專利名稱：通過小核糖核酸病毒直接介導(dǎo)的溶瘤作用治療受試者惡性腫瘤的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用病毒殺死異常細(xì)胞。也描述了篩選細(xì)胞的方法，以明確它們是否對病毒，以及藥物組合物的處理敏感。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一些在獸醫(yī)方面以及在人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用。
背景技術(shù)：
卵巢癌是女性死亡的一個主要原因。幾種惡性腫瘤均源自卵巢。卵巢上皮癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，在因癌癥死亡的女性中發(fā)生率居第五位，在超過65歲的女性患者的所有死亡原因中占半數(shù)。
大約5％至10％的卵巢癌是家族性的，已經(jīng)鑒定了3種明顯的遺傳模式單純卵巢癌，卵巢和乳腺癌，或卵巢和結(jié)腸癌。卵巢癌的最重要危險因素是一級親屬(母親、女兒或姐妹)有患病的家族史。在女性中最高危的情況是兩個或多個的一級親屬患有卵巢癌。對于1個一級親屬和一個二級親屬(外祖母、姑母)患有卵巢癌的女性危險稍微小一些。在大多數(shù)患有乳腺癌和卵巢癌綜合征，或位點特異性卵巢癌的家族中，遺傳基因連鎖已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在染色體17q21上的BRCA1基因座上。BRCA2對于一些遺傳性卵巢癌和乳腺癌也是起作用的，它通過遺傳基因連鎖被定位在染色體13q12上。
在BRCA1上攜帶生殖系突變的患者中，發(fā)生卵巢癌對生命的威脅大大超過了普通人群。對BRCA1上有生殖系突變的患者進行的兩個回顧性研究表明，與BRCA1陰性的女性相比這些女性的生存率是提高的。在解釋這些數(shù)據(jù)時，必須考慮到大多數(shù)具有BRCA1突變的女性的可能擁有卵巢癌和/或乳腺癌史的家族成員。因此，這些女性可能要警惕一些，并最好參與可早期發(fā)現(xiàn)癌癥的癌癥篩選計劃中。對于高?；颊?，如果35歲以后已完成分娩，可考慮采用預(yù)防性卵巢切除術(shù)。但，預(yù)防性卵巢切除術(shù)的優(yōu)勢尚未明確。在預(yù)防性卵巢切除術(shù)后，一小部分女性可發(fā)生原發(fā)性腹膜癌，其表現(xiàn)類似于卵巢癌(Xiao，C等人，2001)。上皮癌是卵巢癌最常見的類型?；|(zhì)和胚細(xì)胞腫瘤相對少見，有不超過10％的病例。
卵巢癌的播散通常通過局部脫落進腹腔內(nèi)，然后種植在腹膜上，以及通過局部侵襲腸和膀胱進行。這種腫瘤的高度致死性是由于患病女性早期缺乏征兆。據(jù)報道在首次手術(shù)中陽性淋巴結(jié)的發(fā)生率在I期患者中高達24％，II期患者為50％，III期患者為74％。腫瘤細(xì)胞也可能阻塞橫隔膜淋巴管。引起的腹膜淋巴引流障礙被認(rèn)為是卵巢癌腹水發(fā)生的原因之一。穿過橫隔膜播散至胸膜也是很常見的。
卵巢癌的預(yù)后受幾個因素的影響，但多變量分析表明最重要的有利因素包括較小的年紀(jì)、良好的表現(xiàn)狀態(tài)、細(xì)胞類型不是粘質(zhì)類和透明細(xì)胞、較低的分期、分化良好的腫瘤、在任何外科減積術(shù)之前較小的病灶體積、沒有腹水和在首次細(xì)胞減積手術(shù)后殘余較少的腫瘤。對于I期患者，最重要的預(yù)后因素是分級，然后是致密斑的附著和大量的腹水。DNA流式細(xì)胞儀分析I期和IIA期患者可鑒定出一組高危患者。組織學(xué)上有透明細(xì)胞的患者似乎具有較差的預(yù)后。明顯具有移行細(xì)胞癌成分的患者似乎有較好的預(yù)后。
盡管當(dāng)在診斷時測定的卵巢癌相關(guān)抗原CA 125與預(yù)后沒有顯著性，但當(dāng)III期或IV期患者在第三個周期化療后1個月測定時，它與生存率有很高的相關(guān)性(Rossmann，M.G.等人，2000)。對于化療使CA125升高的正?；颊?，以后CA125升高一次以上就是活動期疾病的高度預(yù)測指標(biāo)，但這還不能馬上進行治療。
大多數(shù)患者在就診時疾病已經(jīng)播散，因為卵巢癌一般在早期是無癥狀的。部分是由于這種原因，每年卵巢癌的死亡率大約是發(fā)生率的65％。即使使用以鉑類為基礎(chǔ)的組合治療，非最佳減積的III期和IV期患者長期隨訪顯示了不超過10％的5年生存率。然而，該疾病的早期患者仍有很高比例可治愈。
目前晚期卵巢癌的治療包括全腹子宮切除術(shù)，仔細(xì)探查漿膜表面，并嘗試除去所有病灶，通常緊接著進行包含鉑類似物的化療組合。存活率在6至40個月之間，長期存活率不超過10％。
已經(jīng)進行的研究，目標(biāo)是鑒定在良性和惡性腫瘤中表達不同的分子。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)卵巢癌可表達整合蛋白α2β1(Moser，T.L.等人，1996；Cannistra，S.A.等人，1995；Bartolazzi，A.等人，1993)。通過與1型膠原特異結(jié)合相互作用，α2β1可促進人卵巢上皮癌的轉(zhuǎn)移性播散(Schiro，J.A.等人，1991；Cardarelli，P.M.等人，1992)。以前在人胃癌上也觀察到整合蛋白α2β1表面表達的上調(diào)。
α2β1與1型膠原的相互作用可能在腹膜播種和轉(zhuǎn)移中具有重要地位，α2β1的過度表達已經(jīng)顯示可誘發(fā)非轉(zhuǎn)移性細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性(Chan，B.M，等人，1991)。阻斷α2β1已經(jīng)顯示出可極大的抑制1型膠原與卵巢癌的粘附。
已知能夠通過其復(fù)制過程誘發(fā)惡性細(xì)胞裂解的病毒是溶瘤病毒。大多數(shù)溶瘤病毒需要在相同的種屬或細(xì)胞系中增殖。病毒對細(xì)胞的感染包括與細(xì)胞的附著和并可引起攝取進細(xì)胞內(nèi)，這或與病毒衣殼的脫殼同時發(fā)生，隨后在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。
估計具有殺死癌細(xì)胞能力的溶瘤病毒包括腺病毒亞型Egypt 101病毒，其在Hela子宮/宮頸癌細(xì)胞系中顯示有溶瘤活性，治療胃癌、子宮癌和皮膚癌的腮腺炎病毒，新城雞瘟病毒(NDV)，治療卵巢癌的流感病毒，和治療宮頸癌的腺病毒(Nemunaitis J；1999)。
其他報道表明腺病毒和減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒重組體可用于治療惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤(例如，Andreansky S.S.，1996)，呼腸孤病毒具有活化的Ras信號通路，在人U87成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞和NIH-3T3細(xì)胞中顯示有裂解能力(例如，Strong J.E.等人，1998)。
牛痘溶瘤物也已經(jīng)被用于治療黑色素瘤(II期)患者的臨床實驗中(Nemunaitis J.，1999)。已經(jīng)報道改良的無神經(jīng)毒性的單純皰疹病毒(HSV)有希望治療包括顱內(nèi)黑素瘤和皮下人黑色素瘤的腦腫瘤(Randazzo B.R.，1997)，同時也有報道腺病毒感染可增強植物有絲分裂毒素(mitotoxin)肥皂草素對黑色素瘤細(xì)胞的殺傷力(Satyamoorthy K.，1997)。
腺病毒識別的靶細(xì)胞受體對于不同的腺病毒類型是不同的。也就是說，例如腺病毒亞群A、C、D、E和F可識別CAR受體，而腺病毒5型(亞組C)，腺病毒2型(亞組C)和腺病毒9型(亞組D)可分別識別主要組織相容性II類分子、αmβ2和αv整合蛋白。已知該CAR受體可在黑色素瘤細(xì)胞系中表達。
類肝素硫酸鹽可被單純皰疹1型和2型、人皰疹病毒7、腺相關(guān)病毒2型識別。人皰疹病毒7的受體是CD4，而Epstein-Barr病毒可識別補體受體Cr2(CD21)。1型和2型脊髓灰質(zhì)炎病毒可識別脊髓灰質(zhì)炎病毒受體(Pvr)以發(fā)生細(xì)胞粘附，而呼腸孤病毒可識別唾液酸。流感A和B病毒可識別唾液酸N-乙酰神經(jīng)氨酸發(fā)生細(xì)胞粘附。相反，C型流感病毒可識別唾液酸9-O-乙酰神經(jīng)氨酸。牛痘病毒可識別表皮細(xì)胞生長因子受體和類肝素硫酸鹽，柯薩奇病毒A13，A15，A18和A21可識別ICAM-1和補體調(diào)控蛋白DAF(CD55)(例如，見Shafren D.R.等人，1997)。世界專利申請No.PCT/AUOO/01461描述了將識別ICAM-1以感染細(xì)胞的柯薩奇病毒用于受試者，來裂解表達ICAM-1的黑色素瘤細(xì)胞。DAF也可被腸道病毒70識別(例如，見Flint SJ等人，(2000)Principle of Virology(病毒學(xué)原理)molecular biology(分子生物學(xué))，pathogenesis and control(發(fā)病機理和控制)。ASM Press，Washington)。
已經(jīng)報道了一個對卵巢細(xì)胞傳代培養(yǎng)的適應(yīng)性，以及它們用于檢測病毒的可能性進行了評估的研究(Harris，RE和Pindak，F(xiàn)F，1975)。在該研究中，培養(yǎng)的正常卵巢細(xì)胞用多種病毒進行激發(fā)，包括細(xì)小核糖核酸病毒，如柯薩奇病毒A、柯薩奇病毒B、脊髓灰質(zhì)炎病毒、艾柯病毒和心病毒及其血清型；副粘病毒如新城雞瘟病毒、麻疹病毒、瘟熱病毒；腺病毒人亞群血清型3、4、7和21；單純皰疹病毒，1型；外衣病毒如Sindbis和Mararo；呼腸孤血清型1至3；牛痘病毒。研究證明來自人卵巢的細(xì)胞可長期生長在細(xì)胞培養(yǎng)物中，并可傳代的次數(shù)無法確定，以便在體外繁殖多種病毒，推薦這種培養(yǎng)物用于研究病毒的發(fā)病機制和病毒感染的病理學(xué)。報道進一步說明一些病毒，如脊髓灰質(zhì)炎病毒和牛痘，這些已經(jīng)顯示可穿透人類胎盤并感染胎兒，對病毒與培養(yǎng)中的正常卵巢細(xì)胞之間的相互作用的研究可能是促進畸形發(fā)生研究的一種方法。
轉(zhuǎn)移性腫瘤的播散是與一系列粘附/去粘附事件相關(guān)，并與可調(diào)控的組織降解相關(guān)聯(lián)的病理過程。與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附和通過細(xì)胞外基質(zhì)的遷移對于腫瘤的侵襲是很重要的。盡管在惡性腫瘤治療中已經(jīng)取得了一些進展，但對于包括卵巢惡性腫瘤的癌癥的治療仍是對研究的一個主要挑戰(zhàn)，仍需要一些對現(xiàn)有治療方法的可替代手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及到一些觀察結(jié)果，即可使用能識別α2β1進行細(xì)胞感染的艾柯病毒來顯著殺傷異常細(xì)胞，如表達整合蛋白α2β1的癌細(xì)胞。
因此，在本發(fā)明的一個方面，提供了治療哺乳動物異常細(xì)胞的方法，包括使用有效量的病毒治療哺乳動物，該病毒選自艾柯病毒，其修飾形式及其組合，它們可識別α2β1進行細(xì)胞感染，這樣至少有一些細(xì)胞被病毒殺死。
識別α2β1的單個病毒血清型可用于哺乳動物或給予其識別α2β1的多個不同的艾柯病毒。
術(shù)語“異常細(xì)胞”在本發(fā)明中的含義是取其廣義，包括惡性細(xì)胞、任何異常生長的細(xì)胞和與表達正常表現(xiàn)型的相同類型的細(xì)胞相應(yīng)正常細(xì)胞相比任何具有整合蛋白α2β1異常表達上調(diào)的細(xì)胞，不管細(xì)胞是否是癌細(xì)胞以及細(xì)胞是否以異常速率增殖。因此，該術(shù)語包含腫瘤前期細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，以及最終可以或不進展成為癌細(xì)胞的細(xì)胞。例如異常生長可以是一種良性或惡性腫瘤。異常的細(xì)胞通常是惡性細(xì)胞。與發(fā)現(xiàn)異常細(xì)胞的周圍組織相比，一般異常細(xì)胞α2β1的表達上調(diào)。因此，該病毒一般將優(yōu)先感染異常細(xì)胞，因為接觸這些細(xì)胞上的α2β1的可能性更高。同樣，該病毒可用來有效地靶向異常細(xì)胞。
本發(fā)明的一種方法特別適合治療卵巢癌患者或原發(fā)卵巢腫瘤已經(jīng)轉(zhuǎn)移的癌癥。但本發(fā)明并不限于治療這些癌癥，本文所述的方法發(fā)現(xiàn)可應(yīng)用于治療其他癌癥包括黑色素瘤和前列腺腫瘤以及乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌以及已經(jīng)播散至機體其他部位的繼發(fā)癌癥。例如，該病毒可用于哺乳動物皮膚之外的機體部位中的黑色素瘤癌細(xì)胞。因此，本發(fā)明的方法延伸至治療一種惡性腫瘤，該惡性腫瘤已經(jīng)轉(zhuǎn)移至哺乳動物中通常與艾柯病毒的感染無關(guān)的的部位或組織。
該病毒一般作為活的完整病毒用于哺乳動物?？蛇x擇地是，例如使用編碼病毒基因組或足以產(chǎn)生病毒的核酸供細(xì)胞攝取，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活的完整病毒。該核酸包括單個RNA或DNA分子，或分別編碼不同的病毒蛋白的多個分子。
該病毒也可用來篩選異常細(xì)胞以明確，例如病毒是否適合用于治療該細(xì)胞取自的哺乳動物，或不包含該病毒的治療方案是否更有效。相反，不同的艾柯病毒和/或其修飾形式或其組合可采用從哺乳動物獲取的細(xì)胞樣本來篩選，以便選擇最合適治療哺乳動物的病毒。
因此，在本發(fā)明的另一個方面，提供了從哺乳動物篩選對誘發(fā)細(xì)胞死亡的病毒易感的異常細(xì)胞樣本的方法，以評價應(yīng)用病毒于哺乳動物，治療異常細(xì)胞的病毒，該方法包括以下步驟(a)提供哺乳動物異常細(xì)胞的樣本；(b)用病毒治療該細(xì)胞足夠的時間，使病毒感染細(xì)胞；并(c)確定該病毒是否已經(jīng)感染，并引起至少一些異常細(xì)胞死亡；其特征在于所述的病毒選自可識別α2β1以感染異常細(xì)胞的艾柯病毒，和其修飾形式及其組合。
也可通過檢測是否能夠被指定的病毒感染和殺死樣本中至少一些異常細(xì)胞，選擇出可用于本發(fā)明的方法中的病毒。特別是該檢測通過將每種病毒與異常細(xì)胞的樣本分別孵育，并測定病毒感染是否引起這種細(xì)胞死亡，涉及篩選大量不同的病毒。
因此，本發(fā)明的另一個方面，提供了篩選病毒感染和引起哺乳動物異常細(xì)胞死亡能力的方法，該方法用來評估應(yīng)用病毒于哺乳動物對異常細(xì)胞的治療作用，該方法包括以下步驟(a)選擇病毒；(b)用該病毒處理哺乳動物異常細(xì)胞樣本足夠的時間，使病毒感染細(xì)胞；并(c)測定該病毒是否已經(jīng)感染并引起至少一些異常細(xì)胞的死亡；其中所述可識別α2β1以感染異常細(xì)胞的病毒，選自艾柯病毒，其修飾形式及其組合。
該方法也包括以下的步驟，使用另一個細(xì)胞樣本，進行步驟(b)和(c)比較所選擇病毒和另一種可識別α2β1以感染細(xì)胞的艾柯病毒或其修飾形式感染并引起細(xì)胞死亡的能力。
細(xì)胞死亡一般是由病毒感染細(xì)胞引起的，其原因可能是因為病毒的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制造成的細(xì)胞裂解，或由感染引發(fā)的凋亡，這最有可能是由于細(xì)胞級聯(lián)反應(yīng)的活化。一旦被裂解，被感染細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)容物可能從被破壞的漿膜中漏出，釋放一些抗原，包括能夠誘發(fā)對異常細(xì)胞的免疫反應(yīng)的細(xì)胞表面抗原。因此根據(jù)本發(fā)明的方法對哺乳動物異常細(xì)胞的治療可提高哺乳動物對異常細(xì)胞的免疫力。
因此，在本發(fā)明的另一個方面，提供了在哺乳動物中誘發(fā)對表達α2β1的異常細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)的方法，該方法包括用病毒感染哺乳動物的異常細(xì)胞，該病毒選自可識別α2β1以感染異常細(xì)胞并至少引起一些細(xì)胞裂解的艾柯病毒，其修飾形式及其組合。
一般該病毒以藥物組合物的形式提供，用于本發(fā)明的方法中。同樣，在一個更深入的方面，提供了治療哺乳動物異常細(xì)胞的藥物組合物，其包括產(chǎn)生治療細(xì)胞的病毒的接種物，這樣至少有一些細(xì)胞被病毒以及藥學(xué)可接受載體一起殺死，其特征在于所述的病毒選自可識別α2β1以感染細(xì)胞的艾柯病毒，其修飾形式及其組合。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了在生產(chǎn)藥物的過程中使用接種物來產(chǎn)生病毒，這種藥物是用來和病毒一起治療哺乳動物異常細(xì)胞的，這樣至少一些異常細(xì)胞被殺死，其特征在于所述的病毒選自可識別α2β1以感染異常細(xì)胞的艾柯病毒，其修飾形式及其組合。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了在生產(chǎn)藥物的過程中，使用接種物產(chǎn)生病毒，這種藥物是用來誘發(fā)哺乳動物針對異常細(xì)胞的免疫反應(yīng)，其中病毒選自可識別α2β1以感染異常細(xì)胞并殺死細(xì)胞的艾柯病毒，其修飾形式及其組合。
根據(jù)本發(fā)明的方法應(yīng)用的艾柯病毒一般是選自艾柯病毒EV1、艾柯病毒EV8和艾柯病毒EV22的艾柯病毒。雖然該病毒通常是一種很常見的動物艾柯病毒，但本發(fā)明不限于此，可使用改造的能夠感染和殺死異常細(xì)胞的重組病毒，或例如已經(jīng)被修飾以增強其感染和殺死細(xì)胞能力的病毒。
相同的病毒可在不同的治療周期中用于哺乳動物。但優(yōu)選不同的病毒用于不同的治療周期，以避免或減輕針對前面使用的病毒的任何免疫反應(yīng)的潛在作用。例如病毒可局部、瘤內(nèi)或全身應(yīng)用于哺乳動物。
該哺乳動物可以是根據(jù)本發(fā)明，需要治療的任何哺乳動物。該哺乳動物典型地是人類。
本發(fā)明的方法可用作其他治療異常細(xì)胞的方法，如傳統(tǒng)癌癥治療的輔助方法，或作為缺少其他治療方法時的治療手段。特別是本發(fā)明的方法可應(yīng)用在傳統(tǒng)治療不適合或不實用的情況下，或是患者因為可能引起疤痕或畸形，特別是在患者的面部如鼻或唇，不接受異常細(xì)胞切除術(shù)的情況。該病毒可在異常細(xì)胞切除術(shù)之前和/或之后應(yīng)用。切除術(shù)后的應(yīng)用可殺死在周圍組織中殘余的異常細(xì)胞。
因此，本發(fā)明的一個或多個實施方案提供了可替代的治療方法，在早期和晚期惡性腫瘤的診斷之后均可應(yīng)用，并進一步發(fā)現(xiàn)可用于殺死手術(shù)之前和之后殘余的異常細(xì)胞。使用本文所述的方案，普通技術(shù)人員能夠很容易地選擇一種合適的病毒用于本發(fā)明的方法中，并確定何種異常細(xì)胞對感染易感，并引起細(xì)胞的死亡。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種涂藥器，其可將接種物應(yīng)用于哺乳動物，以產(chǎn)生病毒治療哺乳動物中的異常細(xì)胞，其特征在于所述的涂藥器包含一個注入了接種物的區(qū)域，這樣接種物可與哺乳動物接觸，該病毒選自可識別α2β1以感染細(xì)胞的艾柯病毒，其修飾形式及其組合。
在本說明書中，“comprise(包含)”或其變化形式如“comprises(包含)”或“comprising(包含)”，將被理解為包含一個已述的要素、整體或步驟，或一組要素、整體或步驟，但不排除任何其他要素、整體或步驟，或一組要素、整體或步驟。
在本說明書中提及的所有出版物在此合并為參考文獻。已經(jīng)包含在本說明書中的文檔、法規(guī)、材料、裝置、文章等的任何論述的目的僅是為了說明本發(fā)明。不能被認(rèn)為任何或全部這些材料組成了以往本領(lǐng)域基礎(chǔ)理論的一部分，或是與本發(fā)明相關(guān)的領(lǐng)域中的一般公共常識，因為在本申請的每個權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日之前它已經(jīng)普遍存在。
本發(fā)明的特征和優(yōu)勢將更清晰的表現(xiàn)在下面對本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的描述中。
附圖簡要說明

圖1顯示了乳腺癌細(xì)胞表面上表面表達的ICAM-1、CAR、DAF和α2β1水平的流式細(xì)胞儀分析。該乳腺癌細(xì)胞與交聯(lián)R-藻紅蛋白的羊抗鼠免疫球蛋白F(ab′)2片段孵育，這是在存在或缺少這些受體的相應(yīng)特異單克隆抗體的情況下。從腸道病毒受體樣本的幾何平均數(shù)中減去交聯(lián)樣本的幾何平均數(shù)，代表受體表達的相對水平。
圖2顯示了腸道病毒CAV21、CVB3、EV1、EV7和PV1對乳腺癌細(xì)胞的裂解性感染。計算50％的終點滴定度，如果TCID50/ml終點為104或更高，則認(rèn)為溶瘤作用很顯著。
圖3顯示了結(jié)直腸癌細(xì)胞表面上ICAM-1、CAR、DAF和α2β1表面表達水平的流式細(xì)胞儀分析。結(jié)腸癌細(xì)胞與交聯(lián)R-藻紅蛋白的羊抗鼠免疫球蛋白的F(ab′)2片段孵育，這是在存在或缺少這些受體的相應(yīng)特異單克隆抗體的情況下。從腸道病毒受體樣本的幾何平均數(shù)中減去交聯(lián)樣本的幾何平均數(shù)，代表受體表達的相對水平。
圖4顯示了腸道病毒CAV21、CVB3、EV1、EV7和PV1對結(jié)直腸癌細(xì)胞的裂解性感染。計算50％的終點滴定度，如果TCID50/ml終點為104或更高，則認(rèn)為溶瘤作用很明顯。
圖5顯示了前列腺或胰腺癌細(xì)胞表面上ICAM-1、CAR、DAF和α2β1表面表達水平的流式細(xì)胞儀分析。前列腺或胰腺癌細(xì)胞與交聯(lián)R-藻紅蛋白的羊抗鼠免疫球蛋白的F(ab′)2片段孵育，這是在存在或缺少這些受體的相應(yīng)特異單克隆抗體的情況下。從腸道病毒受體樣本的幾何平均數(shù)中減去交聯(lián)樣本的幾何平均數(shù)，代表受體表達的相對水平。
圖6顯示了腸道病毒CAV21、CVB3、EV1、EV7和PV1對前列腺或胰腺癌細(xì)胞的裂解性感染。計算50％的終點滴定度，如果TCID50/ml終點為104或更高，則認(rèn)為溶瘤作用很明顯。
圖7顯示了卵巢癌細(xì)胞表面上ICAM-1、CAR、DAF和α2β1表面表達水平的流式細(xì)胞儀分析。前列腺或胰腺癌細(xì)胞與交聯(lián)R-藻紅蛋白的羊抗鼠免疫球蛋白的F(ab′)2片段孵育，這是在存在或缺少這些受體的相應(yīng)特異單克隆抗體的情況下。從腸道病毒受體樣本的幾何平均數(shù)中減去交聯(lián)樣本的幾何平均數(shù)，代表受體表達的相對水平。
圖8顯示了腸道病毒CAV21、CVB3、EV1、EV7和PV1對卵巢癌細(xì)胞的裂解性感染。計算50％的終點滴定度，如果TCID50/ml終點為104或更高，則認(rèn)為溶瘤作用很明顯。
圖9A顯示了用10-1稀釋度的EV1感染單層卵巢癌細(xì)胞72小時的顯微照相圖片。在重復(fù)進行該病毒輸入的情況下，除了細(xì)胞系A(chǔ)2780以外的所有細(xì)胞系顯示EV1(右側(cè))有顯著的溶瘤作用水平。
圖9B顯示了用10-1稀釋度的EV1感染單層卵巢癌細(xì)胞72小時的顯微照相圖片。在重復(fù)使用多種病毒的情況下，除了細(xì)胞系SKOV-3以外的所有細(xì)胞系顯示EV1(右側(cè))有顯著的溶瘤作用水平。
圖10顯示了EV1對卵巢癌細(xì)胞的裂解性感染。10個細(xì)胞系中的7個被認(rèn)為對EV1的溶瘤作用易感。如果病毒滴定度(TCID50/ml)計算為104或更高，溶瘤作用被認(rèn)為是顯著的。
圖11顯示了存在抗α2β1時EV1結(jié)合作用被抑制。存在和缺少抗α2β1或抗DAF MAb時，[35S]-蛋氨酸標(biāo)記的EV1與卵巢癌細(xì)胞系的結(jié)合作用。通過1450Microbeta TRILUX(Wallac，F(xiàn)inland)液體閃爍計數(shù)測定結(jié)合的[35S]-蛋氨酸標(biāo)記病毒的水平。
圖12顯示了EV1在存在或缺少抗α2β1MAb時，EV1對卵巢癌細(xì)胞系OWA-42和IGROV-1的裂解性感染。感染后72小時，用抗α2β1MAb預(yù)孵育的細(xì)胞仍然是完全被保護的。通過用結(jié)晶紫甲醇溶液染色來測定細(xì)胞存活率。
圖13顯示了在存在或缺少抗α2β1MAb時，EV1對單層OWA-42卵巢癌細(xì)胞的裂解性感染。在感染后24、48和72小時拍攝的顯微照相圖片，證明由于單克隆抗體阻斷α2β1受體，細(xì)胞完全不受EV1感染。
圖14顯示了DOV13卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)在環(huán)形插入物內(nèi)，HeLa細(xì)胞(人成纖維細(xì)胞)培養(yǎng)在外環(huán)。用EV1感染后，活細(xì)胞用結(jié)晶紫甲醇溶液染色。EV1特異性感染卵巢癌細(xì)胞，而HeLa細(xì)胞仍然是健康的。
圖15顯示了黑色素瘤細(xì)胞系SkMel28上表面表達的α2β1水平的流式細(xì)胞儀分析。在存在或缺少抗α2β1的情況下，SkMel28細(xì)胞與R-藻紅蛋白交聯(lián)的羊抗鼠免疫球蛋白F(ab′)2片段孵育。從樣本的幾何平均數(shù)中減去交聯(lián)樣本的幾何平均數(shù)，確定差值，由此確定受體的表達。由于幾何平均數(shù)有差值，證明有顯著的α2β1表達。
圖16顯示了在存在和缺少抗α2β1或抗DAF MAb的情況下[35S]-蛋氨酸標(biāo)記的EV1與SkMel28黑色素瘤細(xì)胞的結(jié)合作用。在1450Microbeta TRILUX(Wallac，F(xiàn)inland)上通過液體閃爍計數(shù)測定已經(jīng)結(jié)合的[35S]-蛋氨酸標(biāo)記病毒的水平。α2β1的阻斷可引起顯著的EV1結(jié)合抑制。結(jié)果表示為三個樣本的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。
圖17顯示了EV1對SkMel28黑色素瘤細(xì)胞的裂解性感染。通過結(jié)晶紫甲醇溶液測定細(xì)胞存活率。觀察到有顯著的裂解作用。
圖18是顯示用EV1處理卵巢癌多細(xì)胞球狀體的顯微照相圖片。
圖19A顯示通過在腹膜內(nèi)(i.p.)途徑用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、UV-滅活艾柯病毒EV1或感染性EV1(105TCID50)腹膜內(nèi)注射前3周給予1.0×106OVHS-1細(xì)胞的SCID小鼠體重變化的直方圖。
圖19B顯示了與用OVHS-1細(xì)胞注射和用PBS，UV-滅活EV1或EV1處理的小鼠相比，正常對照SCID小鼠注射后5周時拍攝的照片。注意在給予PBS或UV-滅活EV1的荷瘤小鼠中腹水的發(fā)生。
優(yōu)選實施方案為了確定一種病毒是否能夠感染并引起腫瘤細(xì)胞的死亡，從腫瘤取活檢，使用常規(guī)的技術(shù)制備細(xì)胞制劑，然后(i)證實病毒受體細(xì)胞的表面表達和(ii)用病毒激發(fā)細(xì)胞，監(jiān)測在預(yù)先確定的孵育時間內(nèi)的細(xì)胞感染和細(xì)胞死亡，雖然根據(jù)使用的病毒，這個孵育時間可發(fā)生變化，但一般大約為2天。α2β1的表達很容易通過流式細(xì)胞分析來證實。大量病毒可以此方式篩選，同時，使用不同的等體積已制備的惡性細(xì)胞，選擇顯示有較高程度感染性和細(xì)胞死亡的病毒給予取活檢的受試者。同樣，從不同來源獲取的活檢中獲得的不同的惡性細(xì)胞制劑可用于使用具體病毒的測定中。該活檢可從單個個體或大量個體的不同部位獲取。
期望在本文所述的方法中使用的病毒僅引起接受者很少或輕微的臨床癥狀。這種病毒很容易從普通技術(shù)人員所熟知的商業(yè)渠道獲得，可用上面所述的方式，用該方法篩選其有效性。通常期望病毒是選自艾柯病毒EV1、艾柯病毒EV7、艾柯病毒EV8和艾柯病毒EV22的艾柯病毒。這些病毒的每一種都識別α2β1以感染細(xì)胞。例如EV1與輕度上呼吸道疾病和胸膜痛有關(guān)(Fields B.N.等人，2000；McCracken A.W.等人，1969)。
相信α2β1的表達在卵巢癌上是上調(diào)的，其原因是在間皮中遇到的基質(zhì)主要是I型膠原。大量的惡性黑色素瘤也已經(jīng)顯示α2β1的表達水平是上調(diào)的(Kramer R.H.和Marks N，1989；Ramos D.M.等人，1990)。使用α2β1亞單位結(jié)構(gòu)區(qū)I中的不同殘基，EV1和膠原附著于α2β1(Bergelson J.H.，1993)。整合蛋白α2β1不能同時接納EV1和膠原。但該病毒與α2β1的結(jié)合與I型膠原相比親和性增加10倍(Xing L，2002)。
為了篩選指定的病毒以明確它是否能夠感染和引起惡性細(xì)胞的死亡，可使用惡性細(xì)胞系而不是從活檢中分離的原代惡性細(xì)胞。
已選擇的病毒將優(yōu)選直接注射至惡性腫瘤的多個部位上，以便將該病毒可能感染腫瘤的區(qū)域最大化。除了完整的病毒，摻入了核酸可產(chǎn)生病毒的病毒，或其他質(zhì)粒，或表達載體可被注射進腫瘤中，以被腫瘤細(xì)胞攝取，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生完整的病毒，使治療發(fā)揮作用。合適的表達載體包括能夠表達編碼產(chǎn)生病毒所需的病毒蛋白的DNA(例如，基因組DNA或cDNA)插入物的質(zhì)粒。表達載體通常包括與被插入的核酸可操作連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列?！翱刹僮鬟B接”的含義是核酸插入物與轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列連接，使被插入序列轉(zhuǎn)錄，而不需要進入插入物的可讀框內(nèi)。這種轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列包括促進RNA聚合酶的結(jié)合以起始轉(zhuǎn)錄的啟動作用，以及使核糖體與已轉(zhuǎn)錄的mRNA結(jié)合的表達控制元件。
更特別的是，在本文使用的術(shù)語“調(diào)控序列”包含參與驅(qū)動轉(zhuǎn)錄和控制(即，調(diào)節(jié))指定DNA序列轉(zhuǎn)錄水平的任何DNA。例如，5′調(diào)控序列是位于編碼序列上游的DNA序列，其包含啟動子和5’未翻譯的引導(dǎo)序列。3′調(diào)控序列是位于編碼序列下游的DNA序列，包含合適的轉(zhuǎn)錄終止(和/或)調(diào)節(jié)信號，包括一個或多個聚腺苷酸化信號。如本文所使用，術(shù)語“啟動子”包括在轉(zhuǎn)錄起始過程中被DNA依賴性ENA聚合酶識別并結(jié)合(直接或間接)的任何DNA序列。啟動子包括轉(zhuǎn)錄起始位點，和轉(zhuǎn)錄起始因子和RNA聚合酶的結(jié)合位點，并能夠包含其他的多種位點或序列(例如，增強子)，基因表達調(diào)控蛋白可與其結(jié)合。
適合轉(zhuǎn)染哺乳細(xì)胞的大量表達載體在本領(lǐng)域中是已知的。適合轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞的表達載體包括pSV2neo、pEF-PGkpuro、pTk2和非復(fù)制性腺病毒穿梭載體，其摻入了聚腺苷酸化位點和延伸因子1-x啟動子和pAdEasy為基礎(chǔ)的表達載體大多數(shù)優(yōu)選摻入了巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子(例如，見He等人，1998)。也可應(yīng)用將多肽延伸因子-α2作為啟動子的質(zhì)粒pEFBOS。
通過逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組或其片段制備編碼產(chǎn)生病毒所必需的病毒蛋白的cDNA，使用本領(lǐng)域中熟知的重組技術(shù)摻入進合適的載體中，例如在Sambrook等人(1989)，分子克隆實驗室手冊，第二版，Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York，和Aueubel等人，(1994)，現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，USA，第1和2卷中所述的技術(shù)。
除了cDNA，可用從純化的病毒體中提取的病毒RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，或例如在體外使用噬菌體T7RNA聚合酶從xDNA模板中產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄物，后者如Ansardi，D.C.等人，2001中所述。同樣，單個質(zhì)?；騌NA分子可用來表達病毒蛋白和產(chǎn)生病毒，或多個質(zhì)?；蚓幋a不同病毒蛋白的RNA分子被用來轉(zhuǎn)染細(xì)胞和產(chǎn)生病毒。
在缺少促進細(xì)胞轉(zhuǎn)染的載體運載體的情況下，或與這種運載體聯(lián)合應(yīng)用，質(zhì)?；騌NA可直接用于腫瘤或其局部，或通過注射被腫瘤細(xì)胞攝取。合適的載體運載體包括脂質(zhì)體，其一般是以本領(lǐng)域中通常已知的水包油乳劑形式提供。脂質(zhì)體通常包含脂類的組合，特別是磷脂，如高相變溫度的磷脂，其通常具有一個或多個類固醇或類固醇前體如膽固醇，可為脂質(zhì)體提供膜穩(wěn)定性?？捎糜谔峁┲|(zhì)體的脂類例子包括磷脂酰化合物如磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、鞘脂、磷脂酰乙醇胺、腦苷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂。二酰基磷脂酰甘油酯特別合適，其脂類部分含有14至18個碳原子，更優(yōu)選16至18個碳原子，并是飽和的。
脂質(zhì)體與靶細(xì)胞的相互作用是被動或主動的。主動的靶向作用涉及脂質(zhì)體的修飾作用，其通過將該配體可結(jié)合的特異的配體摻入進脂質(zhì)體膜，或與靶細(xì)胞表達的相應(yīng)配體相互作用。這種配體包括，例如單克隆抗體或其結(jié)合片段(例如，F(xiàn)ab或F(ab′)2)，糖或糖脂部分，或病毒蛋白。病毒蛋白或α2β1的特異單克隆抗體是特別優(yōu)選的。
正常情況下，只要組織中有惡性細(xì)胞存在的可能性，腫瘤周圍的組織就也可被注射或用該病毒處理。如果該腫瘤直至相對晚期才被發(fā)現(xiàn)，在手術(shù)切除腫瘤后，周圍組織可用該病毒注射。
除了被直接注射進惡性腫瘤中，該接種物可被全身給藥，在腫瘤部位鄰近的位置通過靜脈注射至接受者的血流中以輸送至腫瘤。同樣，該接種物可被皮下或腹膜內(nèi)給藥，或例如，如果認(rèn)為合適可肌肉內(nèi)給藥。但一般當(dāng)使用完整的病毒時，只要有存在病毒特異抗體的可能，就優(yōu)選直接將病毒注射進腫瘤中，該抗體有可能降低各種可交替使用的病毒輸送方式的效率。
接種物也可單獨或與將接種物直接注射入腫瘤聯(lián)合使用局部應(yīng)用于腫瘤。局部治療可通過逐滴應(yīng)用藥物組合物來完成，該組合物含有接種物和合適的藥學(xué)可接受載體，以保持接種物的完整性以便感染惡性細(xì)胞，或使用一種充滿了這種組合物的涂藥器涂抹腫瘤。該涂藥器可含有一團或一塊浸過組合物的合適材料的填充物。在治療皮膚上的黑色素瘤時，使用充滿接種物的涂藥器來應(yīng)用接種物，該涂藥器置于被治療的惡性腫瘤部位，這樣接種物能與皮膚接觸。在這種情況下，涂藥器含有一種貼片或一團填充物等，其中充滿了接種物，可進一步提供粘合表面或多種表面，如附著于黑色素瘤周圍的皮膚上的粘的膏藥，這樣可使接種物保持與黑色素瘤的接觸。一般可給予哺乳動物完整的病毒以發(fā)揮治療效應(yīng)。
通常可在惡性腫瘤上和/或周圍組織上作一個或多個小的切口，為病毒進入其中提供入口。
對于卵巢癌，或卵巢附近的癌癥，艾柯病毒可使用導(dǎo)管或其他合適的給藥裝置，通過將導(dǎo)管或選擇的裝置沿輸卵管插入，直接輸送至卵巢或受累部位。
在靶細(xì)胞內(nèi)使用病毒和/或核酸或含有能產(chǎn)生病毒的病毒核酸的質(zhì)粒來接種受者所使用的藥學(xué)可接受載體可以是液體，如生理鹽水，或被認(rèn)為適合的任何其他傳統(tǒng)已知的生理可接受的介質(zhì)，如市售的適合作為藥物應(yīng)用，并可將接種物施于治療部位的各種凝膠。該載體一般可被緩沖至生理pH，并可含有合適的防腐劑和/或抗生素。
該接種物一般含有大約1×102至大約1×1010空斑形成單位/ml接種物。優(yōu)選，該接種物含有大約超過1×105空斑形成單位/ml接種物。主治醫(yī)生或外科醫(yī)生可根據(jù)公認(rèn)的醫(yī)學(xué)實踐經(jīng)驗，結(jié)合患者的一般情況，分期和惡性腫瘤的位置以及用病毒治療區(qū)域的全部大小和分布，很容易地確定給于患者的接種物的量。一般患者用初始劑量的病毒治療，隨后在決定進一步給予病毒之前，監(jiān)測適當(dāng)?shù)臅r間周期，確定一些不明確的因素如患者初始病毒給藥時的反應(yīng)，以及初始治療產(chǎn)生的病毒感染的程度和惡性細(xì)胞死亡的程度。
期望個體用該病毒以預(yù)先確定的間隔治療一定的時間。如為適合每種情況所確定的那樣，間隔時間可以是每天，或從24小時至72小時或更大的范圍。每次可使用不同的病毒以避免或盡量減小對前面應(yīng)用的病毒的任何免疫反應(yīng)，治療周期可延伸至一至兩周或更多，可由主治醫(yī)生來確定。更優(yōu)選，可應(yīng)用哺乳動物以前未接觸過的或可通過標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)確定的哺乳動物可產(chǎn)生相對小的免疫反應(yīng)的病毒。
雖然很容易獲得的已知艾柯病毒適合用于本發(fā)明的方法中，但也可應(yīng)用修飾的病毒或使用常規(guī)技術(shù)改造的病毒。例如，該病毒可被修飾為使用其他的細(xì)胞粘附分子作為細(xì)胞受體。作為例子，病毒可使用位點定向誘變來修飾，這樣在該病毒衣殼表面上表達肽基序″RGD″。RGD基序可被αv整合蛋白雜二聚體識別，這種衣殼修飾例如可使病毒與整合蛋白α2β1結(jié)合，后者是一種已經(jīng)顯示在黑色素瘤病灶上表達上調(diào)的細(xì)胞粘附分子(Natalia P.G；1997)因為具有α2β1，可能引起靶細(xì)胞對病毒的攝取增強。
為了更清楚的了解本發(fā)明的特征，其優(yōu)選的形式是以下列非限制性例子作為參考來描述。
實施例1材料和方法1.1.細(xì)胞系IGROV-1、A2780、DU145、PC3、AsPC-1、PANC-1、T47-D、MDA-MB361、MDA-MB453、MDA-MB231和MCF-7癌細(xì)胞系從澳大利亞，新南威爾士，悉尼，Garvan Institute獲得。BT-20、MDA-MB157、SK-BR-3、ZR-75-1、HCT116、LIM2537、SW480、SW620、2008、JAM、OVCA-429、OVCAR-3、OVHS-1、OWA-42、SKOV-3和DOV13癌細(xì)胞系從澳大利亞，維多利亞，墨爾本，Peter MacCullum CancerInstitute獲得。SkMel28細(xì)胞從澳大利亞，維多利亞，Monash大學(xué)，生物化學(xué)和分子生物學(xué)系，Ralph博士處獲得。HeLa細(xì)胞從澳大利亞，維多利亞，墨爾本，F(xiàn)airfield醫(yī)院，Margery Kennett，Entero-respiratoryLaboratory獲得。除了BT-20細(xì)胞在α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)以外，所有的細(xì)胞可在標(biāo)準(zhǔn)條件下(37℃，5％CO2大氣條件)在含有2-5％胎牛血清(FCS)和抗生素的RPMI中培養(yǎng)。所有使用的細(xì)胞通過ELISA常規(guī)檢查衣原體的存在(Roche Molecular Systems，CA，USA)。
1.2.病毒柯薩奇病毒A21(CAV21)原型菌株Kuykendall；柯薩奇病毒B3(CVB3)原型菌株Nancy；艾柯病毒(EV1)原型菌株Farouk；艾柯病毒(EV7)原型菌株Wallace；和脊髓灰質(zhì)炎病毒1(PV1)原型菌株Mahoney從澳大利亞，維多利亞，墨爾本，F(xiàn)airfield醫(yī)院，EnterorespiratoryLaboratory的Margery Kennett.博士處獲得。所有病毒在HeLa細(xì)胞中繁殖并進行滴定。
1.3單克隆抗體(MAb)抗-DAF MAb VIIIA7，可識別DAF的第三個SCR，從日本，大阪，大阪大學(xué)，T.Kinoshita博士處獲得，抗DAF mAb IH4由澳大利亞，維多利亞，海德爾堡，Austin研究協(xié)會，Bruce Loveland博士惠贈?？?CARMAb RmcB從馬薩諸塞州，波士頓，Dana Farber癌癥協(xié)會的J.M.Bergelson博士處獲得。抗-β2-微球蛋白MAb 918從英格蘭，赫特福德郡，NIBSC，P.Minor博士處獲得?？?α2β1MAb AK7可識別α2亞單位，對照抗-GPIV(血小板膜糖蛋白)抗體MAb PTA-1從澳大利亞，NSW，紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)，醫(yī)學(xué)生物化學(xué)和癌癥研究系的Gordon Burns教授處獲得?？?ICAM-1MAb IH4從澳大利亞，昆士蘭，昆士蘭醫(yī)學(xué)研究協(xié)會的Andrew Boyd教授處獲得。
1.4.流式細(xì)胞儀分析癌細(xì)胞上腸道病毒受體的表面表達通過流式細(xì)胞儀分析。被分散的細(xì)胞(1×106)在冰上用合適的MAb(5μg/ml，用PBS稀釋)孵育20分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞，離心沉淀，然后重新懸浮在100μl 1∶50稀釋的R-藻紅蛋白交聯(lián)的羊抗鼠免疫球蛋白的F(ab′)2片段(Dako，A/S，Denmark)中。在進行流式細(xì)胞儀分析之前細(xì)胞再次在冰上孵育20分鐘，洗滌，沉淀，重新懸浮在PBS中。使用FACStar分析儀(Becton Dickenson，Sydney，Australia)分析細(xì)胞表面受體的表達。
1.5.病毒感染性測定癌細(xì)胞系的匯合單層用10倍系列稀釋(100μl/孔，三份或四份)的CAV21、CVB3、EV1、EV7或PV1接種在含有1％胎牛血清(FCS)的DMEM中，并在37℃，5％CO2環(huán)境中孵育72小時。為了測定細(xì)胞的生存率，培養(yǎng)板用100μl/孔的結(jié)晶紫甲醇溶液(0.1％結(jié)晶紫，20％甲醇，20％甲醛，磷酸鹽緩沖鹽水(PBS))孵育24小時，并在蒸餾水中洗滌。
有限稀釋測定的終點是影響50％檢測單位的病毒稀釋度。使用Reed和Muench法(參考文獻)來應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)步驟計算終點。終點表示每毫升50％組織培養(yǎng)物的感染劑量(TCID50/ml)。
當(dāng)需要用抗受體的單克隆抗體預(yù)處理細(xì)胞單層時，細(xì)胞用100μl抗-α2β1AK7MAb(20μg/ml，在PBS稀釋)37℃孵育1小時。然后細(xì)胞單層接種在合適病毒稀釋度的兩份樣品中，并在上述染色前在37℃5％CO2環(huán)境中孵育72小時。
使用倒置顯微鏡(Olympus IX-FLA)以100X放大倍數(shù)在24、48或72小時拍攝顯微照相圖片。
1.6病毒純化含有DOV13細(xì)胞匯合單層的6孔組織培養(yǎng)板接種500μl EV1(感染復(fù)數(shù)[moi]＝105TCID50/ml)37℃，1小時。用無蛋氨酸/半胱氨酸DMEM(ICN Biomedical，Ohio，USA)洗滌三次去除未結(jié)合的病毒，在加入300μCi[35S]-蛋氨酸反向標(biāo)記(ICN Biomedical，Ohio，USA)之前，細(xì)胞單層繼續(xù)在1.3ml這種培養(yǎng)基中37℃孵育2小時。被感染的單層在37℃，5％CO2的環(huán)境中孵育過夜。三次冷凍/復(fù)溫循環(huán)后，病毒裂解產(chǎn)物在5-30％蔗糖梯度中純化，在Beckman XL-90超速離心機(SW4ltiRotor)速度離心36,000rpm，離心95分鐘。從每個試管的底部收集組分，通過液體閃爍計數(shù)監(jiān)測(Wallac 1450 Microbeta TRILUX，F(xiàn)inland)，對在病毒結(jié)合測定定位使用的160S病毒峰。
未放射性標(biāo)記的EV1病毒體用集中的峰值感染組分以類似的梯度進行純化，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)透析。紫外線(UV)滅活EV1的產(chǎn)生是通過在6孔板中將1.0ml PBS液中純化的EV1/孔(5×105TCID50)在15瓦UV光下照射30秒。通過微滴定板裂解性感染性細(xì)胞測定計算病毒的滅活。
1.7.放射性標(biāo)記病毒結(jié)合測定重新懸浮在800μl含有1％牛血清白蛋白(BSA)的RPMI中的大約1×106細(xì)胞在20μg/ml MAb(抗-α2β1或抗-DAF，在PBS中稀釋)存在下，4℃孵育1小時，然后加入300μl(1×106)[35S]-蛋氨酸標(biāo)記的160SEV1。4℃孵育2小時后，細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基洗滌4次，在三個樣品通過液體閃爍計數(shù)測定結(jié)合的[35S]蛋氨酸標(biāo)記病毒的水平之前，細(xì)胞團裂解在200μl 0.2M NaOH-1％SDS中。(Wallac 1450 Microbeta TRILUXFinland)。結(jié)果表示為均數(shù)±SE。
1.10十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)[35S]-蛋氨酸標(biāo)記的病毒組分通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析(PAGE)，并通過放射自顯影來顯影。[35S]-蛋氨酸標(biāo)記的160S EV1組分用樣品還原緩沖液(250mM TRIS，0.2g w/v SDS，20％v/v甘油，10％v/v2-巰基乙醇和0.01％w/v溴酚藍(lán)，pH6.8)95℃孵育10分鐘，使病毒體變性。然后變性的160S病毒峰組分在15％Tris-HCl預(yù)制膠(BIORADReady-Gel，CA，USA)結(jié)合Benchmark預(yù)先染色的中等蛋白梯度(GIBCO，USA)上以180V分離45分鐘。接觸96小時后在Hyperfilm MP(Amersham International，England)上通過放射自顯影顯示主要結(jié)構(gòu)蛋白和分析病毒純度。
1.11細(xì)胞的細(xì)胞毒性測定人外周血淋巴細(xì)胞OVHS-1和DOV-13細(xì)胞的細(xì)胞懸液用EV1(moi＝1.0TCID50/細(xì)胞)激發(fā)，37℃孵育24小時。細(xì)胞裂解產(chǎn)物的水平可計算為LDH(一種在細(xì)胞裂解過程中釋放的穩(wěn)定的胞漿酶)釋放的函數(shù)，使用Cyto-Tox 96試劑盒(Promega Corp.Maddison，WI.USA)按照生產(chǎn)廠商的說明書進行評價。
1.12球狀體的培養(yǎng)和球狀體感染性的測定DOV-13細(xì)胞以每孔500或5000個細(xì)胞植入24孔板，1ml含有5％FCS的RPMI1640中接種至半固體的0.5％瓊脂糖層上。在加入EV1(105TCID50)之前細(xì)胞在5％CO2氣體中在37℃孵育48小時，使球狀體形成。
1.13 SCID小鼠腹膜內(nèi)腫瘤異種移植模型6至8周齡的雄性BALB/c SCID小鼠根據(jù)紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)實驗動物管理和倫理委員會所批準(zhǔn)的方案在無菌條件下圈養(yǎng)。OVHS-1細(xì)胞用0.05％胰蛋白酶收獲，重新懸浮在含有10％FCS的RPMI中，離心沉淀。在小鼠用200μL含有1×106細(xì)胞的溶液腹腔內(nèi)注射(i.p.)之前，洗滌細(xì)胞，并重新懸浮在PBS中。14天后，小鼠分為三組(n＝5)，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，或105TCID50的UV滅活EV1或感染性EV1處理。以每周為基準(zhǔn)對動物進行稱重，當(dāng)腫瘤超過其體重20％時處死。處理小鼠的體重與未荷瘤的健康BALB/c SCID小鼠的體重進行比較。
1.14通過實時PCR測定病毒血癥來自感染小鼠的血清采用實時定量RT-PCR分析病毒血癥。簡言之，使用QIAamp病毒RNA mini試劑盒(Qiagen，Clifton Hill，維多利亞，澳大利亞)從10μl血清中提取病毒RNA，并根據(jù)生產(chǎn)廠商的說明書洗脫為40μl終體積。使用Primer ExpressTM1.5軟件(AppliedBiosyatems，F(xiàn)oster City，CA，USA)并基于以前公布的EV1序列(Genbank登記號AF029859)設(shè)計測定EV1病毒RNA水平的引物和探針，；正向引物(5′-CAAGACAGGGACCAAAGAGGAT-3′)，反向引物(5′-CCACTCGCCTGGTTGTAATCA-3′)，以及6-FAM標(biāo)記的MGB-探針(5′-CCAATAGCTTCAACAATT-3′)。使用Platinum定量RT-PCRThermoScriptTM一步系統(tǒng)在ABI7000序列檢測儀上進行一步RT-PCR。為了產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，EV1病毒儲存液(1×106TCID50/ml)的10倍稀釋液用最佳濃度的引物和探針進行擴增。在25μl的體積中，反應(yīng)混合物包括1×ThermoScriptTM反應(yīng)混合物，500nM正向引物，900nM反向引物，250nM探針，500nM ROX，0.5μl ThermoScriptTMPlus/PlatinumTag Mix和5μl提取的RNA。熱循環(huán)條件為60℃30分鐘，然后95℃5分鐘，然后在95℃15秒和60℃1分鐘進行40個循環(huán)。
實施例2病毒介導(dǎo)的對癌細(xì)胞系的溶瘤作用2.1乳腺癌細(xì)胞表面上腸道病毒受體的表達為了確定腸道病毒所使用的被選腸道病毒細(xì)胞表面受體的相對表達水平，進行流式細(xì)胞分析。被選的受體包括CAV21使用的ICAM-1；被EV7，CAV21，CVB3使用的DAF；CVB3使用的CAR；以及EV1使用的整合蛋白α2β1。由于沒有針對PVR受體的Mab，因此沒有檢測到PVR的表達水平。
分析9個乳腺癌細(xì)胞系，包括BT-29、MCF-7、MDA-MB157、MDA-MB231、MDA-MB361、MDA-MB453、SK-BR-3、T47-D和ZR-75-1。這些細(xì)胞系與抗-ICAM-1(IH4)、抗-CAR(RmcB)、抗-DAF(VIIIA7)或抗-α2β1(AK7)共同孵育。
這9個細(xì)胞系中的6個，ICAM-1的表達是顯著的，而在所有細(xì)胞系中DAF似乎表達的水平相對較低。這9個細(xì)胞系中的7個，很明顯存在中等水平的CAR表達，而在8個乳腺癌細(xì)胞的表面上α2β1的表達最低(圖1)。
2.2.被選腸道病毒對乳腺癌細(xì)胞的溶瘤作用對所有9個乳腺癌細(xì)胞系進行裂解性感染測定，以確定它們對被選的腸道病毒CAV21、CAB3、EV1、EV7和PV1的易感性(圖2)。如果在50％終點/ml(TCID50/ml)組織培養(yǎng)的感染劑量計算為104或更高，則認(rèn)為細(xì)胞系高度易感。在9個乳腺癌細(xì)胞系中的6個中CAV21和CVB3可誘發(fā)顯著的裂解作用。除了1個細(xì)胞系T47-D以外，通常乳腺癌細(xì)胞對艾柯病毒EV1和EV7的裂解性感染不敏感，證明T47-D對EV1具有相當(dāng)大的易感性。PV1實質(zhì)上可使9個乳腺癌細(xì)胞系中的8個產(chǎn)生溶瘤作用(圖2)。
2.3.腸道病毒受體在結(jié)直腸癌細(xì)胞上的表達通過流式細(xì)胞儀分析4個結(jié)直腸癌細(xì)胞系(HCT116、LIM2537、SW480和SW620)ICAM-1、CAR、α2β1和DAF的表達。在這兩個細(xì)胞系上觀察到了顯著的ICAM-1和DAF表達水平。在所有這4個細(xì)胞系中有CAR的中等表達水平，而沒有觀察到α2β1的顯著表達水平(圖3)。
2.4.被選腸道病毒對結(jié)直腸癌細(xì)胞的溶瘤作用在所有4個結(jié)直腸癌細(xì)胞系中滴定CAV21、CVB3、EV1、EV7和PV1。在所有細(xì)胞系中觀察到CVB3和PV1具有顯著水平的溶瘤作用(圖4)。但CAV21誘發(fā)的顯著細(xì)胞裂解僅發(fā)生在4個細(xì)胞系中的一個中(LIM2573)。這個細(xì)胞系顯示具有最高水平的ICAM-1表達。盡管α2β1的表達水平非常低，但EV1可裂解性地感染其中的3個細(xì)胞系，而所有細(xì)胞對EV7的感染是可耐受的。
2.5.腸道病毒受體在前列腺和胰腺癌細(xì)胞表面上的表達分析包括DU145和PC3的前列腺癌細(xì)胞系，以及包括AsPC-1和PANC-1的胰腺癌細(xì)胞系中ICAM-1、DAF、CAR和α2β1的表達。在兩種前列腺細(xì)胞系和一個胰腺細(xì)胞系上ICAM-1有顯著水平的表達。在所有4個細(xì)胞系上發(fā)現(xiàn)有中等的CAR和DAF表達，而α2β1的表達似乎是最小的(圖5)。
2.6.前列腺和胰腺癌細(xì)胞的溶瘤作用在微量滴定板裂解性感染中檢測兩個前列腺癌細(xì)胞系和兩個胰腺癌細(xì)胞系對腸道病毒CAV21、CVB3、EV1、EV7和PV1的易感性。該前列腺癌細(xì)胞系對所有的病毒易感，除了DU145對EV7不敏感。PANC-1僅可被CAV21和PV1感染，而其他的胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-1顯示可被除EV7之外的所有病毒裂解(圖6)。
2.7.腸道病毒受體在卵巢癌細(xì)胞表面上的表達檢測卵巢癌細(xì)胞系腸道病毒受體ICAM-1、CAR、DAF和α2β1的表達。在本研究中包括9個細(xì)胞系A(chǔ)2780、DOV13、IGROV-1、JAM、OVCA-429、OVHS-1、OWA-42、SKOV-3和2008。這9個細(xì)胞系中的兩個有顯著水平的ICAM-1表達，而這9個中的6個上有中等水平的CAR表達。在除一個以外的所有卵巢癌細(xì)胞系上DAF為中等至較高水平的表達。這9個卵巢癌細(xì)胞系中的8個顯示中等至較高水平的α2β1表達(圖7)，還有另外一個卵巢癌細(xì)胞系(OVCAR-3)有顯著水平的α2β1表達(數(shù)據(jù)未顯示)。
2.8卵巢癌細(xì)胞系的溶瘤作用在這9個卵巢癌細(xì)胞系中的每一個細(xì)胞系中評價CAV21，CVB3，EV1，EV7和PV1的溶瘤能力(圖8)。在這9個細(xì)胞系中的兩個上發(fā)現(xiàn)了CAV21的易感性，而CVB3在這9個細(xì)胞系中的7個中可引起明顯的裂解作用。卵巢癌似乎特別對艾柯病毒EV7易感，其可引起這9個癌細(xì)胞系中的4個死亡，EV1可引起10個細(xì)胞系中7個在感染過程中發(fā)生明顯地裂解(圖9A，9B和10)。在所有9個卵巢癌細(xì)胞系中均顯示對PV1的易感性。對用EV1感染的所有10個細(xì)胞系拍攝顯微照相圖片(圖9A和9B)，也觀察EV1對10個卵巢癌細(xì)胞系的微滴定板裂解性感染作用(圖10)。
2.9.EV1與卵巢癌細(xì)胞系的結(jié)合因為卵巢癌細(xì)胞系對EV1的溶瘤作用高度易感，因此進行進一步研究以評價EV1細(xì)胞粘附的特征。在加入放射性標(biāo)記的EV1以確定這些受體參與EV1宿主細(xì)胞的結(jié)合之前，細(xì)胞與抗-α2β1(AK7)或抗-DAF(VIIIA7)單克隆抗體預(yù)先孵育。在被測的所有10個細(xì)胞系中EV1的結(jié)合是很明顯的。通過用抗受體抗體對α2β1整合蛋白的阻斷，EV1的細(xì)胞粘附被顯著抑制。用單克隆抗體VIIIA7阻斷細(xì)胞表面受體DAF，沒有引起EV1結(jié)合的顯著抑制(圖11)。
2.10.抗體對α2β1整合蛋白的阻斷可抑制EV1對卵巢癌細(xì)胞系的感染為了評價在EV1感染中α2β1的功能，進行裂解性測定實驗，其中細(xì)胞單層與抗α2β1(AK7)單克隆抗體預(yù)先孵育。分析OWA-42和IGROV-1卵巢癌細(xì)胞系。病毒感染后72小時，缺少MAb阻斷的細(xì)胞單層對EV1的裂解性感染高度易感。即使是在EV1的最低稀釋度時，在MAb阻斷α2β1整合蛋白后，在細(xì)胞系中沒有溶瘤作用的表現(xiàn)，(圖12)。在OWA-42細(xì)胞系感染后24，48和72小時拍攝顯微照相圖片(圖13)。
2.11非癌的人類細(xì)胞對EV1感染不易感進行一個試驗以驗證EV1對非癌的人類細(xì)胞的作用，其測定是通過用EV1感染人成纖維細(xì)胞。簡言之，用組織培養(yǎng)環(huán)形插入物制備6孔組織培養(yǎng)板，DOV13細(xì)胞位于環(huán)內(nèi)，HeLa細(xì)胞，人成纖維細(xì)胞(從CSL，澳大利亞獲得)在外環(huán)，37℃孵育直至形成匯合單層。去掉環(huán)，細(xì)胞用EV1感染，37℃過夜?；罴?xì)胞用結(jié)晶紫甲醇溶液染色。在用EV1感染的過程中，DOV13卵巢癌細(xì)胞被裂解，而HeLa細(xì)胞仍然是健康的(圖14)，證明卵巢癌細(xì)胞對EV1的特異易感性。
2.12α2β1在黑色素細(xì)胞系SkMel28上的表達黑色素瘤，一種皮膚癌，已知其α2β1的表達是上調(diào)的。使用流式細(xì)胞儀檢查黑色素瘤細(xì)胞系SkMel28的表達。觀察到很高水平的α2β1表達。但，用對照MAb顯示很低的本底結(jié)合水平(圖15)。
2.13EV1與SkMel28的結(jié)合為了進一步研究EV1與SkMel28細(xì)胞表面表達的α2β1相附著的性質(zhì)，采取放射性標(biāo)記病毒結(jié)合實驗。放射性標(biāo)記的EV1可顯著的與惡性黑色素瘤細(xì)胞系結(jié)合，MAb阻斷α2β1可極大地減少EV1結(jié)合的量(圖16)。
2.14EV1對SkMel28的滅活實驗裂解性感染試驗用來確定SkMel28對EV1感染的易感性。惡性黑色素瘤細(xì)胞系在用EV1感染的過程中顯示中等程度的溶瘤作用。結(jié)晶紫染色被沒有經(jīng)歷裂解性感染的細(xì)胞吸收，而沒有染色的細(xì)胞表示細(xì)胞單層已完全被裂解(圖17)。
2.15討論發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞系對EV1的裂解性感染高度易感，被檢測的10個細(xì)胞系中有7個顯示有明顯的溶瘤作用。進一步對EV1和卵巢癌細(xì)胞系結(jié)合的研究證實α2β1是EV1所使用的基本受體。放射性標(biāo)記結(jié)合研究進一步表明α2β1是病毒結(jié)合所需要的，MAb的阻斷實驗顯示通過使用α2β1單克隆抗體(Mab)預(yù)處理易感的卵巢癌細(xì)胞，EV1的感染被完全抑制。DAF MAb VIIIA7作為一種陰性對照處理也用于結(jié)合實驗中，以確定DAF是否在EV1結(jié)合中具有重要作用，因為它在腸道病毒CAV21和CVB3中是有作用的。使用抗DAF MAb預(yù)處理沒有出現(xiàn)對EV1結(jié)合的明顯阻斷。
卵巢癌細(xì)胞與人成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，然后EV1進行感染，顯示即使處在病毒可特異性裂解卵巢癌細(xì)胞的環(huán)境中，人成纖維細(xì)胞對EV1的感染不易感。
也研究了EV1介導(dǎo)的溶瘤作用對黑色素瘤細(xì)胞系的作用。數(shù)據(jù)顯示在SkMel28黑色素瘤細(xì)胞系表面上α2β1是上調(diào)的，這些細(xì)胞對EV1的裂解性感染是易感的。放射性標(biāo)記結(jié)合實驗顯示EV1與卵巢癌細(xì)胞的結(jié)合顯示是經(jīng)與α2β1的相互作用。剩余可被EV1感染的癌細(xì)胞系是結(jié)腸癌細(xì)胞系，這4個細(xì)胞系中的三個以及前列腺癌細(xì)胞系是高度易感的。這兩個類型的癌癥可遇到與卵巢癌細(xì)胞相同的細(xì)胞外基質(zhì)，因此在腹膜表面發(fā)現(xiàn)的富含1型膠原的細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)移的過程中上調(diào)了其α2β1表達。
應(yīng)當(dāng)理解的是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對于以具體實施例所顯示的本發(fā)明可進行大量的修動和/或變動，這從廣義上來說是不背離本發(fā)明的精神和范圍的。因此這些實施例從所有方面應(yīng)均可被認(rèn)為是說明性的，而不是限制性的。
實施例3艾柯病毒(EV2)裂解性感染的特異性3.1EV1的相對致病性研究了與腫瘤細(xì)胞相比EV1對體外培養(yǎng)的非惡性卵巢細(xì)胞的相對致病性。使用人乳頭狀瘤病毒16E6-E7開放可讀框永生化的正常人卵巢表面上皮(HOSE)細(xì)胞(Teao，S.W等人，1995)，以及一種透明細(xì)胞卵巢癌細(xì)胞系(OVHS-1)和未分化卵巢癌細(xì)胞(DOV13)給予多重度的EV1進行激發(fā)，moi的范圍從5.0至0.05TCID50/細(xì)胞。在感染后48小時，顯微鏡檢查顯示全部細(xì)胞被破壞，以及兩個卵巢癌細(xì)胞系單層的細(xì)胞裂解，即使病毒激發(fā)的量很低，達到0.05TCID50EV1/細(xì)胞。相反，即使在最高的病毒激發(fā)劑量下仍未觀察到HOSE細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生可檢查到的變化。
為進一步確定EV1感染的特異性，正常的外周血淋巴細(xì)胞(PBL)以及OVHS-1和DOV13細(xì)胞用EV1(moi＝1.0)激發(fā)。流式細(xì)胞儀分析顯示PBL細(xì)胞制品上表面α2β1的表達很少以至沒有，而兩個卵巢癌細(xì)胞系表達很高水平的α2β1。EV1-介導(dǎo)的PBL和卵巢癌細(xì)胞懸液的細(xì)胞裂解作用可使用標(biāo)準(zhǔn)的測量LDH釋放的細(xì)胞毒性測定來評價。EV1的激發(fā)可引起EV1感染的培養(yǎng)卵巢細(xì)胞的幾乎完全裂解，而在PBL與相同施加劑量的EV1接觸后僅觀察到本底水平的細(xì)胞裂解作用。
為了確定在缺少可檢測到的細(xì)胞裂解的情況下，在PBL中EV1是否啟動了可繁殖性的感染，以證實本底水平的細(xì)胞裂解是非特異性的，不是由EV1感染介導(dǎo)的，PBL和兩個卵巢癌細(xì)胞系的懸液用EV1接種(moi＝1.0)，并監(jiān)測子代病毒的產(chǎn)生。在兩個卵巢癌細(xì)胞系(OVHS-1和DOV-13)中，在開始的細(xì)胞結(jié)合接種過程中，EV1的滴定度增加了大約104倍。相反，PBL在48小時的孵育過程中沒有產(chǎn)生子代病毒，觀察到的感染性主要是給予的接種殘余物的非特異性結(jié)合。
實施例4艾柯病毒(EV1)裂解卵巢癌細(xì)胞4.1EV1體外裂解培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞球狀體許多體外卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)物可作為多維球狀體進行繁殖(Casey，R.C等人，2001)。多細(xì)胞球狀體類似通常在晚期卵巢癌患者腹水中發(fā)現(xiàn)的多細(xì)胞集合體。已經(jīng)明確培養(yǎng)的卵巢單層細(xì)胞對EV1的裂解性感染高度易感，卵巢癌細(xì)胞的多細(xì)胞球狀體可用EV1進行激發(fā)。流式細(xì)胞儀分析確定無論OVHS-1細(xì)胞以單層生長或形成球狀體，EV1細(xì)胞受體α2β1的表面表達水平是可比較的。EV1(105TCID50)加在圍繞球狀體周圍的半固體瓊脂糖培養(yǎng)基上，獲得在病毒激發(fā)后不同的間隔時間球狀體形態(tài)學(xué)的顯微照相影像。圖18顯示了對照未感染的球狀體具有增殖活性的，經(jīng)過9天的孵育周期其量是穩(wěn)定增加的。相反，EV1感染的球狀體顯示在接種后的頭7天其量稍微降低，在接下來的48小時發(fā)生明顯的結(jié)構(gòu)崩解和細(xì)胞破壞。數(shù)據(jù)顯示EV1可在癌性球狀體中使增殖的細(xì)胞成為被裂解性感染的細(xì)胞，不管初始接種球狀體的量是多少(即5×102或5×103細(xì)胞)可有效地阻止球狀體的生長。
4.2艾柯病毒1對人卵巢癌腹水模型的作用在轉(zhuǎn)移性卵巢癌的晚期，腫瘤細(xì)胞遷移遍布腹腔和/或定植在遠(yuǎn)隔的組織部位。為了確定EV1介導(dǎo)的溶瘤作用是否是晚期腹膜卵巢癌的一種有效治療手段，使用攜帶人卵巢癌異種移植物的SCID小鼠腹水模型。在給予活EV1之前14天，通過腹膜內(nèi)途徑給SCID小鼠注射2×106OVHS-1細(xì)胞。試驗性治療方案包括通過腹膜內(nèi)途徑注射單劑量的PBS，UV-滅活的EV1或活的EV1(105TCID50)。接受多種治療處理的小鼠體重相對未攜帶卵巢癌異種移植物小鼠的變化被用作腹水負(fù)擔(dān)發(fā)生的標(biāo)志物。
在治療后3周，給予PBS或UV滅活EV1的小鼠表現(xiàn)出體重明顯增加，但在正常和EV1治療小鼠之間沒有觀察到差異。PBS或UV滅活EV1組的體重持續(xù)增加，注射后4周時由于腹水液體積聚除了剩余的治療組以外，所有的小鼠腹脹都很明顯(圖19A)。在注射后5周，因為腹水過多所有PBS和UV滅活EV1處理的小鼠死亡，而在EV1治療的小鼠和沒有接受卵巢癌異種移植物的動物之間沒有觀察到可檢測到的體重增加或腹水形成(圖19B)。經(jīng)過本研究的過程，即使是血清病毒荷載量超過病毒接種劑量10-100倍(注射后7-14天；數(shù)據(jù)未顯示)的情況下，在用活EV1注射的小鼠中沒有觀察到疾病顯著進展的指征。
4.3討論使用有復(fù)制能力的病毒成功進行病毒溶瘤策略的主要要求之一是病毒對宿主的致病性很低，但對腫瘤細(xì)胞有很高的選擇性。
在本研究中，評價了代表性的人艾柯病毒誘發(fā)體外培養(yǎng)的人卵巢癌細(xì)胞裂解性感染的能力。盡管對黑色素瘤細(xì)胞具有很高的溶瘤作用，CVA21和EV7的原型株在許多人卵巢癌細(xì)胞單層中誘發(fā)增殖細(xì)胞裂解性感染的能力不如EV1。單克隆抗體阻斷研究證實了EV1介導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞裂解性感染是通過具體病毒衣殼與細(xì)胞表面表達的整合蛋白α2β1的結(jié)合所啟動的。因為整合蛋白α2β1不能同時結(jié)合EV1和膠原，EV1對卵巢癌細(xì)胞的裂解性感染不僅能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞迅速地裂解，還可以干預(yù)1型膠原和α2β1整合蛋白之間的相互作用，因此有可能減少癌細(xì)胞通過腹膜表面的播散。
EV1激發(fā)對多細(xì)胞三維球狀體的破壞反映了EV1介導(dǎo)的溶瘤作用在體內(nèi)縮小實體腫瘤體積的能力。EV1這種對卵巢球狀體有效的裂解令人信服地使人認(rèn)為卵巢球狀體中的單個細(xì)胞較形成單層中的細(xì)胞更穩(wěn)固，對放射線和化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的凋亡有較強的抵抗力(Frankel，A等人，1997)。
治療性溶瘤病毒對于惡性細(xì)胞的靶向應(yīng)該有一種特殊的機制。選擇性EV1介導(dǎo)的感染作用的突出特點是EV1不能誘導(dǎo)正常卵巢上皮細(xì)胞系和外周血淋巴細(xì)胞(PBL)的大量裂解。在卵巢癌細(xì)胞中而不是PBL懸液中產(chǎn)生高滴度的子代病毒再次說明了EV1感染非腫瘤細(xì)胞的特異性和低致病性。
除了卵巢癌，惡性黑色素瘤細(xì)胞表面整合蛋白α2β1的表達水平也是上調(diào)的，因此使它們對EV1的激發(fā)也是易感的。有些相反的論點認(rèn)為，EV1對卵巢癌細(xì)胞的感染可誘導(dǎo)ICAM-1(Pietiainen，V.等人，2000)，CVA21的細(xì)胞靶向受體在黑色素瘤細(xì)胞表面上的表達增加。因此，通過含有活EV1和CVA21的治療制劑激發(fā)卵巢癌和/或惡性黑色素瘤可引起更有效的溶瘤性感染。
腹膜內(nèi)給予EV1可非常有效的控制SCID小鼠腹腔內(nèi)卵巢腫瘤異種移植物的進展。所有注射活EV1的小鼠沒有顯示體重增加(相對沒有注射卵巢癌異種移植物的小鼠)以及可檢查到的腹水發(fā)生。通過體內(nèi)裂解性感染卵巢腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的子代EV1在注射后7天小鼠的血中可被檢測到(數(shù)據(jù)未顯示)。血中(vireamic)的EV1可被認(rèn)為是控制播散性疾病的儲備庫，檢測到其顯著的水平(大約106TCID50)也表明可顯著降低病毒的給藥劑量-105TCID50，仍可維持其溶瘤作用。在沒有攜帶卵巢癌異種移植物的小鼠中(數(shù)據(jù)未顯示)注射后7天不能檢測到血中的EV1表明在缺少易感性腫瘤細(xì)胞的情況下，EV1迅速和有效地從全身循環(huán)中被清除。
總體來說，這些結(jié)果高度提示，EV1的溶瘤性治療可在體外和體內(nèi)非常有效地控制腹膜卵巢癌。應(yīng)用相對非侵入性的EV1治療被認(rèn)為是現(xiàn)有治療方案中的另一種非常吸引人的方法，現(xiàn)有方案涉及手術(shù)減積術(shù)后進行聯(lián)合化療。EV1治療也可被用作腫瘤減積手術(shù)后的輔助治療，目標(biāo)是靶向和破壞在手術(shù)操作過程中釋放的腫瘤細(xì)胞。EV1溶瘤治療也可被用作治療整合蛋白α2β1高表達水平的其他人類惡性腫瘤中的一種新的治療方法。而且，因為EV1和EV8可競爭整合蛋白α2β1上的相同結(jié)合表位，因此EV8可替代EV1，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞迅速的裂解性感染。利用兩個不同的病毒血清型可相繼地通過整合蛋白α2β1的靶向作用激發(fā)卵巢癌，不依賴首次給予病毒產(chǎn)生的保護性免疫反應(yīng)。對于EV1利用一種有效的抗腸道病毒藥物(pleconaril)(Pevear，D.C.等人，1999)可進一步增強這種治療的目的性，因為它能夠直接控制非特異性病毒的復(fù)制和播散的子代病毒。在pleconaril和EV1之間潛在的協(xié)同性也可允許在全身注射給藥多重度非常高的病毒后，在病毒已經(jīng)靶向并開始對惡性細(xì)胞進行裂解性感染后馬上再應(yīng)用pleconaril(為了滅活游離的病毒)。
應(yīng)當(dāng)理解的是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對于以具體實施例所顯示的本發(fā)明可進行大量的修動和/或變動，這從廣義上來說是不背離本發(fā)明的精神和范圍的。因此這些實施例從所有方面應(yīng)均可被認(rèn)為是說明性的，而不是限制性的。
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權(quán)利要求
1.一種治療哺乳動物異常細(xì)胞的方法，其特征在于包括用有效量的病毒治療哺乳動物，所述病毒選自可識別α2β1以感染細(xì)胞的艾柯病毒，其修飾形式及其組合，這樣至少一些細(xì)胞被所述的病毒殺死。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于包括讓哺乳動物接受多次病毒治療，在每次治療中的病毒是相同的或不同的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于所述的病毒包含艾柯病毒血清型或其修飾形式。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的方法，其特征在于所述的病毒選自EV1、EV7、EV8和EV22。
5.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的方法，其特征在于所述的病毒是修飾后的艾柯病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的方法，其特征在于修飾所述的病毒以提高病毒感染異常細(xì)胞的能力。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6中所述的方法，其特征在于所述的修飾后艾柯病毒是選自EV1、EV7、EV8和EV22的艾柯病毒的修飾形式。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任何一項中所述的方法，其特征在于所述的病毒與另一種感染異常細(xì)胞的病毒聯(lián)合給予哺乳動物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8中所述的方法，其特征在于所述的異常細(xì)胞表達ICAM-1，所述的另一種病毒可識別ICAM-1以感染異常細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9中所述的方法，其特征在于所述的病毒是柯薩奇病毒或其修飾形式。
11.根據(jù)權(quán)利要求10中所述的方法，其特征在于所述的柯薩奇病毒是選自A13、A15、A18和A21的柯薩奇病毒血清型。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11任何一項中所述的方法，其特征在于所述的異常細(xì)胞是癌細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12中所述的方法，其特征在于所述的癌細(xì)胞是選自卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和結(jié)直腸癌的癌細(xì)胞，或已經(jīng)從卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌或結(jié)直腸癌播散的癌細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13任何一項中所述的方法，其特征在于所述的異常細(xì)胞中α2β1的表達是上調(diào)的。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14任何一項中所述的方法，其特征在于所述的病毒通過局部、全身或腫瘤內(nèi)給予哺乳動物。
16.一種篩選對誘發(fā)細(xì)胞死亡的病毒具有易感性的哺乳動物異常細(xì)胞樣本，評價給予哺乳動物所述病毒對異常細(xì)胞治療作用的方法，其特征在于包括(a)提供異常細(xì)胞的樣本；(b)用所述病毒處理細(xì)胞足夠的時間使細(xì)胞被病毒感染；和(d)確定所述病毒是否感染并至少引起一些異常細(xì)胞的死亡；其中所述的病毒選自可識別α2β1以感染異常細(xì)胞的艾柯病毒，其修飾形式及其組合。
17.根據(jù)權(quán)利要求16中所述的方法，其特征在于所述的病毒包括艾柯病毒血清型或其修飾形式。
18.根據(jù)權(quán)利要求16中所述的方法，其特征在于所述的病毒選自EV1、EV7、EV8和EV22。
19.根據(jù)權(quán)利要求17中所述的方法，其特征在于所述的病毒是修飾后的艾柯病毒。
20.根據(jù)權(quán)利要求19中所述的方法，其特征在于修飾所述的病毒以提高病毒感染異常細(xì)胞的能力。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或20中所述的方法，其特征在于所述的修飾艾柯病毒是選自EV1、EV7、EV8和EV22的艾柯病毒的修飾形式。
22.根據(jù)權(quán)利要求16至21任何一項中所述的方法，其特征在于進一步包括使用另一個細(xì)胞樣本進行步驟(b)和(c)比較所述病毒和另一種不同的可識別α2β1以感染細(xì)胞的病毒感染細(xì)胞并引起細(xì)胞死亡的能力。
23.根據(jù)權(quán)利要求22中所述的方法，其特征在于所述的另一種不同的病毒是一種不同的艾柯病毒或其修飾形式.
24.根據(jù)權(quán)利要求16至23任何一項中所述的方法，其特征在于所述的細(xì)胞是癌細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求24中所述的方法，其特征在于所述的癌細(xì)胞是選自卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和結(jié)直腸癌的癌細(xì)胞，或已經(jīng)從卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌或結(jié)直腸癌播散的癌細(xì)胞。
26.一種篩選具有感染并引起哺乳動物異常細(xì)胞死亡能力的病毒，評價對哺乳動物應(yīng)用所述病毒對異常細(xì)胞的治療作用的方法，其特征在于包括(a)選擇病毒；(b)用所述病毒處理哺乳動物異常細(xì)胞樣本足夠的時間使病毒感染細(xì)胞；和(c)確定所述病毒是否已經(jīng)感染并至少引起一些異常細(xì)胞死亡；其中所述的病毒選自可識別α2β1以感染異常細(xì)胞的艾柯病毒及其修飾形式。
27.根據(jù)權(quán)利要求26中所述的方法，其特征在于所述的病毒包括艾柯病毒血清型或其修飾形式。
28.根據(jù)權(quán)利要求26中所述的方法，其特征在于所述的病毒選自EV1、EV7、EV8和EV22。
29.根據(jù)權(quán)利要求27中所述的方法，其特征在于所述的病毒是修飾后的艾柯病毒。
30.根據(jù)權(quán)利要求29中所述的方法，其特征在于修飾所述的病毒以提高病毒感染異常細(xì)胞的能力。
31.根據(jù)權(quán)利要求29或30中所述的方法，其特征在于所述的被修飾后艾柯病毒是選自EV1、EV7、EV8和EV22的艾柯病毒的修飾形式。
32.根據(jù)權(quán)利要求26至31任何一項中所述的方法，其特征在于進一步包括使用另一種細(xì)胞樣本進行步驟(b)和(c)比較所述病毒與另一種不同的可識別α2β1以感染細(xì)胞的病毒感染并引起細(xì)胞死亡的能力。
33.根據(jù)權(quán)利要求32中所述的方法，其特征在于所述的另一種不同的病毒是一種不同的艾柯病毒或其修飾形式。
34.根據(jù)權(quán)利要求26至33中任何一項的方法，其特征在于所述的異常細(xì)胞是癌細(xì)胞。
35.根據(jù)權(quán)利要求34中所述的方法，其特征在于所述的癌細(xì)胞選自卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和結(jié)直腸癌的癌細(xì)胞，或已經(jīng)從卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和結(jié)直腸癌播散的癌細(xì)胞。
36.一種在哺乳動物中誘導(dǎo)針對表達α2β1的異常細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)的方法，其特征在于包括用選自艾柯病毒，其修飾形式及其組合的病毒感染哺乳動物異常細(xì)胞，至少引起一些細(xì)胞裂解。
37.根據(jù)權(quán)利要求36中所述的方法，其特征在于所述的病毒包括艾柯病毒血清型或其修飾形式。
38.根據(jù)權(quán)利要求37中所述的方法，其特征在于所述的病毒選自EV1、EV7、EV8和EV22。
39.根據(jù)權(quán)利要求37中所述的方法，其特征在于所述的病毒是修飾后的艾柯病毒。
40.根據(jù)權(quán)利要求39中所述的方法，其特征在于修飾所述的病毒以提高所述病毒感染異常細(xì)胞的能力。
41.根據(jù)權(quán)利要求39或30中所述的方法，其特征在于所述的被修飾病毒是選自EV1、EV7、EV8和EV22的艾柯病毒的修飾形式。
42.根據(jù)權(quán)利要求36至41任何一項中所述的方法，其特征在于所述的異常細(xì)胞的α2β1的表達是上調(diào)的。
43.根據(jù)權(quán)利要求36至42任何一項中所述的方法，其特征在于所述的病毒與可感染異常細(xì)胞的另一個病毒聯(lián)合給予哺乳動物。
44.根據(jù)權(quán)利要求43中所述的方法，其特征在于所述的異常細(xì)胞表達ICAM-1，所述的另一個病毒可識別ICAM-1以感染異常細(xì)胞。
45.根據(jù)權(quán)利要求44中所述的方法，其特征在于所述的另一個病毒是柯薩奇病毒或其修飾形式。
46.根據(jù)權(quán)利要求45中所述的方法，其特征在于所述的柯薩奇病毒是選自A13、A15、A18和A21中的柯薩奇病毒血清型。
47.根據(jù)權(quán)利要求36至46任何一項中所述的方法，其特征在于所述的異常細(xì)胞是癌細(xì)胞。
48.根據(jù)權(quán)利要求47中所述的方法，其特征在于所述的癌細(xì)胞是選自卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和結(jié)直腸癌的癌細(xì)胞，或從卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌或結(jié)直腸癌播散的癌細(xì)胞。
49.根據(jù)權(quán)利要求36至48任何一項中所述的方法，其特征在于所述的病毒通過局部、全身或腫瘤內(nèi)給藥給予哺乳動物。
50.一種治療哺乳動物異常細(xì)胞的藥物組合物，包括產(chǎn)生病毒治療細(xì)胞的接種物以使至少一些細(xì)胞被病毒和藥學(xué)可接受的載體殺死，其特征在于所述的病毒選自可識別α2β1以感染細(xì)胞的艾柯病毒，其修飾形式及其組合。
51.根據(jù)權(quán)利要求50中所述的藥物組合物，其特征在于所述的病毒包括艾柯病毒血清型或其修飾形式。
52.根據(jù)權(quán)利要求51中所述的藥物組合物，其特征在于所述的病毒選自EV1、EV7、EV8和EV22。
53.根據(jù)權(quán)利要求49中所述的藥物組合物，其特征在于所述的病毒是修飾后的艾柯病毒。
54.根據(jù)權(quán)利要求51中所述的藥物組合物，其特征在于修飾所述的病毒以提高病毒感染異常細(xì)胞的能力。
55.根據(jù)權(quán)利要求53或54中所述的藥物組合物，其中被修飾的艾柯病毒是選自EV1、EV7、EV8和EV22的艾柯病毒的修飾形式。
56.根據(jù)權(quán)利要求50至55任何一項中所述的藥物組合物，其特征在于所述的異常細(xì)胞是癌細(xì)胞。
57.根據(jù)權(quán)利要求50至56任何一項中所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物是局部給藥或注射的。
58.一種將接種物用于哺乳動物以產(chǎn)生病毒治療哺乳動物異常細(xì)胞的涂藥器，其特征在于所述的涂藥器包括侵入接種的哺乳動物的區(qū)域，這樣接種物可與哺乳動物接觸，所述病毒選自可識別α2β1以感染細(xì)胞的艾柯病毒，其修飾形式及其組合。
59.根據(jù)權(quán)利要求58中所述的涂藥器，其特征在于所述的病毒侵入的區(qū)域包括與哺乳動物保持接觸的填料或填塞物。
60.根據(jù)權(quán)利要求58或59中所述的涂藥器，其特征在于所述的異常細(xì)胞是異常皮膚細(xì)胞，所述涂藥器進一步包括一個或多個與哺乳動物的皮膚粘附的粘附表面。
61.一種根據(jù)權(quán)利要求58至60中任何一項所述的涂藥器，其特征在于是貼片或粘性膏藥形式。
62.一種在制造藥物時使用接種物來產(chǎn)生病毒，誘發(fā)哺乳動物對異常細(xì)胞的免疫反應(yīng)的應(yīng)用，其特征在于所述的病毒選自可識別α2β1以感染細(xì)胞的艾柯病毒，其修飾形式及其組合。
63.一種在制造藥物時使用接種物來產(chǎn)生病毒，誘發(fā)哺乳動物對異常細(xì)胞的免疫反應(yīng)的應(yīng)用，其特征在于所述的病毒選自可識別α2β1以感染異常細(xì)胞并殺死細(xì)胞的艾柯病毒，其修飾形式及其組合。
全文摘要
本發(fā)明提供了治療哺乳動物異常細(xì)胞如癌細(xì)胞的方法。該方法涉及使用病毒治療哺乳動物，該病毒選自可識別α
文檔編號A61K39/125GK1784242SQ200380109808
公開日2006年6月7日 申請日期2003年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月18日
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