以及內(nèi)部聚丙氨 酸片段的長度中存在不同。因此，完全預料到的是本文在血清型Ad2和Ad5中證明的結(jié)果 將反映在其它腺病毒變體。
[0039] 已經(jīng)進行了許多互補實驗以顯示E1B-156R的增加是已經(jīng)觀察到的溶瘤指數(shù)（01) 增加的原因（至少部分），使得Ad5-156R的過表達通常使腺病毒的01產(chǎn)生有效的增加。在 本文的圖11A、B和C以及圖12中，顯示5型腺病毒E1B-156R為亞科C組中01的有效增強 劑。此外，顯示來自Ad2wt的E1B-156R等效物對Ad5wt的01具有積極效果，這意指出現(xiàn)的 效果不應限制為一種特定的腺病毒血清型。
[0040] 于此，人Ad5的E1B-156R同工型具有根據(jù)SEQIDN0:2的多核苷酸序列以及根 據(jù)SEQIDN0:3的多肽序列。于此，496R同工型具有根據(jù)SEQIDN0:4的多核苷酸序列以 及根據(jù)SEQIDN0:5的多肽序列。于此，E1B-93R同工型具有根據(jù)SEQIDN0:6的多核苷 酸序列以及根據(jù)SEQIDN0:7的多肽序列。于此，E1B-84R同工型具有根據(jù)SEQIDN0:8 的多核苷酸序列以及根據(jù)SEQIDN0:9的多肽序列。技術(shù)人員讀者應理解序列中一定程 度的變異在天然存在的病毒變體中存在；因此，本發(fā)明包括與在有關(guān)提及的參考序列中列 出的特異性序列不同，但與那些序列具有80%、85%、90%、95%、98%、99%或更多同源性 或同一性的同工型序列，如通過常見的序列比對程序，例如，BLAST(http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi)計算，所述序列比對程序可為核苷酸BLAST(blastn)或蛋白質(zhì) BLAST(blastp)。如果序列中的一者與其它序列具有足夠高程度的同一性或相似性，則兩個 序列被認為是"同源的"，如本文使用的術(shù)語。"同一性"指示在比對的序列的任何特定位置 處，序列之間的核苷酸為同一的。"相似性"指示在比對的多肽序列的任何特定位置處，序列 之間的氨基酸殘基為相似的類型?？扇菀椎赜嬎阃?,性和相似性的程度（Computational MolecularBiology,Lesk，A.M編輯，OxfordUniversityPress，NewYork, 1988; Biocomputing.InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W編輯，AcademicPress,New York, 1993；ComputerAnalysisofSequenceData,Part1，Griffin,A.M和Griffin,H.G 編輯，HumanaPress,NewJersey, 1994；SequenceAnalysisinMolecularBiology,von Heinje,G. ,AcademicPress, 1987 ；以及SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.和 Devereux,J編輯，MStocktonPress,NewYork, 1991) 〇
[0041] 因此，本發(fā)明的實施方案包括不同的重組腺病毒，其中E1B-156R同工型具有與 SEQIDN0:2具有至少80%的序列同一性的多核苷酸序列以及與SEQIDN0:3具有至少 80%的序列同一性的多肽序列；其中E1B-496R同工型具有與SEQIDN0:4具有至少80% 的序列同一性的多核苷酸序列以及與SEQIDN0:5具有至少80%的序列同一性的多肽序 列；其中E1B-93R同工型具有與SEQIDN0:6具有至少80%的序列同一性的多核苷酸序列 以及與SEQIDN0:7具有至少80%的序列同一性的多肽序列；以及其中E1B-84R同工型具 有與SEQIDN0:8具有至少80 %的序列同一性的多核苷酸序列以及與SEQIDN0:9具有至 少80%的序列同一性的多肽序列。不同的E1B-156R同工型序列的代表性實例在本文給出 (圖13)。包括的與Ad5ElB-156R等效的序列為與圖13中提供的那些序列具有80%、85%、 90%、95%、98%、99%或更多同一性的那些(如hf針對Ad5描沭）。通討工稈學的同工塑 水平的調(diào)節(jié)。
[0042] 根據(jù)本發(fā)明，對由E1B基因表達的E1B基因產(chǎn)物的剪接同工型的水平和/或類型 進行了修飾，結(jié)果為病毒變?yōu)槿芰龅??？梢酝ㄟ^任何方法調(diào)節(jié)E1B同工型的水平和/或類 型，例如使用設(shè)計成在選定位置特異性地切割E1B同工型mRNA的核酶，從而防止mRNA翻譯 成功能性多肽。替代方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將為顯而易見的并且包括多拷貝的E1B基 因序列或編碼E1B-156R的形式的插入；調(diào)節(jié)E1B基因表達或編碼E1B-156R的形式的活化， 例如通過調(diào)節(jié)啟動子或增強子序列；調(diào)控序列的插入等。
[0043] 于此，我們以根據(jù)本發(fā)明的不同的腺病毒的特定的實例提供了在實現(xiàn)效果的E1B 基因的剪接區(qū)域中包括一個或多個突變的腺病毒。因為剪接體對剪接位點識別受到mRNA二級結(jié)構(gòu)的影響為已知的，所以影響其mRNA的二級結(jié)構(gòu)的E1B基因的突變也可以調(diào)節(jié)E1B 同工型的水平和類型。例如，突變可以通過改變E1B基因的多核苷酸的多肽序列而除去剪 接位點；或可以通過改變E1B基因的多核苷酸序列并保留原始的多肽序列而除去剪接位 點。
[0044] 在一個實施方案中，當E1B基因在一個或多個剪接識別區(qū)突變時，可以實現(xiàn)該效 果，所述剪接識別區(qū)包括：a)剪接供體位點1(SD1) ;E1B-93R剪接受體（SA1) ;c)E1B-156R剪接受體（SA2) ;d)ElB-84R剪接受體（SA3);和/或e)剪接供體位點2(SD2)。
[0045] 在Ad5的實例情況中，這些剪接位點在以下位置并具有以下序列：SD1在Ad5基因 組的位置 2251-2255 處（Ad5 基因組登錄號AC_000008.1(SEQIDN0:41)的位置 2256-2260 處以及E1B基因（SEQIDNO:l)的位置543-547處）具有序列GTGGC。E1B-93R剪接受 體（SA1)在Ad5基因組的位置3218-3222處（Ad5基因組登錄號AC_000008. 1(SEQID N0:41)的位置3213-3217處以及E1B基因（SEQIDNO: 1)的位置1500-1504處）具有序 列AACAG。E1B-156R剪接受體（SA2)在Ad5基因組的位置3276-3280處（Ad5基因組登錄 號AC_000008.1(SEQIDN0:41)的位置 3271-3275 處以及E1B基因（SEQIDN0:1)的位置 1558-1562處）具有序列ITGAG。E1B-84R剪接受體（SA3)在Ad5基因組的位置3595-3599 處（Ad5基因組登錄號AC_000008. 1(SEQIDN0:41)的位置3590-3594處以及E1B基因（SEQ IDNO: 1)的位置1877-1881處）具有序列TGCAG。剪接供體位點2 (SD2)在Ad5基因組的 位置 3506-3510 處（Ad5 基因組登錄號AC_000008.1(SEQIDN0:41)的位置 3511-3515 處 以及E1B基因（SEQIDNO: 1)的位置1798-1802處）具有序列GTACT。在其它人血清型中 的等效位置的等效位點對灌輸有本發(fā)明教導的本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將為顯而易見的。
[0046] 因此，本發(fā)明的一個方面為重組腺病毒，其中E1B基因剪接識別區(qū)在Ad5基因組 的一個或多個下述位置處為突變的：a)腺病毒Ad5基因組（登錄號AC_000008. 1)(SEQID NO: 41)的核苷酸3216 (E1B基因（SEQIDNO: 1)的位置1503) ;b)腺病毒Ad5基因組（登錄 號AC_000008. 1)(SEQIDN0:41)的核苷酸 3218(E1B基因（SEQIDN0:1)的位置 1505);和 /或c)腺病毒Ad5基因組（登錄號AC_000008. 1)(SEQIDN0:41)的核苷酸3221 (E1B基因 (SEQIDNO: 1)的位置1508)。E1B基因可以含有一個或多個下述突變：a)腺病毒Ad5基因 組的A3216G(E1B基因（SEQIDN0:1)的位置1503處）；b)腺病毒Ad5基因組的G3218A(E1B 基因（SEQIDN0:1)的位置1505);和/或c)在腺病毒Ad5基因組的G3221A(E1B基因（SEQ IDN0:1)的位置1508)。于此，所有點突變的位置根據(jù)Ad5基因組登錄號AC_000008. 1(SEQ IDN0:41)進行編號。
[0047] 下表鑒定了Ad5基因組中E1B基因的剪接識別區(qū)的序列和位置。"Ad 5基因組位 置"和"E1B基因位置"對應于緊挨著剪接供體位點（SD1和SD2)上游的并且緊挨著剪接受 體位點（SA1、SA2和SA3)下游的五個殘基。
[0048]
【主權(quán)項】
1. 重組腺病毒，其中E1B-156R同工型的比例相對于野生型水平有所增加，其中所述腺 病毒在癌細胞中具有溶瘤作用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒，其攜帶突變使得所述E1B-156R同工型的比例相 對于野生型水平有所增加。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的重組腺病