括將至少一種權(quán)利要求35的DMSG盒導(dǎo)入特異細(xì)胞或特異細(xì)胞群體中的每個(gè)細(xì)胞；以及檢測(cè)可檢測(cè)標(biāo)記，從而在細(xì)胞群中跟蹤經(jīng)歷DNA介導(dǎo)的基因沉默的特異細(xì)胞或特異細(xì)胞群。
79.權(quán)利要求78的方法，其包括將第一DMSG盒和第二DMSG盒導(dǎo)入特異細(xì)胞或特異細(xì)胞群，其中第一DMSG盒編碼包含與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的5’部分的第一中間體siRNA，其中第二DMSG盒編碼包含與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的5’部分的第二中間體siRNA，且其中第一中間體siRNA的5’部分與第二中間體siRNA的5’部分互補(bǔ)。
80.鑒定經(jīng)歷DNA介導(dǎo)的基因沉默的細(xì)胞的方法，該方法包括在足以將DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞的條件下，將至少一個(gè)細(xì)胞與至少一種權(quán)利要求35的DMSG盒接觸；以及檢測(cè)細(xì)胞中至少一種DMSG盒的可檢測(cè)標(biāo)記，從而鑒定經(jīng)歷DNA介導(dǎo)的基因沉默的細(xì)胞。
81.權(quán)利要求80的方法，其包括將至少一個(gè)細(xì)胞與第一DMSG盒和第二DMSG盒接觸，其中第一DMSG盒編碼包含與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的5’部分的第一中間體siRNA，其中第二DMSG盒編碼包含與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的5’部分的第二中間體siRNA，且其中第一中間體siRNA的5’部分與第二中間體siRNA的5’部分互補(bǔ)。
82.權(quán)利要求81的方法，其中第一DMSG盒的可檢測(cè)標(biāo)記不同于第二DMSG盒的可檢測(cè)標(biāo)記，且其中所述的檢測(cè)步驟包括檢測(cè)第一DMSG盒的可檢測(cè)標(biāo)記和第二DMSG盒的可檢測(cè)標(biāo)記。
83.評(píng)估測(cè)試細(xì)胞中基因功能的方法，該方法包括將至少一種權(quán)利要求24的DMSG盒導(dǎo)入測(cè)試細(xì)胞，以及當(dāng)表達(dá)DMSG盒編碼的siRNA時(shí)，觀察測(cè)試細(xì)胞的表型，由此將測(cè)試細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞的表型進(jìn)行比較而指示靶基因的功能，從而評(píng)估測(cè)試細(xì)胞中基因的功能。
84.確定試劑是否影響測(cè)試細(xì)胞中特異基因的方法，該方法包括在測(cè)試細(xì)胞中表達(dá)包含被至少一種權(quán)利要求24的DMSG盒編碼的中間體siRNA的siRNA，其中中間體siRNA包含與測(cè)試細(xì)胞中特異基因編碼的RNA分子互補(bǔ)的5’部分；將測(cè)試細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞與試劑相接觸，以及比較測(cè)試細(xì)胞的表型和對(duì)照細(xì)胞的表型，從而評(píng)估試劑是否影響測(cè)試細(xì)胞中的特異基因。
85.權(quán)利要求84的方法，其包括在細(xì)胞中表達(dá)由第一DMSG盒編碼的第一中間體siRNA和由第二DMSG盒編碼的第二中間體siRNA，其中第一中間體siRNA包含與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的5’部分，其中第二中間體siRNA包含與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的5’部分，且其中第一中間體siRNA的5’部分與第二中間體siRNA的5’部分互補(bǔ)。
86.權(quán)利要求84的方法，其中由測(cè)試細(xì)胞的表型相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞的表型的變化確定所述試劑為影響特異基因的試劑。
87.通過(guò)誘導(dǎo)針對(duì)靶RNA介導(dǎo)的疾病的RNAi改善個(gè)體中RNA介導(dǎo)的疾病的方法，該方法包括將表現(xiàn)RNA介導(dǎo)的疾病個(gè)體的細(xì)胞與至少一種DMSG盒接觸，其中表達(dá)包含由DMSG盒的模板核苷酸序列編碼的一種或多種中間體siRNA分子的siRNA能夠介導(dǎo)針對(duì)靶RNA的RNAi。
88.權(quán)利要求87的方法，其中在體外將個(gè)體細(xì)胞與DMSG盒接觸，從而產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞，該方法進(jìn)一步包括將經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞回施與受試者。
89.權(quán)利要求87的方法，其中在體內(nèi)將個(gè)體細(xì)胞與DMSG盒接觸，該方法包括在一些條件下將包含DMSG盒的組合物施與個(gè)體，從而使表現(xiàn)出RNA介導(dǎo)的疾病的細(xì)胞與DMSG盒接觸。
90.權(quán)利要求87的方法，其中靶RNA是內(nèi)源RNA。
91.權(quán)利要求87的方法，其中靶RNA是外源RNA。
92.權(quán)利要求91的方法，其中內(nèi)源RNA是細(xì)菌RNA或病毒RNA。
93.一種試劑盒，其包含至少一種權(quán)利要求1的分離的DNA分子。
94.一種試劑盒，包含至少一種權(quán)利要求24的DMSG盒。
95.權(quán)利要求94的試劑盒，其中異源核苷酸序列包含限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)、重組酶識(shí)別位點(diǎn)、或它們的組合。
96.權(quán)利要求95的試劑盒，其進(jìn)一步包含至少一個(gè)啟動(dòng)子、至少一個(gè)終止子、或它們的組合，其中啟動(dòng)子或終止子包含足以可操作連接于編碼中間體siRNA的核苷酸序列上的末端。
97.權(quán)利要求94的試劑盒，其中異源核苷酸序列包含至少一個(gè)啟動(dòng)子、至少一個(gè)終止子、或它們的組合。
98.權(quán)利要求94的試劑盒，其中異源核苷酸序列包含人U6基因啟動(dòng)子或RNA聚合酶III啟動(dòng)子。
99.權(quán)利要求94的試劑盒，其包含經(jīng)修飾的U6基因增強(qiáng)子，所述增強(qiáng)子包含下述核苷酸序列5′-ATTGCAT-N(10-60)-CTTACCGTAACTTGAAAGTA-3′(SEQ IDNO38)；或5′-ATTGCAT-N(10-60)-CTCACCCTAACTGTAAAGTA-3′(SEQ IDNO39).
100.權(quán)利要求99的試劑盒，其中經(jīng)修飾的U6基因增強(qiáng)子被可操作連接于啟動(dòng)子。
101.權(quán)利要求94的試劑盒，其中異源核苷酸序列包含至少一個(gè)增強(qiáng)子元件。
102.權(quán)利要求94的試劑盒，其中試劑盒進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)染輔助物。
103.權(quán)利要求94的試劑盒，其包含第一DMSG盒和至少第二DMSG盒。
104.權(quán)利要求94的試劑盒，其包含第一DMSG盒和第二DMSG盒。
105.權(quán)利要求103的試劑盒，其中第一DMSG盒編碼包含與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的5’部分的第一中間體siRNA，其中第二DMSG盒編碼包含與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的5’部分的第二中間體siRNA，且其中第一中間體siRNA的5’部分與第二中間體siRNA的5’部分互補(bǔ)。
106.分離的經(jīng)修飾U6基因增強(qiáng)子，其包含5′-ATTGCAT-N(10-60)-CTTACCGTAACTTGAAAGTA-3′(SEQ IDNO38)；或5′-ATTGCAT-N(10-60)-CTCACCCTAACTGTAAAGTA-3′(SEQ IDNO39).
107.權(quán)利要求106的分離的經(jīng)修飾U6基因增強(qiáng)子，其包含5′-ATTGCAT-N(13)-CTTACCGTAACTTGAAAGTA-3′(SEQ ID NO40)；或5′-ATTGCAT-N(13)-CTCACCCTAACTGTAAAGTA-3′(SEQ ID NO41).
108.權(quán)利要求106的分離的經(jīng)修飾U6基因增強(qiáng)子，其包含SEQ IDNO1的6-46位核苷酸。
109.非人的轉(zhuǎn)基因生物，其包含權(quán)利要求24的DMSG盒。
110.權(quán)利要求109的轉(zhuǎn)基因生物，其中轉(zhuǎn)基因生物是哺乳動(dòng)物。
111.權(quán)利要求109的轉(zhuǎn)基因生物，其中轉(zhuǎn)基因生物是轉(zhuǎn)基因嚙齒類動(dòng)物。
112.權(quán)利要求109的轉(zhuǎn)基因生物，其中轉(zhuǎn)基因生物是轉(zhuǎn)基因小鼠。
113.權(quán)利要求109的轉(zhuǎn)基因生物，其中DMSG盒包含組織特異的啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、或發(fā)育階段特異的啟動(dòng)子。
114.DNA介導(dǎo)的基因沉默(DMSG)盒，其包含可操作連接的RNA聚合酶III(pol III)啟動(dòng)子、可表達(dá)的模板核苷酸序列、和至少一個(gè)pol III終止子，其中可表達(dá)模板核苷酸序列與pol III啟動(dòng)子是異源的，其中可表達(dá)模板核苷酸序列由編碼中間體小干擾核糖核酸(RNA)分子(siRNA)的至少約16個(gè)核苷酸組成，它介導(dǎo)靶RNA的RNA干擾，所述的中間體siRNA包含a)含有與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的至少約15個(gè)核苷酸的5’部分，和任選地含有約1-5個(gè)核苷酸的3′端部分，其中該中間體siRNA選擇性地與靶RNA的有意鏈雜交；或b)含有與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的至少約15個(gè)核苷酸的5’部分，和任選地含有約1-5個(gè)核苷酸的3′端部分，其中該中間體siRNA選擇性地與靶RNA的反義鏈雜交。
115.權(quán)利要求114的DMSG盒，其中中間體siRNA長(zhǎng)度約為21-23個(gè)核苷酸。
116.權(quán)利要求114的DMSG盒，其中中間體siRNA的3′端部分長(zhǎng)度約為1-4個(gè)核苷酸。
117.權(quán)利要求114的DMSG盒，其中pol III啟動(dòng)子或pol III終止子包含哺乳動(dòng)物U6基因pol III啟動(dòng)子或pol III終止子。
118.權(quán)利要求117的DMSG盒，其中哺乳動(dòng)物U6基因是人U6基因或小鼠U6基因。
119.權(quán)利要求114的DMSG盒，其還包含可操作連接的增強(qiáng)子。
120.權(quán)利要求119的DMSG盒，其中增強(qiáng)子是組成型的活化增強(qiáng)子或誘導(dǎo)型增強(qiáng)子。
121.權(quán)利要求114的DMSG盒，其是雙鏈DNA分子。
122.權(quán)利要求121的DMSG盒，其中雙鏈DNA分子的一條鏈編碼與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的第一中間體siRNA，其中雙鏈DNA分子的第二條鏈編碼與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的第二中間體siRNA，并且其中第一中間體siRNA與第二中間體siRNA選擇性雜交形成雙鏈siRNA。
123.權(quán)利要求122的DMSG盒，其中雙鏈siRNA在每一3′末端包含1-4個(gè)核苷酸的3′突出端。
124.一種載體，其包含權(quán)利要求114的DMSG盒。
125.一種細(xì)胞，其包含權(quán)利要求114的DMSG盒。
126.權(quán)利要求114的DMSG盒，其中可表達(dá)的模板核苷酸序列編碼第一中間體siRNA，并且其中可表達(dá)模板核苷酸序列被可操作連接于編碼第二中間體siRNA的第二可表達(dá)模板核苷酸序列，其中第二中間體siRNA的5’部分與第一中間體siRNA的5’部分互補(bǔ)，由此當(dāng)表達(dá)時(shí)，第一中間體siRNA的5’部分選擇性地與第二中間體siRNA的5’部分雜交，從而形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
127.權(quán)利要求114的DMSG盒，其包含可操作連接的a)有意多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO1的核苷酸6-13、SEQ IDNO1的核苷酸19-38、SEQ ID NO1的核苷酸66-69、模板核苷酸序列、和至少一個(gè)含有TTTT四核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄終止子；b)與a)的核苷酸序列互補(bǔ)的反義多核苷酸；或c)包含a)的有意多核苷酸和b)的反義多核苷酸的雙鏈多核苷酸。
128.權(quán)利要求127的DMSG盒，其中轉(zhuǎn)錄終止子包含SEQ ID NO48或SEQ ID NO49。
129.權(quán)利要求127的DMSG盒，其中轉(zhuǎn)錄終止子包含SEQ ID NO50或SEQ ID NO51。
130.權(quán)利要求114的DMSG盒，其進(jìn)一步包含可檢測(cè)標(biāo)記、靶向部分、或它們的組合。
131.多種DMSG盒，其包含至少兩種權(quán)利要求114的DMSG盒。
132.權(quán)利要求131的多種DMSG盒，其中第一DMSG盒的可表達(dá)模板核苷酸序列編碼包含與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA。
133.權(quán)利要求132的多種DMSG盒，其中至少第二DMSG盒的可表達(dá)模板核苷酸序列編碼包含與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的5’部分的中間體siRNA。
134.多種分離的脫氧核糖核酸(DNA)分子，其中每一DNA分子被固定在固體支持物上，并且其中每一DNA分子都包含編碼中間體小干擾核糖核酸(RNA)分子(siRNA)的至少約16個(gè)核苷酸的可表達(dá)模板核苷酸序列，其介導(dǎo)靶RNA的RNA干擾，所述中間體siRNA包含a)含有與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的至少約15個(gè)核苷酸的5’部分，和含有不與靶RNA有意鏈互補(bǔ)的約1-5個(gè)核苷酸的3′端部分，其中所述siRNA選擇性地與靶RNA有意鏈雜交；或b)含有與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的至少約15個(gè)核苷酸的5’部分，和含有不與靶RNA反義鏈互補(bǔ)的約1-5個(gè)核苷酸的3′端部分，其中所述siRNA選擇性地與靶RNA反義鏈雜交。
135.權(quán)利要求134的多種DNA分子，其中每一DNA分子進(jìn)一步包含可操作連接于可表達(dá)模板核苷酸序列上的RNA聚合酶III(pol III)啟動(dòng)子，并且其中可表達(dá)模板核苷酸序列相應(yīng)于pol III啟動(dòng)子而言是異源的。
136.權(quán)利要求135的多種DNA分子，其中pol III啟動(dòng)子是人U6基因pol III啟動(dòng)子。
137.權(quán)利要求134的多種DNA分子，其中每一DNA分子包含可操作連接的RNA聚合酶III(pol III)啟動(dòng)子、可表達(dá)的模板核苷酸序列、和至少一個(gè)pol III終止子，并且其中可表達(dá)的模板核苷酸序列相應(yīng)于polIII啟動(dòng)子而言是異源的。
138.權(quán)利要求137的多種DNA分子，其包含可操作連接的a)有意多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO1的核苷酸6-13、SEQ IDNO1的核苷酸19-38、SEQ ID NO1的核苷酸66-69、模板核苷酸序列、和至少一個(gè)含有TTTT四核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄終止子；b)與a)的核苷酸序列互補(bǔ)的反義多核苷酸；或c)包含a)的有意多核苷酸和b)的反義多核苷酸的雙鏈多核苷酸。
139.權(quán)利要求138的多種DNA分子，其中轉(zhuǎn)錄終止子包含SEQ IDNO48或SEQ ID NO49。
140.權(quán)利要求138的多種DNA分子，其中轉(zhuǎn)錄終止子包含SEQ IDNO50或SEQ ID NO51。
141.權(quán)利要求134的多種DNA分子，其中可表達(dá)模板核苷酸序列編碼第一中間體siRNA，其中可表達(dá)模板核苷酸序列被可操作連接于包含編碼第二中間體siRNA的至少約16個(gè)核苷酸的第二可表達(dá)模板核苷酸序列的核苷酸序列上，并且其中第二中間體siRNA的5’部分與第一中間體siRNA的5’部分互補(bǔ)，由此當(dāng)表達(dá)時(shí)，第一中間體siRNA的5’部分選擇性地與第二中間體siRNA的5’部分雜交，從而形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
142.權(quán)利要求134的多種DNA分子，其中每一DNA分子都被固定在固體支持物的特定位置上。
143.權(quán)利要求134的多種DNA分子，其中DNA分子定位在陣列上。
144.權(quán)利要求143的多種DNA分子，其中陣列是可尋址陣列。
145.權(quán)利要求134的多種DNA分子，其中用明膠將多種的DNA分子固定在固體支持物上。
146.權(quán)利要求134的多種DNA分子，其中多種的DNA分子進(jìn)一步包含可操作連接的跨膜結(jié)構(gòu)域肽，其中跨膜結(jié)構(gòu)域肽是膜內(nèi)剪切蛋白酶的底物。
147.權(quán)利要求146的多種DNA分子，其中DNA分子通過(guò)跨膜結(jié)構(gòu)域肽被固定在固體支持物上。
148.權(quán)利要求146的多種DNA分子，其中跨膜結(jié)構(gòu)域肽包括β-淀粉樣前體蛋白質(zhì)的肽、果蠅Sevenless蛋白質(zhì)或其哺乳動(dòng)物同系物的肽、果蠅torso蛋白質(zhì)或其哺乳動(dòng)物同系物的肽、果蠅δ蛋白質(zhì)或其哺乳動(dòng)物同系物的肽、或人血型糖蛋白-A蛋白質(zhì)的肽。
149.權(quán)利要求146的多種DNA分子，其中跨膜結(jié)構(gòu)域肽是早老因子的底物。
150.權(quán)利要求146的多種DNA分子，其中多種的DNA分子進(jìn)一步包含可操作連接的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
151.權(quán)利要求134的多種DNA分子，其中多種的DNA分子進(jìn)一步包含可操作連接的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
152.權(quán)利要求151的多種DNA分子，其中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括人免疫缺陷病毒TAT結(jié)構(gòu)域、果蠅觸角足同源結(jié)構(gòu)域、單純皰疹病毒VP22轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
153.權(quán)利要求134的多種DNA分子，其中固體支持物包括微芯片、玻片、或珠子。
154.一種試劑盒，它包含權(quán)利要求134的多種DNA分子。
155.將DNA介導(dǎo)的基因沉默(DMSG)盒導(dǎo)入細(xì)胞的方法，其包括在足以使DMSG盒進(jìn)入細(xì)胞的條件下，將固定于固體支持物上的權(quán)利要求24的DMSG盒與細(xì)胞接觸，從而將DMSG盒導(dǎo)入細(xì)胞。
156.權(quán)利要求155的方法，其中DMSG盒進(jìn)一步包含可操作連接的跨膜結(jié)構(gòu)域肽，并且其中跨膜結(jié)構(gòu)域肽是膜內(nèi)剪切蛋白酶的底物。
157.權(quán)利要求156的方法，其中DMSG盒通過(guò)跨膜結(jié)構(gòu)域肽被固定于固體支持物上。
158.權(quán)利要求156的方法，其中跨膜結(jié)構(gòu)域肽包括β-淀粉樣前體蛋白質(zhì)的肽、果蠅sevenless蛋白質(zhì)或其哺乳動(dòng)物同系物的肽、果蠅torso蛋白質(zhì)或其哺乳動(dòng)物同系物的肽、果蠅δ蛋白質(zhì)或其哺乳動(dòng)物同系物的肽、或人血型糖蛋白-A蛋白質(zhì)的肽。
159.權(quán)利要求156的方法，其中跨膜結(jié)構(gòu)域肽是早老因子的底物。
160.權(quán)利要求155的方法，其中DMSG盒進(jìn)一步包含可操作連接的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
161.權(quán)利要求155的方法，其中DMSG盒進(jìn)一步包含可操作連接的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
162.權(quán)利要求161的方法，其中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括人免疫缺陷病毒TAT結(jié)構(gòu)域、果蠅觸角足同源結(jié)構(gòu)域、單純皰疹病毒VP22轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
163.權(quán)利要求155的方法，其中DMSG盒包括多種DMSG盒中的DMSG盒，并且其中多種中的每一DMSG盒都被固定于固體支持物上。
164.權(quán)利要求163的方法，其中多種的DMSG盒定位在陣列上。
165.權(quán)利要求164的方法，其中陣列是可尋址陣列。
166.權(quán)利要求155的方法，其中DMSG盒是用明膠固定在固體支持物上的。
167.權(quán)利要求155的方法，其中固體支持物包括微芯片、玻片、或珠子。
168.權(quán)利要求155的方法，其中，當(dāng)在包含DMSG盒的細(xì)胞中表達(dá)DMSG盒的可表達(dá)核苷酸序列時(shí)，細(xì)胞中基因的表達(dá)降低或被抑制。
169.權(quán)利要求168的方法，其中基因降低的或被抑制的表達(dá)是通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的表型變化而檢測(cè)的。
170.權(quán)利要求168的方法，其中基因編碼轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)因子受體、蛋白激酶、或G蛋白。
171.權(quán)利要求168的方法，其中基因?yàn)樵诔尸F(xiàn)病理疾病的細(xì)胞中表達(dá)，而在相應(yīng)的不呈現(xiàn)病理疾病的細(xì)胞中不表達(dá)的基因。
172.權(quán)利要求171的方法，其中呈現(xiàn)病理疾病的細(xì)胞是癌細(xì)胞。
173.權(quán)利要求163的方法，其進(jìn)一步包括從多種DMSG盒中，鑒定能夠降低或抑制包含DMSG盒的細(xì)胞中基因表達(dá)的DMSG盒。
174.通過(guò)權(quán)利要求173的方法分離的DMSG盒。
全文摘要
提供了通過(guò)RNA干擾介導(dǎo)基因沉默的DNA組合物。DNA組合物包括驅(qū)動(dòng)編碼中間體小干擾RNA分子的核苷酸序列表達(dá)的RNA聚合酶III啟動(dòng)子和RNA聚合酶III終止子。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1636010SQ02828345
公開日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2002年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月27日
發(fā)明者王繼武 申請(qǐng)人:美國(guó)綠陽(yáng)生物技術(shù)及醫(yī)藥公司