專利名稱：表達(dá)人cd20和/或cd16的轉(zhuǎn)基因小鼠的制作方法
本申請(qǐng)已于2003年12月11日以如下名義申報(bào)PCT國(guó)際專利申請(qǐng)健泰科公司，該公司是一家美國(guó)國(guó)家公司和居民(除美國(guó)之外所有國(guó)家的申請(qǐng)人)；安德魯.C-Y.陳，美國(guó)公民與居民(僅對(duì)美國(guó)的申請(qǐng)人)；龔謙，中國(guó)公民與美國(guó)居民(僅對(duì)美國(guó)的申請(qǐng)人)；與弗萊維厄斯·馬丁，羅馬尼亞公民與美國(guó)居民(僅對(duì)美國(guó)的申請(qǐng)人)；本申請(qǐng)指定所有國(guó)家，并要求如下優(yōu)先權(quán)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)60/434,115，于2002年12月16日提交；與美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)60/476,481，于2003年6月5日提交。
背景技術(shù)：
T與B細(xì)胞兩者包含可以被用作分化與識(shí)別標(biāo)志的細(xì)胞表面蛋白。一種這樣的人B細(xì)胞標(biāo)志是人B淋巴細(xì)胞限制的分化抗原Bp35，又名″CD20″。CD20在早期前B細(xì)胞發(fā)育期間表達(dá)，并且保持直到漿細(xì)胞分化。人們相信CD20分子調(diào)節(jié)激活過(guò)程中對(duì)細(xì)胞周期起始和分化所必需的一個(gè)步驟，并且通常在腫瘤B細(xì)胞上以非常高水平表達(dá)。
CD20存在于正常的B細(xì)胞以及惡性的B細(xì)胞兩者上，惡性B細(xì)胞的強(qiáng)勁增殖可以導(dǎo)致B細(xì)胞淋巴瘤。因此，CD20表面抗原有作為用特異于該抗原的抗體導(dǎo)向B細(xì)胞的候選物的可能性。這些抗CD20抗體特定地與正常和惡性的B細(xì)胞的CD20細(xì)胞表面抗原結(jié)合，導(dǎo)致B細(xì)胞的破壞與消減。具有破壞腫瘤的潛力的化學(xué)試劑或者放射性標(biāo)記可以被偶聯(lián)到抗CD20抗體上，以致于該藥物被特異地遞送給腫瘤B細(xì)胞。
通過(guò)利用單克隆抗體導(dǎo)向CD20已經(jīng)被描述(參見(jiàn)，例如Weiner，Semin.Oncol.，26，43-51(1999)；Gopal與Press，J.Lab.Clin.Med.，134，445-450(1999)；White et al.，Pharm.Sci.Technol.Today，2，95-101(1999))。RituxanTM是一嵌合的抗CD20單克隆抗體，已經(jīng)被廣泛地作為單個(gè)的藥劑和與化學(xué)療法一起用于具有新診斷的和復(fù)發(fā)的淋巴瘤的病人(Davis et al，J.Clin.Oncol.，1851-1857(1999)；Solal-Celigny et al.，Blood，94，摘要，2802(1999)；Foran et al.，J.Clin.Oncol.，18，317-324(2000)。利用放射性同位素標(biāo)記的抗體偶聯(lián)物也已經(jīng)被描述(例如，BexxarTM；Zelenetz et al.，Blood，94，摘要2806(1999))。
抗體抗原復(fù)合物與免疫系統(tǒng)細(xì)胞的交互作用導(dǎo)致多種反應(yīng)，從效應(yīng)子功能例如抗體依賴的細(xì)胞毒性、肥大細(xì)胞脫顆粒與噬菌作用，到免疫調(diào)節(jié)信號(hào)例如調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖與抗體分泌。所有這些交互作用是通過(guò)抗體的Fc結(jié)構(gòu)域或者免疫復(fù)合物與造血細(xì)胞上的特異的細(xì)胞表面受體結(jié)合而起始的。現(xiàn)在非常明確地確認(rèn)，由抗體與免疫復(fù)合物觸發(fā)的細(xì)胞反應(yīng)的多樣性是Fc受體(FcRs)結(jié)構(gòu)的不均一性(heterogeneity)造成的。
這些受體中的一組，F(xiàn)cγRs，被發(fā)現(xiàn)存在于造血譜系的大多數(shù)細(xì)胞上，并且介導(dǎo)與IgG的高親合力和低親合力結(jié)合(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5,877,396，在此引入作為參考)。高親合力受體，F(xiàn)cγRI，結(jié)合單體IgG，并僅僅在巨噬細(xì)胞與嗜中性白細(xì)胞上表達(dá)。它能夠響應(yīng)與抗體交聯(lián)而介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)與噬菌作用。IgG的低親合力受體，F(xiàn)cγRII與FcγRIII(CD16)，負(fù)責(zé)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)免疫復(fù)合物的反應(yīng)，并且代表主要涉及體內(nèi)炎性反應(yīng)的FcγRs。FcγRII在造血細(xì)胞上廣泛地表達(dá)，并在B細(xì)胞上作為抑制性的受體起作用，而在髓樣譜系細(xì)胞上及在血小板上，當(dāng)被免疫復(fù)合物交聯(lián)時(shí)，F(xiàn)cγRII觸發(fā)ADCC、吞噬作用與炎癥介質(zhì)的釋放。FcγRIII在各式各樣的白細(xì)胞上表達(dá)，包括自然殺傷(NK)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性白細(xì)胞與肥大細(xì)胞，并且當(dāng)被免疫復(fù)合物交聯(lián)時(shí)介導(dǎo)效應(yīng)器反應(yīng)。介導(dǎo)那些細(xì)胞上的所有的抗體依賴的反應(yīng)的是自然殺傷細(xì)胞上唯一的FcR。自然殺傷細(xì)胞是具有自發(fā)性的細(xì)胞毒的淋巴細(xì)胞的亞群，該細(xì)胞溶解性破壞腫瘤細(xì)胞，而無(wú)明顯的抗原特異性或者由組織相容性分子導(dǎo)致的限制。除這些已明確表征的效應(yīng)細(xì)胞通路之外，F(xiàn)cγRIII已在未成熟的胸腺細(xì)胞上被發(fā)現(xiàn)，在這一細(xì)胞中其被假定在早期胸腺細(xì)胞發(fā)育中起作用。
CD16與免疫球蛋白Fc部分的其它受體一起(例如FcγFcyRI、FcγRII、FcγRI)，在介導(dǎo)自體免疫與炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。利用抗CD16單克隆抗體的研究已經(jīng)確定這個(gè)受體在將免疫復(fù)合物從循環(huán)中去除與在介導(dǎo)ADCC中的作用(參見(jiàn)例如Van de Winkel et al.，Immunol.Today，14，215-221(1993))。IgG與CD16的結(jié)合引發(fā)NK/LGL細(xì)胞活化，并觸發(fā)ADCC。在高水平可溶性CD16存在時(shí)ADCC可以暫停。
已發(fā)現(xiàn)(參見(jiàn)Mathiot et al.，J.Clin.Immunol.，13，41-8(1993))，可溶性CD16的水平在患有多發(fā)性骨髓瘤的病人中與健康志愿者相比較顯著地減少。另外，觀察到可溶性CD16階段依賴性減少，在階段I與階段II+III骨髓瘤病人中具有高度顯著的差異。因此，血清中可溶性CD16的測(cè)量既是骨髓瘤的診斷標(biāo)志也是預(yù)后標(biāo)志，可以對(duì)確定和指導(dǎo)疾病的新的免疫調(diào)節(jié)治療有用處。
已經(jīng)更進(jìn)一步地發(fā)現(xiàn)，CD16存在于人血清及其它體液中，并且在炎癥位點(diǎn)是升高的(參見(jiàn)Fleit et al.，Blood，79，2721-8(1992))。似乎有至少兩種形式的人CD16，類型A與類型B。CD16-A主要地在巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞與大的顆粒淋巴細(xì)胞(NK/LGL)表面上表達(dá)，而CD16-B主要地在嗜中性白細(xì)胞與單核細(xì)胞表面上表達(dá)。
盡管CD20和CD16在人淋巴瘤與重要免疫反應(yīng)誘導(dǎo)上具有顯著的作用，缺乏共表達(dá)人標(biāo)志物的動(dòng)物模型。因此，需要有關(guān)的動(dòng)物模型以進(jìn)行疾病研究與藥物研發(fā)。
發(fā)明概述本發(fā)明通常地涉及表達(dá)人細(xì)胞標(biāo)志物—特別地是CD16與CD20的—非自然發(fā)生的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。一方面，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提供鑒定與測(cè)試對(duì)于與CD20有關(guān)的疾病或者病癥，例如癌癥的新治療劑的系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物對(duì)測(cè)試針對(duì)CD20的治療的效力與毒性是有用處的。
本發(fā)明提供非自然發(fā)生的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其基因組包含編碼異源的CD20，優(yōu)選人CD20的核苷酸序列。核苷酸序列優(yōu)選地與人內(nèi)源啟動(dòng)子可操作地連接，其中人CD20在B淋巴細(xì)胞表面上表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方式中，人CD20轉(zhuǎn)基因鼠特征為人CD20在細(xì)胞上的表達(dá)水平足以使與表達(dá)細(xì)胞結(jié)合的抗人CD20抗體影響細(xì)胞的殺傷，引起至少大約75％、和更優(yōu)選80％、85％、90％、95％、99％并且甚至100％外周的和/或循環(huán)B細(xì)胞的B細(xì)胞消減。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，該非自然發(fā)生的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因組更進(jìn)一步地包含編碼異源FcγIII受體，優(yōu)選人CD16，和優(yōu)選人CD16α鏈的核苷酸序列。該核苷酸序列優(yōu)選與人內(nèi)源的啟動(dòng)子可操作地連接，其中異源的受體在白細(xì)胞表面上表達(dá)，所述白細(xì)胞包括一個(gè)或多個(gè)下列細(xì)胞自然殺傷(NK)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性白細(xì)胞、胸腺細(xì)胞與肥大細(xì)胞。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，當(dāng)動(dòng)物基因組包含同源內(nèi)源基因(CD20或CD16，或者其兩者)，該基因被破壞或者剔除，以致內(nèi)源的分子在細(xì)胞表面上不表達(dá)。
本發(fā)明更進(jìn)一步地提供鑒定能治療B細(xì)胞淋巴瘤的藥劑的方法，其中該方法包含給予在B淋巴細(xì)胞上表達(dá)人CD20的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物一種藥劑，并且確定B淋巴細(xì)胞數(shù)目是否有減少。發(fā)明也提供鑒定能消減或者殺死表達(dá)人CD20的細(xì)胞的方法，包含給予表達(dá)人CD20的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物一種藥劑，并且確定像這樣的細(xì)胞的數(shù)目是否有減少。更進(jìn)一步提供根據(jù)這樣的方法鑒定的藥劑。
本發(fā)明的動(dòng)物模型也可以被用于鑒別能誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞反應(yīng)，例如ADCC或者NK細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的藥劑。在給予該藥劑之后，可以通過(guò)例如確定細(xì)胞因子水平的增減監(jiān)視該動(dòng)物的免疫反應(yīng)。在給予該藥劑之后細(xì)胞因子水平增加鑒定出該藥劑誘導(dǎo)Fc-介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞反應(yīng)。也可利用合適的標(biāo)記或者標(biāo)志評(píng)估推定的藥劑與CD16的結(jié)合。此外，通過(guò)在給藥一種藥劑后比較在CD20+轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與CD16+CD20+轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中B細(xì)胞消減，可以篩選該藥劑經(jīng)由CD16介導(dǎo)的免疫反應(yīng)影響表達(dá)人CD20的B細(xì)胞(包括惡性細(xì)胞)消減的能力。本發(fā)明的動(dòng)物也通過(guò)對(duì)目前描述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物給藥，而對(duì)評(píng)估抗-CD20治療的毒性有用。
治療特異性，毒性與效力還可以通過(guò)將該藥劑的效果與在野生型動(dòng)物或者未處理過(guò)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的效果比較而確定。本發(fā)明的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以更進(jìn)一步提供向人給藥的特定的藥劑的安全性指示。例如，可以將人源化的抗體或者其它的藥劑給予該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，并且作為該人源化抗體或者藥劑的人體內(nèi)利用的安全性與耐受性的指示、監(jiān)視作為將該藥劑投藥給該動(dòng)物的結(jié)果的任何毒性或者副作用。那些可以在短期基礎(chǔ)上出現(xiàn)的不利情況包括頭痛、感染、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、疼痛、惡心、無(wú)力、咽炎、腹瀉、鼻炎、灌輸反應(yīng)、與肌痛。短期不利情況是處理后數(shù)天內(nèi)計(jì)量的。長(zhǎng)期的副作用包括某些細(xì)胞類型的細(xì)胞毒、血小板減少導(dǎo)致的出血、由于炎性和/或變態(tài)反應(yīng)導(dǎo)致的介質(zhì)釋放、對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制和/或抗治療劑抗體的激發(fā)、終端器官毒性、與感染或者惡性腫瘤發(fā)生率增加。長(zhǎng)期的不利情況是處理后數(shù)月內(nèi)計(jì)量的。
本發(fā)明另一個(gè)方面涉及確定抗-CD20藥劑效力的方法。通過(guò)向一組具有人CD20和/或人CD16α鏈的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物給予一系列劑量的該藥劑、確定導(dǎo)致攜帶人CD20細(xì)胞的減少的藥劑的至少一個(gè)劑量而確定效力。


圖1顯示來(lái)源于無(wú)轉(zhuǎn)基因(Tg-)、轉(zhuǎn)基因雜合的(Tg+/-)和純合的(Tg+/+)小鼠的小鼠B220+細(xì)胞中人CD20的表達(dá)。
圖2提供在B細(xì)胞分化與成熟期間各種細(xì)胞表面標(biāo)志物(CD43、IgM、IgD)表達(dá)的示意圖。在Tg+小鼠中，hCD20在前-B(pre-B)、未成熟的B細(xì)胞與成熟B細(xì)胞上表達(dá)。
圖3顯示根據(jù)骨髓B細(xì)胞上人CD20表達(dá)篩選Tg+小鼠的結(jié)果。細(xì)胞用偶聯(lián)到FITC的抗-人CD20(BD Pharmingen)染色。用B220與CD43的存在門化(gate)該細(xì)胞允許劃分成B細(xì)胞的各種的群體。為進(jìn)行門化，細(xì)胞用偶聯(lián)到PerCP的抗-B220抗體(BD Pharmingen)與偶聯(lián)到PE的抗-CD43抗體(熒光，BD Pharmingen)染色。
圖4顯示篩選Tg+小鼠脾B細(xì)胞人CD20表達(dá)的結(jié)果。細(xì)胞用偶聯(lián)到FITC的抗-人CD20(BD Pharmingen)染色。用B220與CD21門化該細(xì)胞允許劃分成B細(xì)胞的各種的群體。為進(jìn)行門化，細(xì)胞用偶聯(lián)到PerCP的抗-B220抗體(BD Pharmingen)與偶聯(lián)到PE的抗CD21抗體(熒光，BD Pharmingen)染色。在T1區(qū)、邊緣區(qū)與T2/濾泡區(qū)發(fā)現(xiàn)帶有人CD20的B細(xì)胞。
圖5顯示篩選Tg+小鼠腸系膜淋巴結(jié)B細(xì)胞人CD20表達(dá)的結(jié)果。細(xì)胞用偶聯(lián)到FITC的抗-人CD20(BD Pharmingen)染色。用B220與CD21門化該細(xì)胞允許劃分成B細(xì)胞的各種的群體。為進(jìn)行門化，細(xì)胞用偶聯(lián)到PerCP的抗-B220抗體(BD Pharmingen)與偶聯(lián)到PE的抗CD21抗體(熒光，BD Pharmingen)染色。
圖6顯示篩選Tg+小鼠派伊爾斑B細(xì)胞人CD20表達(dá)的結(jié)果。細(xì)胞用偶聯(lián)到FITC的抗-人CD20(BD Pharmingen)染色。用B220與CD38門化該細(xì)胞允許劃分成B細(xì)胞的各種的群體。為進(jìn)行門化，細(xì)胞用偶聯(lián)到PerCP的抗-B220抗體(BD Pharmingen)與偶聯(lián)到PE的抗CD38抗體(熒光，BDPharmingen)染色。帶有人CD20的B細(xì)胞是成熟B細(xì)胞與生發(fā)中心的細(xì)胞。
圖7是一示意圖，示意將抗-人CD20單克隆抗體給藥給Tg+小鼠，并且分析具有人CD20細(xì)胞的存在或者缺少。在第0天給予單一劑量1毫克的抗-人CD20單克隆抗體。在第-1、1、2、3、4、7、14與21天從各種組織取樣品。如同以前描述經(jīng)過(guò)FACS分析來(lái)自不同組織例如外周血、脾、淋巴結(jié)、骨髓、與派伊爾斑的樣品。也監(jiān)視抗-CD20單克隆抗體的血清水平。
圖8顯示在用抗-人CD20單克隆抗體m2H7(BD Pharmingen)處理的轉(zhuǎn)基因小鼠中外周B細(xì)胞的消減。如同在圖7簡(jiǎn)圖中的概括以總計(jì)1mg的劑量將抗體給予轉(zhuǎn)基因小鼠。如同以前描述地進(jìn)行門化在外周血、脾、淋巴結(jié)、骨髓、與派伊爾斑上做FACS分析。
圖9顯示用抗-人CD20單克隆抗體m2H7處理過(guò)的轉(zhuǎn)基因小鼠中成熟外周淋巴結(jié)B細(xì)胞的消減。如同在圖7簡(jiǎn)圖中的概括以總計(jì)1mg的劑量將抗體給予轉(zhuǎn)基因小鼠。如同以前描述地進(jìn)行門化在外周血、脾、淋巴結(jié)、骨髓、與派伊爾斑上做FACS分析。
圖10顯示用抗-人CD20單克隆抗體m2H7處理的轉(zhuǎn)基因小鼠中脾T2與濾泡的B細(xì)胞的消減。如同在圖7簡(jiǎn)圖中的概括以總計(jì)1mg的劑量將抗體給予轉(zhuǎn)基因小鼠。如同以前描述地進(jìn)行門化在外周血、脾、淋巴結(jié)、骨髓、與派伊爾斑上做FACS分析。
圖11顯示用抗-人CD20單克隆抗體m2H7處理過(guò)的轉(zhuǎn)基因小鼠中再循環(huán)成熟B細(xì)胞的消減。如同在圖7簡(jiǎn)圖中的概括以總計(jì)1mg的劑量將抗體給予轉(zhuǎn)基因小鼠。如同以前描述地進(jìn)行門化在外周血、脾、淋巴結(jié)、骨髓、與派伊爾斑上做FACS分析。
圖12顯示在用抗人CD20單克隆抗體m2H7處理過(guò)的轉(zhuǎn)基因小鼠中成熟B細(xì)胞的消減與派伊爾斑生發(fā)中心B細(xì)胞對(duì)消減的抵抗。如同在圖7簡(jiǎn)圖中的概括以總計(jì)1mg的劑量將抗體給予轉(zhuǎn)基因小鼠。如同以前描述地進(jìn)行門化在外周血、脾、淋巴結(jié)、骨髓、與派伊爾斑上做FACS分析。
圖13顯示用抗-CD20單克隆抗體給藥后B細(xì)胞的消減與恢復(fù)。在第1天給予小鼠抗體。在抗體處理后第6天，表達(dá)人CD20的B細(xì)胞在外周血液中檢測(cè)不到。在第6周，抗體剛一清除，hCD20+細(xì)胞開(kāi)始被檢測(cè)到。到第14周，B細(xì)胞似乎已經(jīng)恢復(fù)到正常水平?；謴?fù)來(lái)自前體B細(xì)胞，該細(xì)胞不表達(dá)CD20而且然后隨后發(fā)展成為具有人CD20+的成熟B細(xì)胞。
圖14顯示FACS圖，指示脾生發(fā)中心B細(xì)胞對(duì)短期抗-CD20單克隆抗體治療的抵抗。小鼠在第1天由腹膜內(nèi)注射用綿羊紅細(xì)胞(SRBC)非免疫或者免疫以在脾中誘導(dǎo)生發(fā)中心。生發(fā)中心在第7天出現(xiàn)。在第8天，一組小鼠用抗-CD20抗體m2H7處理。對(duì)照組的小鼠用mIgG2a同種型對(duì)照抗體處理。在第12天對(duì)來(lái)自小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行分析。使用對(duì)生發(fā)中心染色的PNA(花生凝集素)。在未用SRBC免疫的小鼠脾中沒(méi)有見(jiàn)到可檢測(cè)的生發(fā)中心細(xì)胞，而免疫小鼠脾顯示0.3％的PNA染色細(xì)胞。盡管T2/濾泡的B細(xì)胞被用抗-CD20抗體處理消減，脾中邊緣中心B細(xì)胞對(duì)抗體是有抗性的。
圖15顯示在用抗-CD20單克隆抗體處理過(guò)的小鼠與對(duì)照中不依賴T細(xì)胞的反應(yīng)。小鼠用m2H7或者同種型對(duì)照抗體mIgG2a在第0天處理。在第3-7天，B細(xì)胞消減已經(jīng)發(fā)生。在第7天，小鼠用肺炎鏈球菌IV靜脈注射以誘導(dǎo)對(duì)多糖的反應(yīng)。在第11天建立不依賴T細(xì)胞的反應(yīng)。結(jié)果顯示，用抗-人CD20m2H7處理不影響來(lái)自邊緣區(qū)與B1細(xì)胞的B細(xì)胞反應(yīng)，即非消減的邊緣區(qū)與B1B細(xì)胞給予對(duì)T-非依賴的抗原的保護(hù)。
圖16顯示BR3與2H7抗體處理在Tg+小鼠效應(yīng)上的比較。表達(dá)編碼人CD20的細(xì)菌人工染色體的人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠(命名為hCD20+小鼠)用抗CD20單克隆抗體(在第9天以100微克單一劑注射)，BR3-Fc(從第1天至第12天，每隔一天100微克)，或者抗-CD20單克隆抗體與BR3-Fc的組合進(jìn)行腹膜內(nèi)注射進(jìn)行處理。每組包括4只小鼠。最后一次注射后兩天，將小鼠殺死，分析hCD20+B細(xì)胞。針對(duì)B細(xì)胞標(biāo)志(CD21+CD23+)對(duì)脾、血、淋巴結(jié)與派伊爾斑進(jìn)行FACS分析。抗-CD20單克隆抗體治療消減T2與濾泡的B細(xì)胞，然而并非脾中的邊緣區(qū)B細(xì)胞，而B(niǎo)R3-Fc處理在脾中降低T2/濾泡的與邊緣區(qū)B細(xì)胞。
圖17顯示在派伊爾斑上抗-CD20單克隆抗體處理效應(yīng)的缺乏。表達(dá)編碼人CD20的細(xì)菌人工染色體的人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠(命名為hCD20+小鼠)用抗CD20單克隆抗體(在第9天單一劑注射100微克)、BR3-Fc(從第1天至第12天、每隔一天100微克)、或者抗-CD20單克隆抗體與BR3-Fc的組合進(jìn)行腹膜內(nèi)注射進(jìn)行處理。每組包括4只小鼠。最后一次注射后兩天，將小鼠殺死，分析hCD20+B細(xì)胞。針對(duì)B細(xì)胞標(biāo)志(CD21+CD23+)對(duì)脾、血、淋巴結(jié)與派伊爾斑進(jìn)行FACS分析。BR3-Fc、2H7以及兩者的組合對(duì)派伊爾斑中的生發(fā)中心B細(xì)胞都沒(méi)有影響。
圖18顯示長(zhǎng)期抗-CD20單克隆抗體處理后漿細(xì)胞未被消減。人CD20陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因Tg+小鼠用抗-人CD20mH27抗體如同以前描述地進(jìn)行處理。通過(guò)檢測(cè)骨髓與脾中對(duì)于syndican(CD-138漿細(xì)胞標(biāo)志)陽(yáng)性的細(xì)胞分析小鼠中漿細(xì)胞的存在或者缺乏。在抗-人CD20處理之后也監(jiān)視IgA或者IgM陽(yáng)性的漿細(xì)胞的數(shù)目。結(jié)果表明在Tg+小鼠中漿細(xì)胞不受抗-人CD20抗體處理的影響，指示Tg+小鼠仍然具有產(chǎn)生抗體的能力。
圖19顯示用PK-136單克隆抗體在Tg+小鼠中消減自然殺傷細(xì)胞。產(chǎn)生PK-136單克隆抗體(特異針對(duì)小鼠NK1.1)的雜交瘤克隆從ATCC獲得。分別用對(duì)照單克隆抗體、PK-136、抗-CD20單克隆抗體與PK-136/抗-CD20的組合腹膜內(nèi)注射給四組人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠。腹膜內(nèi)注射給予的劑量如下對(duì)照單克隆抗體200μg/ip，3ip/周，共1周PK-136200μg/ip，3ip/周，共1周抗-CD20單克隆抗體10μg/ip，單一劑量用抗體處理后分析來(lái)自外周血，肝臟與脾的自然殺傷細(xì)胞。數(shù)據(jù)用平均數(shù)+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)表示，n＝8。
圖20表明自然殺傷細(xì)胞在Tg+小鼠的2H7介導(dǎo)的B細(xì)胞消減中起作用。產(chǎn)生PK-136單克隆抗體(特異針對(duì)小鼠NK1.1)的雜交瘤克隆從ATCC獲得。四組人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠腹膜內(nèi)分別注射對(duì)照單克隆抗體、PK-136、抗-CD20單克隆抗體與PK-136/抗-CD20的組合。腹膜內(nèi)注射給予的劑量如下對(duì)照單克隆抗體200μg/ip，3ip/周，共1周PK-136200μg/ip，3ip/周，共1周抗-CD20單克隆抗體10μg/ip，單一劑量在抗-CD20單克隆抗體腹膜內(nèi)注射3天后分析來(lái)自外周血的、淋巴結(jié)與脾的淋巴細(xì)胞。數(shù)據(jù)用平均數(shù)+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)表示，n＝8。
圖21顯示在轉(zhuǎn)基因小鼠不同細(xì)胞群體中人CD20與人CD16的表達(dá)。來(lái)自CD20Tg-/Cd16Tg-(對(duì)照小鼠)、CD20Tg+/CD16Tg-、CD20Tg-/CD16Tg+、與CD20Tg+/CD16+小鼠的血細(xì)胞用標(biāo)記有FITC的標(biāo)記抗-人CD20抗體、偶聯(lián)至PerCP的抗-B220抗體與用PE標(biāo)記的抗-人CD16抗體(BDPharmingen)染色，用FACS分析。結(jié)果表明在B細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)人CD20，并且在缺乏B220標(biāo)記、因而不是B細(xì)胞的細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)人CD16。對(duì)于兩個(gè)標(biāo)記均呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因小鼠顯示兩種細(xì)胞群體。
圖22A顯示人CD16α鏈同種型A的代表性氨基酸序列(SEQ ID NO1)(GenBank登記號(hào)NM 000569)、的cDNA(SEQ ID NO2)(GenBank登記號(hào)NM 000569)(圖22B)與人CD16α鏈同種型A的基因組DNA序列(SEQ ID NO3)(GenBank登記號(hào)Z46222)(圖22C)。圖22D顯示小鼠CD16α鏈(GenBank登記號(hào)碼NM010188)代表性DNA序列(SEQ ID NO9)。圖22E顯示人CD16α鏈同種型B代表性氨基酸順序(SEQ ID NO10)和cDNA序列(SEQ ID NO11)(GenBank登記號(hào)碼NM 000570)。圖22F顯示編碼人CD16α鏈同種型B的代表性基因組序列(SEQ ID NO12)(GenBank登記號(hào)碼Z46223)。圖22G顯示編碼鼠CD16α鏈的cDNA序列(SEQ ID NO13)(GenBank登記號(hào)碼NM010188)。
圖23A顯示人CD20的氨基酸序列(SEQ ID NO4)(GenBank登記號(hào)碼BC 002807)、人CD20cDNA序列(圖23B)(SEQ ID NO5)(GenBank登記號(hào)碼BC002807)與人CD20的基因組序列(SEQ ID NO6)(GenBank登記號(hào)碼AH005353)(圖23C)。圖23D顯示鼠CD20的代表性cDNA序列(SEQ ID NO14)(GenBank登記號(hào)碼M62541)。
圖24顯示比較人CD16Tg-小鼠與人CD16Tg+小鼠中人CD16的表達(dá)。細(xì)胞用偶聯(lián)至PE的抗-人CD16(BD Pharmingen)染色，也用抗-DX5-FITC(BDPhanningen)染色以鑒定NK細(xì)胞，或用偶聯(lián)至APC(別藻藍(lán)蛋白)的抗-F4/80鑒別巨噬細(xì)胞。結(jié)果表明在人CD16Tg+小鼠NK與巨噬細(xì)胞中都表達(dá)人CD16轉(zhuǎn)基因。
圖25顯示人Fc受體γ鏈氨基酸(GenBank登記號(hào)碼P30273)(SEQ IDNO7)和cDNA序列(GenBank登記號(hào)碼M33915)(SEQ ID NO8)。
圖26顯示用FACS分析在巨噬細(xì)胞上小鼠CD16表達(dá)的存在或者缺少。來(lái)自缺乏鼠CD16(CD16-/-)小鼠與來(lái)自具有鼠CD16(CD16+/-)的對(duì)照小鼠的外周血細(xì)胞用抗-小鼠CD16抗體染色。利用抗-mac1抗體門化細(xì)胞對(duì)于巨噬細(xì)胞標(biāo)志物mac-1的表達(dá)。
圖27顯示用FACS分析來(lái)自CD16-/-小鼠外周血細(xì)胞上小鼠CD64表達(dá)的存在或者缺乏。CD64是FcγRI，并且這個(gè)受體在小鼠細(xì)胞上的表達(dá)表明其它的Fc受體的表達(dá)不受FcγRIII(CD16)α鏈敲除的影向。來(lái)自缺乏鼠CD16小鼠(CD16-/-)與來(lái)自同種型對(duì)照小鼠的外周血細(xì)胞用抗-小鼠CD64抗體染色。利用抗-mac 1抗體門化細(xì)胞對(duì)于巨噬細(xì)胞標(biāo)志物mac-1的表達(dá)。
圖28顯示與人外周血細(xì)胞上CD20表達(dá)比較，在來(lái)自人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠的外周血細(xì)胞上人CD20表達(dá)的表達(dá)水平的代表性比較。外周血細(xì)胞獲自人供體和來(lái)自hCD20Tg+小鼠，并且用標(biāo)記的抗-人CD20抗體(mH27)染色。細(xì)胞用FACS分析，門化人CD19+和B220+群體。在圖上的數(shù)字表示平均熒光強(qiáng)度。
發(fā)明詳述以下術(shù)語(yǔ)除非另外規(guī)定具有在下面對(duì)其所賦予的含義。
術(shù)語(yǔ)″構(gòu)建物″或者″導(dǎo)向構(gòu)建物″指包含導(dǎo)向區(qū)的多核苷酸分子。導(dǎo)向區(qū)包含基本上與靶組織、細(xì)胞或者動(dòng)物中的內(nèi)源序列同源的序列，使得該導(dǎo)向構(gòu)建物能向靶組織基因組整合。典型的，導(dǎo)向構(gòu)建物也包括特別感興趣的基因或者核酸序列、標(biāo)記基因與合適的控制序列。
術(shù)語(yǔ)″CD16″或者″FcγRIII″可互換使用，并且指IgG免疫球蛋白Fc部分的細(xì)胞表面受體蛋白。這個(gè)受體是對(duì)于IgG的低親合力受體，并且優(yōu)先地與免疫復(fù)合物中的IgG結(jié)合。FcγRIII由作為配體結(jié)合鏈的α鏈與同二聚體或者雜二聚物組成。當(dāng)FcγRIII在巨噬細(xì)胞上表達(dá)時(shí)，α鏈與γ鏈的同二聚體相結(jié)合。當(dāng)FcγRIII在NK細(xì)胞上表達(dá)時(shí)，a鏈通過(guò)δ鏈與γ鏈的雜二聚體相聯(lián)系。γ鏈參與FcγRIII的細(xì)胞表面表達(dá)?！白匀话l(fā)生的CD16″具有獲得自自然的細(xì)胞表面受體蛋白質(zhì)的氨基酸順序，并且包括自然發(fā)生的變體形式包括等位基因的變體、同種型與截短的形式。人CD16包括α鏈的所有的同種型包括CD16或FcγIII-A(GenBank登記號(hào)碼Z46222)和CD16或者FcγRIII-B(GenBank登記號(hào)碼Z46223)。FcγRIII的α鏈代表性氨基酸與核苷酸序列在圖22A/B/C/D/E中顯示。人γ鏈的代表性序列示于圖25(GenBank登記號(hào)碼P30273與M33195)。本發(fā)明也考慮CD16或者FcγRIII變體。與源序列比較起來(lái)，變體經(jīng)過(guò)普遍已知的技術(shù)加以改變，并且優(yōu)選保有自然發(fā)生的人CD16或者FcγRIII的生物活性。FcγRIII的一些變體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。
術(shù)語(yǔ)″CD20″指在免疫系統(tǒng)的某些細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白，特定地是B淋巴細(xì)胞-限制的分化抗原Bp35?！遄匀话l(fā)生的CD20″具有獲得自自然的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，并且包括自然發(fā)生的變體例如等位基因變體、同種型與截短的形式。更特別地，″CD20″包括人CD20(AH003353；GenBank登記號(hào)碼M27395，J03574)。代表性的人與鼠CD20的氨基酸序列、cDNA序列與基因組序列示于圖23。本發(fā)明也考慮CD20變體。與源序列比較起來(lái)，變體經(jīng)過(guò)普遍已知的技術(shù)加以改變，并且優(yōu)選保有自然發(fā)生的人CD20的生物活性。優(yōu)選該變體不是在自然發(fā)生的人CD20氨基酸位置170與172改變，因?yàn)檫@些位置已經(jīng)被證明是如Polyak et al.，Blood 993256(2002)中所描述的被幾個(gè)不同抗-人CD20單克隆抗體所識(shí)別的表位的一部分。
當(dāng)一DNA片段定位于內(nèi)源同源序列并且與內(nèi)源的同源序列重組時(shí)發(fā)生基因的″破壞″。這些序列破壞或者修飾可以包括DNA序列的插入、錯(cuò)義、移碼、缺失、或者取代或者替換，或者其任何組合。插入包括插入整個(gè)的基因，其可能是動(dòng)物、植物、真菌的、昆蟲(chóng)、原核的、或者病毒來(lái)源。破壞，例如，可以經(jīng)過(guò)部分地或者完全地抑制它的生產(chǎn)或者經(jīng)過(guò)增強(qiáng)正常的基因產(chǎn)物的活動(dòng)改變正常的基因產(chǎn)物。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，該破壞是一沒(méi)有該基因的顯著表達(dá)的無(wú)效破壞(null discruption)。
術(shù)語(yǔ)″內(nèi)源的位點(diǎn)″意味著包括在將變成轉(zhuǎn)基因的宿主動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的天然存在的基因位點(diǎn)。
術(shù)語(yǔ)″異源的″當(dāng)與多肽或者基因聯(lián)合使用時(shí)指具有一氨基酸序列的多肽或編碼多肽的DNA，所述多肽或氨基酸序列在轉(zhuǎn)基因非人宿主動(dòng)物中未找到的。因此，具有人CD20基因的轉(zhuǎn)基因小鼠可以被描述為具有異源的CD20基因。可以利用種種的方法包括PCR、蛋白質(zhì)印跡、或者Southern印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)基因。術(shù)語(yǔ)″人內(nèi)源的啟動(dòng)子″指與編碼將被引入動(dòng)物以形成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的人蛋白質(zhì)的多核苷酸序列有自然聯(lián)系的啟動(dòng)子。
“術(shù)語(yǔ)非人動(dòng)物″意圖包括任何脊椎動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類、爬行動(dòng)物、與兩棲動(dòng)物。合適的哺乳動(dòng)物包括嚙齒類動(dòng)物、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、羊、狗與母牛。合適的鳥(niǎo)類包括雞、鵝與火雞。優(yōu)選的非人動(dòng)物是從嚙齒科包括大鼠和小鼠中選出來(lái)的，最優(yōu)選小鼠。
術(shù)語(yǔ)″自然發(fā)生″或者″自然相關(guān)的″如同在這里應(yīng)用于一對(duì)象時(shí)所使用的指一對(duì)象可以在自然中被發(fā)現(xiàn)這一事實(shí)。例如，存在于一可以從自然來(lái)源分離的有機(jī)體(包括病毒)、并且沒(méi)有被人在實(shí)驗(yàn)室中有意地修飾的一多肽或者多核苷酸序列是自然發(fā)生的。
對(duì)于核酸而言，術(shù)語(yǔ)″基本上同源″指兩個(gè)核酸或者其中指定的序列，當(dāng)最佳地比對(duì)并且與合適的核苷酸插入或者刪除相比較時(shí)彼此具有至少大約80％序列同一性，更優(yōu)選大約81％序列同一性，更優(yōu)選大約82％序列同一性，更優(yōu)選大約83％序列同一性，更優(yōu)選大約84％序列同一性，更優(yōu)選大約85％序列同一性，更優(yōu)選大約86％序列同一性，更優(yōu)選大約87％序列同一性，更優(yōu)選大約88％序列同一性，更優(yōu)選大約89％序列同一性，更優(yōu)選大約90％序列同一性，更優(yōu)選大約91％序列同一性，更優(yōu)選大約92％序列同一性，更優(yōu)選大約93％序列同一性，更優(yōu)選大約94％序列同一性，更優(yōu)選大約95％序列同一性，更優(yōu)選大約96％序列同一性，更優(yōu)選大約97％序列同一性，更優(yōu)選大約98％序列同一性，以及更加優(yōu)選大約99％序列同一性?；蛘?，當(dāng)該片段在選擇性雜交條件下與互補(bǔ)鏈雜交時(shí)存在基本的同源。比對(duì)兩序列并且鑒定同一性百分比的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。已有幾種用于測(cè)定同一性百分比的計(jì)算機(jī)程序。為了確定核酸序列同一性百分比而進(jìn)行的比對(duì)可以以本領(lǐng)域范圍內(nèi)的多種方式取得，例如，利用公眾可以得到的計(jì)算機(jī)軟件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或者M(jìn)egalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以判定用來(lái)測(cè)量比對(duì)的合適的參數(shù)，包括任何對(duì)所比較的序列全長(zhǎng)達(dá)最大比對(duì)所需要的算法。
″轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列″指多核苷酸序列，例如起始信號(hào)、增強(qiáng)子、與啟動(dòng)子，其誘導(dǎo)或者控制與其可操作連接的蛋白質(zhì)編碼序列的轉(zhuǎn)錄。在優(yōu)選方案中，重組轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄在啟動(dòng)子序列(或者其它的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列)的控制之下，所述啟動(dòng)子在預(yù)期表達(dá)的細(xì)胞類型中控制重組基因表達(dá)。也應(yīng)該理解，重組基因可以在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列控制之下，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列與那些控制自然發(fā)生的形式的CD20或CD16轉(zhuǎn)錄的序列相同或者不同。
如同在這里使用的，術(shù)語(yǔ)″轉(zhuǎn)基因″指一個(gè)核酸序列(編碼，例如，CD20或者CD16)，該序列已經(jīng)經(jīng)由人的干預(yù)例如經(jīng)由在這里描述的方法被引入細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因?qū)ζ鋵⒁灰氲霓D(zhuǎn)基因動(dòng)物或者細(xì)胞而言可以是部分地或者完全異源的，即外來(lái)的。轉(zhuǎn)基因可以包括一或多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列與任何其它核酸，該核酸可能是對(duì)所選擇的核酸最佳表達(dá)所需的，例如內(nèi)含子。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物″或″Tg+″可互換地使用，意圖包括任何非自然發(fā)生的非人動(dòng)物，其中該動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞包含異源核酸，該異源核酸已經(jīng)經(jīng)由人的干預(yù)例如經(jīng)過(guò)本領(lǐng)域已熟知的轉(zhuǎn)基因技術(shù)被引入、并編碼人CD20和/或優(yōu)選人CD16。該核酸經(jīng)由有意的遺傳操縱，例如經(jīng)過(guò)顯微注射或者用重組病毒感染，被直接地或者間接地引入該細(xì)胞的前體而使核酸引入該細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)遺傳操縱未包括經(jīng)典的雜交育種，而寧可說(shuō)針對(duì)重組DNA分子的引入。這個(gè)分子可能被整合入染色體，或者其可以是染色體外復(fù)制的DNA。術(shù)語(yǔ)″Tg+″包括對(duì)于人CD20和/或人CD16而言雜合的和/或純合的動(dòng)物。
″CD20相關(guān)的疾病″指疾病或者紊亂，該疾病或者紊亂已經(jīng)被與CD20在細(xì)胞上表達(dá)、B細(xì)胞的異常增殖或者活化聯(lián)系起來(lái)，或者已經(jīng)用抗-CD20抗體處理過(guò)。例如，嵌合的抗-CD20抗體已經(jīng)被用于治療淋巴瘤病人。已經(jīng)用抗-CD20治療處理過(guò)的其它的疾病或者癥狀包括例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、與強(qiáng)直性脊柱炎等自身免疫癥狀或者疾病。其它的病癥包括血或者骨髓移植后的EB病毒有關(guān)的疾病、卡波濟(jì)氏肉瘤相關(guān)的與皰疹病毒有關(guān)的多中心性Castlemen病(Karposi Sarcoma associated herpes virusrelated multicentric Castlemen disease)、丙型肝炎相關(guān)的冷球蛋白血癥血管炎、伴有自體免疫性溶血性貧血的淋巴組織增生性紊亂、及與ANCA相關(guān)的血管炎。
A.本發(fā)明的實(shí)施方式本發(fā)明提供表達(dá)異源的CD20標(biāo)志物、異源CD16標(biāo)志物或者兩者的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的人CD20轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在相同類型的B細(xì)胞上表達(dá)CD20。將抗-人CD20抗體給予該目前描述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物導(dǎo)致表達(dá)人CD20B淋巴細(xì)胞的消減。由于無(wú)法將有效的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域摻入轉(zhuǎn)基因，先前制備表達(dá)人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠的嘗試未能達(dá)成人CD20在合適的B細(xì)胞亞群中的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)人CD20與人CD16。
本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有以類似于人受試者的方式反應(yīng)的細(xì)胞。將抗-人CD20抗體給予該目前描述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物導(dǎo)致表達(dá)人CD20B淋巴細(xì)胞的消減。在一個(gè)實(shí)施方式中，人CD20轉(zhuǎn)基因鼠特征為人CD20在細(xì)胞上的表達(dá)水平足以使與表達(dá)細(xì)胞結(jié)合的抗人CD20抗體影響細(xì)胞的殺傷，引起至少大約75％、和更優(yōu)選80％、85％、90％、95％、99％并且甚至100％外周的和/或循環(huán)B細(xì)胞的消減。一個(gè)類似的反應(yīng)在人中觀察到。這些動(dòng)物模型能被用于篩選藥劑，所述藥劑包括然而不限于抗CD20標(biāo)志物的單克隆抗體。另外，表達(dá)人CD16的轉(zhuǎn)基因小鼠提供一種模型，所述模型用于確定一種藥劑具有誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞反應(yīng)(例如，NK細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng))的能力、或者該藥劑具有更進(jìn)一步地消減表達(dá)CD20的B淋巴細(xì)胞(包括惡性的B細(xì)胞)的能力。另外，該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可能用來(lái)測(cè)試抗-CD20所針對(duì)的治療的效力與毒性。
B.DNA構(gòu)建物典型的，編碼本發(fā)明的異源蛋白質(zhì)的多核苷酸分子被插入載體中，優(yōu)選DNA載體，以在合適的宿主細(xì)胞中復(fù)制該多核苷酸分子。將會(huì)認(rèn)識(shí)到，CD20和/或CD16轉(zhuǎn)基因可能被分別地制備與插入，或者制備在單一的構(gòu)建體中用于插入。DNA構(gòu)建物也可以對(duì)制備用于敲除動(dòng)物的導(dǎo)向載體有用處。
為了分離克隆與轉(zhuǎn)移CD16和/或CD20位點(diǎn)，可以使用酵母人工染色體(YAC)。整個(gè)位點(diǎn)可以被克隆、并包含在一個(gè)或者幾個(gè)YAC克隆中。如果使用許多YAC克隆、并且包含重疊同源(overlapping homology)的區(qū)域，他們可以在酵母宿主株內(nèi)部重組，以產(chǎn)生代表整個(gè)位點(diǎn)的單一構(gòu)建物。YAC臂可以另外用哺乳動(dòng)物選擇盒通過(guò)改型(retrofitting)來(lái)進(jìn)行修飾，以幫助構(gòu)建物通過(guò)以前概括的方法引入胚胎干細(xì)胞或者胚胎。
由于其高穩(wěn)定性與相對(duì)大的插入物、操作容易以及鳥(niǎo)槍法測(cè)序，細(xì)菌人工染色體(BAC)文庫(kù)可以為目的基因提供人序列。BAC文庫(kù)可包含的平均插入物大小為100-150kb。BAC克隆能夠攜帶高達(dá)300,000bp的插入物。Shizuya，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 898794-8797；Kim，et al.，(1996)Genomics 34213-218；Swiatek，et al.，(1993)Genes andDevelopment 72071-2084。人與小鼠的基因組BAC文庫(kù)已經(jīng)被構(gòu)建，并且市場(chǎng)上可買到(Invitrogen，Carlsbad CA)?；蚪MBAC文庫(kù)還可以充當(dāng)人與鼠CD20和/或CD16基因序列以及轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域的來(lái)源。
編碼人CD20的核酸為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。人與鼠CD20代表性的cDNA(SEQ ID NO5)、基因組(SEQ ID NO6)與氨基酸序列(SEQ ID NO4)在圖23中所示。其它的序列也可以在GenBank中找到，例如登記號(hào)碼AH003353。
編碼人CD16α鏈同種型的核酸為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。人α鏈亞型A的代表性cDNA(SEQ ID NO2)、基因組(SEQ ID NO3)與氨基酸序列(SEQID NO1)示于圖22A、B與C(GenBank登記號(hào)數(shù)NM000569與Z46222)。人CD16α鏈同種型B代表性的氨基酸(SEQ ID NO10)與cDNA序列(SEQID NO11)在圖22E中顯示(GenBank登記號(hào)碼NM000570)。編碼人CD16α鏈同種型B的基因組序列示于圖22F(GenBank登記號(hào)碼Z46223)。編碼人Fc受體γ鏈的核酸序列也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。代表性氨基酸(SEQ IDNO7)(GenBank登記號(hào)碼P30273)和cDNA序列(GenBank登記號(hào)碼M33195)(SEQ ID NO8)示于圖25。
異源的轉(zhuǎn)基因優(yōu)選包含與將要在轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物中表達(dá)的目的基因可操作連接的種系(germline)調(diào)節(jié)性DNA序列。術(shù)語(yǔ)″可操作連接″指遺傳片段操作上(即功能上)與核酸片段、或給定片段或者序列的上游(5′)或者下游(3′)序列連接。那些附近的序列經(jīng)常影響在所需的細(xì)胞類型中核酸片段或者序列的加工和/或表達(dá)。
優(yōu)選，這些調(diào)節(jié)性序列是基因組來(lái)源的，并且包括一個(gè)或者多個(gè)內(nèi)含子。例如，轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物可以包括位于編碼CD20和/或CD16的基因的5’-旁側(cè)區(qū)的調(diào)節(jié)區(qū)，該調(diào)節(jié)區(qū)以能在宿主細(xì)胞中復(fù)制與表達(dá)該基因的方式可操作地與編碼序列連接。在一個(gè)實(shí)施方式中，調(diào)節(jié)性序列包含與CD20與/或CD16有自然聯(lián)系的內(nèi)源的啟動(dòng)子序列。在一些實(shí)施方式中，啟動(dòng)子以與該序列所來(lái)源的動(dòng)物中的表達(dá)水平類似的水平提供組織特定的表達(dá)。如果額外的旁側(cè)序列在優(yōu)化表達(dá)中有用，像這樣的序列可以利用現(xiàn)有的序列作為探針被克隆。使轉(zhuǎn)基因的加工或者表達(dá)達(dá)最大化所需的附加序列可以源自于基因組序列。
或者，啟動(dòng)子可以是那些與轉(zhuǎn)基因宿主動(dòng)物中相應(yīng)的內(nèi)源基因有聯(lián)系的啟動(dòng)子。例如，如果鼠基因CD20和/或CD16基因通過(guò)與相應(yīng)的人基因整合而被破壞，該相應(yīng)的人基因優(yōu)選是整合的，以使其分別與內(nèi)源的鼠CD20和/或CD16的鼠轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域可操作地連接。
優(yōu)選，調(diào)節(jié)性序列在合適的細(xì)胞中并以一定的水平提供該轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，從而可以利用標(biāo)準(zhǔn)方法例如用抗體檢測(cè)來(lái)檢測(cè)表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方式中，調(diào)節(jié)序列以人細(xì)胞上CD20表達(dá)的至少40％的水平提供該人CD20轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
編碼轉(zhuǎn)基因的表達(dá)系統(tǒng)或者構(gòu)建物可以從構(gòu)建物表達(dá)，所述構(gòu)建物包括特異于CD20標(biāo)志物和/或CD16受體的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，例如人內(nèi)源的啟動(dòng)子(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5,877,396，在此引入作為參考)。
編碼如同在這里描述的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)系統(tǒng)或者構(gòu)建物還可以包括DNA序列下游的3′非翻譯區(qū)。像這樣的區(qū)域可以使表達(dá)系統(tǒng)的RNA轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定，并因此增加從該表達(dá)系統(tǒng)中所需蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。對(duì)本發(fā)明的構(gòu)建物有用的3′非翻譯區(qū)是那些提供多聚腺苷酸化信號(hào)的序列。像這樣的序列可以源自，例如SV40小t抗原、CD20和/或CD16非翻譯區(qū)或者其它本領(lǐng)域熟知的3′非翻譯序列。
任選地，表達(dá)系統(tǒng)或者構(gòu)建物包括在啟動(dòng)子與編碼信號(hào)序列的DNA序列之間的5′非翻譯區(qū)。像這樣的非翻譯區(qū)可以與啟動(dòng)子來(lái)自相同的控制區(qū)域，或者可以來(lái)自于不同基因，例如他們可能是來(lái)源于其它人造、半-人造或者天然來(lái)源。
另外，可以利用與該轉(zhuǎn)基因不天然相關(guān)的其它啟動(dòng)子或者其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。例如，異源的啟動(dòng)子可以表達(dá)或者組織特異性表達(dá)水平增強(qiáng)。具有不同強(qiáng)度的各種啟動(dòng)子可以被利用，只要該啟動(dòng)子在該非人動(dòng)物或者在所需組織類型中發(fā)揮作用。許多啟動(dòng)子為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。
表達(dá)系統(tǒng)可以利用本領(lǐng)域已知的方法制備。例如，表達(dá)系統(tǒng)可以作為較大質(zhì)粒的一部分被制備。像這樣的制備允許以本領(lǐng)域已知的有效方式克隆與選擇正確構(gòu)建物。表達(dá)系統(tǒng)可以位于質(zhì)粒上便利的限制性位點(diǎn)之間以致他們可以容易地從余下的質(zhì)粒序列中分離以摻入所需的哺乳動(dòng)物。優(yōu)選，編碼人CD20和/或CD16的DNA構(gòu)建物包含細(xì)菌人工染色體，所述細(xì)菌人工染色體包括自然相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，以提供組織特異性的表達(dá)。
質(zhì)粒制備與宿主有機(jī)體轉(zhuǎn)化中使用的各種方法在本領(lǐng)域是已知的。用于原核與真核細(xì)胞的其它合適的表達(dá)系統(tǒng)，以及一般的重組操作，參見(jiàn)Molecular Cloning A Laboratory Manual，第二版，Sambrook、Fritsch與Maniatis編輯(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社1989)第16與17章。
C.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)生產(chǎn)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，包括敲除(knock-out)與“敲入”(knock-in)法，在本領(lǐng)域是熟知的(一般地，參見(jiàn)，“Gene TargetingAPractical Approach”，Joyner編輯.，牛津大學(xué)出版社有限公司(2000)))。轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生可以任選涉及鼠標(biāo)志物基因位點(diǎn)的破壞與將編碼人標(biāo)志物的基因引入鼠基因組，優(yōu)選與內(nèi)源基因在相同的位置。
根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)人CD20已經(jīng)被引入該鼠基因組時(shí)，生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因小鼠模型(huCD20+；或者稱為huCD20Tg+)。內(nèi)源的鼠CD20多肽存在于鼠淋巴細(xì)胞上，但是已知的抗-人CD20單克隆抗體不與鼠B細(xì)胞結(jié)合。因此，可以破壞內(nèi)源的鼠CD20基因但不是必須要破壞。當(dāng)內(nèi)源的鼠CD20不被破壞時(shí)，則編碼人CD20的基因優(yōu)選插入在編碼鼠CD20的基因的位置之外的位置。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因組更進(jìn)一步地包含編碼人CD16的序列，優(yōu)選，α鏈，以及更優(yōu)選亞型Aα鏈。當(dāng)使用小鼠時(shí)，敲除系是優(yōu)選產(chǎn)生的，其中鼠CD16基因，優(yōu)選α鏈，已經(jīng)被破壞(mCD16-/-)。獨(dú)立地，當(dāng)人CD16α鏈基因已經(jīng)被引入基因組時(shí)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因鼠系(huCD16+；或者被稱為huCD16Tg+)。mCD16-/-與huCD16+小鼠系然后雜交，產(chǎn)生表達(dá)人CD16α鏈但不表達(dá)內(nèi)源CD16的小鼠系(huCD16+mCD16-/-)?；蛘撸撊嘶蚩梢员灰雭?lái)源于mCD16-/-系的ES細(xì)胞，或者被用于破壞鼠CD16基因。
內(nèi)源位點(diǎn)的滅活在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，內(nèi)源位點(diǎn)的滅活是通過(guò)胚胎干細(xì)胞內(nèi)的同源重組造成的導(dǎo)向性破壞取得的。在一個(gè)實(shí)施方式中，DNA被引入宿主細(xì)胞并且在內(nèi)源位點(diǎn)重組以破壞內(nèi)源CD16的生產(chǎn)。類似地，在另一個(gè)實(shí)施方式中，DNA被引入宿主細(xì)胞并且在內(nèi)源CD20位點(diǎn)重組以破壞內(nèi)源CD20的生產(chǎn)。
利用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法可以生產(chǎn)導(dǎo)向構(gòu)建物，(參見(jiàn)，例如Sambrook et al.，1989，Molecular CloningA Laboratoy Manual，SecondEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork；E.N.Glover(eds.)，1985，DNA CloningA Practical Approach，Volumes I and II；M.J.Gait(ed.)，1984，Oligonucleotide Synthesis；B.D.Hames & S.J.Higgins(eds.)，1985，Nucleic Acid Hybridization；B.D.Hames& S.J.Higgins(eds.)，1984，Transcription and Translation；R.I.Freshney(ed.)，1986，Animal Cell Culture；Immobilized Cells and Enzymes，IRLPress，1986；B.Perbal，1984，A Practical Guide To Molecular Cloning；F.M.Ausubel et al.，1994，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，)。例如，該導(dǎo)向構(gòu)建體可以依照常規(guī)的方式制備，其中序列可以被合成、從天然來(lái)源分離、操縱、克隆、連接、進(jìn)行體外誘變、引物修復(fù)、等等。在各個(gè)階段，所連接的序列可以被克隆，并通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切分析進(jìn)行分析、測(cè)序等等。
導(dǎo)向DNA可以利用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)獲得。例如，導(dǎo)向DNA可以通過(guò)寡核苷酸的化學(xué)合成、雙鏈DNA模板的切口翻譯、序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增(或者連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增)、攜帶目的序列的原核的或者靶克隆載體的純化(例如克隆的cDNA或者基因組DNA，合成DNA或者來(lái)自任何前面提到過(guò)的組合的DNA)而產(chǎn)生，所述原核或靶克隆載體例如質(zhì)粒、噬粒、YAC、粘粒、BAC、噬菌體DNA、其它的病毒DNA或者復(fù)制中間產(chǎn)品、或者其純化的限制性片段、以及具有所需核苷酸序列的單與雙鏈多核苷酸的其它來(lái)源。此外，可利用本領(lǐng)域已知方法選擇同源性的長(zhǎng)度。例如，選擇可以以預(yù)先確定的內(nèi)源靶DNA序列的序列組成與復(fù)雜性為基礎(chǔ)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的導(dǎo)向構(gòu)建物包含導(dǎo)向區(qū)，所述導(dǎo)向區(qū)包含與要被破壞的CD16基因和/或CD20的一部分或者區(qū)域同源的第一序列(或者臂)，和與該基因的第二部分或者區(qū)域同源的第二序列。該導(dǎo)向構(gòu)建物可以更進(jìn)一步地包含正選擇標(biāo)記，其優(yōu)選位于第一與第二DNA序列之間。該正選擇標(biāo)記可可操作地與啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)連接。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，該導(dǎo)向構(gòu)建物可以包含超過(guò)一個(gè)可選擇標(biāo)記基因，包括負(fù)的選擇性標(biāo)記，例如單純皰疹病毒tk(HSV-tk)基因，其優(yōu)選位于該導(dǎo)向構(gòu)建物的一個(gè)或兩個(gè)同源臂的外面。負(fù)的可選擇標(biāo)記可以與啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)可操作地連接(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5,464,764；5,487,992；5,627,059及5,631,153)。
一旦合適的導(dǎo)向構(gòu)建物已經(jīng)被制備，該導(dǎo)向構(gòu)建物可能利用任何本領(lǐng)域已知方法被引入合適的宿主細(xì)胞。各種的技術(shù)可被用于本發(fā)明，包括，例如原核顯微注射；逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移入種系；在胚胎干細(xì)胞中的基因?qū)?；胚胎的電穿孔；精液介?dǎo)的基因轉(zhuǎn)移；與磷酸鈣/DNA共沉淀；顯微注射DNA入細(xì)胞核；細(xì)菌的原生質(zhì)體與完整細(xì)胞融合；轉(zhuǎn)染；聚陽(yáng)離子例如1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(polybrene)、聚烏氨酸等等。(參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)4,873,191；Van der Putten et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 826148-6152；Thompson et al.，1989，Cell56313-321；Lo，1983，Mol Cell.Biol.31803-1814；Lavitrano et al.，1989，Cell，57717-723)。轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的各種技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的。(參見(jiàn)，例如，Gordon，1989，Intl.Rev.Cytol.，115171-229；Keown et al.，1989，Methods in Enzymology；Keown et al.，1990，Methods andEnzymology，Vol.185，pp.527-537；Mansour et al.，1988，Nature，336348-352)。
能同源重組的任何細(xì)胞類型可被用于本發(fā)明的操作。像這樣的靶細(xì)胞的例子包括來(lái)源于脊椎動(dòng)物的細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物例如人、牛的物種、羊的物種、鼠的物種、猿的物種、與其它真核生物例如絲狀真菌、與高等的多細(xì)胞有機(jī)體例如植物。
優(yōu)選的細(xì)胞類型包括胚胎干(ES)細(xì)胞，其典型的獲得自體外培養(yǎng)的移植前胚胎(參見(jiàn)，例如，Evans，M.J.et al.，1981，Nature 292154-156；Bradley，M.O.et al.，1984，Nature 309255-258；Gossler et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 839065-9069；和Robertson et al.，1986，Nature322445-448)。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法培養(yǎng)與制備ES細(xì)胞用于該導(dǎo)向構(gòu)建物的導(dǎo)入。(參見(jiàn)，例如，Robertson，E.J.ed.″Teratocarcinomas andEmbryonic Stem Cells，a Practical Approach″，IRL Press，Washington D.C.，1987；Bradley et al.，1986，Current Topics in Devel.Biol.20357-371；Hogan et al.，在″Manipulating the Mouse Embryo”A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor N.Y，1986中；Thomas et al.，1987，Cell 51503；Koller et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8810730；Dorin et al.，1992，Transgenic Res.1101；and Veis et al.，1993，Cell 75229)。將要用該導(dǎo)向構(gòu)建物插入的ES細(xì)胞源自于與他們將被引入的發(fā)育胚胎相同物種的胚胎或者胚泡。ES細(xì)胞典型的針對(duì)他們的整合入內(nèi)細(xì)胞群(inner cell mass)的能力被選擇，并且當(dāng)在發(fā)育的胚泡階段被引入該哺乳動(dòng)物胚胎時(shí)成為個(gè)體的種系的一部分。因此，任何具有這一能力的ES細(xì)胞系適于在本發(fā)明的操作中應(yīng)用。
在該導(dǎo)向構(gòu)建物已經(jīng)被引入細(xì)胞之后，鑒別其中已經(jīng)發(fā)生成功基因?qū)虻募?xì)胞。該導(dǎo)向構(gòu)建物插入靶基因典型的是經(jīng)過(guò)鑒定表達(dá)該標(biāo)記基因的細(xì)胞而檢測(cè)。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，用本發(fā)明的導(dǎo)向構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的細(xì)胞用選擇未表達(dá)該選擇性標(biāo)記的細(xì)胞的合適的藥劑處理。只有那些表達(dá)選擇性標(biāo)記基因的細(xì)胞在一定條件下成活和/或生長(zhǎng)。例如，那些表達(dá)引入的新霉素抗性基因的細(xì)胞抗化合物G418，而那些不表達(dá)neo基因標(biāo)記的細(xì)胞被G418殺死。如果該導(dǎo)向構(gòu)建物也包含篩選標(biāo)記例如GFP，同源重組可以通過(guò)在熒光下篩選細(xì)胞菌落而鑒別。那些已經(jīng)進(jìn)行同源重組的細(xì)胞將已經(jīng)刪除該GFP基因，并且不會(huì)發(fā)熒光。
或者，正-負(fù)選擇技術(shù)可能用來(lái)選擇同源的重組體。這個(gè)技術(shù)涉及一種方法，其中第一藥物，例如新霉素樣藥物被加入該細(xì)胞群體，來(lái)選擇轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)，即正選擇。第二藥物，例如FIAU隨后被加入以殺死那些表達(dá)負(fù)選擇標(biāo)記的細(xì)胞，即負(fù)選擇。那些包含與表達(dá)負(fù)選擇標(biāo)記的細(xì)胞被選擇藥劑殺死，而那些沒(méi)有包含與表達(dá)該負(fù)選擇標(biāo)記的細(xì)胞成活。例如，用構(gòu)建物非同源插入的細(xì)胞表達(dá)HSV胸苷激酶，并因此對(duì)皰疹藥物例如更昔洛韋(GANC)或者FIAU(1-(2-脫氧2-氟代-B-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘代尿嘧啶)敏感。(參見(jiàn)，例如，Mansour et al.，Nature 336348-352(1988)；Capecchi，Science 2441288-1292，(1989)；Capecchi，Trends in Genet.570-76(1989))。其它的方法包括受調(diào)節(jié)的正選擇(參見(jiàn)U.S.20030032175A1)，其中要求加入單一選擇劑。
可通過(guò)分析被選擇細(xì)胞的DNA來(lái)鑒別成功重組以印證同源重組。各種的技術(shù)在本領(lǐng)域已知，例如PCR和/或Southern分析可用來(lái)印證同源重組事件。
被選細(xì)胞然后被注射入動(dòng)物(例如小鼠)的胚泡(或者其它的適于創(chuàng)造能生存的動(dòng)物的用途的發(fā)育階段，例如，桑椹胚)，以形成嵌合體(參見(jiàn)，例如Bradley.A.，在“Teratocarcinomas and Embryonic Stem CellsA PracticalApproach”中，J.Robertson編輯，IRL，Oxford，pp.113-152(1987))。或者，可以讓被選的ES細(xì)胞與離解的小鼠胚胎細(xì)胞聚集以形成集合體嵌合體。嵌合胚可隨后被移植入合適的假孕雌性代孕動(dòng)物并且該胚胎被培育至足月。在其性細(xì)胞中攜帶同源重組DNA的嵌合后代可用于繁殖動(dòng)物，其中該動(dòng)物的所有的細(xì)胞包含同源重組的DNA。在一個(gè)實(shí)施方式中，嵌合后代小鼠被用來(lái)產(chǎn)生在CD16或者CD20基因具有雜合破壞的小鼠。雜合轉(zhuǎn)基因小鼠可隨后交配。本領(lǐng)域已熟知，典型的，這種交配的后代中1/4將在CD16或者CD20基因中有純合破壞。
除以上所述滅活內(nèi)源的位點(diǎn)的方法之外，有其它的優(yōu)選滅活方法，并且可以包括例如利用tet轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)來(lái)利用特異目的基因的時(shí)序控制(Proc.Natl.Acad.Sci.919302-9306(1994)或者引入脫氧細(xì)胞周期蛋白(deoxycycline)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)控制進(jìn)行組織特定的控制(Proc.Natl.Acad.Sci.9310933-10938(1996)。
用于功能性滅活的另外優(yōu)選的方法包括使用cre-lox刪除、用于遺傳位點(diǎn)的導(dǎo)向敲除的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，其中l(wèi)oxP位點(diǎn)被插入目的基因的側(cè)翼，并且cre重組酶被激活以刪除基因(Curr.Opin.Biotechnol.521-527(1994))。
或者，反義或RNAi方法可能被利用以抑制該所需位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄，因此導(dǎo)致內(nèi)源位點(diǎn)的功能性破壞(knock-down方法)。在這樣的情形中，生產(chǎn)導(dǎo)向指定的目的位點(diǎn)的特定序列的寡核苷酸，其中成功導(dǎo)向?qū)е鹿δ艿鞍椎纳a(chǎn)抑制。
缺乏鼠FcγRIII受體的敲除小鼠株可從Taconic買到。這些小鼠缺乏鼠FcγRIIIγ鏈，從而也導(dǎo)致FcγRI與FcγRIII表達(dá)的喪失。另外，缺乏功能性γ鏈并且因此缺乏鼠FcγRIII受體的敲除小鼠可以如美國(guó)專利號(hào)5,877,396描述地加以制備，在此引入作為參考。
缺乏功能性的鼠FcγRIIIα鏈的小鼠可以利用類似方法生產(chǎn)。簡(jiǎn)要地說(shuō)，在一個(gè)實(shí)施方式中，可以利用如圖22G所示鼠CD16α鏈cDNA序列(GenBank登記號(hào)碼NM010188)制備導(dǎo)向載體。導(dǎo)向載體優(yōu)選包括編碼序列上游5′序列以及該編碼序列的至少300個(gè)核苷酸。該構(gòu)建物可以被克隆入編碼新霉素抗性基因的載體例如pMC1neo(Stratagene)。所得到的載體能隨后用電穿孔被引入ES細(xì)胞。ES細(xì)胞被鋪于neo抗性的胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，然后在G418存在下被選擇。被選ES細(xì)胞被注射入胚泡。鼠CD 16a鏈的合適導(dǎo)向可以利用RT-PCR或者細(xì)胞上鼠CD16α鏈的表達(dá)的喪失測(cè)定。PCR引物可以利用鼠CD16α鏈cDNA序列加以設(shè)計(jì)。
對(duì)于內(nèi)源CD20的喪失純合的敲除小鼠可以如WO 02/062946中描述制備。簡(jiǎn)要地，在一個(gè)實(shí)施方式中，CD20-缺陷的小鼠可以通過(guò)利用同源重組導(dǎo)向破壞胚胎干(ES)細(xì)胞中鼠CD20基因而生產(chǎn)。導(dǎo)向載體可以生產(chǎn)，其中用新霉素抗性基因替換編碼第二細(xì)胞外環(huán)的一部分的外顯子、第四跨膜結(jié)構(gòu)域、和鼠CD20的羧基末端大的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。鼠CD20的核苷酸序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。(GenBank登記號(hào)碼M62541)。在一個(gè)實(shí)施方式中，合適的基因?qū)ぐ挟a(chǎn)生在氨基酸位置157截?cái)?、并且與Neo基因序列編碼的88個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)融合的異常的CD20蛋白質(zhì)。
在DNA轉(zhuǎn)染之后，攜帶被導(dǎo)向的等位基因的neo-抗性的ES細(xì)胞克隆通過(guò)Southem印跡分析加以確定。一個(gè)ES細(xì)胞克隆的細(xì)胞可被注射入可被轉(zhuǎn)移入代孕母親的那些胚泡。高度嵌合的雄性后代(根據(jù)毛色80-100％)可以用C57BL/6(B6)雌性加以繁殖，以將突變傳遞給他們的后代。對(duì)于CD20基因的破壞純合的小鼠可以通過(guò)雜交雜合的后代以預(yù)期的孟德?tīng)栴l率獲得。
CD20的合適導(dǎo)向可以更進(jìn)一步地通過(guò)來(lái)自純合后代的基因組DNA的PCR分析來(lái)證實(shí)。野生型CD20mRNA在CD20-/-小鼠中存在或者缺乏可以通過(guò)CD20-/-小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生的cDNA的PCR擴(kuò)增來(lái)證實(shí)。CD20-/-小鼠中細(xì)胞表面CD20蛋白質(zhì)表達(dá)的缺乏可以更進(jìn)一步地通過(guò)用鼠抗-CD20單克隆抗體染色B220+脾細(xì)胞證實(shí)。CD20基因的導(dǎo)向突變使細(xì)胞表面CD20蛋白質(zhì)不表達(dá)。
將轉(zhuǎn)基因引入非人動(dòng)物本發(fā)明的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物優(yōu)選通過(guò)將轉(zhuǎn)基因引入該動(dòng)物的種系加以生產(chǎn)。在各種發(fā)育階段的胚胎靶細(xì)胞可用于引入轉(zhuǎn)基因。依賴于胚胎靶細(xì)胞的發(fā)育階段使用不同的方法。以一般健康、良好胚胎產(chǎn)量、胚胎中良好原核能見(jiàn)度與良好生殖適應(yīng)度為標(biāo)準(zhǔn)，選擇任何被用來(lái)實(shí)施本發(fā)明的動(dòng)物的特定的譜系。當(dāng)將生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠時(shí)，株例如C57BL/6或者C57BL/6xDBA/2F1、或者FVB系是經(jīng)常使用的(商業(yè)上獲得自Charles RiverLabs，Boston，Mass，The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME，或Taconic Labs.)。優(yōu)選的株是具有H-2b、H2d或者H-2q單倍體的株例如C57BL/6或者DBA/1。裸鼠可以被利用以允許人腫瘤細(xì)胞的引入。裸鼠的繁殖與維持更困難，因?yàn)槠鋵?duì)感染與疾病敏感。用來(lái)實(shí)行本發(fā)明的系可以本身是轉(zhuǎn)基因的，和/或可以是敲除的。優(yōu)選相同的系被用來(lái)制備初始敲除哺乳動(dòng)物與轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。這會(huì)使以后的繁殖與回交更有效。
轉(zhuǎn)基因引入胚胎可以通過(guò)任何本領(lǐng)域已知的方式完成，例如，顯微注射、電穿孔法、或者脂轉(zhuǎn)染。例如，該轉(zhuǎn)基因可以通過(guò)將構(gòu)建物顯微注射入已受精的哺乳動(dòng)物卵的原核而被引入哺乳動(dòng)物，使得一或多拷貝的該構(gòu)建物保留在發(fā)育哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中。轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物被引入受精卵后，該卵可以體外孵化一可變量的時(shí)間，或者再植入代理宿主內(nèi)，或者兩者都有。體外孵化至成熟是在本發(fā)明范圍之內(nèi)的。一個(gè)常見(jiàn)的方法是體外孵化該胚胎大約1-7天(取決于物種)然后將其再植入代理宿主內(nèi)。
再植入術(shù)利用標(biāo)準(zhǔn)方法完成。通常，代理宿主是被麻醉的，并且胚胎被插入輸卵管中。移植入特定宿主的胚胎數(shù)目將隨物種改變，但是通常與該物種自然生產(chǎn)的后代數(shù)目具有可比性。
還可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染將轉(zhuǎn)基因引入非人動(dòng)物。發(fā)育的非人胚胎可以體外培養(yǎng)至胚泡階段。在這一時(shí)期，可以針對(duì)卵裂球進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒感染(Jaenich，R.(1976)PNAS 731260-1264)。通過(guò)酶處理除去透明帶以獲得卵裂球的有效感染((Manipulating the Mouse Embryo，Hogan eds.(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1986)。用來(lái)引入轉(zhuǎn)基因的病毒載體系統(tǒng)典型的是攜帶該轉(zhuǎn)基因的復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒(Jahner etal.(1985)PNAS 826927-6931；Van der Putten et al.(1985)PNAS 826148-6152)。通過(guò)在生成病毒的細(xì)胞單層上培養(yǎng)卵裂球容易與有效地獲得轉(zhuǎn)染(Van der Putten，見(jiàn)上；Stewart et al.(1987)EMBO J.6383-388)。或者，感染可以在以后階段進(jìn)行。病毒或者生產(chǎn)病毒的細(xì)胞可以被注射入囊胚腔(Jahner et al(1982)Nature 298623-628)。大多數(shù)建立者(founder)對(duì)于該轉(zhuǎn)基因是嵌合體，因?yàn)閾饺雰H僅發(fā)生在形成該轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的細(xì)胞亞群上。更進(jìn)一步地，建立者可以在基因組不同位置包含轉(zhuǎn)基因的各種逆轉(zhuǎn)錄病毒插入物，其通常將分散在后代中。另外，可能通過(guò)妊娠中期胚胎的子宮內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染來(lái)將轉(zhuǎn)基因引入種系(Jahner et al.(1982)見(jiàn)上)。
轉(zhuǎn)基因引入的第三種類型的靶細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因可以通過(guò)DNA轉(zhuǎn)染或者通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)有效地被引入ES細(xì)胞。這樣轉(zhuǎn)化的ES細(xì)胞可以此后與來(lái)自非人動(dòng)物的胚泡結(jié)合。ES細(xì)胞此后移植入胚胎，并且構(gòu)成所得到的嵌合動(dòng)物種系的一部分。
在一個(gè)實(shí)施方式中，編碼例如圖23所示人CD20的cDNA或者基因組克隆可以利用顯微注射或轉(zhuǎn)染被引入FVB小鼠受精卵或者ES細(xì)胞。胚胎體外孵化大約1-7天，然后移植入代理宿主。ES細(xì)胞與來(lái)自自然交配的宿主動(dòng)物的胚泡結(jié)合，并且胚泡被再植入代理母親。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，編碼例如圖22所示人CD16α鏈亞型A的cDNA或者基因組克隆可以使用轉(zhuǎn)染或者顯微注射被引入ES細(xì)胞或者已受精的胚胎。在可選的實(shí)施方式中，編碼人Fc受體γ鏈的cDNA或者基因組克隆也可以與人CD16α鏈一起被引入ES或者已受精的胚胎。受精卵體外孵化1-7天然后再植入代理宿主。ES細(xì)胞與來(lái)自自然交配的宿主動(dòng)物的胚泡結(jié)合，并且胚泡被再植入代理母親。人CD16α鏈(FcγRIIIα鏈)在小鼠細(xì)胞中的表達(dá)將發(fā)生在小鼠γ鏈存在時(shí)，因?yàn)樾∈笈c人γ鏈在序列上相仿。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在非人宿主中的內(nèi)源CD20或CD16通過(guò)異源的CD20或CD16α鏈基因的同源整合作用被功能上破壞，以致于異源CD20或CD16基因?qū)嵸|(zhì)上分別替換內(nèi)源CD20或CD16基因，并且優(yōu)選完全替換內(nèi)源CD20或者CD16基因的編碼序列。優(yōu)選，作為同源整合作用的結(jié)果，異源CD20或者CD16基因分別地連接于內(nèi)源CD20或CD16基因的調(diào)節(jié)性序列(例如增強(qiáng)子啟動(dòng)子)，以致該異源基因在內(nèi)源CD20或CD16基因位點(diǎn)的調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄控制之下被表達(dá)。對(duì)于像這樣的替換等位基因純合的非人類的宿主可以根據(jù)在這里描述的方法生產(chǎn)。像這樣的純合的非人類宿主一般將表達(dá)異源CD20或CD16，或者兩者，但是不表達(dá)內(nèi)源CD20或CD16蛋白質(zhì)。通常，異源CD20或CD16基因的表達(dá)模式實(shí)質(zhì)上分別模仿在自然發(fā)生的(非轉(zhuǎn)基因)非人類宿主中內(nèi)源CD20或CD16基因的表達(dá)模式。
例如，可以生產(chǎn)人CD20基因序列已經(jīng)代替內(nèi)源的鼠CD20基因序列、并且轉(zhuǎn)錄上受內(nèi)源鼠調(diào)節(jié)序列控制的轉(zhuǎn)基因小鼠。人CD20一般地類似于在自然發(fā)生的非轉(zhuǎn)基因小鼠中鼠CD20的方式加以表達(dá)。
例如，可以生產(chǎn)具有人CD16α鏈序列并且轉(zhuǎn)錄上受內(nèi)源的鼠調(diào)節(jié)序列控制的轉(zhuǎn)基因小鼠?；蛘撸撊薈D16α鏈可以被引入小鼠，并且隨后與缺乏鼠CD16α鏈表達(dá)的小鼠雜交。人CD16α鏈的表達(dá)預(yù)計(jì)在鼠γ鏈存在時(shí)發(fā)生。
一般地，使用替換類型(replacement-type)的導(dǎo)向構(gòu)建物進(jìn)行同源基因替換。在導(dǎo)向構(gòu)建物的內(nèi)源CD20或CD16α基因序列之間雙交叉同源重組導(dǎo)致異源CD20或CD16基因片段的靶向整合作用。通常，該轉(zhuǎn)基因的同源導(dǎo)向區(qū)域包含內(nèi)源的CD20和/或CD16α基因片段側(cè)翼的序列，以致同源重組導(dǎo)致內(nèi)源CD20和/或CD16基因片段各自伴隨性地刪除，以及異源基因片段的同源整合作用。實(shí)質(zhì)上整個(gè)內(nèi)源CD20和/或CD16基因可以通過(guò)單一導(dǎo)向事件或者通過(guò)多重導(dǎo)向事件(例如，單個(gè)外顯子的依序替換)用異源CD20和/或CD16基因替換。通常以正的或者負(fù)的選擇表達(dá)盒形式的一或多個(gè)選擇性標(biāo)記可被置于導(dǎo)向構(gòu)建物中。通常優(yōu)選選擇性標(biāo)記位于異源替換區(qū)域的內(nèi)含子區(qū)域。
轉(zhuǎn)基因小鼠的雜交包含轉(zhuǎn)基因人CD20的轉(zhuǎn)基因小鼠可以與包含轉(zhuǎn)基因人CD16和缺乏鼠CD16轉(zhuǎn)基因小鼠雜交。優(yōu)選，該轉(zhuǎn)基因小鼠包含人CD16α鏈并缺乏鼠CD16α鏈。一種制備方法是產(chǎn)生一系列哺乳動(dòng)物，每個(gè)包含該所需敲除構(gòu)建物或者轉(zhuǎn)基因中的一個(gè)。像這樣的哺乳動(dòng)物通過(guò)一系列雜交、回交和選擇共同繁殖，最終產(chǎn)生包含所有所需敲除構(gòu)建物和/或轉(zhuǎn)基因的單一哺乳動(dòng)物，其中該哺乳動(dòng)物除了該敲除構(gòu)建物和/或轉(zhuǎn)基因的存在之外對(duì)野生型是同類系的(遺傳上同一的)。
典型的，取決于增殖過(guò)程中每個(gè)特定步驟的目標(biāo)，通過(guò)交配同胞兄弟姐妹或者用后代交配親本株完成雜交與回交。在某些情況下，也許必需產(chǎn)生許多后代，以產(chǎn)生在適當(dāng)?shù)娜旧w位置包含每一敲除構(gòu)建物和/或轉(zhuǎn)基因的單一后代。另外，也許必需雜交或者回交幾代，以最終獲得所需的基因型。
一旦該人位點(diǎn)已經(jīng)或者由同源重組或者由隨機(jī)整合作用被引入宿主基因組，并且宿主動(dòng)物已經(jīng)被產(chǎn)生，在宿主動(dòng)物中內(nèi)源CD16位點(diǎn)已經(jīng)通過(guò)各種轉(zhuǎn)基因或者突變動(dòng)物的適當(dāng)繁殖而被滅活，可以產(chǎn)生缺乏產(chǎn)生內(nèi)源CD16α鏈的天然能力、但是具有產(chǎn)生人CD16α鏈和/或CD20的能力的宿主。
在一個(gè)實(shí)施方式中，表達(dá)人CD16α鏈的轉(zhuǎn)基因小鼠與鼠CD16α鏈缺陷的小鼠交配，從而在CD16多肽缺陷的小鼠中重建特定的人CD16的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，這些轉(zhuǎn)基因小鼠可隨后與表達(dá)人CD20的小鼠繁殖，以制造表達(dá)CD16和人CD20然而不表達(dá)內(nèi)源CD16的小鼠系。
D.轉(zhuǎn)基因的存在的證實(shí)可經(jīng)過(guò)任何合適的方法以所需組織、細(xì)胞或者動(dòng)物中該轉(zhuǎn)基因的存在和/或表達(dá)篩選代理宿主的轉(zhuǎn)基因后代。篩選經(jīng)常利用對(duì)該轉(zhuǎn)基因的至少一部分互補(bǔ)的探針經(jīng)過(guò)Southern印跡或者Northern印跡分析完成?？梢允褂美每褂稍撧D(zhuǎn)基因編碼的蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡分析，作為篩選轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物存在的可選的或者補(bǔ)充的方法。典型的，DNA制備自尾組織，并且，通過(guò)Southern分析或者PCR分析該轉(zhuǎn)基因?；蛘撸肧outhern分析或者PCR，測(cè)試被認(rèn)為以最高水平表達(dá)該轉(zhuǎn)基因的組織或者細(xì)胞中該轉(zhuǎn)基因的存在與表達(dá)，雖然任何組織或者細(xì)胞類型也可被用來(lái)進(jìn)行這一分析。
評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因存在的其它或者附加方法包括，但不限于，合適的生物化學(xué)試驗(yàn)例如酶和/或免疫學(xué)測(cè)定、對(duì)于特定標(biāo)記物或者酶活性的組織學(xué)染色、流式細(xì)胞計(jì)分析，等等。對(duì)血液的分析也可以對(duì)檢測(cè)血中該轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的存在、以及評(píng)定該轉(zhuǎn)基因在各種類型血細(xì)胞及其它血液組分水平的影響有用處。在一個(gè)實(shí)施方式中，人CD20或CD16或者兩者的表達(dá)可以利用抗人CD20或CD16或兩者的可檢測(cè)的標(biāo)記抗體、并且利用FACS分析標(biāo)記的細(xì)胞，在來(lái)自脾、骨髓、外周血、淋巴結(jié)、與派伊爾斑的免疫細(xì)胞上檢測(cè)。
對(duì)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)模式的檢驗(yàn)揭示出對(duì)在人B系譜細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的正常人CD20表達(dá)的反映。在細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與表型特征方面加以考察的其它免疫學(xué)參數(shù)，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞與嗜中性白細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)與表型特征，揭示在轉(zhuǎn)基因陰性與陽(yáng)性同窩出生仔畜之間的相似性。對(duì)CD20Tg+/CD16Tg+中表達(dá)模式的考察顯示人CD20與CD16標(biāo)志物兩者的表達(dá)。
E.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物代表人中CD16和/或CD20表達(dá)與作用的模型。相應(yīng)地，這些動(dòng)物在研究其起作用與相關(guān)的事件后面的機(jī)制、并且生成及測(cè)試對(duì)治療與診斷CD20有關(guān)的人類疾病包括癌癥與自身免疫病癥有用的產(chǎn)物(例如，抗體、雙特異性、多特異性等等)中有用。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因表達(dá)的人CD20和/或CD16保有在人細(xì)胞中顯示出的類似功能特性。例如，表達(dá)人CD20的B淋巴細(xì)胞被抗-人CD20抗體識(shí)別，并且如同在人中一樣，響應(yīng)人CD20抗體給藥而類似地從該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中消減。如在實(shí)施例中更進(jìn)一步詳細(xì)描述的，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠中的B淋巴細(xì)胞響應(yīng)抗-人CD20抗體例如Rituxan處理而被消減。在一個(gè)實(shí)施方式中，人CD20轉(zhuǎn)基因鼠特征為人CD20在細(xì)胞上的表達(dá)水平足以使與表達(dá)細(xì)胞結(jié)合的抗人CD20抗體影響細(xì)胞的殺傷，引起至少大約75％、和更優(yōu)選80％、85％、90％、95％、99％并且甚至100％外周的和/或循環(huán)B細(xì)胞的B細(xì)胞消減。另外，人CD20在與人CD20相同種類的B細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)。表達(dá)人CD16的細(xì)胞也被抗-人CD16抗體識(shí)別。
轉(zhuǎn)基因CD16動(dòng)物優(yōu)選能介導(dǎo)至少一種Fc-受體介導(dǎo)的效應(yīng)子細(xì)胞功能或者反應(yīng)。術(shù)語(yǔ)″Fc-受體介導(dǎo)的效應(yīng)子細(xì)胞功能″意圖包括任何效應(yīng)子功能，其是由免疫球蛋白(例如IgG)結(jié)合至效應(yīng)細(xì)胞上的Fc受體而觸發(fā)的。例如，免疫球蛋白例如IgG與攜帶轉(zhuǎn)基因表達(dá)的人CD16的細(xì)胞結(jié)合可以誘導(dǎo)各種各樣的效應(yīng)子功能，例如抗體依賴的細(xì)胞細(xì)胞毒性(ADCC)，NK細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)與溶菌酶生產(chǎn)。
相應(yīng)地，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物被用于測(cè)試藥劑例如抗體、多或者雙特異性分子、免疫粘附素(例如對(duì)于人體的安全性與效力)與靶表位，例如人CD20、人CD16或者兩者的區(qū)域的結(jié)合。其它藥劑可以包括有或者沒(méi)有Fc區(qū)域的抗體的抗原結(jié)合片段、單鏈抗體、微抗體(僅有重鏈的抗體)、異源多聚體(heteromultimeric)免疫粘附素，其具有多聚(multimer)抗-人CD20和/或抗-人CD16抗原結(jié)合區(qū)域之一。其它的藥劑可以包括抑制或者導(dǎo)致CD20-B細(xì)胞消減的小分子，可以包括與CD20結(jié)合、但是不激活CD20的CD20配體的變體。例如，像這樣的藥劑消減CD20表達(dá)細(xì)胞例如惡性的B細(xì)胞的效力可以經(jīng)過(guò)測(cè)量測(cè)試藥劑給藥前后轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中B淋巴細(xì)胞水平來(lái)測(cè)定。
相應(yīng)地，本發(fā)明通過(guò)給予表達(dá)人CD20的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物一種藥劑與確定B淋巴細(xì)胞數(shù)目是否有減少，提供鑒定能治療B細(xì)胞淋巴瘤的藥劑，以及能消減或者殺死表達(dá)人CD20的B淋巴細(xì)胞的藥劑的方法。如同在這里使用的，″B細(xì)胞消減″指在藥物或者抗體處理之后同像這樣的處理以前的水平比較起來(lái)在動(dòng)物或者人中B細(xì)胞水平的減少。使用如同在這里描述的已知方法可度量B細(xì)胞水平。B細(xì)胞消減可以是部分或者完全的。優(yōu)選，該藥劑誘導(dǎo)的B細(xì)胞消減的水平與疾病或紊亂癥狀的減輕或者改善相關(guān)。該推定藥劑的效力(即它消減表達(dá)CD20B淋巴細(xì)胞的能力)可以通過(guò)測(cè)量表達(dá)CD20的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中循環(huán)B淋巴細(xì)胞基線水平、并與同一動(dòng)物中給藥之后水平相比較而評(píng)估。B細(xì)胞消減效力的比較可以針對(duì)已知治療劑例如抗-人CD20抗體(例如Rituxan)進(jìn)行，以測(cè)量該推定的藥劑對(duì)于CD20相關(guān)癥狀治療的效力?；蛘?，B淋巴細(xì)胞的基線水平可以在表達(dá)人CD20的第一轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的各種組織(例如脾、骨髓、外周血、淋巴結(jié)、派伊爾斑)中測(cè)量?？呻S后給予表達(dá)人CD20的第二轉(zhuǎn)基因動(dòng)物該推定的藥劑。動(dòng)物然后被殺死，并且分析B淋巴細(xì)胞的水平。在表達(dá)人CD20的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中B淋巴細(xì)胞數(shù)目減少指示該藥劑在減低與B細(xì)胞淋巴瘤有聯(lián)系的癌細(xì)胞和/或在人受試者中治療B細(xì)胞淋巴瘤的效力。也可以測(cè)試聯(lián)合治療來(lái)判定消減該所需細(xì)胞類型的效力。例如，抗-人CD20抗體可以與另一個(gè)藥劑例如Br3-Fc結(jié)合以引起任何可能是對(duì)抗-人CD20殺傷有抗力的攜帶CD20的B細(xì)胞消減。
B淋巴細(xì)胞恢復(fù)還可以通過(guò)隨著時(shí)間測(cè)量在一系列轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中細(xì)胞水平來(lái)評(píng)估。該藥劑對(duì)人CD20的特異性可以通過(guò)比較該藥劑對(duì)表達(dá)人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠的影響與對(duì)野生型小鼠(不表達(dá)CD20標(biāo)志物)的影響而評(píng)估。該藥劑的效力還可以與安慰劑或者對(duì)照物質(zhì)例如非特異性抗體或者其它對(duì)照劑的效應(yīng)比較。優(yōu)選，該藥劑導(dǎo)向大多數(shù)或者所有攜帶人CD20的細(xì)胞但是不影響提供針對(duì)刺激T非依賴性免疫反應(yīng)的抗原的免疫反應(yīng)性的細(xì)胞。
另外，這些動(dòng)物對(duì)于評(píng)估在人中可能的免疫反應(yīng)是有用的模型，因?yàn)樵谵D(zhuǎn)基因動(dòng)物中給藥像這樣的藥劑后免疫反應(yīng)的起始指示該藥劑將在人中產(chǎn)生相同的效應(yīng)。在像這樣的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中對(duì)免疫反應(yīng)的影響可以例如通過(guò)細(xì)胞因子水平的改變、抗體的生產(chǎn)或者T細(xì)胞反應(yīng)來(lái)檢測(cè)。另外，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以在多或者雙特異性分子給藥之前被改造以包含靶細(xì)胞(例如腫瘤、病毒)。
本發(fā)明因此提供鑒定能誘發(fā)效應(yīng)細(xì)胞反應(yīng)例如ADCC或者NK細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的藥劑。特別地，本發(fā)明提供鑒定能誘發(fā)Fc-介導(dǎo)的效應(yīng)子細(xì)胞反應(yīng)、特別是FcγIII-介導(dǎo)的效應(yīng)子細(xì)胞反應(yīng)的方法。推定的藥劑誘導(dǎo)像這樣的反應(yīng)的能力可以通過(guò)，例如，分析細(xì)胞因子水平而評(píng)估。例如，推定藥劑的效力可以通過(guò)測(cè)量一種或更多在表達(dá)人CD16的第一轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中與FcγIII-介導(dǎo)的效應(yīng)子細(xì)胞反應(yīng)有聯(lián)系的一種或更多細(xì)胞因子基線水平、并且與該動(dòng)物給藥之后的水平相比較而評(píng)估?；蛘撸容^可在已經(jīng)給予該藥劑的表達(dá)人CD16的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與或者沒(méi)有給予藥劑或者已經(jīng)給予安慰劑或者對(duì)照物質(zhì)的第二轉(zhuǎn)基因動(dòng)物之間進(jìn)行。該藥劑的特異性可以通過(guò)比較該藥劑對(duì)表達(dá)人CD16的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與對(duì)具有被破壞的內(nèi)源CD16基因(例如CD16敲除)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和/或野生型動(dòng)物(即具有功能性的內(nèi)源CD16)的影響而評(píng)估。在表達(dá)人CD16的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中與人FcγIII介導(dǎo)的效應(yīng)子細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子水平增加指示該藥劑在人受試者中誘發(fā)像這樣的反應(yīng)的效力。
本發(fā)明的一個(gè)方面包含將推定藥劑至給予人CD20和人CD20/CD16轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的每一個(gè)，并且比較該藥劑的效力，例如，殺死或者消減人CD20B細(xì)胞。一個(gè)實(shí)施方式是鑒定能誘發(fā)抗表達(dá)人CD20的B淋巴細(xì)胞的Fc介導(dǎo)的效應(yīng)子細(xì)胞反應(yīng)的藥劑，包含將該藥劑給予該CD20轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；測(cè)量在該CD20轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)人CD20的B淋巴細(xì)胞水平；確定B淋巴細(xì)胞水平降低的百分率；將該藥劑給予該CD20+/CD16+轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；測(cè)量在該CD20+/CD16+轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)人CD20的B淋巴細(xì)胞水平；并確定在該CD20+/CD16+動(dòng)物中B淋巴細(xì)胞水平的降低百分率；其中如果在該CD20+/CD16+動(dòng)物中測(cè)定的B淋巴細(xì)胞降低百分率大于在該CD20動(dòng)物中測(cè)定的降低百分率，該藥劑被認(rèn)為能誘發(fā)Fc介導(dǎo)的抗表達(dá)人CD20的B淋巴細(xì)胞的效應(yīng)子細(xì)胞反應(yīng)。
為了在抗-CD16和/或抗-CD20抗體或者雙或多特異性分子給藥至轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后檢測(cè)抗體結(jié)合，可使用任何合適的分析法。例如，可以取動(dòng)物血樣品并且利用本領(lǐng)域已知的篩選試驗(yàn)，例如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)、或者蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)，分析抗CD抗體-CD復(fù)合物的存在。這些分析中的每一個(gè)通常通過(guò)使用特異于目的復(fù)合物的標(biāo)記試劑(例如抗體)檢測(cè)特定目的的蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物的存在。相應(yīng)地，在本發(fā)明中，這些試驗(yàn)被用于檢測(cè)包含在動(dòng)物血清中的免疫球蛋白(例如IgG，IgA等等)與在該動(dòng)物的特定細(xì)胞表面上包含的人CD標(biāo)志物之間形成的CD-抗體復(fù)合物。
利用例如識(shí)別并特定地與抗體-CD標(biāo)志物復(fù)合物結(jié)合的酶聯(lián)抗體或者抗體片段可以檢測(cè)該CD標(biāo)志物-抗體復(fù)合物?；蛘撸梢岳酶鞣N各樣的其它的免疫測(cè)定中任何一種檢測(cè)該復(fù)合物。例如，抗體可以是放射性標(biāo)記的，并且被用于放射免疫測(cè)定(RIA)。放射性同位素可以通過(guò)像利用γ粒子計(jì)數(shù)管或者閃爍計(jì)數(shù)器或者通過(guò)放射自顯影術(shù)的方式檢測(cè)。
為了在抗體、或者雙或者多特異性分子或者其它藥劑給藥到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后檢測(cè)免疫反應(yīng)，可以使用測(cè)量動(dòng)物血漿或者血清中例如細(xì)胞因子、抗體或者T細(xì)胞群體濃度方面改變的任何合適的程序。例如，體內(nèi)細(xì)胞因子濃度改變可以通過(guò)各種各樣的免疫測(cè)定檢測(cè)，例如酶免疫測(cè)定(EIA)、放射免疫測(cè)定(RIA)或者ELISPOT測(cè)定?？梢员环治龅氖痉缎缘募?xì)胞因子包括粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、白細(xì)胞介素1-12(IL-1至IL-12)。
例如，血漿可以從已經(jīng)進(jìn)行抗體、雙特異性或者多特異性分子或者其它藥劑給藥的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物獲得?？梢岳肊IA，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞因子與同酶偶聯(lián)的抗體的交互作用測(cè)量細(xì)胞因子的濃度。用合適的底物—優(yōu)選顯色底物—進(jìn)行反應(yīng)，借助于產(chǎn)生可以被檢測(cè)的化學(xué)部分的方法，例如，通過(guò)分光光度法、熒光的或者經(jīng)過(guò)視覺(jué)的方法，來(lái)檢測(cè)酶活性(Voller，“The EnzymeLinked Immunosorbent Assay(ELISA)”，Diagnostic Horizons 21-7，1978，Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersville，MD；Voller，etal.，J.Clin.Pathol.31507-520(1978)；Butler，Meth.Enzymol.73482-523(1981)；Maggio，(ed.)Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L，1980；Ishikawa，et al.，(eds.)Enzyme Immunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo，1981)。可用于檢測(cè)性地標(biāo)記該抗體的酶包括，但是不局限于，蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、Δ-5-甾體異構(gòu)酶、酵母乙醇脫氫酶、α-甘油磷酸鹽脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、辣根過(guò)氧化酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、過(guò)氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶與乙酰膽堿酯酶。檢測(cè)可以通過(guò)使用對(duì)該酶的顯色底物的比色法進(jìn)行。檢測(cè)也可以通過(guò)視覺(jué)上將底物的酶促反應(yīng)程度同類似制備的標(biāo)準(zhǔn)比較或者利用RIA進(jìn)行。
也可能用熒光化合物標(biāo)記抗-細(xì)胞因子抗體或者抗CD20藥劑。當(dāng)熒光標(biāo)記的抗體暴露于適當(dāng)波長(zhǎng)的光時(shí)，可隨后檢測(cè)它的存在。最通常使用的熒光標(biāo)記化合物是異硫氰酸熒光素、若丹明、藻紅蛋白、藻青蛋白、別藻藍(lán)蛋白，o-苯二甲醛與熒光胺?？贵w還可以利用發(fā)熒光金屬例如152銪或者其它的鑭系進(jìn)行可檢測(cè)地標(biāo)記。這些金屬可以利用金屬螯合基團(tuán)例如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或者乙二胺四乙酸(EDTA)來(lái)附著于抗體?？贵w也可以通過(guò)將其偶聯(lián)至化學(xué)發(fā)光的化合物而可檢測(cè)地標(biāo)記。然后經(jīng)過(guò)檢測(cè)在化學(xué)反應(yīng)期間產(chǎn)生的熒光確定化學(xué)發(fā)光示蹤的抗體的存在。特別有用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的例子是發(fā)光氨、異氨基苯二酰肼、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶鹽與乙二酸酯。同樣地，生物發(fā)光的化合物可能用來(lái)標(biāo)記抗體。生物發(fā)光是一類在生物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的化學(xué)螢光，其中催化蛋白質(zhì)提高化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率。生物發(fā)光的蛋白質(zhì)的存在經(jīng)過(guò)檢測(cè)熒光的存在而測(cè)定。用于標(biāo)記用途的重要生物發(fā)光化合物是熒光素、熒光素酶與水母蛋白。
本發(fā)明的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以更進(jìn)一步提供向人給藥的特定藥劑的安全性指示。例如，可以將人源化抗體或者其它藥劑給予該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，并且作為該人源化抗體或者藥劑人體內(nèi)利用的安全性與耐受性指示，監(jiān)視作為將該藥劑投藥給該動(dòng)物的結(jié)果的任何毒性或者副作用。可以在短期基礎(chǔ)上出現(xiàn)的不利情況包括頭痛、感染、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、疼痛、惡心、無(wú)力、咽炎、腹瀉、鼻炎、灌輸反應(yīng)、與肌痛。短期不利情況是處理后數(shù)天內(nèi)測(cè)量的。長(zhǎng)期的副作用包括某些細(xì)胞類型的細(xì)胞毒、血小板減少導(dǎo)致的出血、由于炎性和/或變態(tài)反應(yīng)導(dǎo)致的介體釋放、免疫系統(tǒng)和/或抗治療劑抗體發(fā)育的抑制、終端器官毒性、和感染或者惡性腫瘤發(fā)生率增加。長(zhǎng)期的不利情況是處理后數(shù)月內(nèi)測(cè)量的。
本發(fā)明的另一方面涉及測(cè)定抗CD20藥劑的效力的方法。通過(guò)向一系列具有人CD20和/或人CD16α鏈的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物給予一劑量范圍的該藥劑、確定導(dǎo)致攜帶人CD20細(xì)胞減少的至少一個(gè)劑量而確定效力。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，包括細(xì)胞、組織、或者從其中衍生的其它材料，可以作為疾病模型，特別是與攜帶CD20細(xì)胞有關(guān)的或者其介導(dǎo)的疾病模型被使用。任何物種的動(dòng)物，包括然而不限于，小鼠、大鼠、兔、豚鼠、豬、微型豬(micro-pig)、山羊，和非人靈長(zhǎng)目、例如狒狒，猴子和黑猩猩可被用來(lái)產(chǎn)生疾病動(dòng)物模型。這些系統(tǒng)可被用于各種各樣的應(yīng)用。像這樣的試驗(yàn)可以作為被設(shè)計(jì)來(lái)鑒別藥劑的篩選策略的一部分，所述藥劑例如能緩解疾病癥狀的化合物。因此，以動(dòng)物和細(xì)胞為基礎(chǔ)的模型可以用來(lái)鑒別可能在治療疾病中有效的藥物、藥品、治療和介入法。
以細(xì)胞為基礎(chǔ)的系統(tǒng)可被用來(lái)鑒別可以對(duì)緩解疾病癥狀起作用的化合物。例如，像這樣的細(xì)胞系統(tǒng)可能以足夠的濃度并且以在該顯露的細(xì)胞中足夠?qū)е逻@樣的疾病癥狀的緩解的時(shí)間內(nèi)暴露于認(rèn)為顯示出具有緩解疾病癥狀能力的化合物。暴露后，檢查細(xì)胞以判定疾病細(xì)胞表現(xiàn)型中一個(gè)或多個(gè)是否已經(jīng)改變，以類似于更正常的或更野生型的、非疾病表現(xiàn)型。
其它用途對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
以下非限制性實(shí)施例舉例說(shuō)明本發(fā)明。在這里所引用的所有文件因此明白地引入作為參考。
實(shí)施例實(shí)施例1
本實(shí)施例描述人CD20BAC轉(zhuǎn)基因(Tg+)小鼠的產(chǎn)生，并且研究了抗-人CD20抗體處理在hCD20+小鼠中的效果。
利用來(lái)自Invitrogen(Invitrogen，Carlsbad，CA)的人CD20CITB人BAC-D-克隆No.117H19生產(chǎn)人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠。編碼人CD20的DNA從人淋巴細(xì)胞中分離，并且送至Invitrogen。Invitrogen用帶有來(lái)自人BAC文庫(kù)的克隆的濾紙測(cè)試DNA，并且鑒定克隆117H19。先前產(chǎn)生表達(dá)人CD20的轉(zhuǎn)基因小鼠的嘗試不成功，也許部分由于無(wú)法將足夠的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域摻入轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物。通過(guò)用克隆117H19制備的人CD20BAC構(gòu)建物顯微注射入小鼠FVB近交系的受精卵而生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠。受精卵孵化1-7天，然后移植入代理小鼠(surrogate mouse)。基于人CD20表達(dá)的FACS分析篩選小鼠。如同可以從在圖1的FACS圖中看到的，對(duì)于轉(zhuǎn)基因雜合的(Tg+/-)和純合的(Tg+/+)小鼠在他們的B220+B細(xì)胞上表達(dá)人CD20。未有意地破壞鼠CD20基因。
圖2提供在B細(xì)胞分化與成熟期間各種細(xì)胞表面標(biāo)志物(CD43，IgM，IgD)表達(dá)的示意圖。在Tg+小鼠中，hCD20在前-B、未成熟B細(xì)胞與成熟B細(xì)胞上表達(dá)。人CD20在與人相同的細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)，并且以與人B細(xì)胞相比較稍微低的水平在這些細(xì)胞類型上表達(dá)。
利用偶聯(lián)至FITC的抗-人CD20抗體(BD Pharmingen)篩選Tg+小鼠骨髓、脾、腸系膜淋巴法與派伊爾斑B細(xì)胞上人CD20的表達(dá)(結(jié)果示于圖3-6)。以B220和CD43、CD21、或者CD38對(duì)細(xì)胞門化使得對(duì)來(lái)自各種組織的各種B細(xì)胞群體進(jìn)行劃分。為了進(jìn)行門化，細(xì)胞用偶聯(lián)至PerCP的抗-B220抗體(BD Biosciences)染色，并且用偶聯(lián)至PE的抗CD43抗體，抗-CD21抗體或者抗-CD38抗體(fluorescence，Becton Dickinson)染色。
利用FACS分析并計(jì)算平均熒光強(qiáng)度，將在轉(zhuǎn)基因小鼠外周血細(xì)胞上人CD20的表達(dá)水平與在人外周血細(xì)胞上人CD20表達(dá)水平相比較。外周血細(xì)胞獲自人供體和來(lái)自hCD20Tg+小鼠，并且用標(biāo)記的抗-人CD20抗體(mH27)染色。細(xì)胞用FACS分析，在人CD19+與B220+群體上門化。圖28顯示與人外周血細(xì)胞上CD20表達(dá)比較，在來(lái)自人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠的外周血細(xì)胞上人CD20表達(dá)水平的代表性比較。在圖上的數(shù)字表示平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明人CD20在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞上以在人細(xì)胞上人CD20的大約40％的水平表達(dá)。
這些結(jié)果表明獲自轉(zhuǎn)基因小鼠中許多不同組織的B細(xì)胞表達(dá)人CD20標(biāo)志物。人CD20標(biāo)志物主要地在成熟B細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)，但也可以以類似于在人中觀察到的模式在前-B與未成熟B細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。
該轉(zhuǎn)基因小鼠然后用抗-人CD20單克隆抗體m2H7處理，以判定該抗體處理是否將導(dǎo)致B細(xì)胞消減?？贵wm2H7可以獲得自BD PharMingen(SanDiego，CA)，eBioscience，或者Calbiochem。將m2H7的抗-人CD20活性與體外試驗(yàn)中的Rituxan活性相比較，并且具有可比擬的活性。人源化的抗體，例如Rituxan，也可用于細(xì)胞殺傷研究中，因?yàn)轶w內(nèi)細(xì)胞殺死發(fā)生在足夠短的時(shí)間，不用考慮對(duì)該人源化抗體的免疫反應(yīng)。
如同在圖7中示意性概括的，以總計(jì)1毫克劑量給予該轉(zhuǎn)基因小鼠抗體m2H7，相當(dāng)于對(duì)于70公斤人而言3.5毫克。在箭頭指示的日子對(duì)外周血、脾、淋巴結(jié)、骨髓、和派伊爾斑進(jìn)行FACS分析。監(jiān)視抗-CD20單克隆抗體的血清水平。
單獨(dú)用抗-CD20單克隆抗體(m2H7)處理Tg+小鼠導(dǎo)致外周血、成熟外周淋巴結(jié)B細(xì)胞、脾T2與濾泡B細(xì)胞中B細(xì)胞的消減(參見(jiàn)圖8-11)。然而，盡管在細(xì)胞表面上有非常高，很可能是飽和水平的抗體，也觀察到某些B細(xì)胞亞群對(duì)抗抗-CD20抗體殺傷。這些抗性B細(xì)胞是脾邊緣區(qū)B細(xì)胞(圖10)，和派伊爾斑(圖12)與脾(圖14)兩者中的生發(fā)中心B細(xì)胞。在圖14中，小鼠用第一劑量的抗-CD20單克隆抗體以100tg在第1天注射，繼之以在第3天上以第二劑量100μg注射(可能50μg單一劑量就足夠飽和B細(xì)胞)。T2/濾泡B細(xì)胞被消減，但是派伊爾斑生發(fā)中心B細(xì)胞顯示與抗-CD20單克隆抗體結(jié)合，但是對(duì)殺傷具抗性。
研究了抗-人CD20抗體處理后B細(xì)胞的恢復(fù)。在第1天給予小鼠抗體。圖13表明抗體處理后第6天，外周血中檢測(cè)不到B細(xì)胞。在第6周，剛一清除抗體，hCD20+細(xì)胞就開(kāi)始被檢測(cè)，并且到第14周，B細(xì)胞似乎回升至正常水平?；謴?fù)由前體B細(xì)胞引起，該細(xì)胞不表達(dá)CD20而且然后隨后發(fā)育成為具有人CD20+的成熟B細(xì)胞。
圖14顯示FACS圖，指示脾生發(fā)中心B細(xì)胞對(duì)短期(單一注射)抗-CD20單克隆抗體治療的抵抗。在第1天通過(guò)腹膜內(nèi)注射，用綿羊紅細(xì)胞(SRBC)非免疫或者免疫小鼠以在脾中誘導(dǎo)生發(fā)中心。生發(fā)中心在第7天出現(xiàn)。在第8天，一組小鼠用m2H7處理。對(duì)照組的小鼠用mIgG2a同種型對(duì)照抗體處理。在第12天對(duì)小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行分析。使用對(duì)生發(fā)中心染色的PNA(花生凝集素)。在未用SRBC免疫的小鼠脾中沒(méi)有見(jiàn)到可檢測(cè)的生發(fā)中心細(xì)胞，而免疫小鼠脾顯示0.3％的PNA染色細(xì)胞。盡管T2/濾泡B細(xì)胞被用抗-CD20抗體處理消減，脾邊緣中心B細(xì)胞對(duì)抗體是有抗力的。
然后，測(cè)定是否B細(xì)胞剛一消減，小鼠就能發(fā)展出不依賴于T的免疫反應(yīng)。在第0天，小鼠用m2H7或同種型對(duì)照抗體mIgG2a處理。在第3-7天，B細(xì)胞消減已經(jīng)發(fā)生。在第7天，小鼠用肺炎鏈球菌IV靜脈注射以誘導(dǎo)對(duì)多糖的反應(yīng)。在第11天建立起T細(xì)胞不依賴的反應(yīng)。圖15中顯示的結(jié)果表明，用抗-人CD20處理不影響來(lái)自邊緣區(qū)與B1細(xì)胞的B細(xì)胞反應(yīng)，即非消減的邊緣區(qū)與B 1B細(xì)胞賦予對(duì)T-非依賴的抗原的保護(hù)。這個(gè)數(shù)據(jù)顯示，盡管用抗-CD20單克隆抗體處理，體液免疫的一些方面，特別地是T-非依賴的B細(xì)胞反應(yīng)(在這種情況下)仍是保留的。
總之，人CD20轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在血液、骨髓、脾、淋巴結(jié)和派伊爾斑的成熟、前-B與未成熟B細(xì)胞上表達(dá)人CD20。人CD20在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞上以相當(dāng)于人細(xì)胞上表達(dá)的CD20的40％的水平表達(dá)。用抗人CD20抗體處理小鼠，除了脾邊緣區(qū)B細(xì)胞(圖10)與派伊爾斑(圖12)和脾(圖14)兩者的生發(fā)中心B細(xì)胞之外，在處理3-4天之內(nèi)導(dǎo)致B細(xì)胞的顯著消減。不一定受任何學(xué)說(shuō)束縛，B細(xì)胞死亡似乎是由ADCC、依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)或者細(xì)胞程序死亡或者該三者的組合所介導(dǎo)。在用抗-人CD20處理過(guò)的小鼠中觀察到對(duì)T非依賴性抗原的反應(yīng)，其與脾邊緣區(qū)B細(xì)胞對(duì)抗-人CD20抗體導(dǎo)致的消減的對(duì)抗相一致。對(duì)抗-人CD20抗體的殺傷作用有抗力的B細(xì)胞引起T-非依賴性免疫反應(yīng)的保留，和/或提供如果想要的話可能需要聯(lián)合治療以消減所有的B細(xì)胞的指示。在用抗-人CD20抗體處理后14周觀察到表達(dá)人CD20的B細(xì)胞的恢復(fù)，很可能是由于前體B細(xì)胞的成熟。這些結(jié)果類似于在用Rituxan處理過(guò)的人中觀察到的。
實(shí)施例2這個(gè)實(shí)施例顯示在抗-CD20單克隆抗體與BR3拮抗劑治療對(duì)于B細(xì)胞調(diào)制/消減之間的協(xié)同作用。BR3-Fc是免疫粘附素，其中人BR3的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白序列(在這種情況下是人IgG1)的恒定結(jié)構(gòu)域融合。
表達(dá)人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠(命名為hCD20+小鼠)用抗CD20單克隆抗體(在第9天單個(gè)注射100微克)、BR3-Fc(從第1天至第12天，100微克每隔一天)，或者抗-CD20單克隆抗體與BR3-Fc的聯(lián)合進(jìn)行腹膜內(nèi)注射來(lái)處理。每組由4只小鼠組成。最后一次注射后兩天，殺死小鼠，并且分析hCD20+B細(xì)胞。針對(duì)B細(xì)胞標(biāo)志物(CD21+CD23+)對(duì)脾、血、淋巴結(jié)和派伊爾斑進(jìn)行FACS分析。
結(jié)果表示抗-CD20單克隆抗體治療消減多于99％的血液與淋巴結(jié)成熟循環(huán)B細(xì)胞，并且BR3-Fc處理在血與淋巴結(jié)中降低成熟循環(huán)B細(xì)胞(圖16)?？?CD20單克隆抗體治療消減T2與濾泡B細(xì)胞，但不消減脾邊緣區(qū)B細(xì)胞，而B(niǎo)R3-Fc處理降低脾T2/濾泡與邊緣區(qū)B細(xì)胞。
抗-CD20單克隆抗體與BR3-Fc的聯(lián)合協(xié)同消減脾中所有的B細(xì)胞群體?？?CD20單克隆抗體消減不發(fā)生于大部分邊緣區(qū)與一些濾泡/T2脾B細(xì)胞，而B(niǎo)R3-Fc消減主要發(fā)生在邊緣區(qū)與一些濾泡/T2B細(xì)胞(圖16)。因此，這兩試劑的組合完全消減脾的B系譜細(xì)胞。BR3-Fc、2H7以及兩者的組合對(duì)派伊爾斑生發(fā)中心B細(xì)胞都沒(méi)有影響(圖17)。用抗-CD20單克隆抗體處理后漿細(xì)胞沒(méi)有受到顯著影響(圖18)，指示免疫反應(yīng)性的一些方面在用抗-CD20抗體處理過(guò)的小鼠中仍保持著。
這些結(jié)果表明聯(lián)合治療對(duì)消減大多數(shù)B細(xì)胞是有效的。類似于人，轉(zhuǎn)基因小鼠中一些B細(xì)胞對(duì)用抗-CD20抗體的殺傷作用有抗性。聯(lián)合治療導(dǎo)致脾中對(duì)抗-CD20抗體有抗力的B細(xì)胞的消減。這顯示轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)鑒定藥物組合(combinations of agents)上也有用處，該藥物組合在具有抗-CD20抗性細(xì)胞或者極具侵襲性的腫瘤的情況下可能更有效。
實(shí)施例3在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，證實(shí)自然殺傷細(xì)胞在抗-CD20單克隆抗體介導(dǎo)的B細(xì)胞消減中起作用。
產(chǎn)生PK-136單克隆抗體(特異針對(duì)小鼠NK1.1)的雜交瘤克隆從ATCC獲得。分別用對(duì)照單克隆抗體、PK-136、抗-CD20單克隆抗體與PK-136/抗-CD20的聯(lián)合腹膜內(nèi)注射給四組人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠。腹膜內(nèi)注射的劑量如下對(duì)照單克隆抗體200μg/ip，3ip/周，共1周PK-136200μg/ip，3ip/周，共1周抗-CD20單克隆抗體10μg/ip，單一劑量在抗-CD20單克隆抗體腹膜內(nèi)注射之后3天分析來(lái)自外周血、淋巴結(jié)與脾的淋巴細(xì)胞。數(shù)據(jù)用平均數(shù)+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)表示，n＝8。
該結(jié)果指示在已檢查過(guò)的組織之中(肝臟，脾與血液)用PK-136處理導(dǎo)致NK細(xì)胞群體大約80％至90％的減少(圖19)。在大多數(shù)NK細(xì)胞缺乏時(shí)，2H7介導(dǎo)的B細(xì)胞消減有效性降低(圖20)。因此，NK細(xì)胞在抗-CD20單克隆抗體介導(dǎo)的B細(xì)胞消減中起作用。
實(shí)施例4生產(chǎn)表達(dá)人CD20/CD16的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，并且評(píng)價(jià)人標(biāo)志物的表達(dá)。
如實(shí)施例1中的描述從人CD20BAC DNA(Invitrogen，Carlsbad，CA)生產(chǎn)人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠?；谌薈D20表達(dá)的FACS分析篩選小鼠。具有對(duì)于人CD16α鏈亞型A的人轉(zhuǎn)基因與缺乏鼠CD16α鏈的裸鼠獲得自Ravetch博士(洛克菲勒大學(xué))。這些小鼠然后先后與C57B16、FVB、129小鼠交配，以獲得在129/裸鼠/FVB/B6背景下對(duì)于編碼CD16α鏈的人轉(zhuǎn)基因來(lái)說(shuō)陽(yáng)性、并且缺乏鼠CD16α鏈的小鼠。具有人CD20的FVB小鼠然后與具有人CD16α鏈并缺乏小鼠CD16α鏈的129/裸鼠/FVB/B6小鼠雜交。
人標(biāo)志物在huCD20Tg+huCD16Tg+mCD16-/-小鼠中的表達(dá)通過(guò)分離來(lái)自外周血細(xì)胞的白細(xì)胞并且對(duì)其染色來(lái)評(píng)價(jià)，染色使用標(biāo)記的抗-人CD20抗體(m2H7)、抗-B220抗體(獲得自BD PharMingen)、與抗-人CD16抗體(獲得自BD PharMingen)。利用FACS進(jìn)行染色的細(xì)胞群體的分析。將huCD20Tg+huCD 16Tg+mCD 16與CD20Tg-/CD16Tg-(對(duì)照小鼠)、CD20Tg+/CD16Tg-、CD20Tg-/CD16Tg+小鼠比較。結(jié)果示于圖21。
結(jié)果顯示CD20Tg+/CD16Tg-小鼠具有表達(dá)人CD20的細(xì)胞，而且基于他們與抗-B220抗體的反應(yīng)性確定這些細(xì)胞是B細(xì)胞?；谟每?人CD16進(jìn)行的染色，CD20Tg-/CD16Tg+小鼠具有表達(dá)人CD16的細(xì)胞，但是不是B細(xì)胞，因?yàn)檫@些細(xì)胞不與抗-B220抗體反應(yīng)。huCD20Tg+huCD16Tg+mCD16-/-兼?zhèn)淇磥?lái)是不同細(xì)胞群體的CD20與CD16陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)果顯示CD20Tg+/CD16Tg+小鼠被成功地生產(chǎn)。這些結(jié)果也與如下觀點(diǎn)一致，即人CD20在B細(xì)胞上存在，并且人CD16主要在自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞與粒細(xì)胞上表達(dá)。
分析表達(dá)人CD16轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞，以判定哪個(gè)細(xì)胞類型表達(dá)該轉(zhuǎn)基因。外周血細(xì)胞獲自huCD20+huCD16+mCD16-/-轉(zhuǎn)基因小鼠，并且用PE標(biāo)記的抗人CD16抗體(BD Pharmingen)染色，并且用偶聯(lián)至APC的抗F4/80抗體門化以檢測(cè)巨噬細(xì)胞，或用抗-DX5+抗體以檢測(cè)自然殺傷細(xì)胞。結(jié)果表明表達(dá)huCD16+轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞是自然殺傷細(xì)胞與巨噬細(xì)胞。
分析來(lái)自缺乏鼠CD16α鏈小鼠的細(xì)胞，以判定鼠CD16α鏈?zhǔn)欠裨谠摷?xì)胞上存在。來(lái)自缺乏鼠CD16α鏈小鼠和野生型小鼠的外周血細(xì)胞用抗-小鼠CD16抗體染色，并且用FACS分析。結(jié)果示于圖26。結(jié)果表明由于該基因的敲除，在缺乏CD16α鏈小鼠的細(xì)胞上沒(méi)有可檢測(cè)的鼠CD16α鏈。
分析缺乏鼠CD16α鏈小鼠的細(xì)胞，以判定是否表達(dá)其它的Fc受體。分析該細(xì)胞中小鼠FcγRI(CD64)的存在或者缺乏。缺乏鼠CD16α鏈小鼠與野生型小鼠的外周血細(xì)胞用抗-小鼠CD64單克隆抗體(由Genentech制備)染色，并用FACS分析。血細(xì)胞通過(guò)用抗-mac-1染色對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行門化。結(jié)果示于圖27。陰影部分是同種型對(duì)照。結(jié)果表明在由于CD16α鏈基因敲除而缺乏CD16α鏈的小鼠的巨噬細(xì)胞上有FcγRI(CD64)表達(dá)。染色的微弱漂移(shift)可能是由于該抗體的低親合力。這些結(jié)果暗示鼠CD16α鏈-/-敲除小鼠表達(dá)其它的小鼠Fc受體和小鼠γ鏈同二聚體。
權(quán)利要求
1.一種非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因組中包含編碼人CD20的第一核苷酸序列以及編碼異源FcγIII受體的亞單位的第二核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述第一核苷酸序列可操作地與人內(nèi)源啟動(dòng)子連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞表達(dá)人CD20。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中人CD20在B淋巴細(xì)胞的表面上表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述第二核苷酸序列可操作地與人內(nèi)源啟動(dòng)子連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述第二核苷酸序列編碼人CD16α鏈亞型A。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述受體在白細(xì)胞表面上表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述受體在包含自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞或者胸腺細(xì)胞或者其混合物的細(xì)胞表面上表達(dá)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述動(dòng)物的基因組進(jìn)一步在內(nèi)源基因上包含破壞，所述內(nèi)源基因編碼基本上與異源FcγIII受體同源的受體亞單位。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中內(nèi)源基因編碼鼠CD16α鏈。
11.鑒定能治療B細(xì)胞淋巴瘤的藥物的方法，所述方法包含a)測(cè)量權(quán)利要求1或者9的動(dòng)物中表達(dá)人CD20的B淋巴細(xì)胞的水平；b)給藥根據(jù)權(quán)利要求1或者9的動(dòng)物所述藥物；并且c)測(cè)量在該動(dòng)物中表達(dá)人CD20的B淋巴細(xì)胞的水平；其中用該藥物處理后在該動(dòng)物中表達(dá)人CD20的B淋巴細(xì)胞數(shù)目減少，則鑒定該藥物為能治療B細(xì)胞淋巴瘤的藥物。
12.用根據(jù)權(quán)利要求11的方法鑒定的藥物。
13.鑒定能消減或者殺死表達(dá)人CD20的細(xì)胞的藥物的方法，所述方法包含a)測(cè)量權(quán)利要求1或者9的動(dòng)物中表達(dá)人CD20的B淋巴細(xì)胞的水平；b)給藥根據(jù)權(quán)利要求1或者9的動(dòng)物所述藥物；并且c)測(cè)量在該動(dòng)物中表達(dá)人CD20的B淋巴細(xì)胞的水平；其中在該動(dòng)物中表達(dá)人CD20的B淋巴細(xì)胞數(shù)目減少鑒定能消減或者殺死表達(dá)CD20的細(xì)胞的藥物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。
15.用根據(jù)權(quán)利要求14的方法鑒定的藥物。
16.來(lái)源于權(quán)利要求1或者9的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞或者組織。
17.根據(jù)權(quán)利要求1或者9的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述動(dòng)物是嚙齒類動(dòng)物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述嚙齒類動(dòng)物是小鼠。
19.鑒定能誘導(dǎo)Fc-介導(dǎo)的效應(yīng)子細(xì)胞反應(yīng)的藥物的方法，所述方法包含a)測(cè)量權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中與Fc-介導(dǎo)的效應(yīng)子細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)的一個(gè)或更多細(xì)胞因子的基線水平；b)給藥該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物所述藥物；c)測(cè)量該動(dòng)物中細(xì)胞因子的水平；其中給藥之后細(xì)胞因子水平增加鑒定能誘導(dǎo)Fc-介導(dǎo)的效應(yīng)子細(xì)胞反應(yīng)的藥物。
20.鑒定能誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)人CD20的B淋巴細(xì)胞的Fc-介導(dǎo)的效應(yīng)子細(xì)胞反應(yīng)的藥物的方法，所述方法包含a)測(cè)量在第一轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)人CD20的B淋巴細(xì)胞的水平；b)給藥第一轉(zhuǎn)基因動(dòng)物所述藥物；c)測(cè)量第一轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)人CD20的B淋巴細(xì)胞的水平；d)確定在步驟(a)與步驟(c)之間B淋巴細(xì)胞水平的降低百分率；e)測(cè)量權(quán)利要求1的第二轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)人CD20的B淋巴細(xì)胞的水平；f)給藥權(quán)利要求1的第二轉(zhuǎn)基因動(dòng)物所述藥物；g)測(cè)量第二轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)人CD20的B淋巴細(xì)胞的水平；并且h)確定在步驟(e)與步驟(g)之間B淋巴細(xì)胞水平的降低百分率；其中如果在步驟(h)中確定的降低百分率大于在步驟(d)中確定的降低百分率，則該藥物被鑒定為能誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)人CD20的B淋巴細(xì)胞的Fc-介導(dǎo)的效應(yīng)子細(xì)胞反應(yīng)的藥物。
21.測(cè)試抗-人CD20治療的安全性的方法，所述方法包含a)測(cè)量權(quán)利要求1或者9的動(dòng)物中表達(dá)人CD20的B淋巴細(xì)胞的水平；b)給藥根據(jù)權(quán)利要求1或者9的動(dòng)物所述藥物；并且c)測(cè)量該動(dòng)物中表達(dá)人CD20的B淋巴細(xì)胞的水平；其中該動(dòng)物中表達(dá)人CD20的B淋巴細(xì)胞數(shù)目減少鑒定能消減或者殺死表達(dá)CD20的細(xì)胞的藥物；d)監(jiān)視該動(dòng)物短期或者長(zhǎng)期的副作用。
22.測(cè)試抗-人CD20治療效力的方法，所述方法包含a)測(cè)量權(quán)利要求1或者9的一組動(dòng)物中表達(dá)人CD20的B淋巴細(xì)胞的水平；b)給藥該組的每個(gè)動(dòng)物不同劑量的一種藥物；并且c)測(cè)量在每一劑量之后該動(dòng)物中表達(dá)人CD20的B淋巴細(xì)胞的水平；和d)確定導(dǎo)致最多的B細(xì)胞消減的藥物的至少一個(gè)劑量。
全文摘要
本發(fā)明在通常意義上涉及表達(dá)人細(xì)胞標(biāo)志物(包括CD20和/或優(yōu)選CD16)的非－人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
文檔編號(hào)A61KGK1748143SQ200380109690
公開(kāi)日2006年3月15日 申請(qǐng)日期2003年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月16日
發(fā)明者安德魯·C－Y·陳, 龔謙, 弗萊維厄斯·馬丁 申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司