具有增加比例的e1b蛋白質(zhì)的156r剪接同工型的溶瘤腺病毒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及溶瘤腺病毒及其在治療腫瘤性疾病中的用途。更特別地，本發(fā)明涉及 E1B基因的突變，所述突變調(diào)節(jié)該基因的剪接同工型的水平，從而改善溶瘤腺病毒的治療指 數(shù)。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 溶瘤病毒
[0004] 溶瘤病毒療法為用于癌癥治療的新興的治療平臺(tái)。溶瘤病毒為在具有特異性致癌 表型的癌細(xì)胞中選擇性復(fù)制，從而殺死癌細(xì)胞同時(shí)避免殺死正常細(xì)胞的病毒。初步研宄集 中于天然存在的非致病性病毒，然而，這些研宄成果有限。雖然觀察到腫瘤生長(zhǎng)減緩并且正 常組織未受損，但病程未發(fā)生改變。
[0005] 因此，最近的研宄已經(jīng)集中于選擇性地靶向癌細(xì)胞的工程重組病毒。該類工程病 毒的一個(gè)實(shí)例為在病毒基因組的E1B區(qū)突變的腺病毒。
[0006]腺病毒的E1B和d53
[0007] 哺乳動(dòng)物腫瘤抑制蛋白p53的一種功能為介導(dǎo)響應(yīng)于DNA損傷或外源DNA合成的 細(xì)胞周期停滯和/或細(xì)胞凋亡。因此，一些病毒，諸如腺病毒，編碼在受感染細(xì)胞中使P53 失活的蛋白質(zhì)以允許高效的病毒復(fù)制。這些蛋白質(zhì)中的一種蛋白質(zhì)，來(lái)自腺病毒的E1B區(qū) 的55千道爾頓蛋白質(zhì)（E1B-55K或E1B-496R)，結(jié)合于p53,因此引起p53的大量喪失。這 從而防止P53-介導(dǎo)的受感染細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。因此，E1B-496R對(duì)于在含有功能性p53的 細(xì)胞中的腺病毒的復(fù)制而言是必需的。
[0008] 人腫瘤細(xì)胞對(duì)于突變的（如置換、刪除、移碼突變）p53等位基因經(jīng)常為純合或 雜合的，并缺乏對(duì)于正常控制細(xì)胞周期必需的p53功能（Hollstein等人（1991)Science 253:49;Levine等人（1991)Nature;351 (6326) :453-6)。因此，許多瘤細(xì)胞為p53H，因?yàn)?它們?nèi)狈ψ銐蛩降腜53和/或因?yàn)樗鼈儽磉_(dá)突變形式的p53,所述突變形式不能夠發(fā)揮基 本的P53功能。
[0009]E1B突變的腺病毒
[0010] 利用瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間的P53功能性差異已經(jīng)對(duì)溶瘤腺病毒進(jìn)行工程改造。 通過(guò)使E1B-496R蛋白質(zhì)突變以除去與p53的結(jié)合相互作用或通過(guò)在E1B基因座內(nèi)做出各 種刪除（參見，例如US5, 677, 178)，所得腺病毒可復(fù)制并最終裂解基本上缺乏p53功能的癌 細(xì)胞，但在具有正常P53功能的細(xì)胞中并不發(fā)生裂解。
[0011] 一個(gè)實(shí)例為0NYX-015 (最初命名為dl1520并且也稱為H101)，一種不表達(dá) E1B-496R蛋白質(zhì)的突變腺病毒（Heise等人（1997)Nat.Med. 3(6):639-645)。病毒在翻譯 起始密碼子之后立即含有終止密碼子并且也具有大量缺失的E1B-496R編碼序列。結(jié)果該 病毒缺乏結(jié)合P53并使p53失活的能力，因此僅可在p53功能缺陷的細(xì)胞（諸如瘤細(xì)胞和 腫瘤）中高效地復(fù)制。不幸的是，E1B-496R發(fā)揮除了結(jié)合p53并使p53失活以外的其它功 能（Eager等人（2001)CancerGeneTher. 18 (5): 305-317)。因此，0NYX-015 病毒在病毒晚 期mRNA的細(xì)胞質(zhì)積聚、宿主細(xì)胞關(guān)閉以及晚期mRNA的翻譯中存在缺陷。因此，ONYX-015中 的突變降低突變病毒在腫瘤細(xì)胞中自身繁殖的能力。另外的問(wèn)題為大量缺失使病毒基因組 不穩(wěn)定。
[0012] 另外的實(shí)例為0NYX-051和0NYX-053,它們?yōu)樵贓1B-496R蛋白質(zhì)中含有點(diǎn)突變 (分別為R240A和H260A)而防止結(jié)合于p53的突變腺病毒。這些突變使病毒能夠在p53功能 有缺陷的細(xì)胞中選擇性復(fù)制，而不會(huì)降低病毒在這些細(xì)胞中復(fù)制的能力（Shen等人（2001) J.Virol. 75 (9) : 4297-4307 和US7, 785, 887)。
[0013] 然而，仍迫切需要改進(jìn)的突變病毒，其溶瘤能力已經(jīng)得到增強(qiáng)并且可用于癌癥的 治療。
[0014] 發(fā)明的公開內(nèi)容
[0015] 本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)節(jié)E1B基因表達(dá)的E1B基因產(chǎn)物的剪接同工型的水平和 類型，此類病毒的溶瘤活性可得到增強(qiáng)。因此，本發(fā)明的第一方面提供了重組腺病毒，在所 述重組腺病毒中E1B-156R同工型的比例相對(duì)于野生型水平有所增加，其中腺病毒在癌細(xì) 胞中具有溶瘤作用。重組腺病毒可以攜帶突變，如此E1B-156R同工型的比例相對(duì)于野生型 水平有所增加，使得腺病毒在癌細(xì)胞中具有溶瘤作用。突變可以在腺病毒的E1B基因的序 列中。因此，根據(jù)本發(fā)明的病毒在非瘤細(xì)胞中為復(fù)制受抑制的，但能夠在瘤細(xì)胞（包括基本 上缺乏功能性P53的瘤細(xì)胞）中表達(dá)復(fù)制表型。
[0016] 在本文描述的腺病毒的特異性實(shí)例中，E1B-156R的過(guò)表達(dá)被認(rèn)為是由在腺病毒的 E1B基因中突變的93R剪接位點(diǎn)引起的失衡。156R能夠補(bǔ)足某些496R功能，但并非對(duì)腫瘤 選擇性（oncoselectivity)必需的功能。與現(xiàn)有技術(shù)相似類型的病毒相比，根據(jù)本發(fā)明的 病毒包括較好的體內(nèi)功效的功能性E3B區(qū)。例如，Onyx-015缺乏E3B。事實(shí)上，Onyx-015病毒 及其選擇性在所有方面遠(yuǎn)不如根據(jù)本發(fā)明的病毒。此外，發(fā)明人已經(jīng)在正常細(xì)胞中測(cè)試根 據(jù)本發(fā)明制備的病毒，結(jié)果顯示病毒具有顯著的安全概況，特別是與已知的病毒Onyx-015 相比較。
[0017] 本文中，術(shù)語(yǔ)"復(fù)制受抑制的病毒"或"復(fù)制缺陷的"是指在轉(zhuǎn)化成癌癥狀態(tài)或瘤狀 態(tài)的預(yù)定的細(xì)胞群中優(yōu)先地抑制細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的病毒。此類病毒在特征為非復(fù) 制的、非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的包含正常的P53功能水平的細(xì)胞中基本上不能抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo) 細(xì)胞凋亡或表達(dá)復(fù)制表型。此類轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以基本上缺乏P53功能，所述缺乏支持病毒復(fù) 制表型的表達(dá)。然而，根據(jù)本發(fā)明的病毒對(duì)瘤組織的選擇性可能比僅為P53狀態(tài)更廣泛；像 這樣的轉(zhuǎn)化狀態(tài)可能為選擇的基礎(chǔ)。例如，已經(jīng)表明用0NYX-015病毒觀察到的溶瘤選擇性 可能是由于一些癌細(xì)胞系支持晚期病毒RNA從細(xì)胞核輸出的能力（在正常細(xì)胞中0NYX-015 由于E1B-496R缺失而喪失的功能）。相似的機(jī)制可以在本發(fā)明的重組腺病毒中操作，所述 重組腺病毒具有降低水平的E1B-496R蛋白質(zhì)。本發(fā)明的重組腺病毒中E1B-156R水平的增 加如何導(dǎo)致溶瘤選擇性還未完全清楚。
[0018] 通常，根據(jù)本發(fā)明的復(fù)制受抑制的病毒在包含正常的p53功能的細(xì)胞上的噬斑 效率顯示出顯著減少（針對(duì)合適的測(cè)定，參見Wang，Y.，G.Hallden等人（2003).〃E3gene manipulationsaffectoncolyticadenovirusactivityinimmunocompetenttumor models."Naturebiotechnology21 (11): 1328-1335) ^ 可以使用的合適測(cè)定的另一實(shí)例為 使用例如四唑鑰染料諸如MTT、XTT、MTS或WST進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定以測(cè)量活細(xì)胞的喪失（參 見Berridge等人，Biotechnology Annual Review, 11:127-152 (2005)。
[0019] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"復(fù)制表型"是指被病毒諸如復(fù)制受抑制的腺病毒感染的細(xì)胞的 以下表型特征中的一種或多種：（1)晚期基因產(chǎn)物，諸如衣殼蛋白（如，腺病毒的五鄰體基 質(zhì)多肽）或由病毒晚期基因啟動(dòng)子起始的RNA轉(zhuǎn)錄物的顯著表達(dá)；（2)病毒基因組的復(fù)制 或復(fù)制中間體的形成；（3)病毒衣殼或包裝的病毒體顆粒的裝配；(4)在受感染細(xì)胞中細(xì)胞 病變效應(yīng)（CPE)的出現(xiàn)；（5)病毒裂解周期的完成；以及（6)其它表型改變，在感染有編碼 功能性癌蛋白的野生型復(fù)制-感受態(tài)DNA病毒的非瘤細(xì)胞中p53功能喪失后，所述表型改 變通常為偶然的。根據(jù)本發(fā)明的復(fù)制表型包括至少一種上文列出的表型特征，優(yōu)選多于一 種表型特征，諸如2、3、4、5、6或更多種特征。
[0020] 測(cè)量這些表型的技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將為已知的。例如，評(píng)價(jià)CPE出現(xiàn)的方法 在本文的實(shí)施例中進(jìn)行了描述并使用50%的組織培養(yǎng)感染劑量（TCIDJ以及噬斑形成單 位（pfu) /細(xì)胞的數(shù)目（在感染日的細(xì)胞計(jì)數(shù)）進(jìn)行評(píng)估。
[0021] 術(shù)語(yǔ)"瘤細(xì)胞"是指顯示出相對(duì)自發(fā)性生長(zhǎng)，使得它們顯示出特征為細(xì)胞增殖顯著 失控的異常生長(zhǎng)表型的細(xì)胞。瘤細(xì)胞包括可以活性復(fù)制或處于暫時(shí)非復(fù)制休止態(tài)（G1或 G0)的細(xì)胞；相似地，瘤細(xì)胞可以包括具有分化良好表型的細(xì)胞、低分化表型的細(xì)胞或兩種 類型的細(xì)胞的混合物。因此，并非所有瘤細(xì)胞在給定的時(shí)間點(diǎn)處必定復(fù)制細(xì)胞。于此定義 為瘤細(xì)胞的細(xì)胞組由在良性腫瘤中的細(xì)胞以及在惡性（或浸潤(rùn)性（frank))腫瘤中的細(xì)胞 組成。浸潤(rùn)性瘤細(xì)胞經(jīng)常被稱為癌癥，如果源于內(nèi)胚層的或外胚層的組織學(xué)起源的細(xì)胞，則 通常為癌，或如果源于衍生自中胚層的細(xì)胞類型，則通常為肉瘤。術(shù)語(yǔ)瘤細(xì)胞和癌細(xì)胞在本 文中可互換地使用。
[0022] 于此，術(shù)語(yǔ)"p53功能"是指具有基本上正常水平的由p53基因編碼的多肽的性 質(zhì)（即，相對(duì)于相同組織學(xué)類型的非瘤細(xì)胞），其中P53多肽能夠結(jié)合于野生型腺病毒 E1B-49