具有腫瘤組織靶向性和抑癌基因修復性的重組溶瘤腺病毒Ad5-P16及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及溶瘤腺病毒領域，具體地指一種具有腫瘤組織靶向性和抑癌基因修復 性的重組溶瘤腺病毒Ad5-P16及其應用。
【背景技術】
[0002] 溶瘤腺病毒能特異性識別腫瘤細胞并具有腫瘤細胞內自我復制能力。其能通過大 量復制直接溶瘤，誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡、自噬、壞死，以及觸發(fā)機體抗腫瘤免疫等多種機 制發(fā)揮抗腫瘤效應，近年來得到了越來越廣泛地關注。2005年，我國SFDA批準了世界上第 一個溶瘤腺病毒HlOl用于鼻咽癌患者的治療，成為全球首個獲批上市的重組溶瘤腺病毒 產(chǎn)品。目前溶瘤腺病毒或攜帶抗癌基因的溶瘤腺病毒產(chǎn)品更多的正在進行臨床前和臨床試 驗，其中包括 0NYX-015、SG500、ZD55-TRAIL 和 ZD55-IL-24 等。
[0003] 目前，重組溶瘤腺病毒主要有這樣幾種方式：
[0004] 1、剔除腺病毒在正常細胞中復制所必須而在腫瘤細胞中不需要的部分。如去除 ElA或ElB的腺病毒只能在Rb或p53信號通路異常的腫瘤細胞內才能增殖，目前已構建對 應的載體delta24和ZD55,并攜帶抗癌基因取得較好研宄效果。
[0005] 2、利用腫瘤特異性啟動子控制病毒復制必須的基因。如利用hTERT啟動子替換 ElA使得外源基因的表達具有腫瘤細胞特異性。
[0006] 3、修飾腺病毒衣殼蛋白，使其表達特異識別腫瘤表面受體的配體蛋白，增強腫瘤 細胞對其特異性識別能力，并增強感染效率。
[0007] 盡管目前溶瘤腺病毒在體外殺傷腫瘤細胞及體內動物腫瘤抑制實驗中均取得了 較好的抗腫瘤效應，但多數(shù)尚在臨床試驗中，并未進入臨床。宄其原因，主要在于以下兩 占 .
[0008] 1.溶瘤腺病毒存在較高的免疫原性，容易被人體免疫系統(tǒng)識別而清除達不到抗癌 效果。研宄表明，去除病毒基因組E3區(qū)可以有效降低腺病毒的免疫原性，保護腺病毒感染 的腫瘤細胞在病毒大量復制前不提前被T細胞識別清除，從而提高了病毒的感染效率。
[0009] 2.腫瘤細胞耐藥耐病毒性，由于腫瘤細胞生長迅速，原始組織功能喪失，細胞內易 發(fā)生變異，導致單一腫瘤殺傷作用無法徹底殺滅腫瘤細胞，從而導致癌癥復發(fā)。研宄表明， 經(jīng)病毒殺傷后，部分殘存的腫瘤細胞可通過上調PLSR1/STING/IR3等信號通路抑制病毒復 制及殺傷作用。解決辦法之一是，利用病毒本身即是一種有效地基因載體，攜帶外源抑癌基 因或癌基因干擾序列，修復腫瘤細胞基因變異，抑制腫瘤細胞生長及誘發(fā)死亡，有效協(xié)同病 毒自身殺傷作用，在耐病毒性突變出現(xiàn)前，徹底殺滅癌細胞。

【發(fā)明內容】

[0010] 本發(fā)明所要解決的技術問題就是提供一種具有腫瘤組織靶向性和抑癌基因修復 性的重組溶瘤腺病毒Ad5-P16及其應用。
[0011] 為解決上述技術問題，本發(fā)明提供的一種具有腫瘤組織靶向性和抑癌基因修復性 的重組溶瘤腺病毒Ad5-P16,所述重組溶瘤腺病毒Ad5-P16全基因組是由P16⑶S基因替換 原溶瘤腺病毒Ad5全基因組上的固有基因 E3gp-19K得到。
[0012] 進一步地，所述P16⑶S基因序列如SEQ ID No. 1所示。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種含有高效表達抗癌基因 P16的重組溶瘤腺病毒Ad5_P16的構 建方法，包括以下步驟：
[0014] 1)以pCMV pl6INK4A為模板，設計含有酶切位點和保護堿基的引物上下游引物PF 和PR，
[0015] PF :ctgatatgcatggagccggcggcggggag，
[0016] PR ：gccgcggccgctcaatcggggatgtctgagg ；
[0017] 2)經(jīng) PCR 得到 P16CDS 序列
[0018] PCR條件為：預變性95°C 5分鐘，變性95°C 30秒，退火58°C 30秒，延伸72°C 30 秒，循環(huán)34次，最后延伸72°C 10分鐘；
[0019] 3)將PCR產(chǎn)物連接入TA載體，挑選單克隆，并鑒定出陽性克隆子；
[0020] 4)然后在E3gp-19K上游啟動子U6前方設計上游引物Pl和E3gp-19K編碼區(qū)終止 密碼子后方設計下游引物P6,分別為：
[0021] Pl:cggaagcttacgtaccggtccaatccgtc，
[0022] P6 ：ggcgaattcaggtcgtaaacgtccacacgt ；
[0023] 并以Ad5腺病毒全基因組為模板，進行PCR ;
[0024] PCR條件為：預變性95°C 5分鐘，變性95°C 30秒，退火58°C 30秒，延伸72°C 30 秒，循環(huán)34次，最后延伸72°C 10分鐘；
[0025] 得到含有E3gp-19K序列的PCR產(chǎn)物；將PCR產(chǎn)物和pUC18載體進行雙酶切， 連接后并轉化大腸桿菌，挑選單克隆后進行酶切與測序鑒定，得到陽性克隆，即構建為 pUC18-E3gp-19K ；
[0026] 5)在E3gp_19K編碼區(qū)初始密碼子前方設計下游以snal酶切位點及其保護堿基為 5 '末端的正向引物 P2 :ctgatatgcatatggacacaaggatgacga，
[0027] 及其反相互補引物 P3 :tcgtcatccttgtgtccatatgcatatcag ;
[0028] 在E3gp-19K編碼區(qū)終止密碼子后方設計下游以notl酶切位點及其保護堿基為5' 末端的正向 P5 引物：gccgcggccgcggggcggaattcgttat，
[0029] 及其反向互補引物 P4 :ataacgaattccgccccgcggccgcggc ;
[0030] 6)以 pUC18-E3gp-19K 為模板，P1、P2 為上下游引物，PCR 得到以 Hindlll/snal 為 首尾的含有E3gp-19K啟動子增強子區(qū)域序列的DNA產(chǎn)物；
[0031] PCR條件為：預變性95°C 5分鐘，變性95°C 30秒，退火55°C 30秒，延伸72°C 30 秒，循環(huán)34次，最后延伸72°C 10分鐘；
[0032] 7)以pUC18-E3gp-19K為模板，P3、P4為上下游引物，PCR得到以snal/notl為首 尾的含有E3gp-19K編碼區(qū)序列的DNA產(chǎn)物；
[0033] PCR條件為：預變性95°C 5分鐘，變性95°C 30秒，退火60°C 30秒，延伸72°C 30 秒，循環(huán)34次，最后延伸72°C 10分鐘；
[0034] 8)以pUC18-E3gp-19K為模板，P5、P6為上下游引物，PCR得到以notl/EcoRI為首 尾的含有E3gp-19K編碼后方3 '無義區(qū)的DNA產(chǎn)物；
[0035] PCR條件為：預變性95°C 5分鐘，變性95°C 30秒，退火58°C 30秒，延伸72°C 30 秒，循環(huán)34次，最后延伸72°C 10分鐘；
[0036] 9)將上述3種DNA產(chǎn)物分別以各自首尾酶切位點的內切酶進行雙酶切，并將 pUC18-E3gp-19K以HindIII及EcoRI進行雙酶切并回收pUC18載體，經(jīng)回收共得到4段兩 端均為粘性末端的DNA片段；
[0037] 10)以連接酶將這4段DNA以Hindlll/snal/notl/EcRI的順序連接成環(huán)，轉入大 腸桿菌并挑選單克隆，經(jīng)過酶切鑒定及測序鑒定得到陽性克隆，即為導入有snal/notl酶 切位點的pUC18-E3gp-19K新序列；
[0038] 11)將P16CDS序列的PCR產(chǎn)物及導入snal/notl酶切位點的pUC18-E3gp-19K新 序列用snal以及notl雙酶切；
[0039] 12)連接酶連接，并轉入大腸桿菌，經(jīng)單克隆篩選、酶切與測序鑒定，陽性克隆即為 含有E3gp-19K啟動增強子及P16CDS序列的pUC18-P16 ;
[0040] 13)將Ad5溶瘤腺病毒及上面得到的pUC18-P16用Pmel酶切，并于BJ5183細胞 內進行同源重組，挑選單克隆，經(jīng)酶切與測序鑒定得到鑒定為陽性的克隆，即為高效表達人 P16基因的重組人溶瘤腺病毒Ad5-P16。
[0041] 本發(fā)明還提供了一種具有腫瘤組織靶向性和抑癌基因修復性的重組溶瘤腺病毒 Ad5-P16在腫瘤細胞內能特異性增殖并殺傷腫瘤細胞及其抗腫瘤的中應用。
[0042] 本發(fā)明的原理
[0043] 1)溶瘤腺病毒除了自身可以通過特