專利名稱：一種hcv轉(zhuǎn)基因小鼠模型及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
長期以來，丙型肝炎的研究一大難題即缺乏小動物感染模型，阻礙了對HCV致病機理探討、抗病毒藥物篩選和疫苗研究等研究進程。因此探索具有實際應(yīng)用價值的HCV感染模型或HCV基因表達模型，是當今丙型肝炎防治研究的重大課題。
針對HCV基因組抗病毒治療研究的主要靶位是位于基因組5’非編碼區(qū)(NCR)內(nèi)介導(dǎo)并控制著整個HCV基因組的翻譯的內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)。針對病毒基因組高度保守區(qū)IRES設(shè)計的藥物應(yīng)用于體內(nèi)時，也會極大地降低病毒突變體產(chǎn)生的可能性，因而IRES是抗HCV治療的理想靶位。多年來針對HCV IRES抑制劑的研究取得可喜的進展，反義寡核苷酸、核酶(Ribozyme)、脫氧核酶(DNAzyme)、寡核苷酸適配子(Aptamers)和干涉性小dsRNA(siRNA)等藥物在體外或細胞體系均顯示出良好的抗病毒作用。但由于缺乏理想的HCV感染小動物實驗?zāi)Ｐ?，這些反義核酸類藥物在體內(nèi)抗HCV的作用效果，以及對其毒性、安全性等難以作出評估，極大地延緩了這些藥物進入臨床。在可預(yù)見的一段時期內(nèi)，HCV感染小動物模型的建立還是難以取得突破性的進展。在此情況下，以HCV轉(zhuǎn)基因動物模型替代HCV感染的體內(nèi)模型仍然是丙型肝炎抗病毒藥物研究的一個重要途徑。但目前還沒有實用的，來源方便的，能穩(wěn)定評價抗HCV IRES藥物體內(nèi)作用效果的小動物模型。最近水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)的出現(xiàn)為建立在肝臟特異表達HCV IRES的小鼠模型提供了新思路。
水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)(Hydrodynamic transfection)是近年來出現(xiàn)的一種新的簡單、方便、高效的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染方法，它是高壓下經(jīng)小鼠尾靜脈快速注射大體積含目的基因的生理鹽水，從而在小鼠體內(nèi)主要在小鼠肝臟中實現(xiàn)目的基因的高效表達，該方法被正式定名為水動力轉(zhuǎn)染法。該方法的要點是高壓下在小鼠尾靜脈內(nèi)快速(＜5s)注射大體積含目的基因(10μg DNA)的生理鹽水(體重的8％-12％)，用此方法導(dǎo)入體內(nèi)的基因在肝臟中表達水平較其他器官中高102-105倍，而且一次注射能使40％的肝細胞得到轉(zhuǎn)染。它不需要特殊儀器，具有研究周期短、花費小、表達量高等優(yōu)點，因此，該技術(shù)尤其適合于作為經(jīng)典轉(zhuǎn)基因技術(shù)的替代，用于研究目的基因在成年小鼠體內(nèi)肝細胞的表達及其功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種構(gòu)建HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型的方法。
本發(fā)明所提供的構(gòu)建HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型的方法，包括下述步驟1)構(gòu)建包括海腎熒光素酶(Rluc)基因和螢火蟲熒光素酶(Fluc)基因以及位于所述海腎熒光素酶(Rluc)基因和螢火蟲熒光素酶(Fluc)基因之間的HCV IRES序列的雙順反子表達載體；2)采用水動力轉(zhuǎn)染方法將所述雙順反子表達載體轉(zhuǎn)染到小鼠體內(nèi)，得到HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型。
所述雙順反子表達載體中以螢火蟲熒光素酶表達水平反映HCV IRES的活性，而“依賴帽子的掃描機制”翻譯表達的Rluc作為HCV IRES調(diào)控熒光素酶體內(nèi)表達的內(nèi)對照。
所述雙順反子表達載體的啟動子為CMV啟動子或肝臟特異性人α抗胰蛋白酶(hAAT)啟動子(Gene Bank Acession NumberD38257)。
在實際應(yīng)用中，如果需要在小鼠肝臟瞬時表達螢火蟲熒光素酶，所述雙順反子表達載體可采用CMV啟動子，如果需要在小鼠肝臟長期表達螢火蟲熒光素酶，所述雙順反子表達載體可采用肝臟特異性人α抗胰蛋白酶(hAAT)啟動子。
所述CMV啟動子可為來源于表達載體pCI-neo。
所述HCV IRES序列為具有序列表中序列1的DNA序列或與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有相同活性的DNA序列。
所述雙順反子表達載體可為質(zhì)粒pCI-CMV-Rluc-HCV IRES-Fluc和/或pCI-hAAT-Rluc-HCV IRES-Fluc。
所述質(zhì)粒pCI-CMV-Rluc-HCV IRES-Fluc可按照下述方法得到的以pCI-neo載體為出發(fā)載體，將海腎熒光素酶(Rluc)基因和螢火蟲熒光素酶(Fluc)基因以及HCVIRES序列插入pCI-neo載體，且使HCV IRES序列位于所述海腎熒光素酶(Rluc)基因和螢火蟲熒光素酶(Fluc)基因之間。
以hAAT啟動子取代質(zhì)粒pCI-CMV-Rluc-HCV IRES-Fluc中的CMV啟動子即可得到pCI-hAAT-Rluc-HCV IRES-Fluc。
上述表達載體均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。
由上述方法構(gòu)建的HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型也屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明構(gòu)建的雙順反子表達質(zhì)粒載體，以螢火蟲熒光素酶表達水平反映HCV IRES的活性，而“依賴帽子的掃描機制”翻譯表達的Rluc作為HCV IRES調(diào)控熒光素酶體內(nèi)表達的內(nèi)對照，有利于克服系統(tǒng)誤差。本發(fā)明用成年小鼠采用水動力轉(zhuǎn)染方法建立小鼠模型，不需要特殊儀器，具有研究周期短、花費小、目的基因在肝臟特異長期穩(wěn)定表達，且具有表達量高等優(yōu)點。本發(fā)明構(gòu)建的HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型可用于以HCV IRES為靶標的反義寡核苷酸、特異性核酶及siRNA等抗HCV藥物的篩選，評價其穩(wěn)定性、作用效果及其在體內(nèi)的毒性、安全性等，為此類藥物進入臨床提供數(shù)據(jù)資料；也可用于研究宿主因素對HCV IRES的影響。


圖1為雙順反子表達載體pCI-CMV-Rluc-HCV IRES-Fluc的構(gòu)建過程示意2為siRNA/DNAzyme對小鼠體內(nèi)表達HCV IRES的抑制作用柱狀圖具體實施方式
實施例1、雙順反子表達質(zhì)粒的構(gòu)建(1)pCI-CMV-Rluc-HCV IRES-Fluc的構(gòu)建如圖1所示，pRluc-CMV載體(Promega產(chǎn)品)經(jīng)NheI和XbaI雙酶切，獲得Rluc基因序列，連接到同樣經(jīng)NheI和XbaI雙酶切的pCI-neo表達載體(Promega產(chǎn)品)上，得到pCI-Rluc表達載體。以pHCV-neo4載體(中華微生物和免疫學(xué)雜志，1999，19(1)17-20)(含HCV IRES與螢火蟲熒光素酶基因的融合基因)為模板，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成引物IRES-Fluc15`-acgcgtcgaccccaagcttgccagcccc-3`，IRES-Fluc25`-ataagaatgcggccgcagaattacacggcgatctttc-3`，上下游引物分別含SalI和NotI酶切位點，PCR擴增得到的HCV IRES-Fluc融合基因片段，經(jīng)SalI和NotI雙酶切后與同樣經(jīng)SalI和NotI雙酶切的pCI-Rluc表達載體連接，得到pCI-CMV-Rluc-HCV IRES-Fluc雙順反子表達質(zhì)粒。
其中，PCR擴增反應(yīng)條件為94℃2min后，進行35個循環(huán)94℃30s，55℃40s，72℃1min；然后72℃延伸5min。
(2)pCI-hAAT-Rluc-HCV IRES-Fluc的構(gòu)建以從人肝臟組織中提取的總DNA為模板，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成haat啟動子上游引物5`-GGAAGATCTTTCCCTGGTCTGAATGTGTG-3`，haat啟動子下游引物5`-GGCCTTAAGACAGTCCCAGGTCAGTGGTGGTGC-3`，上下游引物分別含BegII和IPpo-I酶切位點，PCR擴增得到的hAAT啟動子基因片段，經(jīng)BegII和IPpo-I雙酶切后與同樣經(jīng)BegII和IPpo-I雙酶切的pCI-CMV-Rluc-HCV IRES-Fluc表達載體連接，構(gòu)建得到pCI-hAAT-Rluc-HCV IRES-Fluc雙順反子表達質(zhì)粒。
其中，PCR擴增反應(yīng)條件為94℃2min后，進行35個循環(huán)94℃30s，55℃40s，72℃1min；然后72℃延伸5min。
實施例2、pCI-CMV-Rluc-HCV IRES-Fluc質(zhì)粒、pCI-hAAT-Rluc-HCV IRES-Fluc質(zhì)粒分別經(jīng)水動力轉(zhuǎn)染小鼠構(gòu)建HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型應(yīng)用水動力轉(zhuǎn)染法向小鼠(6-8周齡，18-20g)尾靜脈短時間內(nèi)(5-8s)注射大體積(1.5-2ml)含pCI-CMV-Rluc-HCV IRES-Fluc或pCI-hAAT-Rluc-HCV IRES-Fluc質(zhì)粒DNA(5-10μg)的生理鹽水溶液，對照組只注射相同體積的生理鹽水。在注射后不同時間點12h、24h、48h、72h、1周、2周、4周處死小鼠，取肝臟制備成單細胞懸液。采用雙熒光素酶測定試劑盒(Dual Luciferase Assay System，Promega)檢測不同時間點熒光素酶活性，按推薦的操作步驟進行。結(jié)果表明采用CMV為啟動子的雙順反子表達質(zhì)粒，水動力轉(zhuǎn)染后目的基因熒光素酶在小鼠肝臟為瞬時表達，水動力轉(zhuǎn)染后12h HCV IRES調(diào)控的熒光素酶表達水平達到高峰，48h后表達水平顯著下降；而采用肝臟特異性人α抗胰蛋白酶(hAAT)啟動子的雙順反子表達質(zhì)粒，水動力轉(zhuǎn)染后目的基因在小鼠肝臟獲得較長期表達，4周后HCV IRES調(diào)控的熒光素酶仍有較高的表達水平。
實施例3、HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型的應(yīng)用應(yīng)用水動力轉(zhuǎn)染法向小鼠(昆明鼠，6-8周齡，18-20g)尾靜脈短時間內(nèi)(5s)注射大體積(1.5ml)含pCI-hAAT-Rluc-HCV IRES-Fluc質(zhì)粒DNA(10μg)為對照組，實驗組水動力轉(zhuǎn)染pCI-hAAT-Rluc-HCV IRES-Fluc質(zhì)粒DNA(10μg)和40μg siRNA或40μg DNAzyme(DNAzyme5’-ATGGTGCAGGCTAGCTACAACGAGGTCTACG-3’，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成；siRNA序列siRNA(sense)5’-UUGUAGACCGUGCACCAUGAGC-3’，siRNA(antisense)5’-UUGCUCAUGGUGCACGGUCUAC-3’，制備方法參見文獻軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊.2004，28(2)163-165)的生理鹽水溶液，siRNA和DNAzyme為靶向HCVIRES第328-347核苷酸處的小干擾性RNA和脫氧核酶。結(jié)果表明水動力轉(zhuǎn)染24h后，與對照組相比siRNA和DNAzyme分別使HCV IRES介導(dǎo)的熒光素酶表達水平降低90％和51％(圖2)，表明本發(fā)明建立的以HCV IRES調(diào)控熒光素酶表達小鼠模型，可用于探討宿主因素對HCV IRES的影響，評價干擾素對HCV IRES介導(dǎo)翻譯啟動的影響，以及用于評價抗HCV IRES的反義寡核苷酸、特異性核酶及siRNA的作用效果。
序列表<160>1<210>1<211>341<212>DNA<213>黃病毒屬丙型肝炎病毒(Flavivirus hepatitis C virus)<400>1gcccgccccc tgatgggggc gacactccgc catgagtcac tcccctgtga ggaactactg 60tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg ttagtatgag tgtcgtacag cctccaggcc120cccccctccc gggagagcca tagtggtctg cggaaccggt gagtacaccg gaattaccgg180aaagactggg tcctttcttg gataaaccca ctctatgtcc ggtcatttgg gcgtgccccc240gcaagactgc tagccgagta gcgttgggtt gcgaaaggcc ttgtggtact gcctgatagg300gtgcttgcga gtgccccggg aggtctcgta gaccgtgcat c34權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型的方法，包括下述步驟1)構(gòu)建包括海腎熒光素酶基因和螢火蟲熒光素酶基因以及位于所述海腎熒光素酶基因和螢火蟲熒光素酶基因之間的HCV IRES序列的雙順反子表達載體；2)采用水動力轉(zhuǎn)染方法將所述雙順反子表達載體轉(zhuǎn)染到小鼠體內(nèi)，得到HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述雙順反子表達載體的啟動子為CMV啟動子或hAAT啟動子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述HCV IRES序列為具有序列表中序列1的DNA序列或與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有相同活性的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述雙順反子表達載體為質(zhì)粒pCI-CMV-Rluc-HCV IRES-Fluc和/或pCI-hAAT-Rluc-HCV IRES-Fluc。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述質(zhì)粒pCI-CMV-Rluc-HCVIRES-Fluc是按照下述方法得到的以pCI-neo載體為出發(fā)載體，將海腎熒光素酶基因和螢火蟲熒光素酶基因以及HCV IRES序列插入pCI-neo載體，且使HCV IRES序列位于所述海腎熒光素酶基因和螢火蟲熒光素酶基因基因之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于以hAAT啟動子取代所述質(zhì)粒pCI-CMV-Rluc-HCV IRES-Fluc中的CMV啟動子，得到pCI-hAAT-Rluc-HCV IRES-Fluc。
7.用權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法構(gòu)建的HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型。
8.權(quán)利要求7所述的HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型在研究宿主因素對HCV IRES的影響中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求7所述的HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型在進行抗HCV IRES藥物篩選中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的構(gòu)建HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型的方法，包括下述步驟1)構(gòu)建包括海腎熒光素酶基因和螢火蟲熒光素酶基因以及位于所述海腎熒光素酶基因和螢火蟲熒光素酶基因之間的HCV IRES序列的雙順反子表達載體；2)采用水動力轉(zhuǎn)染方法將所述雙順反子表達載體轉(zhuǎn)染到小鼠體內(nèi)，得到HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型。本發(fā)明構(gòu)建的HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型可用于以HCV IRES為靶標的反義寡核苷酸、特異性核酶及siRNA等抗HCV藥物的篩選，評價其穩(wěn)定性、作用效果及其在體內(nèi)的毒性、安全性等，為此類藥物進入臨床提供數(shù)據(jù)資料；也可用于研究宿主因素對HCV IRES的影響。
文檔編號A01K67/027GK1718731SQ200410062739
公開日2006年1月11日 申請日期2004年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月8日
發(fā)明者詹林盛, 王全立, 饒林, 彭劍淳 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所