專利名稱：：Pon基因簇在制備用于治療動脈粥樣硬化的藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及對氧磷酶基因簇在制備用于促進(jìn)動脈粥樣硬化癍塊穩(wěn)定性藥物中的用途。本發(fā)明還涉及PON基因簇轉(zhuǎn)基因小鼠模型的培育方法及PON基因簇在培育的PON基因簇陽性的動脈粥樣硬化轉(zhuǎn)基因小鼠模型中的用途。
背景技術(shù)：
：1.動脈粥樣硬化及其癍塊破裂心血管疾病是我國以及發(fā)達(dá)國家的最主要的致死和致病因素，而動脈粥樣硬化是導(dǎo)致心血管疾病的首要因素(Libby，2002)(Glass和Witztum，2001)?，F(xiàn)在認(rèn)為導(dǎo)致動脈粥樣硬化相關(guān)的缺血綜合癥(特別是心肌梗死和中風(fēng))的主要原因是動脈粥樣硬化癍快的破裂和繼發(fā)血栓形成，而不是癍塊本身導(dǎo)致的血管腔狹窄(Lee和Libby，1997)。臨床治療動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥迫切需要有效的針對導(dǎo)致癍塊破裂的因素的治療手段。氧化性低密度脂蛋白(Oxidizedlowdensitylipoprotein,oxLDL)在引發(fā)癍塊形成和惡化的炎癥中起著至關(guān)重要的作用(Libby，2002；Steinberg，1997)，它可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞等表達(dá)粘附分子、趨化因子及其他細(xì)胞因子，進(jìn)而介導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞的粘附和招募致內(nèi)皮下層，并分化為巨噬細(xì)胞(Lusis，2000)。招募來的巨噬細(xì)胞吞噬并進(jìn)一步氧化LDL，過多地吞噬使其自身凋亡壞死，并轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后的巨噬細(xì)胞不但形成早期的脂質(zhì)條紋和壞死核心，而且因為可以分泌大量的炎癥分子及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)而成為活躍的炎癥中心?；钴S的炎癥反應(yīng)進(jìn)一步推動癍塊的發(fā)展，并最終導(dǎo)致破裂，引起并發(fā)癥(Galis,2004；Schwartz等人，2007)。2.對氧磷酶(PON)和oxLDL以及動脈粥樣硬化的關(guān)系2.1對氧磷酶(PON)家族介紹對氧磷酶(paraoxonases)家族又稱PON家族，是一類控制酯類水解的蛋白酶家族。截至目前，研究發(fā)現(xiàn)該家族有3個成員PONl，P0N2和P0N3(Primo-Parmo等人，1996)，而大多數(shù)研究主要集中在PONl和P0N2上。人類PONl基因含有9個外顯子和8個內(nèi)含子，編碼355個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，相對分子量約為43kDa(Mackness等人，1998)。對于PONl蛋白結(jié)構(gòu)的研究表明，它是由6片層beta-螺旋和唯一的活性位點及一個基于His-His結(jié)構(gòu)的異化中心組成(Harel等人，2004)。人類PONl基因有3個半胱氨酸殘基，其中第42位和第352位形成分子內(nèi)的二硫鍵，而第284位半胱氨酸處于游離的自由狀態(tài)，是優(yōu)化對氧磷酶及芳基酯酶活性所必需的。PONl在肝臟內(nèi)合成進(jìn)而被分泌進(jìn)入血液，并專一的結(jié)合于HDL上。PONl可以水解芳香族酯類底物，例如乙酸苯酯，硫代乙酸苯酯和2-乙酸萘酯。除此之外，一些芳香內(nèi)酯和脂肪內(nèi)酯以及環(huán)化碳酸酯也可以被PONl水解。PONl還可以催化酯化反應(yīng)的逆反應(yīng)-水解反應(yīng)(Mackness等人，2002；Ng等人，2001)。P0N2是對氧磷酶基因家族在染色體上的第二個成員，和PONl—樣有9個外顯子和8個內(nèi)含子，與PONl同源性達(dá)7990%，但P0N2不存在HDL上，而是位于膜脂蛋白上。P0N2在人體肝、腦、腎等組織中廣泛表達(dá)，P0N2的芳基脂酶及對氧磷酶的活性比PONl要差(Ng等人，2001)。P0N3含有5個外顯子和3個內(nèi)含子，編碼353個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，蛋白約為40kDa，在人體內(nèi)主要存在于HDL顆粒上，但是其濃度要比PONl低50倍左右(Draganov等人，2000)。P0N2和P0N3與PONl有著相當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)和功能上的相似性。在哺乳動物的組織中，P0N2的表達(dá)很廣泛，并被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)延緩LDL氧化程度的抗氧化劑。而P0N3則是和PONl很相似，在肝臟內(nèi)合成并與HDL結(jié)合發(fā)揮其抗氧化的功能(Ng等人，2005)。2.2P0N家族成員和OXLDL的關(guān)系PON是對氧磷酶，具有催化水解反應(yīng)的活性，可以降解由酯化反應(yīng)形成的各種酯類。而oxLDL的形成正是酯化反應(yīng)，也就是說PON可以對抗oxLDL的形成。而PON家族的3個成員在機(jī)體內(nèi)有著不同的分布位置，功能上卻十分相似，都是具有對氧磷酶的活性，可以催化酯化反應(yīng)的逆反應(yīng)水解反應(yīng)。因此，可以說PON正是對抗oxLDL形成的重要因素之一(Aviram禾口Rosenblat,2004)。2.3P0N家族成員在動脈粥樣硬化中起的作用2.3.1P0N1和動脈粥樣硬化的關(guān)系PONl存在于HDL顆粒上，可以對抗LDL的氧化，降低oxLDL的水平，達(dá)到對抗動脈粥樣硬化的作用(Watson等人，1995)。PONl對抗動脈粥樣硬化的作用已經(jīng)由動物水平PONl的轉(zhuǎn)基因和敲除實驗證明。實驗證明純化的POm可以對抗LDL的氧化損傷，還可以加速氫過氧化磷脂的降解(Watson等人，1995)。而PONl可以水解人體內(nèi)冠狀動脈粥樣癍塊中的氧化性脂類也已經(jīng)被證實(Hedrick等人，2000)。同時關(guān)于PONl的過表達(dá)和敲除動物實驗也提示了PONl對抗動脈粥樣硬化的保護(hù)性作用。PONl基因敲除小鼠，飼喂高脂飲食就會引起比對照小鼠更嚴(yán)重的AS的發(fā)生，而其體內(nèi)的HDL也喪失了保護(hù)LDL不被氧化的作用(Shih等人，1998)。而人PONl基因過表達(dá)的小鼠在同等條件下則會對抗AS的發(fā)生(Tward等人，2002)。同時臨床試驗也提供了關(guān)于PONl功能的證據(jù)，PONl的SNP相關(guān)研究證明PONl體內(nèi)活性低會增加罹患動脈粥樣硬化的機(jī)率(Watzinger等人，2002)。2·3·2P0N2與動脈粥樣硬化的關(guān)系P0N2在哺乳動物體內(nèi)的表達(dá)很廣范，并且被認(rèn)為具有在細(xì)胞內(nèi)對抗LDL氧化的作用(Ng等人，2001)。過表達(dá)P0N2的細(xì)胞可以降低細(xì)胞內(nèi)LDL氧化的程度并且可以更為有效的對抗H2O2和氧化性脂類引起的細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激(Ng等人，2001)。同時有P0N2的動物水平的敲除研究證明其敲除鼠較同窩的野生型小鼠更易產(chǎn)生動脈粥樣硬化癍塊(Ng等人，2006)，這也有力的證明了P0N2也是具有對抗動脈粥樣硬化的作用。同時，有關(guān)P0N2的SNP研究也提示了P0N2和血漿內(nèi)總膽固醇濃度，甘油三酯的調(diào)控，腎病和II型糖尿病都有著密切的關(guān)系(Hegele等人，1997)。而P0N2和動脈粥樣硬化發(fā)展的關(guān)系還可以通過其與患有家族遺傳性的高膽固醇血癥的高加索人的動脈內(nèi)膜增生的關(guān)系得到解釋(Leus等人，2001)。2.3.3P0N3和動脈粥樣硬化的關(guān)系P0N3是一個由肝臟合成的40kDa的蛋白，在人和兔的血清中會結(jié)合在HDL上而不與LDL結(jié)合。而在HDL上，P0N3的濃度比PCMl要低50倍(Draganov等人，2000)。有研究表明，用P0N3預(yù)處理過的人動脈內(nèi)皮細(xì)胞具有對抗輕微oxLDL產(chǎn)生并使已經(jīng)形成的oxLDL失活的特性。但是P0N3的水解活性不如PONl，不能水解對氧磷脂，在HepG2細(xì)胞和高脂飲食刺激的小鼠肝臟中，P0N3的表達(dá)不受氧化性磷脂的調(diào)控。這些表明P0N3在對抗動脈粥樣硬化上發(fā)揮的作用沒有POm強(qiáng)大，但是仍有一定的功能(Reddy等人，2001)。有研究表明在動脈粥樣硬化易感模型的ApoE敲除鼠中，腺病毒介導(dǎo)的P0N3的表達(dá)會對抗動脈粥樣硬化的發(fā)生(Ng等人，2007)。而P0N3的轉(zhuǎn)基因小鼠也表現(xiàn)出對抗動脈粥樣硬化的能力(Shih等人，2007)。綜上所述，PON家族的3個成員雖然在功能上效果強(qiáng)弱不一，但是總體上效應(yīng)卻是一致的，都有著對抗動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的作用，然而，已公開的數(shù)據(jù)均只是側(cè)重于單個PON家族成員在減小動脈粥樣硬化癍塊面積中的作用，截止目前，尚未有關(guān)于PON家族作為一個基因簇是否能夠在抑制癍塊發(fā)展的基礎(chǔ)上進(jìn)一步穩(wěn)定動脈粥樣硬化癍塊的進(jìn)一步研究。
發(fā)明內(nèi)容如前所述，已有的針對P0N1、P0N2和P0N3單個基因的研究表明它們能夠通過抑制LDL的氧化而抑制動脈粥樣硬化。本發(fā)明則涉及PON作為基因簇對動脈粥樣硬化癍塊的作用。因此，本發(fā)明的第一方面涉及PON基因簇在制備用于治療哺乳動物動脈粥樣硬化的藥物中的用途，優(yōu)選地，所述哺乳動物為小鼠或人，更優(yōu)選地，所述哺乳動物為人。本發(fā)明的第二方面涉及一種PON基因簇轉(zhuǎn)基因動物模型的培育方法，其包含下述步驟a)將包含人PON基因簇的載體用適當(dāng)限制酶切線性化取出載體DNA，并常規(guī)處理用于顯微注射；b)將上述DNA用顯微注射緩沖液稀釋為約l_2ng/μL，顯微注射到代孕動物的受精卵；c)將注射過的受精卵置于M16培養(yǎng)基中，CO2孵箱37°C培養(yǎng)1_2天；d)將步驟c)的受精卵移卵假孕的代孕動物，娩出小動物后，通過使用PCR和SouthernBlot篩選PON基因簇陽性轉(zhuǎn)基因動物。優(yōu)選地，載體為BAC載體RP11-104H16，限制酶為NotI。優(yōu)選地，所述動物為小鼠。優(yōu)選地，所述受精卵為C57BL/6J受精卵。本發(fā)明的第三方面涉及PON基因簇在培育PON基因簇陽性的動脈粥樣硬化轉(zhuǎn)基因小鼠模型中的用途。優(yōu)選地，在于所述轉(zhuǎn)基因小鼠模型通過下述步驟獲得a)將根據(jù)權(quán)利要求7獲得的小鼠與動脈粥樣硬化模型apoE+鼠雜交，得到PON基因簇陽性和apoE+基因型的小鼠；b)將步驟a)獲得的小鼠與apoE+鼠再雜交一代，得到PON基因簇陽性和apoE+基因型的小鼠，即PON基因簇陽性的動脈粥樣硬化轉(zhuǎn)基因小鼠模型；及可選的c)將步驟b)獲得的小鼠與apoE+鼠繼續(xù)雜交以獲得大量的PON基因簇陽性的動脈粥樣硬化轉(zhuǎn)基因小鼠。換言之，本發(fā)明選用了含全部3個PON基因序列及其相應(yīng)調(diào)控序列的PON基因簇構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠，并將其與研究動脈粥樣硬化的經(jīng)典模型apoE基因敲除小鼠雜交，獲得PON基因簇轉(zhuǎn)基因陽性而apoE基因純合缺失的小鼠模型進(jìn)行了動脈粥樣硬化相關(guān)研究，通過提取轉(zhuǎn)基因小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞研究PON基因簇在巨噬細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)作用于動脈粥樣硬化的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)與單個PON基因，即P0N1、P0N2和P0N3的作用機(jī)理不同，PON基因簇通過促進(jìn)動脈粥樣硬化癍塊的穩(wěn)定性而實現(xiàn)治療動脈粥樣硬化的目的。PON基因簇的這種獨特的作用機(jī)制為開發(fā)通過提高動脈粥樣硬化癍塊的穩(wěn)定性而實現(xiàn)治療動脈粥樣硬化的藥物提供了依據(jù)。圖1顯示了本發(fā)明的整體實驗設(shè)計思路。圖2:顯示了包含有PON基因簇的基因組片段結(jié)構(gòu)。顯微注射的片段是一個包含有P0N1、P0N2和P0N3結(jié)構(gòu)基因(陰影部分)和旁側(cè)序列(空白部分)的長170kb的人基因組DNA。圖3顯示了用4對引物來通過PCR的方法鑒定BAC克隆04H16。圖4顯示了BAC-RPl1-104H16的PFGE圖，分子量標(biāo)準(zhǔn)是來源于NEB的小片段Pi7G分子量標(biāo)準(zhǔn)N0350。圖5顯示了通過PCR來鑒定轉(zhuǎn)基因鼠。P1-P5轉(zhuǎn)基因鼠，WT:野生型，BAC:RPll-104hl6,DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖6顯示了通過SouthernBlot來鑒定轉(zhuǎn)基因鼠。Southernblot分析的DNA是按照如下所示分離所得的第1泳道，人基因組DNA；第2泳道，Pl株P(guān)C轉(zhuǎn)基因鼠；第3泳道，P2株P(guān)C轉(zhuǎn)基因鼠；第4泳道，P3株P(guān)C轉(zhuǎn)基因鼠；第5泳道，P4株P(guān)C轉(zhuǎn)基因鼠；第6泳道，P5株P(guān)C轉(zhuǎn)基因鼠；第7泳道，野生型小鼠。所有的DNA用EcoRI消化，分別與3對引物雜交較低的引物針對人PONl基因序列(人BAC克隆RP11-104H16的10090-10515位)；中間的引物是針對人的P0N3基因序列(人BAC克隆RP11-104H16的96169-96727位)；更高的引物針對人的P0N2基因序列(人基因組的165366-165663位)。圖7顯示了人(H)P0N1、P0N2和P0N3基于在轉(zhuǎn)基因鼠的組織中的表達(dá)情況，包括心臟(Ht)、腎臟(Kd)、肝臟(Li)、肺(Lu)、肌肉(Ms)、小腸(In)、脾臟(Sp)、胃(St)、主動脈(Ao)、卵巢(Ov)以及腦(Br)，小鼠內(nèi)源性的(M)P0N1、P0N2、P0N3和肌動蛋白作為對照。圖8顯示了野生型鼠的各器官中沒有HPON基因的表達(dá)。圖9顯示了5株轉(zhuǎn)基因鼠中，P2株轉(zhuǎn)基因鼠在肝臟中的人PONl基因表達(dá)最高。圖10顯示了人P0N1、P0N2和P0N3蛋白在P2株轉(zhuǎn)基因鼠的肝臟和主動脈中的表達(dá)情況。圖11顯示了人PONl基因在PC轉(zhuǎn)基因鼠的HDL中的表達(dá)情況。圖12顯示了通過對氧磷酶活性試劑盒，對禁食的野生型(淺色柱)和PC轉(zhuǎn)基因鼠(深色柱)地HDL進(jìn)行相對的對氧磷酶活性檢測。顯示的數(shù)值是每種基因型各10只小鼠的平均值。*代表P<0.05。圖13顯示了PC轉(zhuǎn)基因/ApoE+的小鼠和對照的ApoE+的小鼠相比，癍塊面積更小、脂質(zhì)面積更小。ApoE+小鼠AS癍塊HE染色結(jié)果。PC轉(zhuǎn)基因/ApoE+的小鼠⑶的癍塊面積比對照組的ApoE+小鼠(A)要低30.8%(C)0PC轉(zhuǎn)基因/ApoE+小鼠(B)的癍塊脂質(zhì)核心(圖中癍塊內(nèi)的黑色區(qū)域)面積比對照ApoE+小鼠㈧要低13.1%(D)0*代表ρ<0.05，**代表ρ<0.01。各組中η=10。圖14顯示了PC轉(zhuǎn)基因/ApoE+小鼠的癍塊比對照ApoE+小鼠的更加穩(wěn)定。分離出來的主動脈竇用油紅0對脂質(zhì)進(jìn)行染色(Α&Β)，苦味酸和Sirius染膠原(C&D)，SMA染SMC(E&F)，Moma-2染巨噬細(xì)胞(G&H)。I:PC轉(zhuǎn)基因/ApoE+小鼠的癍塊與對照的ApoE+鼠相比，膠原百分比(76.9%增加)，SMC(15.8%增加)，巨噬細(xì)胞(22.3%)和脂質(zhì)面積(9.5%)降低。*代表ρ<0.05，#代表ρ<0.01。各組中η=10。J:PC轉(zhuǎn)基因/ApoEv-小鼠的癍塊穩(wěn)定性得分比ApoE+小鼠的高70%。具體實施方式通過參考下述的一些具體實施例可進(jìn)一步理解本發(fā)明，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，其無意于對本發(fā)明的范圍做出任何限制。顯然，可以對本發(fā)明做出多種改動和變化而不脫離本發(fā)明的實質(zhì)，因此，這些改動和變化同樣在本申請要求保護(hù)的范圍內(nèi)。實施例實施例1研究方法和材料轉(zhuǎn)基因用細(xì)菌人工染餼體(BAC)包含人PON基因簇的BAC載體(RP11-104H16)購自ChoriBacPac公司，這個克隆包含人P0N1，P0N2和P0N3結(jié)構(gòu)基因及他們相應(yīng)的旁側(cè)序列，全長170kb。如圖2所示。BAC經(jīng)PCR、PFGE及網(wǎng)上檢索，確認(rèn)無誤。實驗用小鼠及飼料C57BL/6小鼠，C57BL/6與FVB雜交Fl代雄鼠和小鼠專用飼料由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供。小鼠飼養(yǎng)于二級動物房，清潔飲水，除說明的情況外自由取食。環(huán)境采用十二小時明暗循環(huán)，早七點到晚七點照明，晚七點到次日早七點無照明。所有動物實驗都按照中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物管理條例進(jìn)行。用于誘導(dǎo)動脈粥樣硬化的高脂飲食由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物研究所提供，成分為每10千克含有基礎(chǔ)食物8875g、甘油三酯lOOOg、膽固醇125g。PON基因簇轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建將BACDNA用NotI酶切線性化取出載體DNA序列，并常規(guī)處理用于顯微注射(Gao等人，2005)。完整DNA稀釋為1.2ng/μL濃度顯微注射到C57BL/6J受精卵構(gòu)建PON基因簇轉(zhuǎn)基因小鼠。癍塊組織形杰學(xué)分析及其穩(wěn)定件判斷高脂飲食誘導(dǎo)16周后，處死小鼠。經(jīng)左心室行冷PBS和4%多聚甲醛溶液相繼體循環(huán)灌注。收集保留升主動脈的心臟(10只/組)以O(shè)TC包埋，之后進(jìn)行主動脈根部連續(xù)冰凍切片，厚度10μm,以主動脈瓣為切片的位置標(biāo)記(Ni等人，2001)。每個染色指標(biāo)以5張連續(xù)的相隔80μm的切片進(jìn)行分析。獲得的切片先行H&E進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。然后分別以油紅0和苦味酸-天狼星紅染色脂質(zhì)核心和膠原；分別用抗-α-平滑肌細(xì)胞(SMC)-Actin(Abcam，ab5694抗體和抗M0MA-2(Serotec,MCA519G)抗體免疫組化染色SMC和巨噬細(xì)胞。相應(yīng)的染色區(qū)域結(jié)果掃描成像后以Imag印roPlus5軟件進(jìn)行定量分析。癍塊穩(wěn)定性的比較通過分別比較癍塊主要成分及脂質(zhì)核心、膠原組織、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的百分比進(jìn)行。總體的穩(wěn)定性以癍塊穩(wěn)定分?jǐn)?shù)來反映，癍塊穩(wěn)定分?jǐn)?shù)=(SMC面積+膠原面積)/(巨噬細(xì)胞面積+脂質(zhì)核心面積)(Ni等人，2001)。統(tǒng)計學(xué)分析所有的值均計算為均值士標(biāo)準(zhǔn)差。兩組之間的數(shù)值以Student'sttest進(jìn)行檢驗分析。當(dāng)P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。實施例2研究結(jié)果BACRP11-104H16包含人完整PON基因簇元件顯微注射用BACRP11-104H16經(jīng)針對不同位點PCR鑒定，證明其克隆的正確性及完整性(參見圖3)。BACRP11-104H16經(jīng)PFGE鑒定，大小約為170kb，與預(yù)期一致(參見圖4)。顯微灃射用DNA的制備得到高質(zhì)量和高純度的DNA可以用于顯微注射。測定DNA濃度，約為25-30ng/μ1，再用顯微注射緩沖液將其稀釋為l-2ng/y1，每管20μ1分裝，存放于_20°C，用于顯微注射。顯微注射后將注射過的受精卵置于M16培養(yǎng)基中，CO2孵箱37°C培養(yǎng)1_2天，觀察到受精卵二分裂率大于90%，三分裂率大于40%，顯示該DNA的質(zhì)量適合用于顯微注射受精卵制備轉(zhuǎn)基因小鼠。人PON基因簇轉(zhuǎn)基因鼠系的建立將純化好的PON基因簇線狀DNA顯微注射C57BL/6小鼠受精卵雄性原核，移卵假孕鼠，懷孕共娩出58只新生小鼠。剪取鼠耳，消化后用PCR的方法鑒定陽性轉(zhuǎn)基因鼠。設(shè)計的引物能與轉(zhuǎn)基因人源PON基因簇的PONl序列配對，但不會與小鼠內(nèi)源基因配對。因此該引物在轉(zhuǎn)基因鼠基因組作為模板時可以擴(kuò)增出陽性條帶，但在野生型小鼠基因組作為模板時不會擴(kuò)增出產(chǎn)物。使用該引物能初步鑒定陽性轉(zhuǎn)基因鼠，先后在5只新生小鼠中檢測到陽性擴(kuò)增片段，分別命名為PI、P2、P3、P4和P5(參見圖5)。應(yīng)用SouthernBlot方法對5株轉(zhuǎn)基因陽性小鼠進(jìn)一步確認(rèn)。剪取鼠尾提取基因組DNA，選取EcoRI消化基因組，轉(zhuǎn)膜，雜交。探針模板P1、P3和P2分別對應(yīng)于轉(zhuǎn)基因片段上的人P0N1、P0N3和P0N2基因序列。序列在網(wǎng)上經(jīng)BLAST比對顯示與小鼠內(nèi)源基因組無明顯同源性。完整的轉(zhuǎn)基因經(jīng)探針雜交分別產(chǎn)生約2kb、5kb和7kb大小的條帶，而正常的小鼠基因組不會有雜交條帶產(chǎn)生。實驗結(jié)果顯示雜交條帶大小均與預(yù)期相符，證實所得5株小鼠均為陽性轉(zhuǎn)基因小鼠(參見圖6)。轉(zhuǎn)基因在小鼠體內(nèi)ιΗ確的表達(dá)在建立轉(zhuǎn)基因小鼠之后，進(jìn)一步檢測轉(zhuǎn)入的PON基因簇的3個基因成員是否在小鼠體內(nèi)能實現(xiàn)正確的組織特異性表達(dá)，以RT-PCR檢測轉(zhuǎn)入基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)產(chǎn)物。分別取轉(zhuǎn)基因和陰性同窩小鼠的心(Ht)、腎(Kd)Jf(Li)、肺(Lu)、肌肉(Ms)、小腸(In)、脾(Sp)、胃(St)、卵巢(Ov)、動脈(Ao)、腦(Br)組織，提取組織總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。cDNA產(chǎn)物各取1μ1作為模板，所用引物見表1:以上引物退火溫度均為60°C，PCR反應(yīng)除β-肌動蛋白為24個循環(huán)外，均為30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳顯示轉(zhuǎn)入的3個PON基因成員的組織表達(dá)分布與相應(yīng)的小鼠內(nèi)源的3個PON基因基本一致，即Ρ0Ν1主要在肝臟高表達(dá)，而Ρ0Ν2和Ρ0Ν3則表達(dá)相對廣泛(參見圖7)。而陰性同窩鼠樣品中檢測不到轉(zhuǎn)入的人PON基因的表達(dá)(參見圖8)。再分別取5株轉(zhuǎn)基因小鼠和陰性同窩小鼠的肝臟勻漿提取蛋白質(zhì)，用Westernblot檢測人POm蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，在5株陽性轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中，P2株小鼠肝臟人PONl表達(dá)最高(參見圖9)。提取P2株轉(zhuǎn)基因鼠的肝臟和主動脈蛋白分別進(jìn)行Western-Blot檢測，發(fā)現(xiàn)P2轉(zhuǎn)基因鼠肝臟可以表達(dá)人P0N1、P0N2、和P0N3，而其主動脈則主要表達(dá)人P0N2，同時在主動脈上還檢測到少量人POm及微量人P0N3，可能是主動脈中有HDL存在的結(jié)果(參見圖10)。分別取10只P2株轉(zhuǎn)基因小鼠和10只同窩對照小鼠的禁食血清，超速離心分離出HDL,兩組分別等量混合后，部分進(jìn)行脫脂處理后行Western-Blot檢測人PON的蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只在P2轉(zhuǎn)基因小鼠的HDL上檢測到人PONl蛋白(參見圖11)。另一部分分離的HDL以苯酸乙酯作為底物測量其對氧磷酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P2-HDL的對氧磷酶活性比對照非轉(zhuǎn)基因小鼠HDL高約1.7倍(參見圖12)。綜上所述，轉(zhuǎn)基因?qū)崿F(xiàn)了在小鼠體內(nèi)的正確高水平表達(dá)，并具有相應(yīng)的活性。依據(jù)以上實驗結(jié)果，我們選擇拷貝數(shù)較高的Pl和P2株轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行后續(xù)的研究。主要出示P2株系的結(jié)果，Pl株系的相應(yīng)結(jié)果只有與P2株系不同時單獨列出。轉(zhuǎn)基因鼠在ιΗ常條件無明顯表型各株系轉(zhuǎn)基因小鼠后代中外源基因的出現(xiàn)頻率接近50%，符合孟德爾遺傳規(guī)律，說明轉(zhuǎn)入的基因沒有胚胎致死效應(yīng)。轉(zhuǎn)基因小鼠外觀行為上無明顯異常。當(dāng)給予正常飲食時，雌性及雄性轉(zhuǎn)基因小鼠的體重、血漿總膽固醇(CHO)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-CHO)、低密度及極低密度脂蛋白膽固醇(LDL/VLDL-CH0)、甘油三酯(TG)、血糖水平均與同窩對照小鼠相近，見表2。hPCVapoEzzz鼠系的津立選擇Pl和P2兩株轉(zhuǎn)基因鼠與動脈粥樣硬化模型apoE+鼠雜交，用來研究轉(zhuǎn)入人PON基因簇對動脈粥樣硬化發(fā)生的影響。陽性鼠與apoE+鼠雜交第一代得到的hPC+/ap0E"_基因型的鼠，再與apoE+鼠雜交一代，可鑒定得到hPC7apoE+基因型的鼠，用這種基因型的鼠繼續(xù)與apoE+鼠繼續(xù)雜交，即可得到足夠數(shù)量的hPC+/apoE+基因型鼠和同窩的非轉(zhuǎn)基因apoE+基因型鼠，喂食高脂飲食誘導(dǎo)發(fā)生動脈粥樣硬化，用于觀察轉(zhuǎn)入人PON基因簇對動脈粥樣硬化發(fā)生的影響。在此過程中用基因型為apoE+的同性別的同窩小鼠作為對照。兩株轉(zhuǎn)基因鼠在雜交中產(chǎn)生的后代各種基因型出現(xiàn)的頻率符合孟德爾規(guī)律。兩株轉(zhuǎn)基因鼠在所有的實驗結(jié)果中都沒有差異，表明所得出的結(jié)果不是株系特異性的，而是具有普遍規(guī)律。PON基因簇轉(zhuǎn)基因促進(jìn)動脈粥樣硬化癍塊的穩(wěn)定性為了研究PON基因簇轉(zhuǎn)基因促進(jìn)動脈粥樣硬化癍塊的穩(wěn)定性，高脂飲食誘導(dǎo)16周后的雌性PCTg/ApoE缺失和ApoE缺失小鼠的心臟被收集并進(jìn)行切片染色分析。H&E染色表明PCTg/ApoE缺失小鼠的癍塊面積比對照鼠小30.8%(參見圖13C)，而其無染色區(qū)面積(指示壞死核心)占癍塊總面積的百分比也比對照鼠少13.(參見圖13D)。這樣的結(jié)果，一方面說明PON基因簇轉(zhuǎn)基因抑制了動脈粥樣硬化的形成；另一方面也提示PON基因簇轉(zhuǎn)基因鼠的癍塊可能具有更厚的纖維帽以及更小的壞死核心。進(jìn)一步通過比較癍塊的組成進(jìn)行穩(wěn)定性分析表明，PCTg/ApoE缺失小鼠的板塊具有更多的膠原(76.9%，參見圖14C、圖14D和圖141)和平滑肌細(xì)胞(15.8%，參見圖14G、圖14H和圖141)，更少的巨噬細(xì)胞浸潤(22.3%，參見圖14E、圖14T和圖141)和脂質(zhì)核心(9.5%，參見圖14A、圖14B和圖141)。以上癍塊組成性方面的系列變化說明PON基因簇轉(zhuǎn)基因促進(jìn)了動脈粥樣硬化癍塊的穩(wěn)定性。相應(yīng)的，癍塊穩(wěn)定分?jǐn)?shù)也因為PON基因簇轉(zhuǎn)基因而增加(參見圖14J)。stress，andmacrophagefoamcellformationduringatherosclerosisdevelopment.FreeRadicBiolMed37，1304-1316.Draganov，D.I.，Stetson，P.L.，Watson，C.E.，Billecke，S.S.，andLaDu,B.N.(2000).Rabbitserumparaoxonase3(P0N3)isahighdensitylipoprotein-associatedlactonaseandprotectslowdensitylipoproteinagainstoxidation.JBiolChem275,33435-33442.Galis，Z.S.(2004).Vulnerableplaque:thedevilisinthedetails.Circulation110，244-246.Gao,J.，Wei，Y.，Huang，Y.，Liu,D.，Liu,G.，Wu,Μ.，Wu,L.，Zhang，Q.，Zhang，Ζ.,Zhang,R.，etal.(2005).TheexpressionofintactandmutanthumanapoAI/CIII/AIV/AVgeneclusterintransgenicmice.JBiolChem280，12559-12566.Glass，C.K.，andWitztum,J.L.(2001).Atherosclerosis,theroadahead.Celll04，503-516.Harel，M.，Aharoni，A.，Gaidukov，L，Brumshtein，B.，Khersonsky，0.，Meged，R.，Dvir，Η·,Ravel1i,R.B.，McCarthy，Α·，Toker，L，etal.(2004).Structureandevolutionoftheserumparaoxonasefamilyofdetoxifyingandanti-atheroscleroticenzymes.NatStructMolBiol11,412-419.Hedrick，C.C.，Hassan，K.，Hough，G.P.，Yoo,J.H.，Simzar,S.，Quinto，C.R.，Kim,S.Μ.，Dooley，Α.，Langi，S.，Hama,S.Y.，etal.(2000).Short-termfeedingofatherogenicdiettomiceresultsinreductionofHDLandparaoxonasethatmaybemediatedbyanimmunemechanism.ArteriosclerThrombVascBiol20，1946—1952.HegeleiR.A.,ConnellyiP.W.,SchereriS.W.,HanleyiA.J.,HarrisiS.B.，Tsui，LC·，andZinman，B.(1997).Paraoxonase~2gene(P0N2)G148variantassociatedwithelevatedfastingplasmaglucoseinnoninsulin-dependentdiabetesmellitus.JClinEndocrinolMetab82，3373-3377.Jiang，Z.Y.，Hunt，J.V.，andWolffiS.P.(1992).Ferrousionoxidationinthepresenceofxylenolorangefordetectionoflipidhydroperoxideinlowdensitylipoprotein.AnalBiochem202，384-389.Lee,R.Τ.,andLibby,P.(1997).Theunstableatheroma.ArteriosclerThrombVascBiol17，1859-1867.Leus,F.R.，Zwart,Μ.，Kastelein,J.J.，andVoorbij,H.A.(2001).P0N2genevariantsareassociatedwithclinicalmanifestationsofcardiovasculardiseaseinfamilialhypercholesterolemiapatients.Atherosclerosis154，641—649·Libby,P.(2002).Inflammationinatherosclerosis.Nature420,868-874.LusisiA.J.(2000).Atherosclerosis.Nature407，233—241.Mackness，Μ.I.，Mackness，B.，andDurrington，P.N.(2002).Paraoxonaseandcoronaryheartdisease.AtherosclerSuppl3，49—55·Mackness，Μ.I.，Mackness，B.，Durrington，P.N.，F(xiàn)ogeIman,A.M.，Berliner，J.，Lusis，A.J.，Navab,Μ.，Shih，D.，andFonarow,G.C.(1998).Paraoxonaseandcoronaryheartdisease.CurrOpinLipidol9,319-324.Ng,C.J.，Bourquard，N.,Grijalva,V.,Hama,S.,Shih,D.Μ.,Navab,Μ.,FogeIman,A.M.，Lusis，A.J.，Young，S.，andReddy,S.T.(2006).Paraoxonase~2deficiencyaggravatesatherosclerosisinmicedespitelowerapolipoprotein-B-containinglipoproteins:anti-atherogenicroleforparaoxonase-2.JBiolChem281,29491-29500.Ng,C.J.，Bourquard，N.，Hama,S.Y.，Shih，D.，Grijalva，V.R.，Navab,Μ.，F(xiàn)ogeIman,Α.Μ.，andReddy,S.Τ.(2007).Adenovirus-mediatedexpressionofhumanparaoxonase3protectsagainsttheprogressionofatherosclerosisinapolipoproteinE—deficientmice.ArteriosclerThrombVascBiol27，1368—1374.Ng，C.J.，Shih,D.Μ.，Hama,S.Y.，Villa，N.，Navab,Μ.，andReddy，S.Τ.(2005).Theparaoxonasegenefamilyandatherosclerosis.FreeRadicBiolMed38，153—163.Ng，C.J.，Wadleigh,D.J.，Gangopadhyay,Α.，Hama,S.，Grijalva,V.R.，Navab,Μ.,Fogelman,A.Μ.,andReddy,S.Τ.(2001).Paraoxonase-2isaubiquitouslyexpressedproteinwithantioxidantpropertiesandiscapableofpreventingcell-mediatedoxidativemodificationoflowdensitylipoprotein.JBiolChem276，44444—44449.Ni，W.，Egashira，K.，Kitamoto，S.，Kataoka，C.，Koyanagi,Μ.，Inoue，S.，Imaizumi,K.，Akiyama，C.,Nishida,K.I.，andTakeshita,Α.(2001).Newanti-monocytechemoattractantprotein—1genetherapyattenuatesatherosclerosisinapolipoproteinΕ-knockoutmice.Circulation103,2096-2101.Primo-Parmo，S.L，Sorenson，R.C.，Teiber,J.，andLaDu,B.N.(1996).Thehumanserumparaoxonase/arylesterasegene(P0N1)isonememberofamultigenefamily.Genomics33,498-507.Reddy,S.T.，Wadleigh,D.J.，Grijalva,V.，Ng，C.，Hama,S.，Gangopadhyay,Α.，Shih,D.Μ.，Lusis,Α.J.，Navab,Μ.，andFogeIman,Α.Μ.(2001).Humanparaoxonase-3isanHDL—associatedenzymewithbiologicalactivitysimilartoparaoxonase-1proteinbutisnotregulatedbyoxidizedlipids.ArteriosclerThrombVascBiol21,542-547.Schwartz,S.M.，Galis，Z.S.，Rosenfeld，Μ.E.，andFalk，E.(2007).Plaqueruptureinhumansandmice.ArteriosclerThrombVascBiol27，705—713.Shih,D.M.，Gu,L，Hama,S.，Xia，Y.R.，Navab,Μ.，F(xiàn)ogeIman,Α.Μ.，andLusis,Α.J.(1996).Genetic-dietaryregulationofserumparaoxonaseexpressionanditsroleinatherogenesisinamousemodel.JClinInvest97，1630—1639·Shih,D.M.，Gu，L.，Xia,Y.R.，Navab,Μ.，Li,W.F.，Hama,S.，Castellani,L.W.，F(xiàn)urlong，C.Ε.，Costa,LG.，F(xiàn)ogeIman,Α.Μ.，etal.(1998).Micelackingserumparaoxonasearesusceptibletoorganophosphatetoxicityandatherosclerosis.Nature394,284-287.Shih,D.M.，Xia,Y.R.，Wang,X.P.，Miller,Ε.，Castellani,L.W.，Subbanagounder,G.，Cheroutre,H.，F(xiàn)aull，K.F.，Berliner，J.Α.，Witztum,J.L，etal.(2000).Combinedserumparaoxonaseknockout/apolipoproteinEknockoutmiceexhibitincreasedlipoproteinoxidationandatherosclerosis.JBiolChem275,17527-17535.Shih,D.M.，Xia,Y.R.，Wang,X.P.，Wang,S.S.，Bourquard,N.，F(xiàn)ogeIman,A.M.，Lusis,A.J.,andReddy,S.T.(2007).Decreasedobesityandatherosclerosisinhumanparaoxonase3transgenicmice.CircRes100,1200-1207.Steinberg,D.(1997).Lowdensitylipoproteinoxidationanditspathobiologicalsignificance.JBiolChem272,20963-20966.Tward,A.，Xia,Y.R.，Wang,X.P.，Shi,Y.S.，Park,C.，Castellani,L.W.，Lusis,A.J.,andShih,D.Μ.(2002).Decreasedatheroscleroticlesionformationinhumanserumparaoxonasetransgenicmice.Circulation106,484-490.Watson,A.D.,Berliner,J.A.,Hama,S.Y.,LaDu,B.N.,Faul1,K.F.,FogeIman,A.M.,andNavab,M.(1995).Protectiveeffectofhighdensitylipoproteinassociatedparaoxonase.Inhibitionofthebiologicalactivityofminimallyoxidizedlowdensitylipoprotein.JClinInvest96,2882-2891.Watzinger,N.,Schmidt,H.,Schumacher,Μ.,Schmidt,R.,Eber,B.,Fruhwald,F.Μ.,Zweiker,R.,Kostner,G.Μ.,andKlein,W.(2002).Humanparaoxonaselgenepolymorphismsandtheriskofcoronaryheartdisease-.acommunity-basedstudy.Cardiology98,116-122.序列表<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所<120>P0N基因簇在制備用于治療動脈粥樣硬化的藥物中的用途<130>890038CG<160>14<170>PatentInversion3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工<220><223>引物hPOm-RT-S<400>1aaaggaatcgaaactggctctg22<210>2<211>21<212>DNA<213>人工<220><223>引物hPONl-RT-A<400>2gactgttggggttgaagctct21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工<220><223>引物hP0N2-RT_S<400>3ctcttcgtgtatgacccgaac21<210>4<211>23<212>DNA<213>人工<220><223>引物hP0N2-RT_A<400>4acccattgttggcataaactgta23<210>5<211>21<212>DNA<213>人工<220><223>引物hP0N3-RT_S<400>5aactttgcgccagatgaacca21<210>6<211>22<212>DNA<213>人工<220><223>引物hP0N3-RT_A<400>6tcatgtggggatgattcacaac<210>7<211>22<212>DNA<213>人工<220><223>引物mPONl-RT-S<400>7tactggtggtaaaccatccaga22<210>8<211>23<212>DNA<213>人工<220><223>引物mPONl-RT-A<400>8gcagctatatcgttgatgetagg23<210>9<211>20<212>DNA<213>人工<220><223>引物mP0N2-RT_S<400>9gctctgagtttgctgggcat20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工<220><223>引物mP0N2-RT_A<400>10ccacgctaaagaaagccagg20<210>11<211>19<212>DNA<213>人工<220><223>引物mP0N3-RT_S<400>11cctcactggacttccgtcg19<210>12<211>23<212>DNA<213>人工<220><223>引物mP0N3-RT-A<400>12ggatcaacggtcaagttatccac23<210>13<211>20<212>DNA<213>人工<220><223>引物β_肌動蛋白-s<400>13gtggggcgccccaggcacca20<210>14<211>24<212>DNA<213>人工<220><223>弓丨物β_肌動蛋白-a<400>14ctccttaatgtcacgcacgatttc權(quán)利要求PON基因簇在制備用于治療哺乳動物動脈粥樣硬化的藥物中的用途。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述哺乳動物為小鼠或人。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述哺乳動物為人。4.一種PON基因簇轉(zhuǎn)基因動物模型的培育方法，其包含下述步驟a)將包含人PON基因簇的載體用適當(dāng)限制酶切線性化取出載體DNA，并常規(guī)處理用于顯微注射；b)將上述DNA用顯微注射緩沖液稀釋為約l-2ng/yL，顯微注射到代孕動物的受精卵；c)將注射過的受精卵置于M16培養(yǎng)基中，CO2孵箱37°C培養(yǎng)1-2天；d)將步驟c)的受精卵移卵假孕的代孕動物，娩出小動物后，通過使用PCR和SouthernBlot篩選PON基因簇陽性轉(zhuǎn)基因動物。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于載體為BAC載體RP11-104H16，限制酶為NotI。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述動物為小鼠。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述受精卵為C57BL/6J受精卵。8.PON基因簇在培育的PON基因簇陽性的動脈粥樣硬化轉(zhuǎn)基因小鼠模型中的用途。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因小鼠模型通過下述步驟獲得a)將根據(jù)權(quán)利要求7獲得的小鼠與動脈粥樣硬化模型apoE+鼠雜交，得到PON基因簇陽性和apoE+基因型的小鼠；b)將步驟a)獲得的小鼠與apoE+鼠再雜交一代，得到PON基因簇陽性并且apoE+基因型的小鼠，即PON基因簇陽性的動脈粥樣硬化轉(zhuǎn)基因小鼠模型；及可選的c)將步驟b)獲得的小鼠與apoE+鼠繼續(xù)雜交以獲得大量的PON基因簇陽性的動脈粥樣硬化轉(zhuǎn)基因小鼠。全文摘要本發(fā)明涉及PON基因簇在制備用于治療哺乳動物動脈粥樣硬化的藥物中的用途，其中PON基因簇通過促進(jìn)動脈粥樣硬化癍塊塊的穩(wěn)定性而實現(xiàn)治療動脈粥樣硬化的目的。本發(fā)明還涉及PON基因簇轉(zhuǎn)基因小鼠模型的培育方法及PON基因簇在培育的PON基因簇陽性的動脈粥樣硬化轉(zhuǎn)基因小鼠模型中的用途。文檔編號C12N15/85GK101843905SQ200910081009公開日2010年9月29日申請日期2009年3月27日優(yōu)先權(quán)日2009年3月27日發(fā)明者劉德培,折志剛,鄭偉,陳厚早,韋玉生申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所