專利名稱：雙黃連在制備治療動脈粥樣硬化藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及雙黃連在制備治療動脈粥樣硬化藥物中的應用。
背景技術：
心腦血管疾病是當代危害人體健康和生命的最嚴重病癥，是中、老年人的常見病和多發(fā)病，在許多國家和地區(qū)的發(fā)病率和死亡率皆位于眾病之首。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的主要病理基礎，迄今為止其病因和發(fā)病機理尚未完全闡明，故目前沒有簡明有效的防治措施和治療藥物。
此外，自首例艾滋病(AIDS)于1981年6月被美國疾病控制中心(CDC)確認以來，艾滋病橫行肆虐于全球，嚴重威脅著人類的健康和生存。自蛋白酶抑制劑(PI)引入臨床后，迅速降低了血漿HIV病毒載量，療效突出，延緩了AIDS的進展，改善了患者的生活質量。但長期的臨床觀察已經發(fā)現(xiàn)PI類藥物可致諸多嚴重的副作用，尤其是引起膽固醇含量增高，動脈粥樣硬化形成及誘發(fā)糖尿病等，嚴重影響病人的生存質量。由于目前常用的降脂藥，存在嚴重的橫紋肌溶解等副作用，不適用于PI類藥物副作用的預防，故國內外尚無有效的方法應對這一副作用的發(fā)生。我國幾千味傳統(tǒng)的天然藥物歷經數(shù)千年臨床，為尋找有效預防藥物提供了豐富的藥源，因此從天然，傳統(tǒng)藥物中篩選治療或輔助治療愛滋病的藥物不僅是可行的，而且是經濟的。
雙黃連制劑是我國的傳統(tǒng)中藥，其主要成分為金銀花、黃芩、連翹，具有較強的抗菌和抗病毒作用，臨床主要用于急性上呼吸道感染、皰疹性咽峽炎、急性喉炎、急性扁桃體炎、急性支氣管炎和肺炎的治療，但雙黃連防治動脈粥樣硬化及PI類藥物引起的動脈粥樣硬化副作用未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明就是針對上述問題提供雙黃連在制備抗動脈粥樣硬化藥物中的應用，用雙黃連制備的抗動脈粥樣硬化的藥物，具有較好的療效，且副作用少。
本發(fā)明提供的技術方案是雙黃連在制備抗動脈粥樣硬化藥物中的應用。以及雙黃連在制備防治PI類藥物引起的動脈粥樣硬化副作用的藥物中的應用。
本發(fā)明可用作抗人或動物的動脈粥樣硬化及防治使用PI類藥物引起的動脈粥樣硬化副作用。本發(fā)明所述藥物可通過口服或靜脈注射給予。本領域技術人員可根據(jù)實際情況容易地確定給藥劑量，一般可按照現(xiàn)有技術中雙黃連制劑的常規(guī)劑量給予；如口服時每天3次，1.6克/次。
具體實施例方式
本發(fā)明通過以下實施例作進一步說明中醫(yī)藥學在抗動脈粥樣硬化方面發(fā)揮著重要作用，具有毒副作用小、療效確切等特點。本發(fā)明選擇金銀花、黃芩、連翹的復方提取物雙黃連作為抗動脈粥樣硬化藥物，用細胞培養(yǎng)的方法，探討雙黃連對動脈粥樣硬化的影響及藥物作用機制。旨在選擇一種抗動脈粥樣硬化作用強、毒性小的藥物。
本發(fā)明通過細胞水平的研究及建立動脈粥樣硬化模型等技術揭示了雙黃連對動脈粥樣硬化的作用及機制。
本發(fā)明經口及靜脈注射給予雙黃連提取物(提取比例金銀花∶黃芩∶連翹＝1∶1∶2)0.12g(生藥)/kg、0.6g(生藥)/kg、3.0g(生藥)/kg，一天一次，20天后，可使動脈粥樣硬化大鼠斑塊面積/內膜面積(％)、內膜厚度(μm)/中膜厚度(％)顯著降低；使血中甘油三脂、總膽固醇及低密度脂蛋白含量下降，表明雙黃連可治療動脈粥樣硬化。
材料與方法1.實驗材料1.1動物和飼料實驗動物健康大鼠，雌雄各半，體重(200.0±20)g由武漢大學實驗動物中心提供。
飼料基礎飼料由湖北省衛(wèi)生防預站實驗動物中心提供。
高脂飼料膽固醇2％，豬油10％，基礎飼料88％.由湖北省衛(wèi)生防預站實驗動物中心加工完成。
1.2藥品及試劑膽固醇平頂山市東珠牧畜廢品提取有限公司；豬油市購豬肥膘自行熬制；膽固醇試劑盒批號571/010/05，上海申能公司；甘油三脂試劑盒批號130/010/05，上海申能公司；高密度脂蛋白試劑盒批號122R1A，日本第一化學試劑公司；低密度脂蛋白試劑盒批號R201AAD，日本第一化學試劑公司；考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒南京建成生物工程研究所MDA測定試劑盒南京建成生物工程研究所SOD測定試劑盒南京建成生物工程研究所；1.3器材美國雅培AEROSET全自動生化分析儀；JY601電子天平上海?？惦娮觾x器廠；TN-100B型托盤扭力天平上海上平儀器公司；OLYMPUS倒置型系統(tǒng)顯微鏡；WF10X-18MM光學顯微鏡重慶光學儀器廠；TGL-16G離心機上海安亭科技儀器廠2.實驗方法2.1內皮細胞培養(yǎng)及雙黃連作用研究2.1.1建立高脂血清損傷的內皮細胞模型取健康日本大耳白兔6只，每日飼喂高脂飼料(2％膽固醇，10％豬油，88％基礎飼料)，4周后無菌條件下心臟取血5ml，分離血清，合并，56℃水浴30min滅活處理，再以0.45及0.22雙層微孔濾膜過濾后，-30冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 2.1.2細胞培養(yǎng)和傳代將傳代培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞株ECV304培養(yǎng)于含20％小牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。用0.25％胰蛋白酶液與0.02％EDTA(1∶1)消化傳代。接種于100ml培養(yǎng)瓶中，送入5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以備實驗用。
雙黃連，臨用前用無血清培養(yǎng)基稀釋。
2.1.3分組取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。細胞加處理因素前24h更換無血清培養(yǎng)基，使細胞同步化至G1期，然后隨機分6組對照組、高脂血清組、雙黃連組0.004mg/ml組、雙黃連組0.02mg/ml、雙黃連組0.1mg/ml組。其中對照組加無血清DMEM培養(yǎng)基；高脂血清組加含5％高脂血清DMEM培養(yǎng)基。
2.1.4MTT法檢測細胞存活率將生長良好的EVC304細胞制備成5×107個·L-1的細胞懸液，按每孔0.1ml接種于96孔板，37℃，5％CO2溫育24h，無血清同步化處理及分組同上。各組細胞作用24h后，每孔加入20μl MTT(5.0g·L-1)，37℃孵育4h，棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜100μl，充分溶解后于酶標儀上讀取570nm處吸光度值(A570nm)，細胞的存活率按下列公式計算。細胞存活率(％)＝處理組A570nm/對照組A570nm×100％2.1.5MDA和SOD含量測定細胞分組及處理同上。作用24h后棄去上清液，用PBS洗3次后每孔加入0.5ml細胞裂解液(150mmol/L NaCl，150mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，1％TritonX-100)，待細胞充分裂解后，參照MDA和SOD檢測試劑盒說明書測定細胞MDA含量。
2.2雙黃連對高脂動物的影響2.2.1動物以基礎飼料喂養(yǎng)1w，作為適應期。隨機等分為6組正常組、模型組、雙黃連低劑量組(0.12g(生藥)/kg)、雙黃連中劑量組(0.6g(生藥)/kg)雙黃連高劑量組(3.0g(生藥)/kg)和多烯康對照組。正常組喂以基礎飼料100g·只-1·d-1；模型組及其他給藥組喂以高脂飼料20g·100g-1·d-1，給藥組每天經口或注射給予相應劑量的雙黃連藥物，連續(xù)給藥20d。
2.2.2指標的測定2.2.2.1血脂的測定于給藥后20d，將動物禁食不禁水12h，心臟采血，3000rpm·min-1離心10min，取上層血清0.5ml，測定。利用美國雅培AEROSET全自動生化分析儀，分別以氧化酶法測定TG、TC含量，直接測定法測定HDLC、LDLC的含量。
2.2.2.2主動脈斑塊的病變分級動物處死后，立即摘取主動脈(自心臟至髂動脈分叉處)，將其上的脂肪組織剔除，于背側面縱行切開，用10％的甲醛溶液固定，蘇丹IV染色，使斑塊呈紅色，鋪平，照像。圖像分析儀測定斑塊面積及血管內膜總面積，并計算斑塊/血管內膜面積比。
按以下規(guī)定進行分級0級無病變1級病變占1％-25％；2級病變占26％-50％；3級病變占51％-75％；4級病變占76％-100％。
2.2.2.3血清MDA及SOD的測定動物心臟采血，3000rpm·min-1離心10min，取上清，用生理鹽水稀釋5倍，混勻待測。采用MDA試劑盒測定MDA含量及SOD活性。
實驗結果1.雙黃連對高脂血清損傷的內皮細胞細胞存活率的影響高脂血清能顯著降低內皮細胞的細胞存活率(P＜0.01)，雙黃連0.004mg/ml、雙黃連0.02mg/ml、雙黃連組0.1mg/ml三個濃度能不同程度抑制高脂血清引起的細胞存活率的降低(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)。
表.1雙黃連對高脂血清損傷的內皮細胞細胞存活率的影響(x±s，n＝6)

與正常組相比*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比▲P＜0.05，▲▲P＜0.012.雙黃連對高脂血清損傷的內皮細胞MDA和SOD含量的影響高脂血清能顯著升高內皮細胞中MDA的含量(P＜0.01)，SOD含量變化不明顯。雙黃連能能不同程度抑制高脂血清引起的MDA含量的升高，提高血清SOD酶活性。
表.2雙黃連對高脂血清損傷的內皮細胞MDA和SOD的影響(x±s，n＝4)

與正常組相比*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比▲P＜0.05，▲▲P＜0.013.雙黃連對高脂飲食大鼠血脂的影響與正常組相比，模型組甘油三脂(TG)、膽固醇(TC)、低密度脂蛋白LDLC的含量均顯著升高(P＜0.01)，高密度脂蛋白(HDLC)無明顯影響；與模型組相比，雙黃連組和多烯康對照組TC、LDLC的含量均顯著降低(P＜0.01)，對HDLC無明顯影響。
表.3雙黃連對高脂飲食大鼠血脂的影響(x±s，n＝4)

與正常組相比*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比▲P＜0.05，▲▲P＜0.014.雙黃連對高脂致動脈粥樣硬化大鼠主動脈斑塊的病變分級的影響與模型組相比，雙黃連中劑量組斑塊面積/內膜面積(％)、內膜厚度(μm)、內膜厚度/中膜厚度(％)均顯著降低(P＜0.05)，雙黃連高劑量組和多烯康對照組斑塊面積/內膜面積(％)、內膜厚度(μm)、內膜厚度/中膜厚度(％)均顯著降低(P＜0.01)。
表4雙黃連對高脂致動脈粥樣硬化大鼠主動脈斑塊面積/內膜面積(％)、內膜厚度/中膜厚度(％)的影響(x±s，n＝4)

與正常組相比*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比▲P＜0.05，▲▲P＜0.015.雙黃連對高脂致動脈粥樣硬化大鼠血清MDA、SOD的影響與正常組相比，模型組血清中MDA的含量顯著升高(P＜0.01)，SOD活性顯著下降；與模型組相比，AA中、高劑量組血清中MDA的含量均顯著降低(P＜0.05，P＜0.05)，SOD的含量顯著升高(P＜0.05)。
表5雙黃連對高脂致動脈粥樣硬化大鼠血清中MDA、SOD的影響(x±s，n＝4)

與正常組相比**P＜0.01；與模型組相比▲P＜0.05，▲▲P＜0.01實驗結論脂代謝紊亂是促使動脈粥樣硬化發(fā)病的重要因素之一。高脂血癥可致內皮細胞損傷和灶狀脫落，導致血管壁通透性升高，血漿脂蛋白進入內膜，引起巨噬細胞的消除反應和血管平滑肌細胞的增殖，進而形成動脈斑塊。本發(fā)明通過建立高膽固醇飲食誘導兔動脈粥樣硬化模型，觀察雙黃連對動脈粥樣硬化的影響。結果表明，高脂飼料喂養(yǎng)可使大鼠血脂水平均顯著升高，表現(xiàn)明顯的高脂血癥，模型組主動脈管壁病變廣泛，有大量白色脂樣斑塊和脂紋向管腔凸出，并連成片狀。應用雙黃連可使主動脈斑塊面積/內膜面積、內膜厚度和內膜厚度/中膜厚度減少，有效地抑制了動脈粥樣硬化的形成。同時，雙黃連可顯著降低大鼠血清TG、TC、LDL水平，并可延緩高脂引起的主動脈病理改變，表明雙黃連在對高脂引起的動脈粥樣硬化形成過程具有干預效應，通過降低與動脈粥樣硬化發(fā)病呈正相關的血脂成分，從而抑制了動脈粥樣硬化進程。
醫(yī)學研究認為高脂血癥(主要為高膽固醇血癥)是AS病變最重要的原因。內皮細胞損傷(多半是功能性損傷)是AS發(fā)生的啟動步驟，其功能降低主要表現(xiàn)在正常的抗凝、抗細胞粘附和抗氧化機能減弱。高膽固醇血癥對動脈內皮的損傷是通過氧化損傷機制產生的，高膽固醇血癥增加動脈壁細胞內自由基釋放系統(tǒng)的活性，使氧自由基及其它活性氧成分釋放增多，動脈壁的脂質過氧化損傷，導致大量的低密度脂蛋白被氧化；另一方面，高膽固醇血癥又直接損傷動脈壁的抗氧化機能，使動脈壁內的SOD活性降低，導致脂質過氧化物清除障礙，其分解代謝產物MDA含量增加，加重局部血管內皮細胞的病理損傷和血管調節(jié)失常。本發(fā)明表明，雙黃連可減少過氧化脂質的生成，提高SOD酶活性，達到保護內皮功能而表現(xiàn)為抗動脈粥樣硬化作用。
權利要求
1.雙黃連在制備治療動脈粥樣硬化藥物中的應用。
2.雙黃連在制備防治PI類藥物引起的動脈粥樣硬化副作用的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及雙黃連在制備治療動脈粥樣硬化藥物中的應用。以及雙黃連在制備防治PI類藥物引起的動脈粥樣硬化副作用的藥物中的應用。雙黃連可通過調節(jié)血脂、保護內皮細胞達到抗動脈粥樣硬化的作用。用雙黃連制備的抗動脈粥樣硬化的藥物對動脈粥樣硬化具有較好的療效，可以作為抗人或動物的動脈粥樣硬化及防治使用PI類藥物引起的動脈粥樣硬化副作用。
文檔編號A61P9/00GK1813913SQ20051001987
公開日2006年8月9日 申請日期2005年11月24日 優(yōu)先權日2005年11月24日
發(fā)明者丁虹, 周惠萍, 王黎, 馬瑤, 陳俊 申請人:武漢思達創(chuàng)新醫(yī)藥科技有限公司