專利名稱：用于對(duì)基本球形代謝粒子的個(gè)體代謝率的非侵入的測(cè)量裝置及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于對(duì)基本球形代謝粒子的代謝率的非侵入及非干擾測(cè)量裝置及方法，以及用于在該粒子的水平上控制代謝物的濃度的方法及裝置。
背景技術(shù)：
使用胚胎移植(ET)技術(shù)，如IVF(試管受精)及相關(guān)技術(shù)，涉及在重新植入被選胚胎前，在試管內(nèi)培養(yǎng)一段時(shí)間要培育的胚胎。即使在理想的生長條件下，也需要作為工具的選擇標(biāo)準(zhǔn)來選擇用于重新植入的最能生存的胚胎。為了決定適于轉(zhuǎn)移的胚胎，胚胎的存活能力是一個(gè)重要的參數(shù)。目前，沒有在實(shí)際水平上可應(yīng)用的客觀手段，其適于評(píng)價(jià)隨著操作的胚胎的存活能力。在實(shí)踐中，胚胎的評(píng)估被限制在基于形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)的多少有些主觀的評(píng)分上。
胚胎的呼吸速率可能證明是客觀存活能力指標(biāo)的好的候選者。以前已經(jīng)證明，牛、鼠和人的胚胎的呼吸速率(以氧消耗表示)是胚胎存活能力的有效指標(biāo)(看Shiko等人2001 “通過電化學(xué)顯微掃描檢測(cè)的單一牛胚胎的氧消耗”，分析化學(xué)733751-3758；或Trimarchi等人2000年“個(gè)體的植入前鼠胚胎的依賴及獨(dú)立于氧消耗的氧化磷酸化”，繁殖生物學(xué)621866-1874；或Overstrom EW等人1992“牛胚泡的存活能力及氧化代謝”，“動(dòng)物生殖學(xué)”37(1)269；或Magnusson C等人1986“試管內(nèi)生長的人卵母細(xì)胞及胚泡的氧消耗”，人類繁殖1183-184)。這些研究顯示，特定的(高的)呼吸速率和改善的發(fā)育如改善的試管內(nèi)發(fā)育(以提高的胚泡頻率表示)或提高的妊娠頻率有關(guān)。
已知許多用于確定胚胎呼吸的方法。Mills和Brinster(看Mills和Brinster1967“重新植入前鼠胚胎的氧消耗”，Exp.Cell.Res.47337-344)描述了一種對(duì)一組鼠胚胎使用笛卡兒潛水員(diver)技術(shù)的方法，該方法測(cè)量了與胚胎培養(yǎng)基直接接觸的氧氣泡的體積的改變。
Magnusson等人1986(在試管中培育的人的卵母細(xì)胞和胚球的氧消耗，人類繁殖1183-184)及后來Houghton等人1996(“早期鼠胚胎的氧消耗及能量代謝”，細(xì)胞繁殖及生長，44476-485)描述了使用靈敏的顯微分光技術(shù)而能夠測(cè)量個(gè)體胚胎的氧消耗的方法，其中胚胎放置在小的密封室里并以氧氣分壓的下降估計(jì)氧消耗，以其光學(xué)吸收對(duì)氧存在敏感的物質(zhì)的吸收的改變監(jiān)測(cè)氧消耗。由于大量將胚胎搬進(jìn)和搬出密封室，測(cè)量耗費(fèi)時(shí)間又打擾胚胎。
已經(jīng)描述另一技術(shù)，其中胚胎固定在薄毛細(xì)管上而用非常精確定位的振蕩氧微電極在假定是球形擴(kuò)散下測(cè)量氧濃度梯度(看Shiko等人2001“通過掃描電化學(xué)顯微方法檢測(cè)單個(gè)牛胚胎的氧消耗”，分析化學(xué)733751-3758，或Trimarchi JR等人2000“個(gè)體的植入前鼠胚胎的依賴及獨(dú)立于氧消耗的氧化磷酸化”，繁殖生物學(xué)621866-1874；)。這些技術(shù)的特征是苛求操作的比較復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，并導(dǎo)致對(duì)胚胎的顯著的干擾。此外，完成測(cè)量較耗費(fèi)時(shí)間并且需要滿足對(duì)該方法的假定。
大體上，測(cè)量個(gè)體胚胎呼吸的上面提到的研究及相關(guān)研究遭受復(fù)雜、干擾胚胎及耗費(fèi)時(shí)間的損害，因此不太可能這樣的方法會(huì)被常規(guī)應(yīng)用到用于監(jiān)測(cè)在試管內(nèi)培養(yǎng)基中的胚胎的個(gè)體呼吸速率。因此仍然存在對(duì)用于測(cè)量作為胚胎存活率的量度的個(gè)體胚胎呼吸速率的，快速、簡單及無干擾的方法和裝置的需要。涉及胚胎的試管培育的研究人員及專業(yè)人員普遍表達(dá)了這種需要。Overstom 1996(看Overstrm EW 1996“胚胎存活率的試管中評(píng)估”，動(dòng)物生殖學(xué)453-16)在一個(gè)文獻(xiàn)的回顧中匯集了對(duì)簡單及客觀的用于確定作為胚胎存活率的表現(xiàn)的個(gè)體胚胎呼吸的方法的要求。當(dāng)試管胚胎技術(shù)成為高度復(fù)雜，包括ICSI(細(xì)胞質(zhì)內(nèi)精子注入)，克隆及冷凍周期，預(yù)計(jì)這一要求會(huì)變得更顯著。在人類不育治療中，專注于單胚胎移植以避免不想要的其是多胚胎移植的結(jié)果的多胞胎懷孕已經(jīng)變得必要。然而，為了能夠選擇選擇最好的胚胎并因此提高成功懷孕的可能性，單胚胎移植要求嚴(yán)格的存活能力評(píng)估，其再次強(qiáng)調(diào)對(duì)在常規(guī)水平上可應(yīng)用的簡單及客觀存活指標(biāo)的需要。新的方法應(yīng)最好包括下面的如Overstrm 1996年概括的(看“胚胎存活能力的試管中評(píng)估”，動(dòng)物生殖學(xué)453-16 1996)的關(guān)鍵要素。
-對(duì)多個(gè)個(gè)體胚胎的進(jìn)行同時(shí)的客觀測(cè)量的能力。
-測(cè)量個(gè)體胚胎的靈敏度和分辨率。
-快速的評(píng)估(～30分鐘或更少)。
-存活能力測(cè)試必須非擾亂并理想地非侵入的。
-技術(shù)上簡單及使用者易使用的。
-能承擔(dān)得起的。
除了表達(dá)出來的對(duì)用于在常規(guī)水平上可應(yīng)用的呼吸測(cè)量的方法和裝置的需求，胚胎的試管內(nèi)培育遭受如在培育胚胎中經(jīng)歷的氧分壓控制不足的損害。胚胎的試管內(nèi)培育經(jīng)常是在有規(guī)定大氣(溫度、相對(duì)濕度及氣體組成)的孵育器中進(jìn)行。大氣空氣包括21％氧氣(210hPa分壓)，但在試管內(nèi)(輸卵管和子宮)氧壓力被認(rèn)為是約5-10％氧(50-100hPa)飽和。因此并不奇怪，一般來說，胚胎發(fā)育在5-10％大氣下比在空氣下更好。Lim等人和Thompson等人(看Lim等人1999“在5％CO2的空氣中或5％O2、5％CO2及90％N2中的牛胚胎試管內(nèi)的發(fā)育”，人的生殖7(4)558-562；或Thompson JGE等人1990“氧濃度對(duì)植入前羊及牛胚胎的試管內(nèi)發(fā)育的影響”，J.Reprod.Fert 89，573-578)和其他人先前展示了在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育中減小氧分壓的積極效果。因此在一些情況中胚胎是在減小氧的大氣中例如5％飽和中培育的。然而，通過單獨(dú)控制在培養(yǎng)基上的大氣來控制胚胎對(duì)氧的暴露是不充分的。當(dāng)開始試管內(nèi)培育時(shí)培養(yǎng)基典型地是氧飽和的(21％)，而在培養(yǎng)基和覆蓋氣體大氣之間的平衡周期時(shí)間，依賴于該試管內(nèi)培育系統(tǒng)，可以長達(dá)12-24小時(shí)，以致胚胎會(huì)在試管內(nèi)培育的相當(dāng)時(shí)間中經(jīng)受明顯超過目前認(rèn)為是最優(yōu)(5-10％)的氧分壓。然而由于穩(wěn)定狀態(tài)氧分壓梯度從大塊的培養(yǎng)基向胚胎，作為胚胎呼吸的結(jié)果而上升，在胚胎表面的最后的穩(wěn)定狀態(tài)氧分壓會(huì)低于在上述大氣例如5％中的。
因此仍然存在對(duì)調(diào)節(jié)如在試管內(nèi)培育期間培育胚胎時(shí)經(jīng)歷的氧分壓的，簡單及快速(＜1h)的方法的需要。
在本申請(qǐng)中引用的所有專利及非專利的參考資料，此處也在其整體上并入?yún)⒖肌?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及適于用于對(duì)基本球形代謝粒子的代謝速率的容易且快速地測(cè)量的裝置。因此，本發(fā)明涉及對(duì)基本球形代謝粒子的個(gè)體代謝速率的非侵入測(cè)量的裝置，該裝置包括a)至少一個(gè)隔室，所述隔室由擴(kuò)散隔障確定并能夠包括有基本球形代謝粒子的培養(yǎng)基，所述擴(kuò)散隔障允許代謝物經(jīng)由擴(kuò)散向及/或從基本球形代謝粒子遷移，由此使得能建立從基本球形代謝粒子并貫穿培養(yǎng)基的代謝物擴(kuò)散梯度，b)至少一個(gè)用于測(cè)量在隔室內(nèi)的代謝物的濃度的檢測(cè)器。
該裝置適于既用于測(cè)量代謝粒子的代謝速率，也用于監(jiān)測(cè)粒子及選擇指定情形的粒子。因而，本發(fā)明還涉及用于測(cè)定基本球形代謝粒子的代謝速率的非侵入方法，包括a)提供至少一個(gè)如上面定義的裝置，b)在一個(gè)隔室的培養(yǎng)基中設(shè)置基本球形代謝粒子，c)測(cè)量在隔室中的代謝物濃度得到代謝物濃度的量，及d)將所述代謝物濃度的量與所述基本球形代謝粒子的代謝速率聯(lián)系起來。
以及本發(fā)明還涉及一種用于在培育期間調(diào)節(jié)對(duì)基本球形代謝粒子的代謝物供應(yīng)的方法，包括a)提供至少一個(gè)包括具有培養(yǎng)基的隔室的裝置，b)在一個(gè)隔室的培養(yǎng)基中培育基本球形代謝粒子，并任選地c)測(cè)量在隔室中的代謝物濃度得到代謝物濃度的量，并任選地d)將所述代謝物濃度的量與所述基本球形代謝粒子的代謝速率聯(lián)系起來并任選地e)依賴于代謝物濃度的量及/或所述基本球形代謝粒子的代謝速率調(diào)節(jié)代謝物供應(yīng)。
在另一方面本發(fā)明涉及用于選擇有存活力的胚胎，包括，a)在培育中至少一次測(cè)定出該胚胎的代謝速率，及b)選擇具有最優(yōu)代謝速率的胚胎。
本發(fā)明尤其適于用于確定在與環(huán)境連通的開放系統(tǒng)中的粒子的代謝速率。然而，根據(jù)本發(fā)明的裝置也可用于在封閉系統(tǒng)中的代謝速率。
因此，在又一方面本發(fā)明涉及用于測(cè)定代謝粒子的代謝速率的非侵入方法，包括a)提供至少一個(gè)如上面定義的裝置，b)在一個(gè)隔室的培養(yǎng)基中培育代謝粒子，c)在培育的至少部分期間中減少對(duì)培養(yǎng)基的代謝物供應(yīng)，d)在減少了代謝物供應(yīng)后測(cè)量在隔室中的代謝物濃度得到代謝物濃度的量，及e)將所述代謝物濃度的量與所述基本球形代謝粒子的代謝速率聯(lián)系起來。
此外，本發(fā)明涉及最優(yōu)化的培育裝置，所述裝置包括至少一個(gè)隔室，所述隔室由擴(kuò)散隔障確定并能包括具有基本球形代謝粒子的培養(yǎng)基，所述擴(kuò)散隔障允許經(jīng)由擴(kuò)散的向及/或從基本球形代謝物的遷移，由此使得能建立從基本球形代謝粒子并貫穿培養(yǎng)基的代謝物擴(kuò)散梯度。
在再一方面本發(fā)明涉及用于培育如這里定義的粒子的方法，包括a)提供至少一個(gè)包括具有培養(yǎng)基的隔室的裝置，b)在一個(gè)隔室的培養(yǎng)基中培育基本球形代謝粒子，并任選地c)調(diào)節(jié)向及/或從所述基本球形代謝粒子的代謝物供應(yīng)。
對(duì)在附圖上的附圖標(biāo)記的解釋每個(gè)附圖標(biāo)記包括以x.x形式的兩個(gè)數(shù)字，其中第一個(gè)數(shù)字指附圖號(hào)而第二個(gè)數(shù)字指在每個(gè)附圖上的說明，如這樣x.1指代謝粒子x.2指周圍培養(yǎng)基x.3指檢測(cè)器x.4指代謝物可滲透擴(kuò)散隔障x.5指代謝物基本無法滲透的隔室壁x.6指能支持代謝粒子的代謝物可滲透層x.7指隔室朝向隔室外面周圍的開口x.8指理論代謝物濃度梯度x.9指根據(jù)圖1的在實(shí)施例中的插入物x.10指隔室的可調(diào)節(jié)底部x.11指濃度梯度等高線x.12指CCD照相機(jī)x.13指覆蓋培養(yǎng)基以防止蒸發(fā)及湍流的粘性層x.14指插入端口(僅圖7)x.15指間隔物(僅圖9和10)x.16指支撐結(jié)構(gòu)
x.17指可調(diào)節(jié)頂部(僅圖16)x.18指線圖1是根據(jù)本發(fā)明，在底部具有氧檢測(cè)器的擴(kuò)散隔室的第一實(shí)施例的橫截面；理論上的穩(wěn)定態(tài)氧梯度在旁邊的圖中示出。在此情形中的可滲透擴(kuò)散隔障是培養(yǎng)基的停滯體。
圖2是在根據(jù)圖1的實(shí)施例的具有插入物的隔室的橫截面，該插入物調(diào)節(jié)第一實(shí)施例的內(nèi)部的橫向尺寸。
圖3是本發(fā)明包括具有可調(diào)節(jié)底部的擴(kuò)散隔室的另一實(shí)施例的橫截面。
圖4是在圓筒形擴(kuò)散隔室中測(cè)量的穩(wěn)定態(tài)氧梯度的例子，其中在底部培育胚胎。在圖4中的梯度的直線部分對(duì)應(yīng)在圖1中的理論圖示的線的實(shí)線的一段。x軸的單位是hPa而y軸單位是μm。關(guān)于梯度的隔室的開口(X.7)的位置用垂直線標(biāo)記。
圖5是所述擴(kuò)散隔室的另一個(gè)實(shí)施例，其中該擴(kuò)散隔室完全打開而在胚胎周圍二維記錄氧梯度。5B示出在胚胎水平面處底部的橫截面。5C示出如從CCD照相機(jī)處看到的假想圖像(頂視圖或底視圖)，其中期望的在每個(gè)個(gè)體胚胎周圍的發(fā)光體的發(fā)光強(qiáng)度為灰度色調(diào)顯現(xiàn)。
圖6A是如圖5顯示的對(duì)朝向胚胎沿平的打開的隔室的底部的穩(wěn)定態(tài)氧梯度的測(cè)量的例子。圖6B是示出實(shí)際梯度與理論上的理想球形梯度配合情況的圖表。如果該圖示是直的，則滿足球形擴(kuò)散系統(tǒng)的假定。
圖7(設(shè)計(jì)范例)設(shè)計(jì)使橫向部分形成的象吸液管，用它從轉(zhuǎn)移容器中拾取被研究的代謝粒子。吸液管柱塞的特殊之處在于它具有氣體檢測(cè)器。在已經(jīng)拾取呼吸粒子后，吸液管轉(zhuǎn)動(dòng)使尖頭向上并通過端口插入到中介容器的底部。該中介容器隨后被注滿培養(yǎng)基。吸液管的管筒作為隔室的側(cè)壁。
圖8(設(shè)計(jì)范例)對(duì)橫向部分的設(shè)計(jì)為，代謝粒子被放置在一個(gè)平板的淺井中。該井具有一個(gè)可滲透代謝物的有變動(dòng)厚度因而具有變動(dòng)代謝物傳輸能力的蓋，通過水平位移該蓋可用不同部分覆蓋該井。因而通過放置蓋的不同部分在井的直接上方可調(diào)節(jié)在培養(yǎng)基和環(huán)境之間的擴(kuò)散隔障。在此圖中，在井外面的培養(yǎng)基是小滴的形式，但也可以是更大塊的形式。
圖9(設(shè)計(jì)范例)對(duì)橫向部分的設(shè)計(jì)為，代謝粒子被放置在一個(gè)不滲透盤下靠近檢測(cè)器。該盤包括基本不滲透的隔室壁的上部，由間隔物支撐以保持與基本不滲透的隔室壁的下部的一個(gè)已定好的距離。用陰影線示出該間隔物以顯示出它們僅占盤下的一小部分并不會(huì)對(duì)擴(kuò)散構(gòu)成明顯的阻礙。其中放置代謝粒子的淺井在盤下中心定位。通過改變支撐基本不滲透隔室壁的上壁(蓋)的間隔物的高度可調(diào)節(jié)可滲透擴(kuò)散隔障的滲透性。
圖10(設(shè)計(jì)范例)對(duì)橫向部分的設(shè)計(jì)為，呼吸粒子放置在不滲透板的錐形模槽中。檢測(cè)器設(shè)置在靠近錐形的尖端處，且一個(gè)錐形的不滲透蓋放置在該模槽。間隔物確保在該蓋和模槽之間保持定好的距離。
圖11(設(shè)計(jì)范例)對(duì)橫向部分的設(shè)計(jì)為，隔室包括穿過放置在不滲透板(11.5)的不滲透材料塊(11.5)的空腔(11.4)。該空腔基本是圓筒形(或多面體)并充滿培養(yǎng)基，但在靠近面向板的端部可以是空的以形成對(duì)代謝粒子(11.1)的容器。發(fā)光體(11.3)放置在延伸的空腔中靠近底板(11.5)。
圖12(設(shè)計(jì)范例)具有部分敞開蓋(可調(diào)節(jié))的凹陷部。檢測(cè)器形態(tài)為在代謝粒子下的平面，例如發(fā)光體片。
圖13(設(shè)計(jì)范例)具有中央孔(不可調(diào)節(jié)的)的凹陷部。
圖14(設(shè)計(jì)范例)立方體，其中代謝粒子落入該立方體中并通過轉(zhuǎn)動(dòng)立方體讓代謝粒子經(jīng)由重力落出而取回代謝粒子。具有兩個(gè)開口使得可施加水流穿過立方體而將呼吸粒子沖出。
圖15(設(shè)計(jì)范例)端部有漏斗的彎曲毛細(xì)管。檢測(cè)器形態(tài)為在毛細(xì)管內(nèi)的兩個(gè)圓形區(qū)域，例如一層發(fā)光體。通過改變?cè)谥挝锷系拿?xì)管的位置可以調(diào)節(jié)呼吸粒子的位置及因而，擴(kuò)散隔障的長度，由于該位置會(huì)決定在毛細(xì)管中代謝粒子在重力下能移動(dòng)到的最低點(diǎn)的位置。
圖16(設(shè)計(jì)范例)在轉(zhuǎn)盤機(jī)構(gòu)中的可調(diào)節(jié)底部。該特殊實(shí)施例提供又一容量可調(diào)節(jié)的隔室，使得通過改變?cè)搶拥暮穸榷虼烁淖儩B透系數(shù)，能調(diào)節(jié)可滲透擴(kuò)散隔障的滲透性，該擴(kuò)散隔障在此例中為培養(yǎng)基的停滯部分。通過順時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)16.17，由此經(jīng)由線16.18使16.17移向包含周圍培養(yǎng)基16.2的大井的底部，可減小可滲透層的厚度。由于隔室的底部相對(duì)于大井的底部固定，這引起隔室容量的下降并因此可滲透層的厚度的下降，而因此增大的滲透性。檢測(cè)器從隔室的底部向包含周圍培養(yǎng)基的大井的底部延伸，在那里它可與記錄單元達(dá)到接觸。
圖17(設(shè)計(jì)范例)具有凹陷的板。該實(shí)施例包括一個(gè)板，其具有幾個(gè)例如500-3000μm深的適宜角為30(例如15-60度)的錐形凹陷，其放置在另一個(gè)具有親水表面的凹陷中。板表面的剩余部分是親水的。具有適當(dāng)體積10-20μl的一滴17.2填充兩個(gè)凹陷并形成可滲透擴(kuò)散隔障。一層在該滴上的合適的油防止該滴蒸發(fā)及該滴內(nèi)部的對(duì)流，使得用于實(shí)際目的培養(yǎng)基的主體保持為停滯?？蛇x擇的，在錐形凹陷外的體積構(gòu)成周圍培養(yǎng)基并且不是被特定地包括在可滲透擴(kuò)散隔障中，除非它用于其他目的而保持停滯。通過應(yīng)用不同角度或深度的錐形凹陷(隔室)可以調(diào)節(jié)擴(kuò)散隔障的滲透性，并且根據(jù)例4中的等式可以計(jì)算特別是錐形的隔室的滲透性。
圖18用于測(cè)量在圖11中示出的及例6(Skorstens范例)中描述的機(jī)構(gòu)中的鼠胚胎的呼吸速率。原始熒光數(shù)據(jù)。分別使用360nm和550nm的激發(fā)光及在Tecan Spectraflour熒光板讀出器中記錄650nm的發(fā)射光，記錄下從氧可熄滅卟啉熒光團(tuán)(在聚苯乙烯中的鉑(II)-8乙基卟啉)，與孵育室中的培養(yǎng)基接觸的熒光強(qiáng)度。激發(fā)后從0-500μs記錄熒光。
圖19用于測(cè)量在圖11中示出的及例6(Skorstens范例)中描述的機(jī)構(gòu)中的鼠胚胎的呼吸速率。測(cè)得的氧濃度的已校正數(shù)據(jù)。使用修正的Stern-Volmer方程將熒光強(qiáng)度轉(zhuǎn)變?yōu)檠醴謮?，該方程根?jù)Klimant等人1995(“纖維光學(xué)氧微傳感器，一種在水生生物學(xué)中的新工具”，湖泊學(xué)及海洋學(xué)401159-1165)充分描述了大多數(shù)optrode的反應(yīng)。
圖20使用如例7中描述的使用圖17中的設(shè)計(jì)的氧微傳感器完成測(cè)量用于鼠胚胎的呼吸速率。
定義測(cè)量電流的氧傳感器克拉克型電化學(xué)傳感器，具有針對(duì)著內(nèi)部基準(zhǔn)極化的金陰極，氧在陰極表面上被還原。電流計(jì)將引起的電流轉(zhuǎn)變?yōu)樾盘?hào)。
隔室的底部在當(dāng)前的上下文中名詞“隔室的底部”意味著隔室的該部分比起基本球形代謝粒子設(shè)置在更遠(yuǎn)離任何代謝物可滲透的開口?！暗住辈⒉槐厝恢冈诨厩蛐未x粒子下方的垂直位置，而可以是隔室與開口相反的一側(cè)。
大塊培養(yǎng)基在隔室外面周圍或與代謝粒子離開一段距離的培養(yǎng)基以致粒子的代謝不影響大塊培養(yǎng)基的代謝物濃度。
擴(kuò)散由此液體、氣體或固體粒子作為由熱擾動(dòng)引起的隨機(jī)分子運(yùn)動(dòng)的結(jié)果而混合的過程，導(dǎo)致溶解的物質(zhì)從較高濃度區(qū)域向較低濃度區(qū)域的凈轉(zhuǎn)移。
擴(kuò)散隔障在當(dāng)前的上下文中名詞“擴(kuò)散隔障”既指的是限制代謝物向代謝粒子的擴(kuò)散流動(dòng)的不可滲透材料，也是通過其粒子接受的代謝物經(jīng)過分子擴(kuò)散可通過的可滲透材料。在一些情形中它也可能指可滲透材料和不可滲透材料擁有的體積和特定幾何形狀。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中擴(kuò)散隔障包括由不可滲透壁限制的一個(gè)或更多充滿培養(yǎng)基的開口，但它也可以包含其他可滲透材料如硅樹脂或其他聚合物(請(qǐng)看上文)。如果代謝物采用的從大塊培養(yǎng)基到代謝粒子的擴(kuò)散路徑經(jīng)過一個(gè)受限制的區(qū)域，該區(qū)域具有減小的橫截面及/或減小的滲透性如2中的插入物或圖8中的蓋，那么這一區(qū)域是專門限制該面積的積分流量。它因而包括最大和最急劇的代謝物濃度梯度而該裝置的這一部分因此經(jīng)常被提作“擴(kuò)散隔障”。
擴(kuò)散隔室具有朝向外部環(huán)境的確定開口的有確定內(nèi)部尺寸的空間或隔室。在擴(kuò)散隔室內(nèi)的液基材料是停滯的，主要由于在液體與隔室壁之間的摩擦力。在本發(fā)明的裝置和方法中擴(kuò)散隔室也被稱作“隔室”。
不可滲透材料在當(dāng)前的上下文中名詞“不可滲透材料”或“基本不可滲透材料”指一種和水相比對(duì)討論的代謝物具有顯著減少的滲透性的材料，優(yōu)選的和水相比對(duì)討論的代謝物的滲透性減少到＜1％，更優(yōu)選的和水相比對(duì)討論的代謝物的滲透性減少到＜0.2％或＜0.05％，使得通過此材料到代謝物體的面積積分流量比通過可滲透材料(例如開口、可滲透的膜及/或擴(kuò)散隔障)的流量要低很多。通過不可滲透或基本不可滲透材料的面積積分流量應(yīng)為到代謝粒子的總面積積分流量的＜10％，優(yōu)選為＜1％或最優(yōu)選＜0.01％。
發(fā)光光線的產(chǎn)生。在本發(fā)明的上下文中由于發(fā)光體吸收光線并隨后在發(fā)射較長波長的光線后返回基態(tài)而出現(xiàn)發(fā)光。依賴于衰變的類型和壽命這一過程經(jīng)常被提作熒光或磷光。
培養(yǎng)基用于胚胎的液體生長物質(zhì)，如一種液體生長物質(zhì)，優(yōu)選為液體生長物質(zhì)。
薄膜入口質(zhì)譜分析法(MIMS)一種用于測(cè)量氧及其他溶解的氣體的技術(shù)，基于裝備有可透過氣體膜的管，連接到質(zhì)譜儀的入口。由于管內(nèi)的真空(由質(zhì)譜儀施加的)，氣體通過可透過氣體膜進(jìn)入質(zhì)譜儀。隨后質(zhì)譜儀確定所選擇的氣體的濃度。
代謝物在當(dāng)前上下文中名詞“代謝物”指或者是被代謝粒子吸收或者是被代謝粒子釋放的化合物。代謝物的例子包括氧、二氧化碳、氨基酸、葡萄糖、離子象Ca++離子和H3O+離子。
代謝速率代謝粒子消耗或釋放討論的代謝物的速率。該代謝速率既依賴于討論的代謝物也依賴于生物體的活動(dòng)水平。
新陳代謝在當(dāng)前上下文中名詞“新陳代謝”指吸收和釋放代謝物的過程。優(yōu)選的新陳代謝的代謝物是通過呼吸吸入和消耗的氧。
代謝物可滲透開口在當(dāng)前上下文中在隔室中的“代謝物可滲透開口”可以是既可用作標(biāo)示開放開口(即只包含培養(yǎng)基)也表示被遮蓋的開口。后者是這樣的情況即開口被可滲透材料如膜(例如硅樹脂層)覆蓋而構(gòu)成擴(kuò)散隔障，該擴(kuò)散隔障比隔室的其他壁有更強(qiáng)的滲透性。
代謝粒子在當(dāng)前上下文中名詞“代謝粒子”指在一段時(shí)間內(nèi)吸收或釋放代謝物的粒子。代謝粒子的優(yōu)選類型是呼吸粒子其通過呼吸消耗氧。該代謝粒子優(yōu)選是一個(gè)細(xì)胞或一組細(xì)胞，然而代謝粒子也可以是消耗氧的合成粒子。
顯微分光技術(shù)一種基于對(duì)在435nm處的吸收的增大或減小而測(cè)量氧的技術(shù)，反映歸因于氧分壓中的下降或增高的氧基血紅素的離解?？梢允褂镁哂衅渌仗匦缘钠渌踅Y(jié)合分子。
非侵入方法一種方法，其無任何破壞性的干擾，或不需要穿過皮膚或身體洞口插入器械或設(shè)備而能夠測(cè)量關(guān)于相關(guān)身體的參數(shù)。
光學(xué)氧檢測(cè)一種測(cè)量原理，基于氧作為發(fā)光體的動(dòng)態(tài)發(fā)光熄滅劑的能力。發(fā)光體被定義波長激發(fā)，而發(fā)光指示劑發(fā)出作為氧濃度的函數(shù)的光。這一過程經(jīng)常被提作熒光或磷光。由于熄滅作用發(fā)光的亮度和衰減時(shí)間在氧存在下以可預(yù)測(cè)的方式下降。二維的光學(xué)氧檢測(cè)可基于發(fā)光壽命成像，其在一些場(chǎng)合中優(yōu)于發(fā)光亮度成像。
氧分壓氧作為單獨(dú)成分會(huì)施加的壓力?？偟臍怏w壓力是單獨(dú)氣體壓力的和。在正常大氣環(huán)境下總的實(shí)際氣體壓力接近一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓(atm)或1000hPa?？諝庋醴謮航茷?1％或210hPa。氧濃度C等于氧分壓P乘以氧溶解度S，(C＝PS)，其中溶解度S是溫度、鹽度及總氣壓的函數(shù)。
呼吸速率大多數(shù)活的生物體，包括發(fā)育中的胚胎，通過稱作呼吸的過程，在它們的能量代謝中消耗氧。一個(gè)呼吸生物體的氧消耗速率也被叫做呼吸速率。先前已確定人的胚胎的呼吸速率在0.34-0.53nl O2/每胚胎*小時(shí)的范圍，但胚胎呼吸速率在從卵母細(xì)胞經(jīng)過桑椹胚到胚泡階段期間可以相當(dāng)大地變化(看MagnussonC等人1986，“試管中培育的人卵母細(xì)胞及胚泡的氧消耗”，人類生殖1183-184)。牛胚胎典型具有在1-8nl O2/每胚胎*小時(shí)范圍中的呼吸速率。
響應(yīng)時(shí)間從開始測(cè)量到獲得足夠用于測(cè)量的響應(yīng)或信號(hào)的時(shí)間，并可以認(rèn)為該測(cè)量是成功的。
停滯液體沒有任何流動(dòng)、擾動(dòng)或移動(dòng)的液體。溶解物質(zhì)的傳輸主要通過擴(kuò)散發(fā)生。
穩(wěn)定態(tài)一種情形其中消耗和傳輸在平衡中使得氣體分壓或溶解物質(zhì)的濃度梯度是穩(wěn)定的并隨著時(shí)間的過去不發(fā)生分壓或濃度的改變。
基本球形代謝粒子在當(dāng)前上下文中名詞“基本球形粒子”指一個(gè)代謝粒子或一組代謝粒子，其中該組排列為形成大體為球形或橢圓體或方形物體，象一組細(xì)胞，例如多細(xì)胞胚胎。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及確定基本球形代謝粒子的代謝速率。為了不打擾粒子，優(yōu)選的非侵入地確定代謝速率。本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)即可能通過測(cè)量在小體積的該粒子的環(huán)境中的預(yù)定代謝物的濃度而快速而非侵入地確定代謝速率，如果該環(huán)境構(gòu)建為僅允許所述代謝物擴(kuò)散到粒子或從粒子擴(kuò)散。通過這樣的結(jié)構(gòu)在環(huán)境中逐漸出現(xiàn)預(yù)定代謝物的擴(kuò)散梯度并通過測(cè)量在擴(kuò)散梯度的僅一個(gè)位置處的預(yù)定代謝物的濃度，知道在環(huán)境外的濃度，可能計(jì)算出在粒子位置的代謝物濃度并由此確定粒子的代謝速率。
本發(fā)明涉及基本球形代謝粒子。該相關(guān)于本發(fā)明的代謝粒子包括原核或真核細(xì)胞或一組這樣的細(xì)胞，然而代謝粒子也可以是消耗氧的合成粒子。粒子的一種優(yōu)選類型是胚胎、細(xì)胞團(tuán)例如癌細(xì)胞、干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、處于生命階段具有適當(dāng)尺寸和代謝速率的小的多細(xì)胞生物體(即卵、胚胎或一些更大生物體的組織樣品)，例如Caenorhabditis elegans(克氏病原)、Dictyostelium discoideum(網(wǎng)柱原蟲)、Drosophila melanogaster(黑腹果蠅)、Xenopus laevis(有爪蟾蜍)、Arabidopsis thaliana(阿布屬…)、Danio reri(鯉科魚…)、Chlamydomonas reinhardtii(短桿菌肽)、Aplysia californica(锎發(fā)育不全)。最優(yōu)選的粒子包括哺乳動(dòng)物胚胎，如人、?；蚴蟮呐咛?。
被這種粒子吸收或被它們釋放的代謝物通過如例4中概括的分子擴(kuò)散而補(bǔ)充或去除。本發(fā)明的該裝置包括具有其中放置基本球形代謝粒子的隔室的裝置。該隔室包括安排在代謝粒子周圍以限制和減少到和從該粒子的代謝物的擴(kuò)散流量的可滲透和不可滲透材料。如果基本球形代謝粒子設(shè)置在其中代謝物的補(bǔ)充和去除是不受阻礙的通過具有適度代謝速率的有效的球形擴(kuò)散進(jìn)行的環(huán)境中，那么僅對(duì)接近呼吸粒子的很小的體積這些代謝物的濃度被輕微影響。然而如果該粒子放置在限制代謝物的擴(kuò)散再供應(yīng)或去除的隔室中，可以檢測(cè)到在隔室內(nèi)這些代謝物的濃度的可測(cè)量的改變。該包括本發(fā)明的裝置通過不可滲透(或基本不可滲透)表面通過限制代謝物通過分子擴(kuò)散而通過的量能完成這一點(diǎn)。這些表面(或壁)不是完全包圍該代謝粒子，而是留出一個(gè)可滲透開口，經(jīng)由該開口代謝物通過擴(kuò)散而通過?？蓾B透開口可以充滿培養(yǎng)基或另一種可滲透材料?？蓾B透和不可滲透材料在代謝粒子周圍的空間安排構(gòu)成擴(kuò)散隔障。它用于三個(gè)目的1)限制代謝物的流量使得可以用檢測(cè)器測(cè)量與大塊濃度間的局部偏差。2)它使得基于該偏差的數(shù)量能夠確定代謝粒子的代謝速率。3)它限制或消除了代謝物通過紊流向代謝粒子的傳輸。擴(kuò)散隔障的后面的目的實(shí)現(xiàn)通常是通過限制培養(yǎng)基在表面之間，其安置的如此相互接近使得液體不能被表面之間的紊流混合。在例5中展示了對(duì)裝置和擴(kuò)散隔障的許多不同的可能的設(shè)計(jì)的例子。在例4中展示了不同設(shè)計(jì)所導(dǎo)致的理論濃度梯度。在例1和例6中展示了源自具有圓柱形凹陷的隔室的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，而在例7或例3中展示了有胚胎放置在不可滲透表面有或沒有凹陷的情形的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
擴(kuò)散理論在例4中提出，基于下面的文獻(xiàn)Crank J 1997，“擴(kuò)散數(shù)學(xué)”牛津大學(xué)出版社。
如果由基本球形代謝粒子的新陳代謝導(dǎo)致的隔室中的梯度特性，不能被充分描述，或者隔室的內(nèi)部尺寸沒有被確定好，可以使用已知代謝物的攝取及/或釋放的人造基本球形代謝粒子校準(zhǔn)該裝置。用于校準(zhǔn)的人造基本球形代謝粒子可以是具有相關(guān)基本球形代謝粒子的直徑的小球形粒子，例如由氧消耗材料(抗氧化劑)制成的尺寸50-200μm的人造胚胎，象維生素C、E、A、類胡蘿卜素、硒、鈦氯化物、連二亞硫酸鹽、硫化鐵，其嵌入到穩(wěn)定的輔助化合物如淀粉中，或涂覆在惰性球形體象玻璃珠上。
在隔室內(nèi)的代謝物濃度梯度未處于穩(wěn)定態(tài)并仍在逐漸顯現(xiàn)的情況下，該情況可以是在基本球形代謝粒子剛被放置在隔室中后不久的情況，可以仍然通過檢測(cè)在隔室內(nèi)每時(shí)間單位中代謝物濃度梯度的改變確定代謝速率。換句話說穩(wěn)定態(tài)梯度是從一系列隨時(shí)間過去的非穩(wěn)定態(tài)梯度的數(shù)學(xué)模型化的。
代謝物根據(jù)本發(fā)明測(cè)量的代謝物可以是任何相關(guān)的代謝物，其或者被基本球形代謝粒子吸收或被從所述粒子中釋放。代謝物的例子如上面描述的在定義中的。在一個(gè)實(shí)施例中代謝物是氣體，例如氧，其可被通過下面描述的集中方法監(jiān)測(cè)，或該代謝物是二氧化碳，其檢測(cè)方法也在下面描述。
因而，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中本發(fā)明涉及通過測(cè)量氧及/或二氧化碳的氣體分壓確定基本球形代謝粒子的呼吸速率。
隔室如上所述本發(fā)明是基于確定要測(cè)量的代謝物的擴(kuò)散梯度，即在基本球形代謝粒子周圍的物理?xiàng)l件允許確定擴(kuò)散梯度，至少在測(cè)量代謝速率的相關(guān)時(shí)間段內(nèi)。
基本球形代謝粒子被放置及/或培育在具有預(yù)定尺寸的隔室中。隔室優(yōu)選包括包含基本球形代謝粒子的相關(guān)代謝物的培養(yǎng)基。此外，最好隔室與隔室外面連通而允許代謝物經(jīng)由擴(kuò)散進(jìn)入隔室及培養(yǎng)基。由此有可能在較長時(shí)間內(nèi)使用該隔室培育基本球形代謝粒子，而在確定代謝速率時(shí)不必移動(dòng)基本球形代謝粒子。然而，當(dāng)確定代謝速率時(shí)將基本球形代謝粒子移到隔室而隨后再移出隔室，是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
為了確定能夠確定擴(kuò)散梯度的條件，隔室可被擴(kuò)散隔障定義并可以包括培養(yǎng)基，所述擴(kuò)散隔障允許代謝物通過擴(kuò)散到及/或從基本球形代謝粒子的傳輸，由此使得能夠確定從基本球形代謝粒子并貫穿培養(yǎng)基的代謝物擴(kuò)散梯度。
隔室為基本球形代謝粒子建立了一個(gè)本地環(huán)境，允許僅通過擴(kuò)散至少一種代謝物被傳輸?shù)郊?或從基本球形代謝粒子。
在隔室內(nèi)圍繞基本球形代謝粒子的培養(yǎng)基應(yīng)優(yōu)選為保持停滯，使得溶解在培養(yǎng)基中的物質(zhì)傳輸僅通過擴(kuò)散發(fā)生。在隔室外的大塊培養(yǎng)基不是必須是停滯的。停滯如上面所定義。
此外，隔室應(yīng)被設(shè)計(jì)為使得內(nèi)部的培養(yǎng)基保持停滯，并另外使得相關(guān)于要確定代謝速率的基本球形代謝粒子，控制預(yù)定代謝物向隔室的傳輸。
停滯相關(guān)于胚胎的呼吸速率可以解釋停滯的培養(yǎng)基的重要性當(dāng)胚胎在隔室內(nèi)的停滯的培養(yǎng)基中，鄰近胚胎的氧分壓由于胚胎對(duì)氧的消耗，比起隔室外面的氧分壓會(huì)減小。在穩(wěn)定態(tài)情形中，氧的供應(yīng)等于消耗而朝向胚胎的氧分壓梯度是穩(wěn)定的。從擴(kuò)散空間的開口或與胚胎離一定距離，朝向胚胎的梯度的陡度因而是胚胎氧消耗(呼吸)的量度。通過確定在隔室內(nèi)一個(gè)位置的氧分壓或者濃度可測(cè)量胚胎的呼吸速率。一次測(cè)量足以用于確定在上述情況下的呼吸速率。
隔室設(shè)計(jì)及材料可以以幾種方式設(shè)計(jì)隔室，下面討論其范例。
以下討論隔室的兩種不同原則，然而任何類型的隔室其能夠允許確定擴(kuò)散梯度的都落入本發(fā)明范圍內(nèi)。
該兩個(gè)不同原則是●由圍繞空間的壁制成隔室●制作隔室并填充粘性材料使得至少一種代謝物可受控?cái)U(kuò)散。
這樣，關(guān)于第一個(gè)原則隔室可由至少一個(gè)構(gòu)成隔室外邊界的壁確定并能夠保存培養(yǎng)基和基本球形代謝粒子。該壁優(yōu)選對(duì)要測(cè)量的粒子為不可滲透的。在選擇聚合物或共聚物來構(gòu)成提供基本不可滲透擴(kuò)散隔障的材料的情形中，它應(yīng)該具有相對(duì)于填充在隔室中的培養(yǎng)基更低的滲透性的特征。如果壁是可滲透的，壁材料具有相對(duì)于填充在隔室中的培養(yǎng)基更低的滲透性的特征就有很大的重要性。
當(dāng)象這樣的壁是對(duì)要測(cè)量的代謝物基本不可滲透的，該壁必須具有包括至少一個(gè)允許所述代謝物到基本球形代謝粒子的傳輸?shù)拈_口。這樣的開口可以是對(duì)周圍環(huán)境完全開放的或者它可以是被膜部分或全部覆蓋的，其中所述膜允許代謝物到及/或從隔室內(nèi)的傳輸。
圍繞代謝物體的擴(kuò)散范圍的隔障材料(不可滲透部分)應(yīng)擁有限制代謝物或物質(zhì)大體上穿過它們的邊界的通行的能力。因而，隔室壁可以由任何建議限制所述代謝物經(jīng)由其邊界通過的合適的材料制成。塑料、復(fù)合材料、涂料、層壓材料、織物、金屬、玻璃、陶瓷、聚合物如縮醛樹脂、丙烯酸樹脂、纖維素塑料、氟塑料、離聚物、聚對(duì)二甲苯基、聚酰胺、聚酰胺納米合成物、聚碳酸酯、聚酯、聚酰亞胺、聚烯烴、硫化聚苯、聚砜、聚苯乙烯樹脂、乙烯樹脂、可塑合金、多組分聚合物、環(huán)氧樹脂、石蠟熱塑彈性體、聚醚嵌段氨化物、聚丁二烯熱塑彈性體、苯乙烯熱塑彈性體、乙烯熱塑彈性體、橡膠材料如丁二烯橡膠、丁基橡膠、溴丁基橡膠、氯丁基橡膠、聚異丁烯橡膠、氯硫化聚乙烯橡膠、環(huán)氧氯丙烷橡膠、乙烯-丙稀橡膠、氟橡膠、天然橡膠、氯丁橡膠、丁腈橡膠、聚硫橡膠、聚氨酯橡膠、硅橡膠、苯乙烯-丁二烯橡膠、是可用于獲得基本不可滲透隔障層的例子。
材料的滲透性是在對(duì)滲透劑越過隔障的質(zhì)量傳輸?shù)囊话惴匠讨械谋壤?shù)。
Q=ΔmgasΔt=PAΔpλ]]>其中，P是材料/隔障的滲透性，Q＝Δmgas/Δt面積積分流量即傳輸速率，A是面積，I是厚度而Δp是跨越隔障的分壓差。P具有尺寸[P]＝(滲透劑的量*隔障厚度)(面積*時(shí)間*壓力梯度)如上面定義的名詞滲透性最經(jīng)常用在氣體上，而對(duì)其他溶解代謝物所最經(jīng)常用的名詞是擴(kuò)散性(看例4)。在這種情況中Q=J·F=DAΔCλ]]>氣體的擴(kuò)散傳輸可以被任一組方程描述，因?yàn)闈B透性P是擴(kuò)散系數(shù)D和溶解度S的乘積(即P＝S*D)，其中溶解度定義為濃度和分壓的比(即S＝C/p)。擴(kuò)散系數(shù)的常見單位是cm2/s。
滲透性和擴(kuò)散系數(shù)兩者都被溫度影響。作為第一級(jí)近似兩者都約略地遵循經(jīng)典的阿列紐斯關(guān)系隨溫度增長。
停滯的水性培養(yǎng)基在37℃具有對(duì)氧的近似6700cm3mm/(m2天大氣壓)的滲透性。
在代謝物氧的情況下，可滲透材料可以定義為一種材料其具有最多40cm3mm/(m2天大氣壓)23℃的滲透性，例如最多35cm3mm/(m2天大氣壓)23℃的滲透性，例如最多30cm3mm/(m2天大氣壓)23℃的滲透性，例如最多25cm3mm/(m2天大氣壓)23℃的滲透性，例如最多20cm3mm/(m2天大氣壓)23℃的滲透性，例如最多15cm3mm/(m2天大氣壓)23℃的滲透性，例如最多10cm3mm/(m2天大氣壓)23℃的滲透性，例如最多5cm3mm/(m2天大氣壓)23℃的滲透性，例如最多2cm3mm/(m2天大氣壓)23℃的滲透性，例如最多1cm3mm/(m2天大氣壓)23℃的滲透性。
選擇塑料/聚合物的氧滲透性的例子是苯乙烯-丙烯腈共聚物SAN(P＝15-40cm3mm/(m2天大氣壓)24℃)丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物ABS(P＝39.3cm3mm/(m2天大氣壓)25℃)聚氯乙烯聚丁烯對(duì)酞酸鹽PBT(P＝15.5cm3mm/(m2天大氣壓))聚苯硫醚PPS(P＝11.8cm3mm/(m2天大氣壓))聚酰亞胺(P＝10cm3mm/(m2天大氣壓))聚環(huán)己烯二亞甲基(poly cyclo hexylene dimethylene)乙烯對(duì)酞酸鹽PETG(P＝9.97cm3mm/(m2天大氣壓)22.8℃)聚偏二氟乙烯PVDF(P＝1.96cm3mm/(m2天大氣壓))聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯PET(P＝2.4cm3mm/(m2天大氣壓))聚乙烯萘二甲酸酯PEN(P＝0.525cm3mm/(m2天大氣壓))尼龍/聚酰胺(P＝0.4-1.5cm3mm/(m2天大氣壓)液晶聚合物L(fēng)CP(P＝0.037cm3mm/(m2天大氣壓)23℃)乙烯-乙烯醇共聚物EVOH隔障層(即Capran Oxyshield OB P＝0.0021-24cm3mm/(m2天大氣壓))丙烯腈-甲基丙烯酸酯共聚物AMA(P＝0.08-0.64cm3mm/(m2天大氣壓)25℃)在隔室中的開口可以被由代謝物可滲透的材料制成的膜覆蓋，由此該膜構(gòu)成可控?cái)U(kuò)散隔障(看例5中設(shè)計(jì)L，圖8)。
在另一個(gè)實(shí)施例中，整個(gè)隔室的壁可由代謝物可滲透的材料制成，該壁材料唯一規(guī)定的特征是具有相對(duì)于填充在隔室中的培養(yǎng)基更低的滲透性。由此隔室構(gòu)成可控?cái)U(kuò)散隔障。
可滲透膜和不可滲透壁兩者都可以具有膜或象膜一樣的結(jié)構(gòu)或另外的結(jié)構(gòu)，允許代謝物的可控的顯著的傳輸，如氧到及/或從代謝粒子。在代謝物氧的情況下，可滲透材料使能得到可控?cái)U(kuò)散隔障，該滲透性優(yōu)選為至少50cm3mm/(m2天大氣壓)23℃，例如至少60cm3mm/(m2天大氣壓)23℃，例如至少750cm3mm/(m2天大氣壓)23℃，例如至少80cm3mm/(m2天大氣壓)23℃，例如至少90cm3mm/(m2天大氣壓)23℃。
對(duì)氧可滲透材料的合適材料的例子是
聚砜(P＝90.5cm3mm/(m2天大氣壓)23℃)聚丙烯PP(P＝59-102cm3mm/(m2天大氣壓)23℃)環(huán)石蠟共聚物COC(P＝71cm3mm/(m2天大氣壓))聚碳酸酯(P＝90-120cm3mm/(m2天大氣壓))聚苯乙烯PS(P＝117-157cm3mm/(m2天大氣壓))聚乙烯PE(P(ULDPE)＝280，P(LDPE)＝102-188，P(HDPE)＝35-110，P(LLDPE)＝98-274cm3mm/(m2天大氣壓))乙烯-丙烯酸共聚物EAA(P＝178-550cm3mm/(m2天大氣壓))聚四氟乙烯PTFE特氟綸(P＝223cm3mm/(m2天大氣壓)25℃)乙烯-醋酸乙烯共聚物EVA(P＝177-210cm3mm/(m2天大氣壓))一個(gè)滲透性非常高的聚合物的例子硅樹脂(P＝17280cm3mm/(m2天大氣壓))這些提到的材料僅構(gòu)成例子而可以選擇具有適當(dāng)?shù)臐B透性和特性的其他材料以獲得在所述呼吸粒子周圍的擴(kuò)散隔障的恰當(dāng)組合。在Liesl K.Massey“塑料及彈性體的滲透性特性”，包裝及包裝材料指南第二版P57-507附有滲透系數(shù)地列出了更多相關(guān)聚合物的例子。在Brandrup & Immergut，聚合物手冊(cè)第四版中還列出了更多的例子。
在一個(gè)特定實(shí)施例中，隔室由具有至少一個(gè)氣體可滲透開口的氣體不可滲透材料制成。所述開口由氣體可滲透材料覆蓋。在一個(gè)特定實(shí)施例中側(cè)壁和底部由氣體不可滲透材料制成。隔室包括基本球形代謝粒子在合適的培養(yǎng)基中，隔室直接通過開口或隔室外的更大體積的培養(yǎng)基與已知?dú)怏w組成并溫度和濕度受控的大氣開放連通。氧及其他溶解物質(zhì)直接從大氣或由與大氣在平衡下的更大體積培養(yǎng)基，通過確定的擴(kuò)散隔室經(jīng)由穿過隔室內(nèi)的停滯培養(yǎng)基的擴(kuò)散，供應(yīng)到基本球形代謝粒子。在兩種情況中均要知道在隔室外的氧分壓?；蛘咧来髿獾慕M成或者大塊培養(yǎng)基要與已知組成的大氣處于平衡。
在另一實(shí)施例中隔室或者由高粘性的培養(yǎng)基確定或者被更高粘性及/或極性的培養(yǎng)基包圍。
市售培養(yǎng)基(從例如Sigma，Medicult，“試管內(nèi)生命”Nidacon)通常具有近似象同樣鹽度的水的擴(kuò)散系數(shù)。這樣的培養(yǎng)基可以通過或者在培養(yǎng)基中懸浮不可滲透粒子或物體或者增大培養(yǎng)基的粘性來改變。
為了減小孔隙率及因而擴(kuò)散系數(shù)D，可以通過懸浮不可滲透粒子或物體改變培養(yǎng)基。當(dāng)氣體或其他代謝物在液體和不可滲透粒子的混合物中擴(kuò)散時(shí)，D混合物＝D液體*孔隙率。
培養(yǎng)基也可通過增大粘性來改變，以獲得具有更高粘性和顯著減小的擴(kuò)散系數(shù)的培養(yǎng)基。這樣的培養(yǎng)基可以通過加入基本惰性的有機(jī)溶質(zhì)如葡萄聚糖、甘油、糖、碳水化合物、蛋白質(zhì)、有機(jī)聚合物或無機(jī)鹽來形成。
通過加入有機(jī)聚合物如淀粉、瓊脂糖或其他凝膠反應(yīng)物也可以不明顯影響擴(kuò)散系數(shù)來改變粘性。這可能對(duì)減少在大的自由液體空間中的擾動(dòng)混合是重要的。
此外，培養(yǎng)基可以被例如覆層油如石蠟油或硅油或其他醫(yī)用油包圍，該油構(gòu)成與相同培養(yǎng)基量相比相似或不同的擴(kuò)散隔障。溶解度和對(duì)紊流和擴(kuò)散流動(dòng)的傳輸系數(shù)在油和水之間可以是不同。
隔室形狀隔室在原則上可呈每一種合適的用于確定討論的代謝物的擴(kuò)散梯度的形狀。然而，隔室的形狀應(yīng)優(yōu)選為也便于處理基本球形代謝粒子，尤其是關(guān)于基本球形代謝粒子的插入和取出。在當(dāng)前上下文中形狀指隔室的內(nèi)部尺寸。隔室的外部尺寸可以是任何實(shí)用的形狀。
因此，隔室的形狀可以從圓柱形、多面體形、圓錐形、半球形或者其結(jié)合的一組之中選出。在優(yōu)選實(shí)施例中形狀是圓柱形、圓錐形、兩個(gè)圓柱形的結(jié)合或圓錐形和圓柱形的結(jié)合。在附圖中示出實(shí)例。更優(yōu)選的，形狀是圓柱形。
隔室尺寸隔室尺寸要形成為能夠象上面討論的確定擴(kuò)散梯度。從這方面來說，關(guān)于基本球形代謝粒子的代謝物的吸收及/或釋放的隔室的尺寸是重要的。由于指定基本球形代謝粒子的代謝物的吸收及/或釋放經(jīng)常依賴于基本球形代謝粒子的尺寸，涉及基本球形代謝粒子的尺寸的隔室的尺寸是有關(guān)聯(lián)的。
下面討論的尺寸涉及大體為圓柱形的隔室及具有哺乳動(dòng)物胚胎的尺寸即依賴于發(fā)育階段和物種大約是直徑在30-400微米之間的基本球形代謝粒子。對(duì)于其他基本球形代謝粒子本領(lǐng)域技術(shù)人員可相應(yīng)計(jì)算合適的尺寸。
典型地，隔室的橫向尺寸小于2.5mm，特別是小于1.5mm，尤其是小于500微米，例如小于250微米。
隔室的縱向尺寸在一個(gè)實(shí)施例中是在2到25mm之間，特別是在3到15mm之間。縱向尺寸通常是構(gòu)成擴(kuò)散隔障的培養(yǎng)基的垂直高度。概括來說它是從代謝粒子到大塊培養(yǎng)基的與擴(kuò)散梯度垂直的距離。
該尺寸可以是象這樣的隔室的尺寸，或者該尺寸的提供可以是通過在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)隔室中插入一個(gè)或更多插入物由此便于使用相同類型的隔室測(cè)量幾個(gè)不同類型的基本球形代謝粒子的代謝速率。
在一個(gè)實(shí)施例中隔室具有至少一個(gè)用于調(diào)節(jié)隔室橫向尺寸的插入物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中圓柱形插入物的內(nèi)橫向尺寸如上定義，例如小于2.5mm，特別是小于1.5mm，尤其是小于500微米，例如小于300微米。
在另一實(shí)施例中，也可通過向隔室提供可調(diào)節(jié)底部來調(diào)節(jié)尺寸，例如其中隔室形成有象活塞的底部。由此隔室的尺寸既可以增加也可以減小。
在特定的合適的情況下可調(diào)節(jié)底部可以與一個(gè)或更多插入物結(jié)合使用。
隔室的功能尺寸也可通過改變隔室中的培養(yǎng)基的體積來改變。通過增加或減少培養(yǎng)基的定義的量可以以可控的方式改變隔室中的培養(yǎng)基水平。這個(gè)的功能原理涉及代謝物氧必須擴(kuò)散穿過停滯培養(yǎng)基的距離的增加或下降，相應(yīng)于有效擴(kuò)散隔室的尺寸的改變并因而控制代謝物從固定成分的隔室外面向基本球形代謝粒子的傳輸。有了調(diào)節(jié)培養(yǎng)基水平及因此在任何代謝速率時(shí)基本球形代謝粒子經(jīng)受的代謝物濃度到想要的水平的選項(xiàng)，可以確定基本球形代謝粒子的代謝速率。
代謝物可滲透層在一個(gè)實(shí)施例中基本球形代謝粒子設(shè)置在隔室中在一層代謝物可滲透層上。由此從所有側(cè)面向基本球形代謝粒子供應(yīng)代謝物而產(chǎn)生更優(yōu)的環(huán)境。代謝物可滲透膜的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它可便于如下討論的對(duì)代謝物濃度的測(cè)量。代謝物可滲透層最好設(shè)置在所述至少一個(gè)隔室的底部，其中底部如上所述定義。
代謝物可滲透層可由任何對(duì)討論的代謝物為可滲透的材料制造，如上面討論的代謝物可滲透膜。代謝物可滲透層尤其可由包括硅樹脂、特氟綸含氟聚合物、可塑化合物例如聚乙烯、聚丙烯或氯丁橡膠的材料制造。
在另一個(gè)實(shí)施例中代謝物可滲透層由包括可滲透充填物或多孔材料如玻璃、陶瓷、礦物質(zhì)、玻璃或礦物纖維、或貴金屬如金或鉑的材料制造。
在又一實(shí)施例中代謝物可滲透層由包括硅樹脂的材料制造。
代謝物可滲透層的厚度被形成用于如上所述其應(yīng)適于的目的的尺寸。在優(yōu)選實(shí)施例中代謝物可滲透層的厚度優(yōu)選為至少是基本球形代謝粒子的直徑的兩倍，如至少100微米、特別是至少300微米，及尤其是至少900微米。
檢測(cè)方法優(yōu)選用非侵入方法測(cè)量在隔室內(nèi)的代謝物濃度。應(yīng)依賴于討論的代謝物適當(dāng)選擇該方法。
在一個(gè)實(shí)施例中代謝物是被基本球形代謝粒子消耗的氧。氧檢測(cè)可基于具有不動(dòng)的發(fā)光體的光學(xué)檢測(cè)(看定義)、具有溶解在培養(yǎng)基中的發(fā)光體的光學(xué)檢測(cè)、顯微分光技術(shù)、電化學(xué)地基于包括Clack型氧傳感器的氧傳感器、MIMS技術(shù)(薄膜入口質(zhì)譜分析法)或任何其他的可被本領(lǐng)域技術(shù)人員想到的檢測(cè)手段。在本發(fā)明一個(gè)單獨(dú)實(shí)施例中使用不動(dòng)的發(fā)光體層及用發(fā)光讀出器或相機(jī)如CCD相機(jī)或光電倍增管記錄該發(fā)光來確定氧分壓或濃度。
光學(xué)氧傳感器主要基于發(fā)光熄滅的原理。氧濃度越低，熄滅變得越弱而觀測(cè)到增大的發(fā)光?；谛拚腟tern-Volmer方程得到下面等式C=I0-IKSV(I-I0α)---(1)]]>其中α是發(fā)光的不可熄滅部分，I0是沒有氧時(shí)的發(fā)光強(qiáng)度，而KSV是表達(dá)不動(dòng)發(fā)光體的熄滅效率的常數(shù)(Stern和Volmer 1919，Klimant等人1995)。濃度可基于簡單的三點(diǎn)測(cè)定來計(jì)算。
對(duì)具有長的磷光壽命的發(fā)光體已經(jīng)發(fā)展一種可供選擇的光學(xué)檢測(cè)原理。當(dāng)氧濃度在發(fā)光體周圍的環(huán)境中下降時(shí)，磷光壽命(在一次閃光之后)以系統(tǒng)的方式延長。
對(duì)于這種類型傳感器的磷光的氧依賴被Stern-Volmer關(guān)系描述τ0/τ＝1+Kq·τ0·PO2其中，τ0和τ分別是無氧和氧分壓為PO2時(shí)的磷光壽命，而Kq(熄滅常數(shù))是二次項(xiàng)速度常數(shù)其涉及在氧和卟啉的被激發(fā)三重態(tài)之間的碰撞頻率及當(dāng)碰撞發(fā)生時(shí)能量轉(zhuǎn)移的概率。為計(jì)算氧分壓PO2，必須測(cè)量熄滅常數(shù)和在無氧時(shí)的壽命。
與更經(jīng)常使用的基于強(qiáng)度的系統(tǒng)相對(duì)比，發(fā)光壽命的測(cè)量提供某些優(yōu)點(diǎn)，如對(duì)光致漂白、染料的不均勻分布或流失、或被激發(fā)光的強(qiáng)度的改變不敏感。這便于使用簡單的光學(xué)系統(tǒng)或光纖。已經(jīng)提出了一種新的一類氧敏染料，卟啉酮，其展示了良好的光譜特性和十和百毫秒量級(jí)的衰減時(shí)間。這允許使用簡單的光電子電路和低成本的電子處理組件。
近來，發(fā)展了基于將用于氧的平面光學(xué)傳感器薄片與成像技術(shù)結(jié)合使用的用于高的空間分辨率研究的新方法。此處，該傳感器薄片可以安裝在透明的樣品容器的內(nèi)部，并通過用電荷耦合裝置(CCD)相機(jī)從外面監(jiān)測(cè)該傳感器薄片，在傳感器薄片的氧依賴發(fā)光中的改變可被監(jiān)測(cè)并用于測(cè)量在樣品中的氧的二維分布。這些薄片可既用于基于強(qiáng)度的測(cè)量也用于基于壽命的測(cè)量。它們可被用作在本文中描述的新型裝置中的內(nèi)部檢測(cè)器。氧發(fā)光體的例子是金屬有機(jī)物染料，如釕(II)聚吡啶絡(luò)合物、釕(II)聯(lián)吡啶絡(luò)合物、釕(II)二亞胺絡(luò)合物、卟啉絡(luò)合物、二(組氨酸合)鈷(II)，鉑1，2，烯二硫醇鹽(enedithiolate)。優(yōu)選由在聚苯乙烯基質(zhì)中固定不動(dòng)的釕(II)-三(tris)-4，7-聯(lián)苯-1，10-菲咯啉高氯酸鹽(Rudpp)、釕(II)-三-1，7-聯(lián)苯-1，10-菲咯啉氯化物、釕(II)-三(聯(lián)吡啶)絡(luò)合物、三(2，2’-聯(lián)吡啶二氯-釕)六水合物、Ru(bpy)、在聚苯乙烯中的鉑(II)-八-乙基-卟啉、在聚(甲基丙烯酸甲酯)中的鉑(II)-八-乙基-卟啉、在聚苯乙烯中的鉑(II)-八-乙基-酮-卟啉、鉑(II)-八-乙基-酮-卟啉、在聚苯乙烯中的鈀(II)-八-乙基-卟啉制成氧發(fā)光體。
關(guān)于使用光學(xué)氧傳感器和用于其他代謝物如葡萄糖、pH和二氧化碳的傳感器的更多信息可在下面列出的文獻(xiàn)中找到。
因而，在一個(gè)實(shí)施例中氧檢測(cè)器可以是電化學(xué)的或其他氧檢測(cè)原理的。
在一個(gè)特定實(shí)施例中在隔室的底部完成氧濃度的確定，而在另一個(gè)實(shí)施例中用于確定氧的裝置放置在隔室的底部在代謝物可滲透層下面并至少一個(gè)基本球形代謝粒子放置在該氣體可滲透層上，使得代謝物可滲透層處于基本球形代謝粒子和代謝物檢測(cè)器之間。
在一個(gè)實(shí)施例中氧分壓由具有尖頭直徑不超過隔室的橫向直徑的Clark型電化學(xué)氧微傳感器確定，其放置在隔室的底部，傳感器尖頭穿透隔室的氧不可滲透底壁。氧可滲透層將傳感器尖頭與基本球形代謝粒子分開。氧傳感器應(yīng)為這樣的設(shè)計(jì)即傳感器的被分析物(氧)消耗不應(yīng)超過基本球形代謝粒子的呼吸速率的可忽略部分如1％，這樣在隔室內(nèi)的氧分壓梯度不會(huì)被所述傳感器的測(cè)量活動(dòng)干擾。
在另一個(gè)實(shí)施例中Clark型氧傳感器被穿透隔室的氧不可滲透底部的MIMS光纖代替。一個(gè)氣體可滲透層將MIMS光纖尖頭與胚胎分開。該MIMS光纖應(yīng)為這樣的設(shè)計(jì)即傳感器的被分析物(任何可穿過MIMS光纖膜并可在質(zhì)譜儀上檢測(cè)的氣體)消耗不應(yīng)超過基本球形代謝粒子的消耗或產(chǎn)生速率的可忽略部分如1％，這樣在隔室內(nèi)的特定氣體的分壓梯度不會(huì)被所述MIMS光纖的測(cè)量活動(dòng)干擾。
在又一實(shí)施例中，通過加入氧血紅蛋白或另一種具有氧依賴吸收特性的分子到培養(yǎng)基，并通過隔室的透明側(cè)壁測(cè)量在435nm或另一合適波長的吸收梯度，即由此去定在隔室中的氧分布，而確定在隔室內(nèi)的氧分壓梯度。
其他代謝物可以通過使用用于這些代謝粒子的發(fā)光指示劑來測(cè)量，如用于二氧化碳的、Ca2+、及葡萄糖的發(fā)光指示劑。
此外，在隔室中指定的位置可以測(cè)量顯示在隔室中的代謝物的濃度的pH。
裝置根據(jù)本發(fā)明的裝置包括至少一個(gè)如上所述的隔室。在優(yōu)選實(shí)施例中該裝置包括一個(gè)以上隔室，例如至少兩個(gè)隔室，例如至少4個(gè)隔室，例如至少6個(gè)隔室，例如至少8個(gè)隔室，例如至少12個(gè)隔室，例如至少24個(gè)隔室，例如至少48個(gè)隔室，例如至少96個(gè)隔室。由此，每個(gè)隔室包括一個(gè)基本球形代謝粒子，可以容易地確定一個(gè)以上的基本球形代謝粒子的代謝速率。
優(yōu)選地，隔室適于培育基本球形代謝粒子。在一個(gè)實(shí)施例中該裝置是常規(guī)的用于細(xì)胞培育的48或96井裝置。然而，當(dāng)測(cè)量基本球形代謝粒子時(shí)，常規(guī)的井具有的開口對(duì)允許確定梯度來說是太大了。因此，該井可以設(shè)置如上所述的插入物?？梢允窃谡麄€(gè)培育期間都設(shè)置該插入物，或僅在確定代謝物梯度和測(cè)量代謝物濃度期間設(shè)置。
培育裝置本發(fā)明還設(shè)計(jì)一個(gè)最優(yōu)的用于培育如上定義的代謝粒子的裝置，其中，所示裝置包括至少一個(gè)如上所述的隔室。因此，本發(fā)明設(shè)計(jì)一種用于培育代謝粒子的裝置，該裝置包括至少一個(gè)隔室，所述隔室由擴(kuò)散隔障確定并能包括具有代謝粒子的培養(yǎng)基，所述擴(kuò)散隔障允許代謝物經(jīng)由擴(kuò)散到及/或從代謝粒子的傳輸，由此允許建立從代謝粒子并貫穿培養(yǎng)基的代謝物擴(kuò)散梯度。
隔室優(yōu)選為如上所述，除了在培育裝置中不是必須包括檢測(cè)器以外。因此該裝置可包括一個(gè)以上隔室，例如至少兩個(gè)隔室，例如至少4個(gè)隔室，例如至少6個(gè)隔室，例如至少8個(gè)隔室，例如至少12個(gè)隔室，例如至少24個(gè)隔室，例如至少48個(gè)隔室，例如至少96個(gè)隔室。
由于能如上所述容易地監(jiān)測(cè)并最優(yōu)化圍繞細(xì)胞和生物體的微環(huán)境，該裝置為細(xì)胞和生物體的培育提供了最優(yōu)的條件。
因此，本發(fā)明還涉及用于培育粒子的方法，所述方法包括a)提供至少一個(gè)如此處定義的裝置，b)在隔室培養(yǎng)基中安排代謝粒子，及c)培育代謝粒子。
將該培育方法和任何如此處所述的其他方法結(jié)合是在本發(fā)明的范圍中。
確定代謝速率的方法在另一方面本發(fā)明涉及用于確定基本球形代謝粒子的代謝速率的非侵入方法。所述方法包括a)提供至少一個(gè)如此處定義的裝置，b)在隔室培養(yǎng)基中安排代謝粒子，c)測(cè)量在隔室中的代謝物濃度獲得代謝物濃度的量，及d)將所述代謝物濃度的量與所述基本球形代謝粒子的代謝速率聯(lián)系起來，由此確定基本球形代謝粒子的代謝速率代謝物可以是如上所述的。該代謝物可以經(jīng)由擴(kuò)散穿過培養(yǎng)基被供應(yīng)到或從基本球形代謝粒子除去，例如氧經(jīng)由擴(kuò)散穿過培養(yǎng)基被供應(yīng)到基本球形代謝粒子。在后者的情形中，代謝物濃度可以是氣體分壓，例如氧或二氧化碳的氣體分壓。
優(yōu)選地，基本球形代謝粒子在隔室中培育，使得不會(huì)發(fā)生由于確定代謝速率引起的對(duì)基本球形代謝粒子的不必要的干擾。
代謝物的濃度可以在比隔室的體積及/或培養(yǎng)基的體積更小的體積中測(cè)量。優(yōu)選地，所述基本球形代謝粒子的代謝速率通過基于測(cè)量的代謝物濃度確定在隔室中的代謝物擴(kuò)散梯度，及將所述代謝物擴(kuò)散梯度與所示基本球形代謝粒子的代謝速率聯(lián)系起來而確定。
代謝速率可以通過完成代謝物濃度的一次測(cè)量或幾次測(cè)量如至少兩次測(cè)量來確定。此外，在培育期間到監(jiān)測(cè)基本球形代謝粒子的狀態(tài)期間可以一次以上地確定代謝速率。
如上所述，當(dāng)代謝物是氣體，如氧，該氣體可以直接從大氣或從與大氣處于平衡的較大體積的培養(yǎng)基，經(jīng)由擴(kuò)散穿過在隔室中的停滯的培養(yǎng)基被供應(yīng)到基本球形代謝粒子。
封閉呼吸計(jì)量法根據(jù)本發(fā)明的裝置還可用于通過封閉呼吸計(jì)量法測(cè)量粒子如基本球形代謝粒子的呼吸速率。封閉呼吸計(jì)量法是對(duì)在封閉呼吸運(yùn)動(dòng)細(xì)胞即其中至少暫時(shí)停止氧的供應(yīng)的細(xì)胞的呼吸速率的測(cè)量。本裝置通過應(yīng)用對(duì)代謝物如氧不可滲透材料的蓋在裝置的隔室中的任何開口上，可轉(zhuǎn)變?yōu)榉忾]呼吸運(yùn)動(dòng)細(xì)胞。該蓋可由上面提到的任何不可滲透材料制成。
因此，本發(fā)明還涉及一種用于確定代謝粒子的代謝速率的非侵入方法，包括a)提供至少一個(gè)如上面定義的裝置，b)在隔室培養(yǎng)基中培育代謝粒子，c)至少在部分培育期間減少對(duì)培養(yǎng)基的代謝物的供應(yīng)d)在已經(jīng)減少了代謝物以后，測(cè)量在隔室中的代謝物濃度獲得代謝物濃度的量，及e)將所述代謝物濃度的量與所述基本球形代謝粒子的代謝速率聯(lián)系起來。
關(guān)于封閉呼吸計(jì)量法，代謝物經(jīng)常是氧而代謝速率是呼吸速率。在該方法中氧的供應(yīng)優(yōu)選為減少到零。
優(yōu)選地，在減少供應(yīng)期間已經(jīng)得到代謝物濃度的量。
代謝物供應(yīng)的調(diào)節(jié)在另一方面本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)對(duì)在隔室中的粒子如基本球形代謝粒子的代謝物供應(yīng)的方法。
因此，本發(fā)明還涉及用于調(diào)節(jié)對(duì)基本球形代謝粒子在培育期間的代謝物供應(yīng)的方法，包括a)提供至少一個(gè)包括具有培養(yǎng)基的隔室的裝置，b)在隔室培養(yǎng)基中培育基本球形代謝粒子，c)測(cè)量在隔室中的代謝物濃度獲得代謝物濃度的量，并可選的d)將所述代謝物濃度的量與所述基本球形代謝粒子的代謝速率聯(lián)系起來e)依賴于代謝物濃度的量及/或所述基本球形代謝粒子的代謝速率調(diào)節(jié)代謝物供應(yīng)。
該方法特別涉及其中代謝物是氣體如氧以及代謝過程是呼吸的測(cè)量。
該隔室優(yōu)選為如此處定義的適于允許建立代謝物擴(kuò)散梯度的隔室。
可以用任何適當(dāng)?shù)姆绞綄?shí)施對(duì)代謝物供應(yīng)的調(diào)節(jié)。在一個(gè)實(shí)施例中是通過改變?cè)诟羰彝獾拇x物濃度實(shí)施該調(diào)節(jié)。
在另一實(shí)施例中通過改變隔室的尺寸實(shí)施調(diào)節(jié)。如上所述，可以用幾種方式改變體積。此處的一個(gè)例子是其中通過插入插入物調(diào)節(jié)尺寸，例如其中通過插入一個(gè)插入物來調(diào)節(jié)隔室的橫向尺寸。通過移動(dòng)隔室的可調(diào)節(jié)底部的位置也可以調(diào)節(jié)縱向尺寸。
在第三實(shí)施例中，通過改變隔室的擴(kuò)散隔障實(shí)施該調(diào)節(jié)。這可以通過改變隔室壁的厚度或改變?cè)诟羰冶谥械闹辽僖粋€(gè)開口的尺寸來實(shí)施。
對(duì)基本球形代謝粒子的監(jiān)測(cè)本發(fā)明還涉及對(duì)基本球形代謝粒子的監(jiān)測(cè)及選擇在如被代謝速率量度的存活能力方面具有高品質(zhì)的基本球形代謝粒子。
在優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明涉及對(duì)可存活胚胎的選擇，例如一種用于選擇可存活胚胎的方法包括，a)在培育期間至少一次確定胚胎的代謝速率，b)選擇具有最優(yōu)代謝速率的胚胎。
確定代謝速率優(yōu)選為在如本發(fā)明所定義的裝置中實(shí)施及使用此處描述的方法。此外，胚胎優(yōu)選為在所述裝置的隔室中培育。
由此便于實(shí)施確定代謝速率而不引起胚胎經(jīng)歷的成長環(huán)境的任何改變。
附圖的詳細(xì)描述下面將參照附圖描述本發(fā)明的許多不同的實(shí)施例，但可以理解的是這些實(shí)施例僅構(gòu)成一般性的發(fā)明概念的示例，而本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想出其他的實(shí)施例。
在圖1中示出的用于測(cè)量胚胎呼吸的本發(fā)明的實(shí)施例說明了一端為開放的縱向隔室1.4。隔室的底部，其可以是圓柱形的，包括在透明氧敏發(fā)光體1.3之上的氣體可滲透物質(zhì)1.6。擴(kuò)散隔室的底壁1.5由透明材料制成其允許對(duì)胚胎的放大視覺檢察。底壁1.5由象玻璃或塑料這樣的氣體不可滲透材料制成，使得唯一的氧供應(yīng)是通過隔室1.7的開口。在隔室底部發(fā)光體層1.3中的氧分壓，其測(cè)量是借助于外部的發(fā)光讀出器通過透過透明底壁1.5記錄從在隔室底部的氧發(fā)光體1.3來的發(fā)光。在一個(gè)實(shí)施例中可以是大塊培養(yǎng)基的周圍部分1.2與已知或未知?dú)怏w組成的大氣處于平衡中。該裝置容納一個(gè)或幾個(gè)放置在氣體可滲透物質(zhì)1.6上的胚胎1.1，在一個(gè)實(shí)施例中該物質(zhì)是硅樹脂，在透明氧敏發(fā)光體1.3之上。氣體可滲透物質(zhì)1.6可以是硅樹脂化合物、特氟龍含氟聚合物、塑料化合物象聚乙烯、聚丙烯或氯丁橡膠、可滲透基體或基于另一種化學(xué)上惰性材料象玻璃、陶瓷或礦物、玻璃纖維或礦物纖維或象金或鉑的貴金屬的多孔材料。
本發(fā)明的功能原理是胚胎的氧消耗與在大塊培養(yǎng)基/周圍部分1.2的氧分壓相比，其減小在氧檢測(cè)器(發(fā)光體)1.3的氧分壓。只要胚胎的氧消耗是不變的，氧分壓梯度1.8會(huì)處于穩(wěn)態(tài)，為穩(wěn)定的并不經(jīng)受變化。在包括縱向圓柱形擴(kuò)散隔室的本實(shí)施例中，氧分壓梯度是如圖1中示出的線性的。在圖4中示出真實(shí)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。因此可用在所述擴(kuò)散隔室1.4的底部1.3和開口1.7的氧分壓之間的差值，使用Ficks 1擴(kuò)散定律(方程1)，確定胚胎的氧消耗，J=-DdCdx---(1)]]>假定從開口向在底部的胚胎的氧線性下降(看理論圖線1.8)，其中J是氧的流量其在穩(wěn)態(tài)中等于胚胎的消耗，D是已知的培養(yǎng)基的擴(kuò)散系數(shù)而dC/dx是氧梯度。梯度dC/dx是在隔室的開口1.7處的確定的大氣或培養(yǎng)基的的氧分壓和底部在胚胎1.1水平面上的氧分壓之間的差值。在本發(fā)明中使用光學(xué)氧發(fā)光體1.3覆蓋隔室1.4的底部，會(huì)綜合在整個(gè)底部區(qū)域的氧信號(hào)。從與胚胎相關(guān)的不均勻分布的氧消耗產(chǎn)生的，在胚胎水平面的水平氧梯度會(huì)被平均化，就好像該消耗是均勻分布在底部區(qū)域上一樣，使得胚胎的確切位置變得與呼吸估算無關(guān)。
因而通過單獨(dú)的氧分壓的測(cè)量其通過在隔室內(nèi)的不動(dòng)的氧檢測(cè)器從擴(kuò)散隔室外面進(jìn)行而不打擾胚胎，可確定個(gè)體胚胎的呼吸速率。該測(cè)量可在幾秒中完成而不對(duì)胚胎有任何打擾。依賴于檢測(cè)器手段，該測(cè)量可以在是例如培育箱或溫暖房間的培育室中完成，或者該測(cè)量可以在培育室外面在非常短的時(shí)間內(nèi)完成，這樣不會(huì)明顯影響胚胎經(jīng)受的生長環(huán)境。
通過使用本發(fā)明隔室陣列，可同時(shí)掃描多個(gè)胚胎的單獨(dú)的呼吸速率。在一個(gè)實(shí)施例中至少一個(gè)隔室包括至少5個(gè)隔室，特別是至少10個(gè)隔室，更特別是至少24個(gè)隔室，及尤其是至少96個(gè)隔室。
在另一實(shí)施例中個(gè)體胚胎在分開的隔室中生長而在又一個(gè)實(shí)施例中每個(gè)隔室包括一個(gè)以上胚胎。
圖2示出在第一實(shí)施例中的插入物10，其用作調(diào)節(jié)縱向隔室2.4的橫向尺寸A。通過變窄或增大橫向尺寸擴(kuò)散隔室的通過擴(kuò)散傳輸溶解物質(zhì)的能力可以被增大或減小。擴(kuò)散隔室的傳輸能力決定在胚胎位置的穩(wěn)態(tài)氧分壓。
在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中在胚胎位置的氧分壓是通過調(diào)節(jié)隔室2.4的尺寸來控制。這一點(diǎn)可通過幾種方式做到，例如通過調(diào)節(jié)可調(diào)節(jié)底部3.10的位置(看圖3)、通過降低或提高在隔室內(nèi)的培養(yǎng)基的水平面、或通過引入插入物2.9(看圖2)到隔室中，該插入物會(huì)減小橫向尺寸A。
在一個(gè)實(shí)施例中氣體可滲透層2.6的厚度是至少100微米，特別是至少300微米，及尤其是至少900微米。氣體可滲透層的厚度應(yīng)優(yōu)選為胚胎的直徑的兩倍或更大，對(duì)哺乳動(dòng)物胚胎其典型是30-400微米之間，依賴于物種和發(fā)育階段。
圖3示出本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例。與在圖1中示出的第一實(shí)施例的元件相同的元件以如圖1上相同的附圖標(biāo)記標(biāo)示(看附例)。該實(shí)施例包括隔室3.4，例如圓柱形的隔室，在一端具有開口3.7，而具有可移動(dòng)或可調(diào)節(jié)的底部3.10，該底部具有在氧敏發(fā)光體3.3之上的氣體可滲透層3.6。底壁3.10對(duì)隔室壁3.5密封使得該密封是氣體不可滲透的。
在本發(fā)明第二實(shí)施例中的隔室的尺寸由于可移動(dòng)底部3.10可以以可控的方式，或者增加或者減少從隔室3.7的開口到胚胎3.1的氧的擴(kuò)散長度來改變。通過增加或減小隔室3.4的長度，在胚胎3.1水平面處的穩(wěn)態(tài)氧分壓可以或者被減少或者被增加以達(dá)到想要的氧分壓，并不影響完成呼吸估計(jì)的可能性。以這種方式確定胚胎的呼吸速率可以有在任何呼吸速率調(diào)節(jié)胚胎經(jīng)受的氧分壓到想要的水平的選擇權(quán)。
圖5是本發(fā)明又一實(shí)施例其中在生長盤中的全部體積的培育培養(yǎng)基確定隔室5.4，其因而比在本發(fā)明其他實(shí)施例中的要大的多。生長盤的底部5.5是透明的并覆蓋有發(fā)光體5.3，在該發(fā)光體上放置了一個(gè)或幾個(gè)相互離開一距離的胚胎5.1，其足夠大典型為大于2毫米以避免在胚胎之間的分壓梯度的重疊。本實(shí)施例的功能原理是如在圖5B中所示氧從與在胚胎上隔室外的大氣接觸的周圍培養(yǎng)基供應(yīng)到胚胎。當(dāng)隔室相對(duì)胚胎為非常大，最后得到的朝向胚胎的氧梯度會(huì)如在圖5B中的氧分壓等高線5.11所示那樣是球形的，而圖6是真實(shí)數(shù)據(jù)。構(gòu)成擴(kuò)散隔室的生長盤放置在CCD相機(jī)5.12上，該相機(jī)通過光學(xué)氧傳感在二維上解析在發(fā)光體5.3中的氧的水平分布。從CCD相機(jī)5.12來的對(duì)應(yīng)每個(gè)胚胎5.1周圍區(qū)域的信號(hào)因而會(huì)成為個(gè)體胚胎呼吸的量度。該效果在圖5C中示出，圖5C示出如從CCD相機(jī)看到的圖像，其中以灰階顯現(xiàn)在每個(gè)個(gè)體胚胎周外的發(fā)光體的發(fā)光強(qiáng)度。通過將記錄的胚胎周圍的氧分壓梯度與假定理想球形擴(kuò)散的理論模型相對(duì)照，估計(jì)胚胎的呼吸。理論上可描述在自由擴(kuò)散空間的朝向氧消耗體的氧梯度如果已知在a的濃度(C1)和在b的濃度(C2)，可以描述在a和b(a＜r＜b)的空心球中的指定點(diǎn)r的濃度C(Crank 1997)。在a和b之間沒有氧消耗。
C(r)=aC1(b-r)+bC2(r-a)r(b-a)]]>(方程II)給出擴(kuò)散穿過球形壁的氧的流量JJ=4πDabb-a(C2-C1)]]>(方程III)其中D是氧在培養(yǎng)基中的擴(kuò)散系數(shù)。
該梯度圍繞該氧消耗體對(duì)稱并可被任一穿過該體中心的平面鏡像。因此可以認(rèn)為一個(gè)氧消耗體在此例中為胚胎，其放置在大的隔室(直徑大于1厘米而高度大于2毫米)的底部的平的表面，作為球的中心，僅是從半球供應(yīng)被胚胎消耗的氧。當(dāng)將記錄的梯度與理論模型對(duì)照，計(jì)算出的呼吸速率(穿過球形壁的氧流量)應(yīng)因此除以二。在擴(kuò)散隔室中的梯度的自然狀態(tài)，其由胚胎的呼吸引起，不能被完全的描述，可通過使用具有已知氧消耗的人造胚胎來校準(zhǔn)該裝置。該實(shí)施例也適于用于用氧分布的2D記錄在相同隔室底部培育的胚胎之間進(jìn)行呼吸速率的相對(duì)比較。
范例例1放置牛胚胎在直徑1毫米及深4毫米的圓柱形隔室的底部，并在氧分壓為55hPA的大氣下培育。從隔室的開口朝向胚胎以100微米的間隔測(cè)量在隔室內(nèi)的穩(wěn)態(tài)氧分壓梯度。在達(dá)到穩(wěn)態(tài)前的時(shí)間t(秒)可通過下面的公式近似得出，t=0.45l2D]]>(從J.Crank 1995，擴(kuò)散數(shù)學(xué))其中l(wèi)是擴(kuò)散隔室的深度單位厘米而D是培養(yǎng)基的擴(kuò)散系數(shù)。因此直徑1毫米及深4毫米的隔室中的穩(wěn)態(tài)在大約35分鐘后達(dá)到，假定D為3.5×105。使用具有尺寸10微米的尖頭的Clarck型氧微傳感器，其被用微型機(jī)械手定位。如在圖4中示出的數(shù)據(jù)示出穿過隔室的線性梯度。因而足夠知道在隔室的上部和底部的氧分壓以確定該梯度。此外從圖4可明顯看出可通過從開口朝向胚胎，在隔室內(nèi)的線性梯度的任一點(diǎn)上測(cè)量氧分壓來確定梯度。
為了實(shí)際目的，以及當(dāng)使用發(fā)光體層時(shí)，將用于氧檢測(cè)的裝置放置在隔室的底部是更便利的。
例2在胚胎處理后，通過吸液管將每個(gè)個(gè)體胚胎轉(zhuǎn)移到隔室中(試管內(nèi)培育、克隆、解凍或另一技術(shù)，看例如“試管內(nèi)受精”，KayElder，BrianDale 2001修訂第二版劍橋大學(xué)出版社，對(duì)胚胎處理技術(shù)有大體的描述)。隔室被包括在具有幾個(gè)隔室的更大的機(jī)架中，這樣從一個(gè)或幾個(gè)人或動(dòng)物的一組或幾組胚胎，可以被容納在具有多個(gè)隔室或多組隔室的單一機(jī)架內(nèi)。然后在預(yù)期的條件中孵育該機(jī)架，該條件對(duì)人胚胎來說典型是37℃，在氮?dú)庵?-21％O2及5％CO2，100％濕度，在市售培養(yǎng)基(例如從斯堪的納維亞IVF科學(xué)AB來的IVF-50，Gteborg Sweden)中生長。培養(yǎng)基的選擇依賴于可接受質(zhì)量控制和可得到的培養(yǎng)基而非任何特定的類型。可以使用用于胚胎培育的相對(duì)簡單的平衡鹽溶液。Earle、Tyrode和Hepes的培養(yǎng)基已被成功引進(jìn)。這些市售培養(yǎng)基作為單一濃度或濃縮溶液。通過將機(jī)架放置在特別設(shè)計(jì)的發(fā)光讀出器中完成該呼吸測(cè)量，該讀出器產(chǎn)生從在每個(gè)個(gè)體隔室底部的發(fā)光體來的發(fā)光信號(hào)。在測(cè)量后該機(jī)架被立刻放回到培育室中。用關(guān)于每個(gè)個(gè)體隔室尺寸的信息計(jì)算實(shí)際呼吸速率。如果在胚胎的位置的氧分壓不在指定的最優(yōu)間隔內(nèi)，例如5-10％，可調(diào)節(jié)隔室的尺寸及從而氧分壓，例如用適當(dāng)?shù)牟迦胛铩?br>
在試管內(nèi)培育期間盡所要求的經(jīng)常完成呼吸測(cè)量。然后使用胚胎呼吸速率，典型地與形態(tài)學(xué)評(píng)估結(jié)合，作為選擇用于轉(zhuǎn)移到受體的胚胎的基礎(chǔ)。
試管內(nèi)形態(tài)評(píng)估基于胚胎的幾個(gè)特征。這樣的評(píng)估方法是主觀的并非常依賴經(jīng)驗(yàn)。胚胎是球形的并由被似膠的殼包圍的細(xì)胞(卵裂球)、叫做膜環(huán)pellucida的非細(xì)胞母體組成。膜環(huán)pellucida完成多種功能直到胚胎孵化，并是胚胎評(píng)估的良好標(biāo)記。膜環(huán)是球形的及半透明的，并應(yīng)是與細(xì)胞殘骸可清楚辨別的。在對(duì)胚胎的形態(tài)評(píng)估的重要原則是(1)胚胎的形狀；(2)膜環(huán)pellucida的存在；(3)尺寸；(4)顏色；(5)與其發(fā)育階段有關(guān)的胚胎的年齡的知識(shí)；及(6)卵裂球膜的完整性。在胚胎發(fā)育期間，卵裂球數(shù)目幾何增長(1-2-4-8-16-等等)。同步細(xì)胞分裂大體維持到胚胎的16細(xì)胞階段。在這以后，細(xì)胞分裂變得不同步并最后各個(gè)細(xì)胞有它們自己的細(xì)胞周期。作為球形細(xì)胞在16細(xì)胞階段之前，組成胚胎的細(xì)胞應(yīng)可容易地識(shí)別出來。在32細(xì)胞階段(桑椹胚階段)之后，胚胎經(jīng)歷致密。結(jié)果是，難以在此階段后評(píng)估在胚胎中的各個(gè)細(xì)胞。在不育治療中產(chǎn)生的人胚胎通常在桑椹胚階段前轉(zhuǎn)移到受體，然而其他哺乳動(dòng)物的胚胎在轉(zhuǎn)移到受體或排除之前經(jīng)常被實(shí)驗(yàn)培育到更遠(yuǎn)的發(fā)育階段(膨脹胚泡)。
例3模型化的半球擴(kuò)散圖6A示出向放置在較大隔室的平的底部的牛胚胎的氧輪廓。圖6B顯示出在C(r)對(duì)a/r的相同的數(shù)據(jù)，其中a是從球形中心(胚胎的中心)到氧輪廓的選定的端點(diǎn)(朝向胚胎)的距離。在輪廓在胚胎表面開始的情況中，a是胚胎的半徑(a也可以被選在遠(yuǎn)離胚胎的一點(diǎn))。對(duì)非常大的b值(當(dāng)C2是這是大塊濃度)，如果C(r)對(duì)a/r是線性的，則滿足關(guān)于球形擴(kuò)散的假定。
通過球面且在點(diǎn)a的氧流量可如前面描述的來計(jì)算。如6B示出在此特定例子中因?yàn)樵摼€不是完全線性的，沒有完全滿足完美球形擴(kuò)散的假定。因此對(duì)a的選擇會(huì)影響消耗的評(píng)估，其不是完美配合的情況。
例4擴(kuò)散理論1.向恒定消耗源的擴(kuò)散在具有消耗一化合物的代謝粒子或物體的擴(kuò)散系統(tǒng)中，通過擴(kuò)散將該化合物傳向消耗源。通過Fick第一定律可描述擴(kuò)散的量-流量J=-DdCdx,]]>(4.1.1)(Crank，1997)其中D是擴(kuò)散系數(shù)，C是濃度，而x是軸沿該軸考慮流量。
在穩(wěn)態(tài)，在系統(tǒng)中在任何位置朝向消耗源的面積分?jǐn)U散流量是不變的。面積分流量定義為擴(kuò)散系統(tǒng)垂直于對(duì)稱軸的橫截面，F(xiàn)。假設(shè)是正的假定，Q可表達(dá)為-J·F＝Q，其代入方程4.1.1得DdCdx·F=Q]]>(4.1.2)下面會(huì)將這些方程應(yīng)用到一套幾何形狀中(側(cè)面平行多面體、圓柱形、球形)，可認(rèn)為這些形狀代表本發(fā)明的不同的實(shí)施例。例如計(jì)算懸在擴(kuò)散系數(shù)為3.45·10-5cm2s-1(在38℃)的水中的氧呼吸粒子。
2.一維系統(tǒng)(平行多面體或圓柱形)如果擴(kuò)散化合物濃度及物理邊界僅在一維上變化，擴(kuò)散系統(tǒng)被定義為一維的。一維系統(tǒng)的一個(gè)例子是無限大的平的薄片。如果可忽略邊界效應(yīng)，在底部有消耗源的側(cè)面平行井被認(rèn)為是一維擴(kuò)散系統(tǒng)。
在穩(wěn)態(tài)，數(shù)學(xué)上可描述一維擴(kuò)散為d2Cdx2=0]]>(Crank，1997)積分后得到dCdx=A,]]>(4.2.1)再積分得到C＝Ax+B，(4.2.2)其中A和B是積分常數(shù)。
考慮長度為h的一維系統(tǒng)，其在x＝h處有固定濃度Cw，及在x＝0處有固定的源點(diǎn)濃度Q。在一維擴(kuò)散系統(tǒng)中，橫截面面積F作為x的函數(shù)是常數(shù)。
將方程式4.2.1應(yīng)用到方程式4.1.2得到D·A·F＝Q(4.2.3)在x＝h處的濃度等于Cw，根據(jù)方程式4.2.2得到C(h)＝Ah+B＝Cw(4.2.4)通過聯(lián)合方程式(4.2.3)和(4.2.4)來求解A和B，方程式(4.2.2)可以寫為
C(x)=CW+QF·D(x-h)]]>(4.2.5)考慮到在x＝0處濃度為C0，方程式4.2.5可被重新整理而得到Q=(CW-C0)F·Dh·(4.2.6)]]>因而，如果已知F、D、h和Cw，使用方程式4.2.6通過測(cè)量C0可計(jì)算消耗速率。
在例6完成的測(cè)量中應(yīng)用此方法，在例6中擴(kuò)散系統(tǒng)是以直徑0.5毫米的側(cè)面平行圓柱形井的形式，相應(yīng)產(chǎn)生0.00196cm2的表面積F，深度h為4毫米，比起在井的頂部的21％的氧(對(duì)應(yīng)210μM)在井的底部測(cè)得的氧濃度為17％(對(duì)應(yīng)169μM)，其可轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)于0.546毫微升/小時(shí)的6.7710-6nmol/s的消耗率。
3.基本上是二維的圓柱形系統(tǒng)(盤形)在圓柱形擴(kuò)散系統(tǒng)中，擴(kuò)散的發(fā)生沿圓柱體的半徑，而沿圓柱形系統(tǒng)的縱軸沒有變化。如果可忽略邊緣效應(yīng)，可以將由盤形本體及在其中心的擴(kuò)散源組成的擴(kuò)散系統(tǒng)認(rèn)為是圓柱形系統(tǒng)。
在穩(wěn)態(tài)，數(shù)學(xué)上可描述圓柱形擴(kuò)散為ddr(rdCdr)=0]]>(Crank，1997)，積分后得到rdCdr=A,]]>(4.3.1)再積分得到C＝A+Blnr，(4.3.2)其中A和B是積分常數(shù)。
考慮長度為l及半徑為r1的圓柱形系統(tǒng)，其在r＝r1處具有恒定濃度Cw，并具有在r＝0處恒定濃度Q的源點(diǎn)。
將方程式4.3.1應(yīng)用到方程式4.1.2得到D·Ar·F=Q]]>(4.3.3)在r＝r1處濃度等于Cw，根據(jù)方程式4.3.2得到C(r1)＝A+Blnr1＝Cw(4.3.4)。
在圓柱形擴(kuò)散系統(tǒng)中，橫截面面積F是r的函數(shù)
F＝2π·r·l (4.3.5)通過聯(lián)合方程式4.3.3、4.3.4和4.3.5來求解A和B，方程式(4.3.2)可寫為C(r)=CW+Q2π·l·Dln(r/r1)]]>(4.3.6)，考慮在另一點(diǎn)r0處濃度為C0，在擴(kuò)散系統(tǒng)中，方程式4.3.6可被重新整理而得到Q=(CW-C0)·2π·l·Dln(r1/r0).]]>(4.3.7)這樣，如果已知l、D、r0、r1及Cw，可使用方程式4.3.7通過對(duì)C0的測(cè)量計(jì)算出消耗速率。
如果圓柱形擴(kuò)散系統(tǒng)構(gòu)建為將直徑10mm的圓形不可滲透盤放置在不可滲透表面上50μm并放置直徑100μm的氧呼吸粒子且在盤的中心的下面的氧呼吸速率為1nl氧/小時(shí)，根據(jù)方程式4.3.6最后得到的在粒子表面處的穩(wěn)態(tài)濃度將是157μM。
4.球形系統(tǒng)(錐形-半球形)三維系統(tǒng)在球形擴(kuò)散系統(tǒng)中，擴(kuò)散的發(fā)生是沿球的半徑或球的扇區(qū)。如果可忽略邊緣效應(yīng)，可以將由錐形本體和在其尖端的消耗源組成的擴(kuò)散系統(tǒng)認(rèn)為是球形系統(tǒng)。
在穩(wěn)態(tài)，數(shù)學(xué)上可描述球形擴(kuò)散為ddr(r2dCdr)=0]]>(Frank，1997)，積分得到r2dCdr=A,]]>(4.4.1)再積分得到C=B+Ar,]]>(4.4.2)其中A和B是積分常數(shù)。
考慮半徑為r1的球形系統(tǒng)，其在r＝r1處具有恒定濃度Cw，并具有在r＝0處恒定濃度Q的源點(diǎn)。
將方程式4.4.1應(yīng)用到方程式1.2得到
D·Ar2·F=Q]]>(4.4.3)在r＝r1處的濃度等于Cw，根據(jù)方程式4.4.2得到C(r1)=B+Ar1=CW]]>(4.4.4)。
在圓柱形擴(kuò)散系統(tǒng)中，橫截面面積F是半徑r的函數(shù)，如果系統(tǒng)是錐形，F(xiàn)可被描述為F=2π·r2·(1-cosθ2)]]>(4.4.5)，其中θ是錐形的頂角。通過聯(lián)合方程式4.4.3、4.4.4及4.4.5來求解A和B，方程式(4.4.2)可被重新寫為C(r)=CW-Q2π·D·(1-cosθ2)(1r-1r1)(4.4.6),]]>考慮在另一點(diǎn)r0處濃度為C0，在擴(kuò)散系統(tǒng)中，方程式x4.6可被重新整理而得到Q=(CW-C0)·2π·D(1-cosθ2)(1r0-1r1)-1(4.4.7).]]>這樣，如果已知D、r0、r1、θ及Cw，可使用方程式4.4.7通過對(duì)C0的測(cè)量計(jì)算出消耗速率。
在例7完成的測(cè)量中應(yīng)用此方法，在例7中在r0＝0.015cm(胚胎表面)處發(fā)現(xiàn)C0＝206μM，而D＝3.45·10-5·cm2·s-1，r1＝0.04cm，θ＝60°，Cw＝210μM，得到呼吸速率為0.11nl/小時(shí)。
文獻(xiàn)Crank，J.1997。擴(kuò)散數(shù)學(xué)。牛津大學(xué)出版部印刷所。
例5本發(fā)明所述的新型裝置的示例本專利申請(qǐng)的附圖中示出了用于此處描述的新型裝置的15個(gè)不同的設(shè)計(jì)。這些變化中的許多是功能相當(dāng)?shù)脑O(shè)計(jì)以便于操作代謝粒子及/或調(diào)節(jié)擴(kuò)散隔障來保證對(duì)代謝粒子的最優(yōu)化孵育條件。根據(jù)在培養(yǎng)基內(nèi)并非常接近隔室產(chǎn)生的代謝物濃度梯度的類型可將它們編組為幾個(gè)種類。該四個(gè)種類是1.具有線性代謝物濃度梯度的一維系統(tǒng)
2.具有對(duì)數(shù)代謝物濃度梯度的二維系統(tǒng)3.具有雙曲線形代謝物濃度梯度的三維系統(tǒng)(錐形-半球形)4.不規(guī)則系統(tǒng)，其為上述的組合并且其需要更復(fù)雜的模型來描述濃度梯度在前面的例子(例4)中詳細(xì)描述了與該三個(gè)種類的每一個(gè)相關(guān)的擴(kuò)散理論。使用導(dǎo)出的方程式，我們展示一個(gè)例子，其為怎樣設(shè)計(jì)及形成每一類裝置的示例的尺寸以對(duì)具有給定呼吸速率的代謝粒子得到想要的傳感器信號(hào)。我們的標(biāo)準(zhǔn)示例涉及向懸在水性培養(yǎng)基中的呼吸胚胎的氧擴(kuò)散。我們會(huì)用到下面的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)消耗速率，Q＝1.0毫微升/小時(shí)(＝1.24·10-5nmol·s-1)，氧擴(kuò)散系數(shù)D＝3.45·10-5cm2s-1(在38℃)。
在培養(yǎng)基中的氧濃度，Cw＝210μM，在38℃想要的傳感器信號(hào)比大塊培養(yǎng)基低30％(即C0＝147μM，在38℃)具有線性代謝物濃度梯度的一維系統(tǒng)在例4中的第二部分描述了與這樣一種系統(tǒng)相關(guān)的擴(kuò)散方程式。如果我們假定圓柱形的高h(yuǎn)為3毫米，那么假設(shè)F=π(d/2)⇔d=2F/π]]>我們可以使用方程式4.2.6來計(jì)算圓柱形的直徑d，d=4·Q·hπ·D·(CW-C0)---(5.1)]]>給定上面的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)我們發(fā)現(xiàn)圓柱形的直徑必須減小到約470μm以對(duì)具有預(yù)期氧呼吸速率的目標(biāo)給出想要的信號(hào)。
設(shè)計(jì)A，在圖1中示出，在不可滲透材料中的開孔。此設(shè)計(jì)是在不可滲透材料(1.5)中的簡單的圓柱形開孔。它也可以是具有類似尺寸的矩形或多面體形孔洞。代謝粒子(1.1)放置在底部檢測(cè)器(1.3)(其可以是，但不限于是一層可從上方或透過透明底部(1.5)觀測(cè)的發(fā)光體)上方的一層可滲透材料1.6上面?？蓾B透層(1.6)的目的是使在非常接近代謝粒子(1.1)處提供的水平代謝物濃度梯度變均勻。因而從檢測(cè)器(1.3)觀測(cè)到的信號(hào)實(shí)際上是均勻地穿過它的表面。在非常接近代謝粒子處的濃度梯度會(huì)稍微偏離理想的線性曲線，但如果開孔的高寬比較高(即h＞＞d)那么這些輕微的扭曲是無關(guān)緊要的。在開口(1.7)外面，我們預(yù)期半球形的梯度其濃度快速地呈現(xiàn)出大塊流體的濃度。為了所有實(shí)際的目的我們因而將該系統(tǒng)認(rèn)為是具有上面方程式描述的特性的一維系統(tǒng)，其中流量受開孔的高寬比控制。應(yīng)將開孔的直徑保持在較小從而在代謝粒子上方的培養(yǎng)基柱中不發(fā)生劇烈地混合。此設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)是它的簡單性。它已被成功地用于在例1中描述的氧微電極實(shí)驗(yàn)中。此設(shè)計(jì)的兩個(gè)缺點(diǎn)是1)難以取回沉置在深且狹窄開孔中的代謝粒子，2)無法根據(jù)代謝粒子的代謝速率調(diào)整擴(kuò)散隔障設(shè)計(jì)B，在圖11中示出，具有可更換的頂部的開孔。此設(shè)計(jì)與前面討論的簡單開孔(設(shè)計(jì)A)非常相似。它包括兩個(gè)不可滲透件。在由不可滲透材料(例如玻璃)制成的容器中充滿培養(yǎng)基(11.5)。在此容器上放置一小塊不可滲透材料(11.5)其具有穿過其中心的圓柱形(或多面體形)孔(11.4)。在孔面對(duì)容器表面的一端該孔被挖空(挖洞)以形成放置呼吸粒子(11.1)的小孔。該孔的頂壁覆蓋有代謝物檢測(cè)器(11.3)。只要放置代謝粒子的孔“室”較小而孔的高寬比較大，那么此設(shè)計(jì)等價(jià)于上面討論的簡單開孔。由玻璃件制成的具有氧敏發(fā)光體的此設(shè)計(jì)的原型已被成功用于如例6中所述的對(duì)鼠胚胎的呼吸速率的測(cè)量。此裝置比起上面描述的中央開孔其優(yōu)點(diǎn)是通過分開兩個(gè)不可滲透件(即移除頂部“煙囪”)可以從裝置中去除代謝粒子。也可以更換頂部以提供具有不同直徑或長度的中心孔的不同的擴(kuò)散隔障。然而，其主要的缺點(diǎn)是難以將兩個(gè)不可滲透件平穩(wěn)地安裝，以使在它們之間的界面處沒有在其中代謝物可沿界面橫向擴(kuò)散的水平間隙。
設(shè)計(jì)C，在圖2中示出，具有插入物的開孔。此設(shè)計(jì)與設(shè)計(jì)A(圖1)相同。唯一的差別是在開口(2.9)中的不可滲透插入物，其將開孔的橫截面從圖1中的A減少到圖2中的B。橫截面被減小會(huì)增大擴(kuò)散阻隔并因而減小在隔室中在插入物(2.4)下面的代謝物濃度。此設(shè)計(jì)的主要優(yōu)點(diǎn)是通過在有不同的開孔直徑的插入物之間的換用能夠調(diào)節(jié)擴(kuò)散隔障。如果先移除插入物以增大開孔的直徑，則也更易于移除代謝粒子，及便于接近代謝粒子。缺點(diǎn)是插入物和開孔要求的尺寸使它們非常難以操作，因?yàn)樗鼈兎浅Ｐ〔⒈仨毎惭b得非常好以避免在插入物和開口之間的代謝物可能通過其擴(kuò)散的間隙。
設(shè)計(jì)D，在圖15中示出，彎曲毛細(xì)管。此設(shè)計(jì)在功能上與設(shè)計(jì)A等同。它包括一個(gè)彎曲的不可滲透毛細(xì)管(15.5)其具有一個(gè)封閉端(或非常遠(yuǎn)的開口從而可忽略從后端的代謝物的擴(kuò)散傳輸)，及在另一端有一個(gè)漏斗。代謝粒子放置在漏斗端(15.7)并允許通過重力停留在毛細(xì)管的最低點(diǎn)(15.1)，該毛細(xì)管放置在浸沒在容納培養(yǎng)基(15.2)的容器中的兩個(gè)保持架(標(biāo)記為15.4的黑色三角形)上。對(duì)代謝物敏感的檢測(cè)器放置在兩個(gè)嵌條(15.3)中以檢測(cè)代謝物濃度梯度。如果有兩個(gè)嵌條那么最外面的嵌條可作為參照，且只要嵌條比呼吸粒子更接近開口就不需要知道從開口(15.7)到代謝粒子(15.1)的距離。如果一個(gè)嵌條相比代謝粒子(15.1)在離開開口(15.7)更遠(yuǎn)的距離上那么必須知道前者和后者之間的距離。毛細(xì)管的直徑必須是足夠小以防止湍流。此設(shè)計(jì)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能夠通過在保持架上傾斜毛細(xì)管調(diào)節(jié)擴(kuò)散隔障，從而重力使代謝粒子(15.1)朝向或遠(yuǎn)離開口(15.7)移動(dòng)(滾動(dòng))因而改變代謝物必須通過擴(kuò)散穿過的距離。此裝置的最大的問題是使代謝粒子進(jìn)入毛細(xì)管。漏斗會(huì)起作用但會(huì)使這樣的裝置更難于建造。
設(shè)計(jì)E，在圖3中示出，具有可調(diào)節(jié)底部的開孔。此設(shè)計(jì)與設(shè)計(jì)A相同，圓柱形(多面體形)開孔(3.4)在具有放置在底部可滲透層(3.6)上在代謝物敏感檢測(cè)器之上的代謝物(3.1)的不可滲透材料(3.5)中。然而此設(shè)計(jì)使用活塞(3.10)來得到擴(kuò)散隔障的可調(diào)節(jié)的高度h，它因此可以調(diào)節(jié)開孔的高寬比及因此在開孔底部的代謝物濃度。此處通過移動(dòng)有固定壁的底部來實(shí)現(xiàn)高度的可調(diào)節(jié)，然而相同的效果可通過保持底部靜止而向后移動(dòng)該壁(如下面的設(shè)計(jì)G)來達(dá)到同樣的效果。可調(diào)節(jié)底部(3.10)有兩個(gè)目的1)通過改變擴(kuò)散隔障調(diào)節(jié)向呼吸粒子的代謝物供應(yīng)，及2)便于從裝置中移除代謝粒子。主要的缺點(diǎn)是要求開孔直徑微小及導(dǎo)致的活塞的小尺寸。作為進(jìn)一步復(fù)雜化，它們必須安裝得非常好以避免在活塞和開孔之間代謝物可通過其擴(kuò)散的間隙。從底部即通過活塞(3.10)測(cè)量從代謝物敏感檢測(cè)器(3.3)也可能較為困難。
設(shè)計(jì)F，在圖7中示出，具有檢測(cè)器活塞的吸液管。此設(shè)計(jì)是一個(gè)怎樣實(shí)現(xiàn)上述設(shè)計(jì)E的例子。它示出了特定的實(shí)施例，其中可調(diào)節(jié)底部形成有吸液管，用它從轉(zhuǎn)移容器中拾取要研究的代謝粒子。吸液管(7.10)的柱塞的特殊之處在于它包括代謝物檢測(cè)器(7.3)。在已經(jīng)拾取呼吸粒子(7.1)以后，轉(zhuǎn)動(dòng)吸液管使尖頭朝上并通過端口(7.14)插入到培養(yǎng)基容器的底部中。隨后將培養(yǎng)基容器充滿培養(yǎng)基(7.2)。吸液管的管筒作為隔室的側(cè)壁(7.5)。
設(shè)計(jì)G，在圖16中示出，具有帶螺紋的可調(diào)節(jié)底部的開孔。此設(shè)計(jì)在功能上與前面兩個(gè)相當(dāng)，但其調(diào)節(jié)是以略微不同的方式實(shí)現(xiàn)的。它包括具有可調(diào)節(jié)尺寸的中央開孔(16.4)及同樣通過轉(zhuǎn)動(dòng)可調(diào)節(jié)頂部(16.17)可調(diào)節(jié)周圍的壁(16.5)相對(duì)固定底部(16.10)的高度。通過逆時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)(l6.17)，可減小擴(kuò)散隔障的厚度即液體層(16.4)的厚度，由此(16.17)通過螺紋(16.18)被移向包含周圍培養(yǎng)基(16.2)的較大井的底部。由于隔室(16.10)的底部相對(duì)較大的井的底部固定，這導(dǎo)致隔室容積的下降及因此可滲透層(16.4)的厚度的下降及因此可滲透性的增大。檢測(cè)器(16.3)從隔室的底部向包含周圍培養(yǎng)基的較大的井的底部延伸，在那里它與記錄單元接觸。因?yàn)槌藱z測(cè)器表面(16.10)在代謝粒子(16.1)下面，檢測(cè)器材料(16.3)嵌入在不可滲透井材料中，同一代謝物濃度應(yīng)當(dāng)在所有的檢測(cè)器材料中觀測(cè)到。因而可以將檢測(cè)器延伸到在代謝粒子下面的水平盤。該盤可作為物理信號(hào)放大器，用于使用嵌入不可滲透材料中的對(duì)代謝物敏感的發(fā)光體但從下方觀測(cè)的光學(xué)檢測(cè)原理。因?yàn)檎麄€(gè)檢測(cè)器體積作為代謝物的儲(chǔ)室其必須處于平衡以獲得穩(wěn)態(tài)信號(hào)，這種類型的信號(hào)放大或?qū)е聶z測(cè)器的反應(yīng)較慢。盡管這樣在其他設(shè)計(jì)中這種類型的被動(dòng)信號(hào)放大也可是有用的。該提出的設(shè)計(jì)的主要優(yōu)點(diǎn)是當(dāng)頂部被一路旋轉(zhuǎn)下來時(shí)，對(duì)擴(kuò)散隔障的漸進(jìn)調(diào)整及對(duì)代謝粒子的容易的操作。主要的缺點(diǎn)是要求開孔直徑微小及導(dǎo)致活塞小尺寸。進(jìn)一步的復(fù)雜化是，它們必須安裝得非常好以避免在活塞和開孔之間代謝物可通過其擴(kuò)散的間隙。
具有對(duì)數(shù)代謝物濃度梯度的二維系統(tǒng)在這個(gè)種類的設(shè)計(jì)中代謝粒子安置在兩個(gè)不可滲透的平坦表面之間使得可滲透材料(即培養(yǎng)基)構(gòu)成盤。在盤形圓筒中我們有基本上是放射狀的擴(kuò)散。在圓柱形擴(kuò)散系統(tǒng)中，擴(kuò)散沿圓柱形的半徑發(fā)生，而沿圓柱形系統(tǒng)的縱軸沒有改變。如果可忽略邊緣效應(yīng)，則形成由盤構(gòu)成的擴(kuò)散系統(tǒng)。在例4中的第三部分描述了關(guān)于這樣的系統(tǒng)的擴(kuò)散方程。如果我們假定在代謝粒子下面的檢測(cè)器盤的半徑是r0＝0.5mm，而布置在代謝粒子上面的平坦表面的外徑是r1＝5mm。那么我們可以使用方程式4.3.7來計(jì)算在不可滲透平坦表面之間的距離l以獲得想要的檢測(cè)器信號(hào)l=Q·ln(r1/r0)2π·D·(CW-C0).]]>給出上面的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)我們發(fā)現(xiàn)對(duì)有預(yù)期氧呼吸速率的物體要給出想要的信號(hào)，平坦表面之間的距離必須是20.1μm。
設(shè)計(jì)H，在圖9中示出，在不可滲透板之間的擴(kuò)散盤。這是一個(gè)其中代謝粒子(9.1)放置在靠近檢測(cè)器(9.3)在不可滲透盤(9.5)下面的設(shè)計(jì)。該盤，其構(gòu)成基本不可滲透的隔室的壁的上部，被間隔物(9.15)支撐以保持到基本不可滲透的隔室的壁(9.5)的下部的定好的距離。代謝粒子(9.1)放置在板中的一個(gè)淺井中。以陰影線示出間隔物(9.15)以示它們僅占據(jù)盤下一小部分區(qū)域并不構(gòu)成對(duì)擴(kuò)散的顯著阻隔。通過改變支撐基本不可滲透隔室壁的上壁(蓋)的間隔物的高度可調(diào)節(jié)擴(kuò)散隔障。主要的缺點(diǎn)是需要高度平坦的表面使得在板之間的距離保持不變。在相對(duì)較大的10mm的直徑上對(duì)平面度的偏離必須僅為幾μm，以避免危及在不可滲透表面之間的間隙的均勻性。另一個(gè)問題是放置和移除緊密配合的蓋要不太明顯地打擾代謝粒子。
設(shè)計(jì)I，在圖10中示出，以包起來的擴(kuò)散盤作為錐形體的表面。這是一個(gè)與前面的設(shè)計(jì)功能上相當(dāng)?shù)脑O(shè)計(jì)，同樣是可用于代謝物的擴(kuò)散傳輸?shù)目蓾B透空間限制在兩個(gè)不可滲透表面之間。然而，在這個(gè)例子不可滲透表面不是平坦的而是由一個(gè)不可滲透錐形蓋(10.5)插入到在不可滲透板(10.5)的錐形空腔中。代謝粒子(10.3)放置在充滿培養(yǎng)基(10.2)的錐形空腔，在那里通過重力它到達(dá)停留在空腔的底部尖端。檢測(cè)器(10.3)設(shè)置在靠近代謝粒子在空腔的尖端，錐形不可滲透蓋放置在空腔中。間隔物(10.15)保證在蓋和空腔之間保持定好的距離。此設(shè)計(jì)對(duì)比前面設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)是代謝粒子的密度使它下沉到在空腔的底部的檢測(cè)器的位置。仍然必須以非常小的容差小心地控制在兩個(gè)不可滲透件之間的間隔，這是較不易完成的。
具有雙曲線濃度梯度的三維系統(tǒng)(圓錐-半球)在這個(gè)種類的設(shè)計(jì)中代謝粒子放置在平坦的不可滲透表面或在這樣的表面的圓錐形凹陷處中。這兩種情況都是球形擴(kuò)散系統(tǒng)的例子，其中不可滲透材料限制了代謝物能夠接近代謝粒子的角度。如果我們將觀測(cè)到的流動(dòng)表達(dá)為錐形凹陷處的角度的函數(shù)，那么代謝粒子在不可滲透表面的半球形擴(kuò)散圖案可以由角度θ＝180°的同一組方程式來描述。在例4的第四個(gè)部分中描述了關(guān)于這樣的系統(tǒng)的擴(kuò)散方程式。如果我們假定錐形在代謝粒子的位置處的半徑是r0＝0.5mm，而錐形凹陷處的外徑是r1＝3mm。那么我們可以使用方程式4.4.7來計(jì)算在錐形的尖端的圓錐頂角θ以獲得想要的檢測(cè)器信號(hào)
θ=2·cos-1[1-Q(1r0-1r1)2π·D·(CW-C0)]---(5.3)]]>給出上面的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)我們發(fā)現(xiàn)對(duì)具有預(yù)期氧呼吸速率的物體要給出想要的信號(hào)錐形的頂角必須是20°。這對(duì)應(yīng)于深2.5mm的錐形孔，其具有1.05mm的開口和170μm寬的底部。在例7中舉出了一個(gè)朝向呼吸粒子的代謝物濃度梯度的例子，在此例中鼠胚泡在錐形孔中。
設(shè)計(jì)J，在圖5A中示出，在檢測(cè)器板上的代謝粒子。此設(shè)計(jì)是某種擴(kuò)散隔室中可能實(shí)現(xiàn)的最簡單的，該種擴(kuò)散隔室是完全敞開的且由嵌入到代謝粒子(5.1)被放置的表面中的檢測(cè)器(5.3)在二維上記錄代謝物梯度。5B示出顯示代謝物的濃度等高線(5.11)的在代謝粒子的水平上的底部的橫截面。5C示出如同從CCD相機(jī)(5.12)中看到的假設(shè)的圖像(頂視圖或底視圖)，其中在每個(gè)個(gè)體代謝粒子周圍的預(yù)期的檢測(cè)器信號(hào)以灰階顯示。在這種類型的結(jié)構(gòu)中已經(jīng)測(cè)量了靠近牛胚胎的微電極的輪廓。在例3中介紹了該實(shí)驗(yàn)。此設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)是簡單，主要的缺點(diǎn)是在確定非?？拷x粒子的局部代謝物濃度時(shí)必須的精確度。因?yàn)榍蛐螖U(kuò)散在短距離上是非常有效的空間分辨率是至關(guān)緊要的。
設(shè)計(jì)K，在圖17中示出，具有錐形凹陷處的板。此設(shè)計(jì)包括具有500-3000μm深的有適當(dāng)角度30(例如15到60度)錐形凹陷處的不可滲透板(17.5)，其放置在又一個(gè)具有親水表面的輕微的凹陷處。該板表面的剩余部分是憎水的。有適當(dāng)體積10-20μl的一滴(17.2)充滿了該兩個(gè)凹陷處并構(gòu)成可滲透擴(kuò)散隔障(17.4)。代謝粒子(17.1)放置在錐形凹陷處(17.4)的底部從而它嵌入到不可滲透材料(17.3)中的檢測(cè)器材料(17.3)盤接觸。如上面對(duì)設(shè)計(jì)G所描述的，檢測(cè)器延伸成為在代謝粒子下面的水平盤使得它能夠充當(dāng)對(duì)光學(xué)檢測(cè)原理的物理信號(hào)放大器。一層在該滴上面的適當(dāng)?shù)挠头乐箯脑摰蔚恼舭l(fā)并消除在該滴(容器內(nèi)粗陰影線的液體)內(nèi)的對(duì)流從而用于實(shí)際目的的該滴培養(yǎng)基(17.2)被保持為停滯。可選的，在錐形凹陷處(17.4)外的量是周圍培養(yǎng)基的一部分并因而不特別包括在可滲透擴(kuò)散隔障中，除非因?yàn)槠渌蛩３滞?。通過移動(dòng)代謝粒子到具有不同角度及/或深度的其他錐形凹陷處(隔室)中，可調(diào)節(jié)擴(kuò)散隔障的可滲透性，如在例4及上面的方程式中所解釋的，可計(jì)算特定的錐形隔室的可滲透性。
在例7中介紹了這樣的設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此設(shè)計(jì)的主要優(yōu)點(diǎn)是簡單，然而需要獲得在相當(dāng)深且狹窄的錐形凹陷處的在代謝物濃度上的可測(cè)量的差異，因而接近上述的簡單開孔。因而并不肯定當(dāng)與如A類型裝置描述的簡單開孔相比，是否錐形凹陷處在操作(特別是關(guān)于從裝置中取出呼吸物體)上產(chǎn)生可察覺的進(jìn)步。
由上述設(shè)計(jì)的組合構(gòu)成的不規(guī)則系統(tǒng)，其中需要更復(fù)雜的模型來描述濃度梯度設(shè)計(jì)L，在圖8中示出，具有厚度可調(diào)節(jié)的蓋子的隔室。此設(shè)計(jì)使用蓋子(8.4)作為非液態(tài)擴(kuò)散隔障，組成其的材料對(duì)代謝物的滲透性小于培養(yǎng)基但仍大于隔室的不可滲透壁(8.5)的滲透性。代謝粒子(8.1)放置在不可滲透板中的一個(gè)淺井中。檢測(cè)器(8.3)放置在該井的底部。該井具有具有變動(dòng)厚度(8.4)的代謝物可滲透蓋子。通過水平方向上簡單地移動(dòng)蓋子而用蓋子的具有不同厚度的不同部分覆蓋該井，這樣我們能夠調(diào)節(jié)擴(kuò)散隔障。在此圖中，井和蓋子被一小滴培養(yǎng)基(8.2)覆蓋，該滴培養(yǎng)基浸沒在油的蓋層(8.13)下面以防止蒸發(fā)，也可以用培養(yǎng)基充滿容器而沒有油。此設(shè)計(jì)的主要優(yōu)點(diǎn)是簡單、在比較淺的井中易于處理代謝粒子，及具有蓋子的可調(diào)節(jié)的“緊湊”擴(kuò)散隔障。主要的缺點(diǎn)是要保證在蓋子和基板之間的緊密配合。如果該配合不充分，代謝粒子可能水平擴(kuò)散到隔室中。
設(shè)計(jì)M，在圖12中示出，具有部分敞開的蓋子的隔室。此設(shè)計(jì)幾乎與前面的相同，除了它使用不可滲透蓋子(12.5)，該蓋子部分覆蓋井，留下一個(gè)小的開口(12.7)作為代謝物的擴(kuò)散隔障。此設(shè)計(jì)的主要優(yōu)點(diǎn)是簡單及調(diào)節(jié)擴(kuò)散隔障的可調(diào)節(jié)蓋子，然而缺點(diǎn)是因?yàn)闆]有在每次測(cè)量中保持對(duì)蓋子的精確位置的細(xì)致的追蹤，在校準(zhǔn)這樣的不規(guī)則系統(tǒng)中可預(yù)見的困難。
設(shè)計(jì)N，在圖13中示出，具有帶腹孔的不可滲透蓋子的隔室。此設(shè)計(jì)在功能上與前一設(shè)計(jì)相同，除了它使用在不可滲透蓋子(13.5)中的中央孔(13.7)作為不可調(diào)節(jié)的擴(kuò)散隔障。要改變擴(kuò)散隔障可以將該蓋子更換為另一個(gè)具有更大尺寸的孔的蓋子。與前一設(shè)計(jì)相比，它非常簡單并可能更易于校準(zhǔn)及使用。主要的缺點(diǎn)是要保證在蓋子和基板之間的緊密配合。如果配合不充分，代謝物可能水平擴(kuò)散到隔室中。
設(shè)計(jì)O，在圖14中示出，具有代謝粒子入口及出口的立方體。該設(shè)計(jì)是浸沒在培養(yǎng)基(14.2)中的不可滲透立方體(14.5)，它包含兩個(gè)連接到中央隔室的開孔(14.4)。每個(gè)開孔具有一個(gè)漏斗形的入口(14.7)。開始代謝粒子(14.1)滴入垂直定向的漏斗并通過重力使其停留在檢測(cè)器(14.3)上，由于通過兩個(gè)孔補(bǔ)充代謝物最終得到的代謝物濃度梯度較復(fù)雜。然而給出裝置的正確尺寸，數(shù)學(xué)模型可以預(yù)測(cè)預(yù)期的梯度。一旦設(shè)計(jì)完成可以使用已知代謝速率的代謝粒子來校準(zhǔn)它。一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)是通過轉(zhuǎn)動(dòng)立方體使粒子通過重力落下來可以取回代謝粒子。通過轉(zhuǎn)動(dòng)立方體也可以將代謝粒子沉置在隔室具有不同檢測(cè)器的其他側(cè)面上。如果必須放出代謝粒子可以施加穿過立方體的對(duì)流流動(dòng)。缺點(diǎn)是設(shè)計(jì)更復(fù)雜及代謝粒子可能卡在隔室內(nèi)。
例6在具有鼠胚胎的圓柱形隔室中的氧的光學(xué)測(cè)量在根據(jù)圖11的特定實(shí)施例中評(píng)估總體的測(cè)量原理。根據(jù)下面的描述測(cè)量在胚泡階段的鼠胚胎的呼吸活動(dòng)。
裝置看在例5中的詳細(xì)描述，B樣式，在圖11中示出。
它由兩個(gè)由玻璃制成的不可滲透件組成。一個(gè)玻璃板形成底部(11.5)。在該板上放置高h(yuǎn)為4mm的小的玻璃圓柱體(11.5)。直徑d為0.5mm的圓柱形孔(11.4)穿過該玻璃圓柱的中心。在該孔面向容器表面的一端，用鉆頭將該孔挖空(“挖洞”)以形成放置呼吸粒子(11.1)的小的圓錐形空腔。圓柱形空腔的上壁覆蓋有氧可熄滅卟啉熒光團(tuán)(在聚苯乙烯中的鉑(II)-8乙基卟啉)。用齒蠟將玻璃圓柱粘附并密封在玻璃板上，以避免氧在兩個(gè)玻璃件之間的界面上的水平傳輸。
胚胎在第0日用61.U.PMSG(Folligonvet，Intervet，丹麥)i.p處理三到四周大的發(fā)育不成熟的雌性B6D2F1鼠(雄性DBA/2J與雌性C57BL/6L之間的F1雜交后代)。兩天后(第3日)用61.U.SuigonanVet.(Suigonan，Intervet，丹麥4001.E.血清促性腺激素2001.E.絨毛膜促性腺激素)處理它們。在同一天使雌性與成熟(已測(cè)生育能力)雄性B6D2F1鼠交配。在交配兩天后(第5日)使用培養(yǎng)基M2(西格馬化學(xué)，圣路易斯.美國)從輸卵管中沖洗出兩細(xì)胞胚胎。在沖出后，將胚胎轉(zhuǎn)移到M16(西格馬化學(xué)，圣路易斯.美國)培養(yǎng)基中并在37℃在5％CO2的空氣大氣下培養(yǎng)。動(dòng)物被關(guān)在Macrolon II型籠(Techniplast，意大利)中，可隨意得到食物(Altromin #1314，Brogaarden丹麥)和水。
根據(jù)圖11(在例5中的類型B設(shè)計(jì))的裝置放置在以微滴定量格式(NuncA/S，Roskilde丹麥)的Nunc 12井盤，充滿M2培養(yǎng)基，并留置60分鐘以在孵卵器中達(dá)到平衡。通過從轉(zhuǎn)移吸液管將胚胎在中央孔(11.7)的口部噴出并讓它下沉到底部通過重力到該室中(11.1)，在胚泡階段(交配后5天)的胚胎被轉(zhuǎn)移到裝置中。通過反轉(zhuǎn)顯微鏡方法使得從下面直接視覺檢察該室，來核實(shí)胚胎到達(dá)室中。分別使用360nm和550nm的激發(fā)光及在TecanSpectraflour熒光板讀出器中記錄650nm的發(fā)射光，記錄下從氧可熄滅卟啉熒光團(tuán)(在聚苯乙烯中的鉑(II)-8乙基卟啉)來的，與孵育室(11.3)中的培養(yǎng)基接觸的熒光強(qiáng)度。激發(fā)后從0-500μs記錄熒光。使用修正的Stern-Volmer方程將熒光強(qiáng)度轉(zhuǎn)變?yōu)檠醴謮?，該方程根?jù)Klimant等人1995(“纖維光學(xué)氧微傳感器，一種在水生生物學(xué)中的新工具”，湖泊學(xué)及海洋學(xué)401159-1165)充分描述了大多數(shù)optrode的反應(yīng)I=I0[α+(1-α)(11+KSVC)]]]>其中α是包括散射的雜散光的熒光非熄滅部分，I0是在將胚胎放置在裝置中后沒有時(shí)的熒光強(qiáng)度，氧分壓從21％(大氣濃度)下降到接近17％在裝置的垂直圓柱形空腔(圖11中11.4)的高度(4mm)上產(chǎn)生4％的氧的梯度(或19％的大氣飽和度)。在38℃(孵育溫度)氧的溶解度是210μM產(chǎn)生100μM cm-1的梯度(dC/dX)。在38℃的培養(yǎng)基中的擴(kuò)散系數(shù)是近似3.45*10-5cm2s-1，其產(chǎn)生3.45*10-12mol cm-2s-1的流量。由于管具有0.00196cm2的橫截面面積，這給出胚胎的明確的呼吸速率微0.677*10-14mol每胚胎每秒，或0.546*10-9l每胚胎每小時(shí)(0.546nl O2h-1)。
例7在錐形凹陷中的微傳感器測(cè)量通過將60度尖角鋼棒壓入聚苯乙烯塑料板的的表面在2cm寬的井的底部制造一個(gè)0.04cm深的錐形凹陷處。用薄層齒蠟涂直徑4mm的圍繞該凹陷處的圓。用吸液管吸取大約20μl的培養(yǎng)基到凹陷處及在蠟圓中的區(qū)域內(nèi)，在注入5ml石蠟油到井中以覆蓋該滴培養(yǎng)基之前，將一個(gè)四天大直徑約100μm的鼠胚胎放置在該凹陷處的底部。該盤放置到37℃的水浴室中，固定在馬達(dá)驅(qū)動(dòng)的微型機(jī)械手中的氧傳感器的尖頭定位于凹陷處的上方。編程一個(gè)既能控制微型機(jī)械手也能從微傳感器放大器中獲得信號(hào)的個(gè)人電腦軟件來進(jìn)行沿朝向胚胎的垂直線步長為5微米的氧測(cè)量。在圖20中示出測(cè)得的濃度對(duì)微傳感器到胚胎的距離。在胚胎表面，其位于大約離凹陷處尖端、底部0.015cm，濃度為206μM，使用公式4.4.7該濃度對(duì)應(yīng)為0.11nl/小時(shí)的氧消耗率。從圖中可以看到，測(cè)量了朝向胚胎的完整的濃度曲線，使用公式4.4.7來模擬這一曲線得到很好的配合，其證實(shí)該模型的正確性。
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權(quán)利要求
1.一種對(duì)基本球形代謝粒子的個(gè)體代謝速率的非侵入測(cè)量的裝置，該裝置包括a)至少一個(gè)隔室，所述隔室由擴(kuò)散隔障確定并能夠包括具有基本球形代謝粒子的培養(yǎng)基，所述擴(kuò)散隔障允許代謝物經(jīng)由擴(kuò)散向及/或從基本球形代謝粒子傳輸，由此使得能建立從基本球形代謝粒子并貫穿培養(yǎng)基的代謝物擴(kuò)散梯度，b)至少一個(gè)用于測(cè)量在隔室內(nèi)的代謝物的濃度的檢測(cè)器。
2.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中該擴(kuò)散隔障由具有至少一個(gè)代謝物可滲透的開口的隔室壁和培養(yǎng)基構(gòu)成。
3.如權(quán)利要求2所述的裝置，其中該隔室壁由代謝物基本不可滲透的材料制成。
4.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中基本不透過代謝物的材料具有小于在水中的代謝物擴(kuò)散系數(shù)的1％的代謝物擴(kuò)散系數(shù)，特別是小于0.2％，尤其是小于0.05％。
5.如權(quán)利要求2-4中任一所述的裝置，其中穿過基本不透過代謝物的材料的隔室壁的代謝物流量在全部到隔室的代謝物流量中占小于10％，特別是小于1％，尤其是小于0.1％。
6.如權(quán)利要求3所述的裝置，其中基本不透過氣體的材料從塑料材料、聚合物材料、玻璃材料、金屬材料，及陶瓷材料及它們的組合中選擇。
7.如權(quán)利要求6所述的裝置，其中聚合物材料從如縮醛樹脂、丙烯酸樹脂、纖維素塑料、氟塑料、離聚物、聚對(duì)二甲苯基、聚酰胺、聚酰胺納米合成物、聚碳酸酯、聚酯、聚酰亞胺、聚烯烴、硫化聚苯、聚砜、聚苯乙烯樹脂、乙烯樹脂、可塑合金、多組分聚合物、環(huán)氧樹脂、石蠟熱塑彈性體、聚醚嵌段氨化物、聚丁二烯熱塑彈性體、苯乙烯熱塑彈性體、乙烯熱塑彈性體、橡膠材料如丁二烯橡膠、丁基橡膠、溴丁基橡膠、氯丁基橡膠、聚異丁烯橡膠、氯硫化聚乙烯橡膠、環(huán)氧氯丙烷橡膠、乙烯-丙稀橡膠、氟橡膠、天然橡膠、氯丁橡膠、丁腈橡膠、聚硫橡膠、聚氨酯、硅橡膠、苯乙烯-丁二烯橡膠或其共聚物中選擇。
8.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中該擴(kuò)散隔障由高粘性培養(yǎng)基構(gòu)成。
9.如權(quán)利要求8所述的裝置，其中該高粘性培養(yǎng)基是歸因于從葡萄聚糖、甘油、糖、碳水化合物、蛋白質(zhì)及無機(jī)鹽中選擇的高濃度的有機(jī)溶質(zhì)。
10.如前面權(quán)利要求中任一所述的裝置，其中隔室的形狀從圓柱形、多面體形、錐形、半球形或它們的組合中選擇。
11.如權(quán)利要求10所述的裝置，其中隔室的大體形狀是圓柱形。
12.如前面權(quán)利要求中任一所述的裝置包括用于調(diào)節(jié)隔室的橫向尺寸的插入物。
13.如前面權(quán)利要求中任一所述的裝置，為了改變尺寸及或者增加或者減少隔室體積，隔室具有可調(diào)節(jié)底部。
14.如前面權(quán)利要求中任一所述的裝置，其中橫向尺寸小于2.5mm，特別是小于1.5mm，尤其是小于500μm，例如小于250μm。
15.如權(quán)利要求12所述的裝置，其中插入物的橫向尺寸小于1.5mm，特別是小于1.0mm，尤其是小于500μm，特別尤其是小于300μm。
16.如前面權(quán)利要求中任一所述的裝置，其中隔室的縱向尺寸在2mm到25mm之間，尤其是在3mm到15mm之間。
17.如權(quán)利要求2所述的裝置，其中該代謝物可滲透的開口由代謝物可滲透膜構(gòu)成。
18.如權(quán)利要求17所述的裝置，其中該代謝物可滲透膜由包括硅樹脂、特氟綸含氟聚合物、可塑化合物例如聚乙烯、聚丙烯或氯丁橡膠的材料制成。
19.如權(quán)利要求17所述的裝置，其中代謝物可滲透膜由包括可滲透充填物或多孔材料如玻璃、陶瓷、礦物質(zhì)、玻璃或礦物纖維、或貴金屬如金或鉑的材料制成。
20.如權(quán)利要求17所述的裝置，其中代謝物可滲透膜由包括硅樹脂的材料制成。
21.如前面權(quán)利要求中任一所述的裝置，其中在至少一個(gè)隔室的底部設(shè)置代謝物可滲透膜。
22.如權(quán)利要求21所述的裝置，其中該代謝物可滲透層由包括硅樹脂、特氟綸含氟聚合物、可塑化合物例如聚乙烯、聚丙烯或氯丁橡膠的材料制成。
23.如權(quán)利要求21所述的裝置，其中代謝物可滲透層由包括可滲透充填物或多孔材料如玻璃、陶瓷、礦物質(zhì)、玻璃或礦物纖維、或貴金屬如金或鉑的材料制成。
24.如權(quán)利要求21所述的裝置，其中代謝物可滲透層由包括硅樹脂的材料制成。
25.如前面權(quán)利要求21-24中任一所述的裝置，其中代謝物可滲透層的厚度為至少100μm，特別是至少300μm，尤其是至少900μm。
26.如前面權(quán)利要求中任一所述的裝置，其中代謝物檢測(cè)器放置在隔室的底部。
27.如權(quán)利要求21-26中任一所述的裝置，其中代謝物可滲透層放置在基本球形代謝粒子和代謝物檢測(cè)器之間。
28.如權(quán)利要求21-27中任一所述的裝置，其中代謝物可滲透層的厚度至少為基本球形代謝粒子的直徑的兩倍。
29.如前面權(quán)利要求中任一所述的裝置，其中該代謝物是氣體。
30.如前面權(quán)利要求中任一所述的裝置，其中代謝物是氧或二氧化碳。
31.如前面權(quán)利要求中任一所述的裝置，其中該檢測(cè)器是氧檢測(cè)器。
32.如權(quán)利要求31所述的裝置，其中用于測(cè)量氧濃度的檢測(cè)器包括電流測(cè)量氧傳感器、薄膜入口質(zhì)譜分析法、顯微分光技術(shù)或光學(xué)氧檢測(cè)。
33.如權(quán)利要求32所述的裝置，其中使用發(fā)光體，特別是放置在隔室內(nèi)尤其是在底部的固定不動(dòng)的發(fā)光體，以及發(fā)光檢測(cè)器來完成光學(xué)氧檢測(cè)。
34.如權(quán)利要求33所述的裝置，其中該發(fā)光體包括在聚苯乙烯填充物中固定的釕(II)-三-4，7-聯(lián)苯-1，10-菲咯啉高氯酸鹽(Rudpp)、釕(II)-三-1，7-聯(lián)苯-1，10-菲咯啉氯化物、釕(II)-三(聯(lián)吡啶)絡(luò)合物、三(2，2’-聯(lián)吡啶二氯-釕)六水合物、Ru(bpy)、在聚苯乙烯中的鉑(II)-八-乙基-卟啉、在聚(甲基丙烯酸甲酯)中的鉑(II)-八-乙基-卟啉、在聚苯乙烯中的鉑(II)-八-乙基-酮-卟啉、鉑(II)-八-乙基-酮-卟啉、在聚苯乙烯中的鈀(II)-八-乙基-卟啉、鉑-1，2烯-連二硫酸鹽類的化合物。
35.如權(quán)利要求33所述的裝置，其中該發(fā)光檢測(cè)器是發(fā)光讀出器、光電倍增管或CCD相機(jī)(12)。
36.一種用于測(cè)定基本球形代謝粒子的代謝速率的非侵入的方法，包括a)提供至少一個(gè)如權(quán)利要求1到35中任一所定義的裝置，b)在一個(gè)隔室的培養(yǎng)基中設(shè)置基本球形代謝粒子，c)測(cè)量在隔室中的代謝物濃度得到代謝物濃度的量，及d)將所述代謝物濃度的量與所述基本球形代謝粒子的代謝速率聯(lián)系起來。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中該代謝物經(jīng)由通過培養(yǎng)基的擴(kuò)散被供應(yīng)到基本球形代謝粒子。
38.如權(quán)利要求36-37中任一所述的方法，其中該基本球形代謝粒子是在隔室中培育。
39.如權(quán)利要求36-38中任一所述的方法，其中在一個(gè)比隔室的體積及/或培養(yǎng)基的體積小的體積中測(cè)量代謝物濃度。
40.如權(quán)利要求36-39中任一所述的方法，其中通過基于測(cè)得的代謝物濃度確定隔室中的代謝物擴(kuò)散梯度，及將所述代謝物擴(kuò)散梯度與所述基本球形代謝粒子的代謝速率聯(lián)系起來而確定所述基本球形代謝粒子的代謝速率。
41.如權(quán)利要求36-40中任一所述的方法，其中至少完成對(duì)代謝物濃度的兩次測(cè)量。
42.如權(quán)利要求36-41中任一所述的方法，其中該代謝物濃度是氣體分壓。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中該氣體分壓是氧或二氧化碳的分壓。
44.如權(quán)利要求36-43中任一所述的方法，其中氣體通過穿過在隔室中的停滯的培養(yǎng)基的擴(kuò)散被直接從大氣或從與大氣處于平衡的較大體積的培養(yǎng)基供應(yīng)到基本球形代謝粒子。
45.如權(quán)利要求36-44中任一所述的方法，其中該基本球形代謝粒子從胚胎、細(xì)胞團(tuán)例如癌細(xì)胞、干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、C.elegans或其他小的多細(xì)胞生物體。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中該基本球形代謝粒子是胚胎。
47.如權(quán)利要求36-46中任一所述的方法，其中在暫時(shí)切斷從隔室外對(duì)隔室的擴(kuò)散性的代謝物供應(yīng)之后實(shí)施對(duì)代謝物濃度的測(cè)量。
48.一種用于在培育期間調(diào)節(jié)對(duì)基本球形代謝粒子的代謝物供應(yīng)的方法，包括a)提供至少一個(gè)包括具有培養(yǎng)基的隔室的裝置，b)在隔室的培養(yǎng)基中培育基本球形代謝粒子，c)測(cè)量在隔室中的代謝物濃度得到代謝物濃度的量，并任選地d)將所述代謝物濃度的量與所述基本球形代謝粒子的代謝速率聯(lián)系起來并任選地e)依賴于代謝物濃度的量及/或所述基本球形代謝粒子的代謝速率調(diào)節(jié)代謝物供應(yīng)。
49.如權(quán)利要求48所述的方法，其中至少一個(gè)所述的裝置是如同權(quán)利要求1-35中任一所定義的。
50.如權(quán)利要求48或49所述的方法，其中該代謝物是氣體
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中該代謝物是氧而代謝過程是呼吸。
52.如權(quán)利要求48或49所述的方法，其中通過改變隔室外的代謝物濃度來實(shí)施所述調(diào)節(jié)。
53.如權(quán)利要求48或49所述的方法，其中通過改變隔室的尺寸來實(shí)施所述調(diào)節(jié)。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中通過插入插入物來調(diào)節(jié)體積。
55.如權(quán)利要求53所述的方法，其中通過插入插入物來調(diào)節(jié)隔室的橫向尺寸。
56.如權(quán)利要求53所述的方法，其中通過改變隔室的可調(diào)節(jié)底部的位置來調(diào)節(jié)體積。
57.如權(quán)利要求53所述的方法，其中通過改變隔室的擴(kuò)散隔障來實(shí)施調(diào)節(jié)。
58.如權(quán)利要求53所述的方法，其中通過改變隔室壁的厚度來改變擴(kuò)散隔障。
59.如權(quán)利要求53所述的方法，其中通過改變至少一個(gè)在隔室壁上的開口的尺寸來實(shí)施調(diào)節(jié)。
60.一種用于選擇有存活力的胚胎的方法，包括，a)在培育期間至少有一次測(cè)定該胚胎的代謝速率，及b)選擇具有最優(yōu)代謝速率的胚胎。
61.如權(quán)利要求60所述的方法，其中不引起胚胎經(jīng)受的生長環(huán)境的任何改變來實(shí)施對(duì)代謝速率的測(cè)定。
62.如權(quán)利要求60-61中任一所述的方法，其中在如權(quán)利要求1-35中任一所定義的裝置中測(cè)量該代謝速率。
63.如權(quán)利要求60-61中任一所述的方法，其中用在權(quán)利要求36-47中任一所定義的方法測(cè)定該代謝速率。
64.一種用于測(cè)定代謝粒子的代謝速率的非侵入的方法，包括a)提供至少一個(gè)如權(quán)利要求1-35所定義的裝置，b)在一個(gè)隔室的培養(yǎng)基中培育代謝粒子，c)在培育的至少部分期間中減少對(duì)培養(yǎng)基的代謝物供應(yīng)，d)在減少了代謝物供應(yīng)后測(cè)量在隔室中的代謝物濃度得到代謝物濃度的量，及e)將所述代謝物濃度的量與所述基本球形代謝粒子的代謝速率聯(lián)系起來。
65.如權(quán)利要求64所述的方法，其中該代謝物是氧而代謝速率是呼吸速率。
66.如權(quán)利要求64所述的方法，其中該氧供應(yīng)被減小到零。
67.如權(quán)利要求64所述的方法，其中在減少氧供應(yīng)期間已經(jīng)獲得在隔室中的氣體分壓的量。
68.一種用于培育代謝粒子的培育裝置，該裝置包括至少一個(gè)隔室，所述隔室由擴(kuò)散隔障確定并能包括具有基本球形代謝粒子的培養(yǎng)基，所述擴(kuò)散隔障允許代謝物經(jīng)由擴(kuò)散向及/或從代謝粒子傳輸，由此使得能建立從代謝粒子并貫穿培養(yǎng)基的代謝物擴(kuò)散梯度。
69.如權(quán)利要求68所述的方法，其中所述裝置具有一個(gè)或更多的如權(quán)利要求1-35中任一所定義的特征。
70.一種用于培育代謝粒子的方法，所述方法包括a)提供至少一個(gè)如權(quán)利要求68-69中任一所定義的裝置，b)在隔室的培養(yǎng)基中設(shè)置代謝粒子，及c)培育該代謝粒子。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于對(duì)基本球形代謝粒子如胚胎的代謝速率的非侵入及非干擾的測(cè)量方法及裝置，及涉及在該胚胎水平上控制氧分壓的方法和裝置。此外，本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)向基本球形代謝粒子供應(yīng)代謝物的方法，及用于選擇有預(yù)定品質(zhì)的基本球形代謝粒子的方法。本發(fā)明在一個(gè)裝置中實(shí)施，該裝置能夠在裝置中的隔室內(nèi)的基本球形代謝粒子和隔室外的環(huán)境之間建立代謝物擴(kuò)散梯度?；诖x物擴(kuò)散梯度的信息而確定代謝速率。
文檔編號(hào)A61B5/00GK1748144SQ200380109752
公開日2006年3月15日 申請(qǐng)日期2003年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月23日
發(fā)明者拉斯·D·M·奧托森, 尼爾斯·B·拉姆辛, 拉斯·R·丹加德, 詹斯·K·岡德森 申請(qǐng)人:尤尼森斯繁殖技術(shù)公司