條件型伊維菌素受體ivmr轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種條件型伊維菌素受體(ivermectin?receptor，IVMR)轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，屬于條件型動物模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】。在Cre重組酶的作用下，該小鼠模型的所有細胞(特別是腦神經(jīng)元)中均能條件型的表達伊維菌素受體IVMR，通過施加藥物伊維菌素(ivermectin，IVM)可以下調(diào)表達伊維菌素受體IVMR的神經(jīng)元的興奮性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方法(包括給藥方式，針對使用特定表達Cre的轉(zhuǎn)基因小鼠)對小鼠沒有任何腦部損傷。本發(fā)明使用的藥物伊維菌素IVM對動物的影響具有足夠長的半衰期，適合進行動物行為實驗。另外半衰期也相對穩(wěn)定，可以在藥物失效后再次實驗，方便的對同一個動物的進行前后比較實驗。
【專利說明】條件型伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及條件型轉(zhuǎn)基因動物模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用，尤其是涉及一種條件型伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法及在神經(jīng)元功能研究中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域中的一個關(guān)鍵問題就是特定神經(jīng)元的活性(興奮性)與行為的因果關(guān)系。對這個問題，目前國際上已經(jīng)發(fā)展出了不少新的方法，比如，突觸傳遞的分子操作方法、光遺傳學(xué)方法和配體門控的離子通道方法。特別是已發(fā)展出用配體門控的離子通道用于可誘導(dǎo)和可逆轉(zhuǎn)的調(diào)控神經(jīng)元活性的方法。比如，果蠅Allatostatin受體在被Allatostatin激活的情況下，可以抑制神經(jīng)元的動作電位的產(chǎn)生，這種方法已經(jīng)在哺乳動物腦中開始使用。然而，Allatostatin這個分子不能透過血腦屏障，必須通過侵入性的方法(比如腦部打孔埋管)將其注射到腦中，這在進行大規(guī)模動物行為實驗時就顯得很不方便。最近，一種工程化的GABAa受體已經(jīng)用來沉默特定的腦神經(jīng)元，特點是對藥物唑吡坦(zolpidem)不敏感。但是這個系統(tǒng)也有明顯的缺陷，就是必須在已經(jīng)表達GABAa Y 2亞基的神經(jīng)元中起作用。第三種能夠降低神經(jīng)元發(fā)放動作電位的系統(tǒng)就是伊維菌素IVM門控的氯離子通道(該通道來源于線蟲谷氨酸氯離子通道GluCl α和β亞基)，已有報道顯示這種通道在小鼠腦中可以很好的起作用(Lerchner, ff.et al.2007.Reversiblesilencing of neuronal excitability in behaving mice by a genetically targeted，ivermectin-gated Cl-channel.Neuron 54，35-49.)。但是，該系統(tǒng)的一個大的限制就是需要同時表達α和β 兩個亞基。為了克服這個問題，Lynagh等人將人源的甘氨酸α I受體進行了 F207A和A288G兩個點突變，使該受體不再對甘氨酸敏感，而對伊維菌素IVM敏感(這個突變后的人甘氨酸α I受體被命名為伊維菌素受體IVMR)，這就提供了一種很好的可誘導(dǎo)和可逆轉(zhuǎn)沉默神經(jīng)元的工具(Lynagh, T.&Lynch, J.W.2010.An ImprovedIvermectin-activated Chloride Channel Receptor for Inhibiting ElectricalActivity in Defined Neuronal Populat1ns.J Bi。Chem 285,14890-14897)。但截至目前，國際上只有構(gòu)建表達伊維菌素受體IVMR受體的病毒進行研究的報道，而將其制備為轉(zhuǎn)基因小鼠模型還未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的就是為了針對現(xiàn)有缺乏伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠的不足，而提供一種能夠更好的用于神經(jīng)元的活性對動物行為的影響的研究的條件型(或稱誘導(dǎo)型)伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠模型及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
[0004]將IVMR的序列整體插入到Rosa26基因位點的下游(該基因為一個表達廣泛并且水平很強的基因)，緊接在一個1xP位點包圍的STOP元件后面。接著將這樣的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)進小鼠胚胎干細胞中進行同源重組，正負篩選、多次PCR進行篩選完成同源重組的胚胎干細胞。再將陽性的胚胎干細胞移植進母鼠的囊胚中，選取出生后嵌合水平最高的嵌合小鼠與野生型小鼠進行交配，鑒定為陽性的子代小鼠即為IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠。該小鼠可與Cre重組酶小鼠進行交配或者在腦立體定位注入Cre表達病毒，這樣在特定的Cre重組酶的作用下，IVMR前面的STOP序列被剪切掉，IVMR得以在特定神經(jīng)元中表達出來。在Cre表達的IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔給藥IVM即可激活I(lǐng)VMR，降低神經(jīng)元的活性。
[0005]因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種條件型表達伊維菌素受體IVMR的轉(zhuǎn)基因小鼠的模型。
[0006]本發(fā)明的另一個目的是提供一種構(gòu)建條件型表達伊維菌素受體IVMR的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的方法，該方法包括以下步驟:
[0007](I)將IVMR-2A-GFP的序列插入到Rosa26基因位點的下游，緊接在一個1xP位點包圍的STOP元件后面，構(gòu)建Rosa26-1VMR打靶載體；
[0008](2)將Rosa26-1VMR打靶載體電轉(zhuǎn)進小鼠胚胎干細胞中進行同源重組，經(jīng)過正負篩選和PCR篩選完成同源重組的胚胎干細胞；
[0009](3)將陽性的胚胎干細胞移植進母鼠的囊胚中，選取出生的嵌合小鼠與野生型小鼠進行交配，鑒定為陽性的子代小鼠即為IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠；
[0010](4)將表達Cre重組酶的病毒經(jīng)立體定位注射進IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠的腦中，或者將特定神經(jīng)元表達Cre重組酶的小鼠與IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠進行交配，得到的雙陽性的子代小鼠，成功構(gòu)建條件型IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠；
[0011](5)對注射病毒或者特定神經(jīng)元表達Cre重組酶的IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠給藥伊維菌素IVM,降低特定神經(jīng)元的活性。
[0012]上述步驟(2)需要用到基因特異性引物鑒定篩選陽性的小鼠胚胎干細胞，步驟
(3)和(4)需要用到基因特異性引物鑒定陽性的IVMR和Cre轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0013]本發(fā)明的再一個目的是提供該小鼠模型在研究特定神經(jīng)元的活性與動物行為之間關(guān)系的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明提供的條件型表達伊維菌素受體IVMR的轉(zhuǎn)基因小鼠的模型與以往技術(shù)相比的有益效果如下:
[0015]首先，與現(xiàn)有的構(gòu)建表達伊維菌素受體IVMR病毒的技術(shù)相比，本發(fā)明首次構(gòu)建成功伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠，目前在國際上未見有報道。
[0016]其次，與其余能夠降低神經(jīng)元活性的技術(shù)方法相比，特別是現(xiàn)在國際上特別流行的光遺傳學(xué)技術(shù)(需要在腦部埋管插入光纖)相比，本發(fā)明的技術(shù)方法(包括給藥方式，針對使用特定表達Cre的轉(zhuǎn)基因小鼠)對小鼠沒有任何腦部損傷。
[0017]最后，本發(fā)明使用的藥物伊維菌素IVM對動物的影響具有足夠長的半衰期，適合進行動物行為實驗。另外半衰期也相對穩(wěn)定，可以在藥物失效后再次實驗，方便的對同一個動物的進行前后比較實驗。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為構(gòu)建IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠使用的基因打靶策略的示意圖；
[0019]圖2為PCR鑒定發(fā)生同源重組小鼠胚胎干細胞；
[0020]圖3為獲得IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠后使IVMR基因表達、神經(jīng)元活性下降的技術(shù)步驟和策略；
[0021]圖4為將表達Cre重組酶的病毒通過腦立體定位注射的方法注射到IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠的腦后，使用IVMR基因的RNA原位雜交鑒定IVMR的表達情況；
[0022]圖5為將表達特定Cre重組酶(CamKII啟動子驅(qū)動Cre表達的CamKI1-Cre)的轉(zhuǎn)基因小鼠與IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠交配，得到雙陽性的CamKI1-Cre ;IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠，使用IVMR基因的RNA原位雜交鑒定IVMR的表達情況。

【具體實施方式】
[0023]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。
[0024]實施例:
[0025]1、構(gòu)建IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠的打靶載體
[0026]包含IVMR-2A-GFP基因序列的質(zhì)粒由澳大利亞昆士蘭大學(xué)Joseph W.Lynch教授惠贈，Rosa26-CAG打靶載體從美國Addgene網(wǎng)站購得。使用通用分子克隆的方法將IVMR-2A-GFP基因序列(GFP為綠色熒光蛋白，2A為自酶切序列，方便將IVMR和GFP蛋白分開)插入到Rosa26打靶載體的STOP位點后面，替換掉原始載體中的tdTomato序列，從而構(gòu)建成功包含IVMR基因的打靶載體，如圖1B所示，打靶載體⑶所用到的5’同源臂(5’arm)和3’同源臂(3’arm)位于野生型Rosa26基因位點(A)的第一和第二外顯子(exon)之間。同源重組將打靶載體的兩個同源臂之間的基因序列插入至胚胎干細胞Rosa26基因位點的同源序列之間，包括CAG啟動子、1xp包圍的STOP位點、IVMR-2A-GFP表達序列和多個篩選標(biāo)記等。其中，5’同源臂和3’同源臂鑒定引物也在圖1C上標(biāo)記出來。其中，該打靶載體含有1.1kb長的5’同源臂(5，arm)和4.3kb長的3’同源臂(3，arm)、CAG啟動子、1xp包圍的STOP序列、IVMR-2A-GFP表達序列和用于篩選克隆用的PGK-NeoR和PGK_DTA_pA序列。
[0027]2、同源重組
[0028]接著將構(gòu)建好的打祀載體線性化后，通過Amaxa電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)到129/B6小鼠雜交第一代的胚胎干細胞系G442中。發(fā)生同源重組的胚胎干細胞可以表達Neo抗性基因，因此能夠在含有抗生素G418的培養(yǎng)液中存活下來；并且同源重組不會將PGK-DTA-pA序列整合進干細胞的基因組里，所以干細胞不會被DTA的毒性所損傷。通過上述正負篩選的胚胎干細胞，進一步提取它們的總基因組DNA，進行同源臂的PCR鑒定。5’和3’同源臂的引物位點如圖1C下面5’ arm_F/R,3’ arm_F/R所示,引物序列如下:
[0029]5，arm-F:5，-CGCGGAACTCCATATATGGGCTATG-3，，如 SEQ ID NO:1 所示；
[0030]5，arm-R:5，-GGCTCCTCAGAGAGCCTCGGCTAG-3，，如 SEQ ID NO:2 所示；
[0031]3，arm-F:5/ -AGACCATTCTCAGTGGCTCAACAAC-3’，如 SEQ ID NO:3 所示；
[0032]3，arm-R:5，-ATTCGGCTATGACTGGGCACAACA-3，，如 SEQ ID NO:4 所示；
[0033]PCR鑒定的結(jié)果如圖2所示，5’和3’同源臂PCR均為陽性的胚胎干細胞為2、4、5、7和10號克隆。這表明，這五個克隆是經(jīng)過同源重組的胚胎干細胞。
[0034]3、囊胚注射與嵌合體獲得
[0035]選取5’和3’同源臂PCR均為陽性的4、5和10號胚胎干細胞克隆分別注射到C57BL/6J母鼠的囊胚中。其后這些經(jīng)過同源重組的胚胎干細胞和囊胚中的其他胚胎干細胞會整合在一起，發(fā)育成胚胎直到順利出生。由于129品系小鼠的皮毛是白色，C57BL/6J品系的皮毛是黑色的，再加上使用的4、5、10號胚胎干細胞克隆都是上述2個品系混合，所以出生的小鼠的皮毛呈黑白相間，稱為嵌合體小鼠。將嵌合體小鼠和C57BL/6J品系小鼠相交配，在子代小鼠用以下引物進行PCR，鑒定為陽性的小鼠即為伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0036]WT-F:5，-TGCATAAAACCCCAGATGACTACC-3，，如 SEQ ID NO:5 所示；
[0037]WT-R:5，-GCAATACCTTTCTGGGAGTTCTCT-3，，如 SEQ ID NO:6 所示；
[0038]IVMR-F:5，-TCGACCATGGTAATAGCGATGAC-3，，如 SEQ ID NO:7 所示；
[0039]進行PCR鑒定時同時加入以上3個引物，PCR程序設(shè)定為:94°C預(yù)變性5分鐘，940C 30秒，58°C 30秒，72°C 30秒，共35個循環(huán)，然后72°C延伸5分鐘，12°C保存。野生型小鼠的條帶為304bp，而IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠的條帶為514bp。
[0040]到這一步為止，成功的構(gòu)建出IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠，但在這種小鼠中，IVMR基因前面還有一個STOP序列，所以伊維菌素受體IVMR并不會表達。
[0041]4、條件型伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建
[0042]在構(gòu)建條件型伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠可以有以下兩種策略(如圖3所示):A，使用Cre重組酶表達病毒(包括腺相關(guān)病毒AAV、慢病毒Lentivirus等)；B，使用特定Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小鼠(以特定啟動子序列表達Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠)。詳細來說，當(dāng)使用Cre重組酶表達病毒時(圖3A)，將麻醉后的IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠的頭固定在立體定位儀上，剪開頭皮暴露頭骨，用微型鉆頭在頭骨上的相應(yīng)位置(如紋狀體)打孔，使用玻璃毛細管將AAV病毒注射至紋狀體內(nèi)。另一種方法(圖3B)就是將特定Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小鼠(如CamKII啟動子驅(qū)動Cre表達的轉(zhuǎn)基因小鼠)與IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠交配，在子代中通過PCR篩選Cre和IVMR雙陽性的小鼠即為Cre ； IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0043]篩選IVMR陽性的引物和PCR程序與上一步用到的WT_F，WT_R，IVMR-F相同。
[0044]篩選Cre陽性的弓丨物如下:
[0045]Cre-F:5，-TCGATGCAACGAGTGATGAG-3，，如 SEQ ID NO:8 所示；
[0046]Cre-R:5，-TCCATGAGTGAACGAACCTG-3，，如 SEQ ID NO:9 所示；
[0047]PCR程序設(shè)定為94°C預(yù)變性5分鐘，94°C 30秒，60°C 30秒，72°C 30秒，共30個循環(huán)，然后72°C延伸5分鐘，12°C保存。野生型小鼠無條帶，Cre陽性小鼠的條帶為約400bp。
[0048]不論是通過病毒表達Cre重組酶還是通過與Cre重組酶轉(zhuǎn)基因動物交配表達Cre,都是為了將IVMR基因序列前面的STOP序列剪切掉，以使該伊維菌素受體IVMR順利表達出來。這樣成功獲得了條件型伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0049]最后將伊維菌素IVM通過腹腔注射至在腦中注射過Cre表達病毒的IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠以及Cre ;IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠中，伊維菌素IVM在腦中激活伊維菌素受體IVMR，使神經(jīng)元的活性下降。
[0050]5、條件型伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定
[0051]進行了兩種策略獲得的條件型伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定?；虻腞NA原位雜交是一種常用的檢測基因mRNA表達的方法。在IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠中注射表達Cre的AAV病毒7天后，將小鼠麻醉處死，用PBS和4% PFA先后灌注，4% PFA后固定，冰凍切片，進行原位雜交，藍紫色信號即為雜交的陽性信號，表明該細胞表達伊維菌素受體IVMR的mRNA(圖4B)，而未注射Cre病毒的轉(zhuǎn)基因小鼠(圖4A)或是注射Cre病毒的野生型小鼠(圖4C)，都沒有IVMR的表達。另外，將CamKI1-Cre小鼠與IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，獲得雙陽性子代小鼠CamKI1-Cre ；IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠，將這種小鼠以上述相似的方法處死、灌注、切片，進行IVMR基因的RNA原位雜交。在海馬和大腦皮質(zhì)廣泛區(qū)域均有原位雜交的陽性信號表達，這表明在CamKI1-Cre ;IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠小鼠腦中的海馬和大腦皮質(zhì)中，均有較強的IVMR基因表達，如圖5所示，圖5中C Al:海馬CAl區(qū)；DG:海馬齒狀回；I_V1:大腦皮質(zhì)的分層。
[0052]上述的對實施例的描述是為便于該【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應(yīng)用到其他實施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動。因此，本發(fā)明不限于上述實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0053]

【權(quán)利要求】
1.一種條件型伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將IVMR-2A-GFP的序列插入到Rosa26基因位點的下游，緊接在一個1xP位點包圍的STOP元件后面，構(gòu)建Rosa26-1VMR打靶載體； (2)將Rosa26-1VMR打靶載體電轉(zhuǎn)進小鼠胚胎干細胞中進行同源重組，經(jīng)過正負篩選和PCR篩選完成同源重組的胚胎干細胞； (3)將陽性的胚胎干細胞移植進母鼠的囊胚中，選取出生的嵌合小鼠與野生型小鼠進行交配，鑒定為陽性的子代小鼠即為IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠； (4)將表達Cre重組酶的病毒經(jīng)立體定位注射進IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠的腦中，或者將特定神經(jīng)元表達Cre重組酶的小鼠與IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠進行交配，得到的雙陽性的子代小鼠，成功構(gòu)建條件型IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種條件型伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)~步驟(4)中分別進一步包括對所獲得的小鼠利用特異基因擴增引物進行基因型鑒定。
3.一種采用權(quán)利要求1方法得到的條件型伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠模型。
4.一種采用權(quán)利要求1方法得到的條件型伊維菌素受體IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠模型在研究腦神經(jīng)元活性下降與神經(jīng)元功能和動物行為中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，對注射病毒或者特定神經(jīng)元表達Cre重組酶的IVMR轉(zhuǎn)基因小鼠給藥伊維菌素IVM，降低特定神經(jīng)元的活性。
【文檔編號】C12N15/89GK104131036SQ201410363847
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】丁玉強, 胡玲, 張玲, 黃纓, 張磊, 宋寧寧 申請人:同濟大學(xué)