專利名稱：文蛤溶菌酶基因及其編碼蛋白和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，具體的說是一種文蛤溶菌酶基因及其編碼蛋白和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
溶菌酶能夠催化水解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中N-乙酰葡聚糖和N-乙酰胞壁酸之間的 β-1，4-糖苷鍵，從而導(dǎo)致細(xì)胞的裂解，達(dá)到殺菌的目的。已發(fā)現(xiàn)的溶菌酶分為不同的型，在 動物中存在C型(雞卵清溶菌酶)、G型(鵝卵清溶菌酶)和I型(無脊椎動物型)，其分 布非常廣泛。溶菌酶在生物體免疫防御體系中發(fā)揮作用，尤其對于缺少獲得性免疫的貝類， 在抵御外來細(xì)菌入侵時有著舉足輕重的作用。另外，也有報道指出溶菌酶可以作為貝類的 一種消化酶，通過分解濾食到的細(xì)菌，貝類可以得到自身所需的營養(yǎng)。隨著海水養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)殖環(huán)境的污染、養(yǎng)殖病害頻發(fā)等問題備受人們關(guān)注， 傳統(tǒng)的利用抗生素控制的辦法受到了越來越多的質(zhì)疑，而且也不適用于開放的海水養(yǎng)殖環(huán) 境，開發(fā)新的有效的免疫增強劑就成為亟待解決的問題。來源于水產(chǎn)動物本身的溶菌酶作 為一種天然無毒的酶制劑，為這一問題的解決帶來了曙光，可以作為備選的新型免疫增強 劑。由于人體細(xì)胞沒有細(xì)胞壁成分，溶菌酶對人體沒有毒副作用，對環(huán)境的壓力也遠(yuǎn)小于 抗生素。另外，溶菌酶作為一種天然的免疫增強劑、防腐劑、抗菌劑，已經(jīng)廣泛地被應(yīng)用到食 品、醫(yī)藥衛(wèi)生和飼料行業(yè)中，例如奶粉添加劑、水產(chǎn)品保鮮防腐劑、飼料添加劑、去除原生質(zhì) 層，等等。其應(yīng)用前景非常廣泛。文蛤是一種在沿海和灘涂地區(qū)廣泛分布的雙殼貝類(Wang et al.，1993)。在我國 沿海，文蛤作為一種重要的經(jīng)濟(jì)貝類而被廣泛養(yǎng)殖(Liu et al.，2006)。目前，還沒有從文 蛤中獲得溶菌酶基因的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種文蛤溶菌酶基因及其編碼蛋白和應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為文蛤I型溶菌酶基因，其是從文蛤中克隆得到的溶菌酶的cDNA序列，該序列全長 552bp，其中完整閱讀框441bp，5'非編碼區(qū)15bp，3，非翻譯區(qū)96bp，有多聚賴氨酸加尾信 號(AATAA)和多聚賴氨酸尾巴。該基因在文蛤防御中發(fā)揮著重要作用，具體為序列表SEQ ID NO. 1中堿基序列所示。所得溶菌酶基因利用PGEX-4T-1表達(dá)載體在大腸桿菌BL21中重 組表達(dá)了該蛋白，表達(dá)產(chǎn)物具有抑菌活性。其編碼的蛋白具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，完整編碼蛋白含有146個氨 基酸，其中編碼序列的1-15個氨基酸為信號肽序列，成熟肽包括131個氨基酸，其中含有14 個半胱氨酸，預(yù)測分子量為14. 6kDa。成熟肽具有典型的失穩(wěn)酶超家族結(jié)構(gòu)域(Destabilase superfamily)。本發(fā)明利用構(gòu)建cDNA文庫，采用RACE技術(shù)以及體外重組表達(dá)技術(shù)，克隆到溶菌 酶基因cDNA全長序列。通過PCR技術(shù)，擴(kuò)增編碼溶菌酶成熟肽的基因片斷并將其克隆到PGEX-4T-1表達(dá)載體中，在大腸桿菌中重組表達(dá)了該蛋白。重組產(chǎn)物經(jīng)過GSTrap FF親和柱 純化以及凝血酶切掉GST融合蛋白后，獲得了溶菌酶重組蛋白，經(jīng)檢測此重組蛋白具有較 高的抑菌活性，能起到天然蛋白的功能，具有大規(guī)模生產(chǎn)的可能，可以彌補天然蛋白量低以 致難以滿足需要的局限。


圖1為本發(fā)明實施例純化的文蛤溶菌酶重組蛋白，其中M 蛋白marker ;1 帶有 GST標(biāo)簽的文蛤溶菌酶重組蛋白；2 用凝血酶切下的GST標(biāo)簽蛋白；3 切掉GST標(biāo)簽的文蛤 溶菌酶重組蛋白。圖2為本發(fā)明實施例獲得文蛤溶菌酶重組蛋白對藤黃微球菌(革蘭氏陽性菌)的 抑菌效果圖。圖3為本發(fā)明實施例獲得文蛤溶菌酶重組蛋白對銅綠假單胞菌(革蘭氏陰性菌) 的抑菌效果圖。
具體實施例方式下面的實施例中將本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明不限于此。實施例1.一種克隆得到的文蛤溶菌酶基因，具有SEQ ID NO. 1所示的序列。本發(fā)明中的文蛤溶菌酶的cDNA序列克隆包括下列步驟a)文蛤總RNA的提取及mRNA的純化；b)文蛤cDNA文庫構(gòu)建；c)文蛤cDNA文庫EST序列的大規(guī)模測定；d)文蛤EST序列的同源性分析及溶菌酶基因片段的篩選；e) RACE擴(kuò)增獲得文蛤溶菌酶的全序列以及全序列的驗證。具體操作如下1.文蛤總RNA的提取及mRNA的純化利用Invitrogen公司的Trizol試劑從文 蛤幼蟲中提取總RNA，利用QIAGENE公司的OligotexmRNA純化試劑盒純化mRNA。2.文蛤 cDNA 文庫構(gòu)建利用 Stratagene 公司 cDNA Synthesis Kit 和 ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene)進(jìn)行 cDNA 的合成，雙鏈 cDNA 經(jīng)末端補平、EcoR I接頭連接、EcoR I末端磷酸化、Xho I內(nèi)切酶酶切后利用QIAGEN公司QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit對大于IOObp的酶切片段進(jìn)行回收，與Invitrogen公司Uni-ZAP XR vector 載體連接，利用 Stratagene 公司的ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit試劑盒進(jìn)行文庫包裝，利用Exassist Helper Phage和SOLR菌株從Uni-ZAP XR Vector上體外切割pBluescript成為質(zhì)粒文庫。3.文蛤cDNA文庫EST序列的大規(guī)模測定文庫中篩選陽性克隆，使用載體通用引 物T3在MegaBACElOOO測序儀上進(jìn)行序列測定，將得到的原始峰圖文件(*. abi，abd文 件)數(shù)據(jù)經(jīng)Phred程序處理轉(zhuǎn)化為序列文件(*. seq)和質(zhì)量文件(*. seq. qual)，依據(jù)質(zhì)量 文件提供的數(shù)值確定獲得序列的誤差概率，去除低質(zhì)量的堿基，用cross-mach程序屏蔽數(shù) 據(jù)中的載體序列，從得到的數(shù)據(jù)中選取連續(xù)堿基質(zhì)量大于Q13(準(zhǔn)確率大于95% )且長度大于IOObp的序列作為EST數(shù)據(jù)，具體《基因表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)分析手冊》(胡松年 著，浙江大學(xué)出版社，2005年)。4.文蛤EST序列的同源性分析及溶菌酶基因片段的篩選將獲得的全部有 效的EST數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類拼接，生成Contigs和Singletons，分別將所獲的Contigs與 Singletons在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTn和BLASTx分析，結(jié)果顯示在EST序列中發(fā)現(xiàn)了與菲 律賓給仔(Venerupis philippinarum)，紫貝臺貝(Mytilusgalloprovincialis)禾口長牡販 (Crassostrea gigas)溶菌酶相似性較高的序列，根據(jù)相似性分析結(jié)果確定了文蛤溶菌酶 基因的EST序列。5.文蛤溶菌酶基因cDNA全長序列的克隆根據(jù)與溶菌酶基因同源的EST序列設(shè) 計特異性引物Fl和R1，分別利用載體通用引物T3和T7進(jìn)行3’和5’末端的擴(kuò)增。PCR產(chǎn) 物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，用膠回收試劑盒(Promega，USA)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回 收和純化，再與PMD-18T載體(大連寶生物工程有限公司)連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài) 細(xì)胞ToplO，挑選陽性克隆用載體引物M13-47和M13-48進(jìn)行測序，所得結(jié)果經(jīng)BioEdit軟 件拼接，得到文蛤溶菌酶全長序列見SEQ ID NO. 1。所使用的引物序列如下Fl 5’ GCA ACA TGG ACG AGG GAA CGC TT 3'Rl :5，CCA CAG TCA GTC CAG TAT GGT TCC 3，T3 5' ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA 3'T7 :5， TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3，6.文蛤溶菌酶基因cDNA全長的驗證在測序拼接的溶菌酶全長序列上設(shè)計一對 引物F2和R2以cDNA為模板進(jìn)行全長的驗證。測序以及分析同5.。所使用的引物序列如 下F2 5' ACC GGC ATG ATC AGT TTA ATT G 3'R2 5' AGG AAT GTT ATG TTT ATA CCA T 3'3’ RACE擴(kuò)增所用反應(yīng)體系及反應(yīng)條件25 μ 1反應(yīng)體系，包含
滅菌超純水17. 25 μ 1
cDNA文庫模板1 μ 1
IOXbuffer2. 5μ 1
MgCl2 (25mM)1. 5μ 1
dNTP(IOmM)0. 5μ 1
Fl(IOyM)1 μ 1
Τ7(10μΜ)1 μ 1
Taq DNA Polymerase(5u/μ 1)0. 25 μ 1
擴(kuò)增所用PCR反應(yīng)程序941變性41^11，1個循環(huán)；94°C變性50s，57. 5°C退火50s，72°C延伸Imin, 35個循環(huán)；72°C延伸IOmin, 1個循環(huán)。
5’ RACE擴(kuò)增所用反應(yīng)體系及反應(yīng)條件
25 μ 1反應(yīng)體系，包含
滅菌超純水17. 25 μ 1
cDNA文庫模板1 μ 1
IOXbuffer2. 5μ 1
MgCl2 (25mM)1. 5μ 1
dNTP(IOmM)0. 5μ 1
引物 Rl (10 μ Μ)1 μ 1
引物 Τ3 (10 μ Μ)1 μ 1
Taq DNA Polymerase(5u/'μ 1)0. 25 μ 1
擴(kuò)增所用PCR反應(yīng)程序94°C變性4min，1個循環(huán)；94°C變性50s，54°C退火50s，72°C延伸lmin, 35個循環(huán)；72°C延伸IOmin, 1個循環(huán)；4°C保溫。
全長驗證的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為
25 μ 1反應(yīng)體系，包含
滅菌超純水17. 25 μ 1
cDNA文庫模板1 μ 1
IOXbuffer2. 5μ 1
MgCl2 (25mM)1. 5μ 1
dNTP(IOmM)0. 5μ 1
引物 F2 (10 μ Μ)1 μ 1
引物 R2 (10 μ Μ)1 μ 1
Taq DNA Polymerase(5u/'μ 1)0. 25 μ 1
擴(kuò)增所用PCR反應(yīng)程序941變性41^11，1個循環(huán)；94°C變性50s，47. 5°C退火50s，
72°C延伸lmin, 35個循環(huán)；72°C延伸IOmin, 1個循環(huán)。實施例2.文蛤溶菌酶重組蛋白的獲得具體操作如下根據(jù)SEQ ID NO. 2對應(yīng)的cDNA序列，設(shè)計含有限制性內(nèi)切酶BamH I和Sa II酶 切位點的特異性引物L(fēng)YBamH I-F和LYSal I-R，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增編碼溶菌酶成熟肽的基 因片段，然后通過酶切將其克隆到PGEX-4T-1表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，測序確認(rèn)表 達(dá)框正確后，接種陽性克隆到含有氨芐青霉素(100mg/ml)的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至 0. D. 600 = 0. 4-0. 6，加入IPTG至終濃度為ImM誘導(dǎo)4小時后離心收集菌體。菌體在冰浴條 件下用超聲波200W處理30-60分鐘(每次1秒，間隔1秒)。離心去掉上清，沉淀(含有 重組蛋白包涵體)用Buffer A洗3次，Buffer B洗3次，然后加入10_20ml Buffer C在 37度搖床中震蕩20-30min，溶解沉淀，將其轉(zhuǎn)移到透析袋中，4度條件下，在梯度尿素透析 液(透析液中分別含4M，2M，0M尿素)中透析，使重組蛋白復(fù)性。利用GE公司的GSTrap FF 親和柱純化重組產(chǎn)物。最后用凝血酶切掉重組產(chǎn)物中帶有的GST融合蛋白標(biāo)簽，得到文蛤 溶菌酶的重組蛋白，參見圖1。利用Bio-Rad公司試劑盒采用Bradford檢測原理測得文蛤 溶菌酶重組蛋白溶液的濃度為0. 2-0. 3μ g/μ 1。擴(kuò)增所使用的引物序列如下LYBamH I-F 5 ’ AGCGGATCCGCCAGCGTAGAGAAGAGAG 3 ’LYSal I-R :5’ CGCGTCGACTTAATGAACATTACTGCATC 3’反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5分鐘；然后進(jìn)行35循環(huán)包含94°C變性30秒，60°C退火 30秒，72°C延伸30秒；最后72°C延伸10分鐘。反應(yīng)體系與實施例1中各PCR反應(yīng)體系中 的組成及含量相同，區(qū)別之處僅是引物的設(shè)計不同。所用的溶液的組成
Buffer A :50mM Tris_HCl，5mM EDTA，0. 1% TritonX-100 ；Buffer B :50mM Tris_HCl，5mM EDTA, 2M 尿素；Buffer C : IOOmM Tris-HCl, IOmM DTT，8M 尿素；透析液100mMTris_HCl，5mM EDTA，5mM 半胱氨酸。實施例3.文蛤溶菌酶重組蛋白的體外抑菌實驗通過檢測對藤黃微球菌(革蘭氏陽性菌)和銅綠假單胞菌(革蘭氏陰性菌)的抑 菌圈的大小來檢測重組蛋白的溶菌活性。具體操作如下采用經(jīng)典的牛津杯抑菌實驗步驟。將藤黃微球菌和銅綠假單胞菌分別加入未溶的 固體培養(yǎng)基混勻后倒平板，菌體濃度控制在IO5-IO6CFU/μ 1培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基凝固之后，在 平板表面放上6個牛津杯。牛津杯中所加溶液如下1號牛津杯100 μ 1濃度為0. 3 μ g/ μ 1的溶菌酶(商品化的雞蛋清溶菌酶)2號牛津杯100 μ 1濃度為0. 3 μ g/ μ 1的溶菌酶(商品化的雞蛋清溶菌酶)，并且其中含有40mM的EDTA · 2Na3號牛津杯100 μ 1切掉GST的溶菌酶重組蛋白(濃度約為0. 2-0. 3 μ g/ μ 1)4號牛津杯100 μ 1切掉GST的溶菌酶重組蛋白(濃度約為0. 2-0. 3 μ g/ μ 1)，并且其中含有40mM的EDTA · 2Na5號牛津杯200 μ 1切掉GST的溶菌酶重組蛋白(濃度約為0. 2-0. 3 μ g/ul)6號牛津杯(陰性對照)純化蛋白時用的洗脫液，即溶菌酶重組蛋白的溶解液加好樣品之后，將平板放入37度培養(yǎng)箱24小時，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑(d)。如附圖2所示，藤黃微球菌(革蘭氏陽性菌)各抑菌圈的直徑大小如下1 號牛津杯d = 26. Omm2 號牛津杯d = 36. Omm3 號牛津杯d = 21. Omm4 號牛津杯d = 34. 5mm5 號牛津杯d = 22. 5mm6號牛津杯無抑菌圈如附圖3所示，銅綠假單胞菌(革蘭氏陰性菌)各抑菌圈的直徑大小如下1 號牛津杯d = 11. Omm2 號牛津杯d = 17. Omm3 號牛津杯d = 13. 2mm4 號牛津杯d = 19. Omm5 號牛津杯d = 15. 2mm6號牛津杯無抑菌圈抑菌結(jié)果說明1.文蛤溶菌酶重組蛋白對革蘭氏陽性菌藤黃微球菌具有顯著的抑菌效果。2.文蛤溶菌酶重組蛋白對革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌具有一定的抑菌效果，低于 對藤黃微球菌的抑菌效果。
3.相比同樣濃度的商品化雞蛋清溶菌酶，文蛤溶菌酶重組蛋白具有相似的溶菌效 果，即所得的重組溶菌酶蛋白的活性很高，與天然雞蛋清溶菌酶效果類似。4.加入一定量的EDTA *2Na有助于增強抑菌效果，尤其對于革蘭氏陰性菌，因此如 果應(yīng)用此重組溶菌酶作用革蘭氏陰性菌，可以配合EDTA · 2Na使用，效果更佳。5.保持重組溶菌酶的濃度不變，只是加大量，并不能明顯增強抑菌效果，抑菌效果 與重組溶菌酶的濃度有關(guān)。6.陰性對照沒有抑菌圈形成，說明所顯示的抑菌效果完全出于文蛤溶菌酶重組蛋 白的作用。實施例4.文蛤溶菌酶重組蛋白的溶菌活性定量利用南京建成生物有限公司生產(chǎn)的溶菌酶檢測試劑盒，對所得的文蛤溶菌酶重組 蛋白的溶菌活性進(jìn)行定量。其原理是利用溶菌酶能夠溶解細(xì)菌細(xì)胞壁而使細(xì)菌裂解，從而 使細(xì)菌溶液的透光度增大，通過比較待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶菌酶溶液對細(xì)菌溶液透光度的影 響，來定量計算出待測樣品中溶菌酶的濃度。詳細(xì)方法參照其說明書中空白對照法進(jìn)行測定。方法及結(jié)果如下樣品包括空白(蒸餾水)、標(biāo)準(zhǔn)溶菌酶溶液(0.01yg/yl即0.2U/yl)、陰性對 照(純化蛋白時用的洗脫液，即文蛤溶菌酶重組蛋白的溶解液，其中除了緩沖液成分以外， 還包括20mM的還原型谷胱甘肽和0. 02U/ μ 1的凝血酶)、切掉GST的文蛤溶菌酶重組蛋白 10倍稀釋液。在500μ 1的以上樣品中各加入5ml的微球菌菌液，37度水浴15分鐘，之后 立即冰上放置3分鐘，然后測在530nm下的吸光度，重復(fù)三次，取平均值。平均值如下0.D.530空白管0.04850標(biāo)準(zhǔn)管0.02500陰性對照管0.04525待測樣品管0.02150根據(jù)說明書上的計算公式溶菌酶含量(μ g/μ 1)=(測定管透光度-空白管透光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管透光度-空 白管透光度)X標(biāo)準(zhǔn)管濃度(0.01yg/yl即0. 2U/yl)X樣本測試前稀釋倍數(shù)得出文 蛤溶菌酶重組蛋白10倍稀釋液所表現(xiàn)出的活性溶菌酶的濃度約為0.0115 μ g/μ 即 0. 2297872υ/μ 1，也就是說得到的文蛤溶菌酶重組蛋白原液的溶菌酶濃度約為0. 115 μ g/ μ 1 (2· 297872υ/μ 1)。濃度測定結(jié)果說明1.得到的文蛤溶菌酶重組蛋白是有活性的，且活性較高。濃度約為0. 2-0. 3 Ug/ μ ι的文蛤溶菌酶重組蛋白經(jīng)試劑盒檢測所得到的活性溶菌酶濃度約為ο. ι 5μ g/ui即 2. 297872U/y 1。2.陰性對照管的透光度(0.04525)與空白管的透光度(0.04850)相似，說明所得 到的溶菌酶活性全部來自于文蛤溶菌酶重組蛋白。
權(quán)利要求
一種文蛤溶菌酶基因，其特征在于文蛤溶菌酶基因的cDNA序列為序列表SEQ ID NO 1中所示的核苷酸序列。
2.一種按權(quán)利要求1所述的文蛤溶菌酶基因的編碼蛋白，其特征在于所述文蛤溶菌 酶基因的cDNA序列所編碼的蛋白為序列表SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列。
3.一種按權(quán)利要求1所述的文蛤溶菌酶基因的應(yīng)用，其特征在于文蛤溶菌酶基因的 重組表達(dá)產(chǎn)物可作為殺菌劑及貝類生長的免疫增強劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，具體的說是一種文蛤溶菌酶基因及其編碼蛋白和應(yīng)用。本發(fā)明利用cDNA文庫和RACE技術(shù)從文蛤中擴(kuò)增到文蛤溶菌酶的全cDNA序列552bp，其中完整閱讀框441bp，5′非編碼區(qū)15bp，3’非編碼區(qū)96bp，完整編碼蛋白含有146個氨基酸，其中編碼序列的1-15為信號肽序列，成熟肽包括131個氨基酸，其中含有14個半胱氨酸。根據(jù)所得序列設(shè)計表達(dá)引物，擴(kuò)增全長后經(jīng)酶切連接到表達(dá)載體pGEX-4T-1中，之后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)，然后經(jīng)過GSTrap FF親和柱純化和凝血酶酶切GST后得到重組溶菌酶。本發(fā)明中的溶菌酶，具有廣泛的醫(yī)藥、工業(yè)價值，具有廣闊的應(yīng)用前景，可作為殺菌劑、貝類生長的免疫增強劑及醫(yī)藥、飼料、食品等的添加劑等。
文檔編號C12N9/36GK101921788SQ20101020125
公開日2010年12月22日 申請日期2010年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日
發(fā)明者劉保忠, 岳欣, 王鴻霞, 郇聘 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所