專利名稱：免疫刺激rna和hbv靶基因沉默rna的雙表達(dá)載體及其構(gòu)建與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的雙表達(dá)載體，及其構(gòu)建與 應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
HBV感染可引起急、慢性肝炎，并且與肝硬化、肝癌的發(fā)病密切相關(guān)。而且，作為一 種能夠逃逸免疫監(jiān)視的病毒，在感染的早期不能引起免疫反應(yīng)，從而不被機體抗病毒系統(tǒng) 所清除。為HBV的治療帶來了挑戰(zhàn)。RNAi技術(shù)用于抗HBV治療，有望成為治療乙型肝炎的 革命性新方法。由于HBV復(fù)制具有以RNA為模板合成DNA的特點，只要阻斷RNA的合成就 能抑制DNA的復(fù)制，因此HBV感染特別適用于RNAi治療。并且某些RNA序列能夠激活免疫 系統(tǒng)，誘導(dǎo)抗病毒反應(yīng)。因此設(shè)計并構(gòu)建能夠表達(dá)靶向沉默HBV基因的RNA和能夠激活免 疫系統(tǒng)的RNA，是實現(xiàn)對HBV的治療的有效手段。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，針對HBV生命周期的特點，本發(fā)明提供了一種免疫刺激RNA和 HBV靶基因沉默RNA的雙表達(dá)載體，以及其構(gòu)建方法，及在制備抗HBV的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的雙表達(dá)載體，是由轉(zhuǎn)錄shRNA的DNA 序列、轉(zhuǎn)錄ssRNA的DNA序列與pTZTO+Ι載體組成的重組載體，其序列如seq. 1所示。本發(fā)明的免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的雙表達(dá)載體是通過以下方法構(gòu)建 制得的(1)針對HBV χ基因的序列，人工設(shè)計合成shRNA相對應(yīng)的DNA序列，并在序列的 兩端添加雙酶切位點Sal I和Xbal I，退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)，得表1所示的序列；表1人工設(shè)計合成shRNA相對應(yīng)的DNA序列
(2)將PTZU6+1載體進(jìn)行Sal I和Xbal I的雙酶切，并回收載體骨架；(3)將步驟⑴制得的序列與步驟⑵制得的PTZU6+1載體連接，構(gòu)建pTZU-shRNA 重組載體；(4)利用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000(購自invitrogen)將構(gòu)建的
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4pTZU-shRNA轉(zhuǎn)染到HBV感染的人肝細(xì)胞系H印G2. 2. 15細(xì)胞，并檢測HBV χ基因的表達(dá)水 平，篩選具有較好沉默能力的shRNA序列的DNA序列；然后將篩選得到的pTZU-shRNA重組 載體進(jìn)行EcoR I和Hind III雙酶切，得到U6+shRNA的表達(dá)框，其序列如seq. 2所示；(5)根據(jù)能夠激活免疫系統(tǒng)的RNA病毒序列，設(shè)計編碼具有潛在免疫刺激作用序 列的RNA的DNA序列，并在序列的兩端添加雙酶切位點序列EcoRI和BamHI，得表2所示的 序列；表2人工設(shè)計合成SSRNA相對應(yīng)的DNA序列
權(quán)利要求
一種免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的雙表達(dá)載體，其特征在于是由轉(zhuǎn)錄shRNA的DNA序列、轉(zhuǎn)錄ssRNA的DNA序列與pTZU6+1載體組成的重組載體，其序列如seq.1所示。
2.權(quán)利要求1所述的免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的雙表達(dá)載體的構(gòu)建方法， 其特征在于，步驟如下(1)針對HBVχ基因的序列，人工設(shè)計合成shRNA相對應(yīng)的DNA序列，并在序列的兩端 添加雙酶切位點Sal I和Xbal I，退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)，得表1所示的序列；(2)將pTZU6+l載體進(jìn)行SalI和XbalI的雙酶切，并回收載體骨架；(3)將步驟(1)制得的序列與步驟(2)制得的PTZU6+1載體連接，構(gòu)建pTZU-shRNA重 組載體；(4)利用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000將構(gòu)建的pTZU-shRNA轉(zhuǎn)染到HBV感染的人 肝細(xì)胞系H印G2. 2. 15細(xì)胞，并檢測HBV χ基因的表達(dá)水平，篩選具有轉(zhuǎn)錄較好沉默能力的 shRNA序列的DNA序列；然后將篩選得到的pTZU-shRNA重組載體進(jìn)行EcoR I和Hind III 雙酶切，得到TO+shRNA的表達(dá)框，其序列如seq. 2所示；(5)根據(jù)能夠激活免疫系統(tǒng)的RNA病毒序列，設(shè)計編碼具有潛在免疫刺激作用序列的 RNA的DNA序列，并在序列的兩端添加雙酶切位點序列EcoRI和BamH I，得表2所示的序 列；(6)將pSIREN載體進(jìn)行EcoRI和BamH I雙酶切，并回收載體骨架；(7)將步驟(5)制得的序列與步驟(6)制得的pSIREN載體連接，構(gòu)建pSIREN-ssRNA重 組載體；(8)利用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000將構(gòu)建的pSIREN-ssRNA轉(zhuǎn)染到小鼠巨 噬細(xì)胞系RAW264. 7、新鮮分離的小鼠肝淋巴細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞系!fepG2和HBV感染細(xì)胞系 HepG2. 2. 15，并檢測細(xì)胞因子IFN的RNA水平和蛋白水平，篩選能夠激活免疫系統(tǒng)的表達(dá)載 體，得到的具有刺激作用的序列，然后將篩選得到的PSIREN-ssRNA重組載體進(jìn)行EcoRI單 酶切，得線性片段；(9)將步驟(3)制得的TO+shRNA表達(dá)框和步驟(6)制得的線性片段平端化，連接，即得 到表達(dá)shRNA和ssRNA的雙表達(dá)載體，其序列如seq. 1所示。
3.權(quán)利要求1所述的免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的雙表達(dá)載體在制備抗HBV 的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的雙表達(dá)載體，是由轉(zhuǎn)錄shRNA的DNA序列、轉(zhuǎn)錄ssRNA的DNA序列與pTZU6+1載體組成的重組載體，其序列如seq.1所示。本發(fā)明的免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的雙表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，經(jīng)Northern blot鑒定能夠在胞內(nèi)表達(dá)；轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，24h后檢測，發(fā)現(xiàn)能夠下調(diào)HBV的表達(dá)；轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，24h后檢測，發(fā)現(xiàn)能夠下調(diào)上清中HBV抗原含量和胞內(nèi)抗原含量；由此可見，本發(fā)明的免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的雙表達(dá)載體能夠作為抗HBV的藥物應(yīng)用。
文檔編號A61P1/16GK101979595SQ201010282600
公開日2011年2月23日 申請日期2010年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月16日
發(fā)明者蘭培祥, 張建, 張彩, 田志剛 申請人:山東大學(xué)