一種耐阿霉素u87細(xì)胞模型及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞模型的建立，具體地說(shuō)，涉及一種耐阿霉素 U87細(xì)胞模型及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腦膠質(zhì)瘤是由于大腦和脊髓膠質(zhì)細(xì)胞癌變所產(chǎn)生的、最常見(jiàn)的原發(fā)性顱腦腫瘤。 年發(fā)病率約為3-8人/10萬(wàn)人口。如同其他腫瘤（疾?。┮粯?，膠質(zhì)瘤也是由于先天的遺 傳高危因素和環(huán)境的致癌因素相互作用所導(dǎo)致的。一些已知的遺傳疾病，例如神經(jīng)纖維瘤 ?。↖型）以及結(jié)核性硬化疾病等，為腦膠質(zhì)瘤的遺傳易感因素。
[0003] 化療藥物阿霉素（DOX)通過(guò)細(xì)胞內(nèi)途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，常用于腦膠質(zhì)瘤的治 療，但易發(fā)生耐藥，而耐藥后再化療效果很差。普通腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株在研宄腦膠質(zhì)瘤耐藥機(jī) 制中存在局限性，而腦膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞株更能從分子生物學(xué)角度來(lái)研宄其耐藥機(jī)制，有助 于進(jìn)一步尋找腦膠質(zhì)瘤耐藥后的治療方法。同時(shí)，腦膠質(zhì)瘤等腫瘤也可導(dǎo)致癲癇發(fā)作，導(dǎo)致 難治性癲癇，腦膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞株也可用于難治性癲癇耐藥的研宄。
[0004] 中國(guó)期刊《中華神經(jīng)外科雜志》2009年4月第25卷第4期，刊出的論文"人神經(jīng) 膠質(zhì)瘤耐阿霉素細(xì)胞株的建立及其耐藥機(jī)制的初步研宄"，選用常用的化療藥物阿霉素和 人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SHG44為研宄對(duì)象，用ADM濃度梯度遞增結(jié)合間歇誘導(dǎo)法建立 多藥耐藥的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SHG44/ADM，并對(duì)SHG44/ADM的耐藥特性及機(jī)制進(jìn)行了初步 研宄，其建立的人神經(jīng)膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞株SHG44/ADM通過(guò)藥敏實(shí)驗(yàn)表明對(duì)ADM的IC50為 17. 83±0. 52,耐藥指數(shù)為10. 7,凍存3個(gè)月、復(fù)蘇后對(duì)ADM耐藥指數(shù)為10. 5,對(duì)耐藥的穩(wěn)定 性無(wú)明顯影響。
[0005] 中國(guó)期刊《中國(guó)臨床神經(jīng)外科雜志》2014年02期，刊出的論文"膠質(zhì)瘤多藥耐藥 細(xì)胞株U251/TMZ的生物學(xué)特性"，探討了膠質(zhì)瘤U25/替莫唑胺（TMZ)多藥耐藥細(xì)胞株的生 物學(xué)特性，采用TMZ間歇濃度梯度遞增法誘導(dǎo)建立膠質(zhì)瘤多藥耐藥細(xì)胞株U251/TMZ，光鏡 觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算倍增時(shí)間，四甲基偶氮唑藍(lán)法檢測(cè)耐藥指數(shù)，流式細(xì)胞儀檢測(cè) 細(xì)胞周期，逆轉(zhuǎn)錄-PCR法檢測(cè)多藥耐藥性I(MDRl)、Bcl-2、多藥耐藥相關(guān)蛋白5 (MRP5)、肺 耐藥相關(guān)蛋白I(LRPl)等mRNA表達(dá)，結(jié)果膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞株U251/TMZ對(duì)TMZ、依托泊苷、 硫酸長(zhǎng)春新堿、環(huán)磷酰胺、阿霉素的耐藥指數(shù)分別為4. 39、3. 61、2. 64、2. 00、1. 63。
[0006] U87細(xì)胞是人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，被用于人腦膠質(zhì)瘤病理機(jī)制的研宄，以及人腦膠質(zhì) 瘤藥物的篩選等。目前還未見(jiàn)耐阿霉素 U87細(xì)胞模型的相關(guān)報(bào)道。而建立更多的耐藥細(xì)胞 模型對(duì)于探討人腦膠質(zhì)瘤耐藥產(chǎn)生原因及其機(jī)制，進(jìn)一步指導(dǎo)對(duì)人腦膠質(zhì)瘤的治療具有重 要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種耐阿霉素 U87細(xì)胞模型。
[0008] 本發(fā)明的再一的目的是，提供所述的耐阿霉素 U87細(xì)胞模型的用途。
[0009] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是，提供所述的耐阿霉素 U87細(xì)胞模型的建立方法。
[0010] 為實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0011] -種耐阿霉素 U87細(xì)胞模型，所述的耐阿霉素 U87細(xì)胞模型的保藏號(hào)為CCTCC C201531。
[0012] 為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0013] 所述的耐阿霉素 U87細(xì)胞模型的用途，用于研宄腦膠質(zhì)瘤耐藥機(jī)制、尋找腦膠質(zhì) 瘤耐藥逆轉(zhuǎn)的靶點(diǎn)、篩選治療腦膠質(zhì)瘤或解除腦膠質(zhì)瘤耐藥的藥物。
[0014] 所述的耐阿霉素 U87細(xì)胞模型的用途，用于腦膠質(zhì)瘤引起的難治性癲癇的機(jī)制研 宄、尋找腦膠質(zhì)瘤引起的癲癇的耐藥逆轉(zhuǎn)靶點(diǎn)、篩選治療腦膠質(zhì)瘤引起的癲癇或解除腦膠 質(zhì)瘤引起的癲癇耐藥的藥物。
[0015] 為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0016] 所述的耐阿霉素 U87細(xì)胞模型的建立方法，它包括以下步驟：
[0017] a)培養(yǎng)U87細(xì)胞；
[0018] b)U87細(xì)胞用阿霉素開(kāi)始干預(yù)，然后換無(wú)阿霉素培養(yǎng)基，至細(xì)胞生長(zhǎng)恢復(fù)正常即細(xì) 胞穩(wěn)定生長(zhǎng)、形態(tài)飽滿、無(wú)漂浮死細(xì)胞、傳代密度為30%的情況下3至5天可長(zhǎng)至90%后再 開(kāi)始正常傳代并提高阿霉素的濃度，每次阿霉素的干預(yù)時(shí)間均為24小時(shí)；
[0019] c)對(duì)干預(yù)后的U87細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，獲得耐阿霉素 U87細(xì)胞模型。
[0020] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0021] 本發(fā)明通過(guò)科學(xué)的方法建立了耐阿霉素 U87細(xì)胞模型，建立細(xì)胞模型的過(guò)程不 是機(jī)械式設(shè)置藥物濃度梯度和定期傳代，最后篩選出存活的細(xì)胞系，而是密切觀測(cè)細(xì)胞生 長(zhǎng)狀態(tài)，待達(dá)到細(xì)胞形態(tài)飽滿，無(wú)漂浮死細(xì)胞，細(xì)胞密度為30 %的情況下3至5天可長(zhǎng)至 90%后再開(kāi)始正常傳代并提高阿霉素的濃度，通過(guò)該方法建立了一株耐阿霉素 U87細(xì)胞模 型，其耐藥系數(shù)均顯著高于現(xiàn)有的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型，且耐藥穩(wěn)定性好，且耐藥性和耐藥穩(wěn) 定性均優(yōu)于相同方法得到的其他耐阿霉素 U87細(xì)胞株。本發(fā)明建立的細(xì)胞模型可用于腦膠 質(zhì)瘤耐藥機(jī)制、腦膠質(zhì)瘤耐藥逆轉(zhuǎn)、預(yù)防腦膠質(zhì)瘤化療耐藥和提高腦膠質(zhì)瘤化療敏感性方 面的研宄，還可用于腦膠質(zhì)瘤引起的難治性癲癇的機(jī)制研宄、尋找癲癇耐藥逆轉(zhuǎn)的靶點(diǎn)、篩 選治療癲癇或解除癲癇耐藥的藥物。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說(shuō)明。
[0023] 實(shí)施例1
[0024] 一、實(shí)驗(yàn)材料
[0025] U87細(xì)胞購(gòu)自中科院。
[0026] 阿霉素（DOX)購(gòu)自凱基生物（中國(guó)，南京）。
[0027] 阿霉素工作液用細(xì)胞培養(yǎng)基（SH30243. 01B+10% FBS，購(gòu)自美國(guó)HyClone公司）配 制。
[0028] 二、實(shí)驗(yàn)方法
[0029] 1)U87 細(xì)胞用 SH30243. 01B+10% FBS+100U/ml 青霉素 +0· lmg/ml 鏈霉素培養(yǎng)。 [0030] 2)用DOX起始濃度為lng/ml開(kāi)始干預(yù)，給予DOX 24小時(shí)后換無(wú)藥培養(yǎng)基 (SH30243. 01B+10% FBS+lOOU/ml 青霉素 +0· lmg/ml 鏈霉素）。
[0031] 3)待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)、形態(tài)飽滿、無(wú)漂浮死細(xì)胞、傳代密度為30%的情況下3至5天 可長(zhǎng)至90 %后再開(kāi)始正常傳代（P)并提高DOX的濃度。
[0032] 母細(xì)胞U87在第5代起（P5)到PlO加 lng/ml DOX干預(yù)，共3次，每次24小時(shí)；在 P6,加 5ng/ml DOX 干預(yù) 2 次；在 P7-P9,加 10ng/ml DOX 干預(yù)，共 3 次；在 P10-P11，加 30ng/ ml DOX 干預(yù)，共 2 次；在 P12-P14,加 50ng/ml DOX 干預(yù)，共 6 次；在 P15-P17,加 100ng/ml DOX干預(yù)，共7次；在P18-P22,加150ng/ml DOX干預(yù)，共8次。細(xì)胞生長(zhǎng)良好，-80°C儲(chǔ)存。
[0033] 細(xì)胞每次干預(yù)24小時(shí)后更換無(wú) DOX培養(yǎng)基，至細(xì)胞生長(zhǎng)恢復(fù)正常（即細(xì)胞穩(wěn)定生 長(zhǎng)、形態(tài)飽滿、無(wú)漂浮死細(xì)胞）后再進(jìn)入下一輪DOX干預(yù)。歷時(shí)5個(gè)月，最終在U87細(xì)胞株 中DOX至150ng/ml，標(biāo)記為人星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87R-D0X。耐藥株建立過(guò)程中U87共傳 19代。該耐藥株已于2015年4月1日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（中國(guó)武漢大學(xué)， 430072)，保藏編號(hào)為CCTCC C201531，培養(yǎng)物名稱為人星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87R-D0X。
[0034] 4)計(jì)算半抑制濃度（IC50)和耐藥系數(shù)（RI)。
[0035] 采用WST-I法（美國(guó)Roche公司）檢測(cè)細(xì)胞存活率。每孔5000個(gè)U87及人星形 膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87R-D0X細(xì)胞分別接種至96孔培養(yǎng)板，24小時(shí)后給予不同濃度的DOX (0， 0· 1，1，10,100, 500,1000ng/ml)干預(yù)，48小時(shí)后每孔加10 μ L WST-I試劑，在培養(yǎng)箱中37°C 繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長(zhǎng)的吸光度。通過(guò)Graphpad Prism軟件計(jì)算 IC50。耐藥系數(shù)（RI)=耐藥株IC50/敏感株IC50。耐藥細(xì)胞建成后放-80°C冰柜凍存，1 個(gè)月、6個(gè)月后復(fù)蘇，再次檢測(cè)耐藥系數(shù)以確定其耐藥系數(shù)的穩(wěn)定性。
[0036] 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0037] 阿霉素對(duì)各U87細(xì)胞株的IC50見(jiàn)表1，人星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87R-D0X的耐藥系數(shù) 見(jiàn)表2。
[0038] 表1阿霉素對(duì)U87細(xì)胞株的IC50
[0042] 本發(fā)明為進(jìn)一步研宄腦膠質(zhì)瘤的耐藥機(jī)制、逆轉(zhuǎn)腦膠質(zhì)瘤耐藥建立了可靠模型， 建立的耐藥細(xì)胞株的耐藥系數(shù)高，且耐藥細(xì)胞株的耐藥穩(wěn)定性很好。
[0043] 實(shí)施例2
[0044] 發(fā)明人在人星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87R-D0X建立過(guò)程中，平行實(shí)驗(yàn)得到另一耐阿霉 素 U87細(xì)胞模型U87R-D0X'，其IC50為685ng/ml，耐藥系數(shù)（48小時(shí)）為20. 15,耐藥系數(shù) (1個(gè)月）為14. 32,耐藥系數(shù)（6個(gè)月）為12. 80。耐藥性和耐藥穩(wěn)定性均顯著差于人星形 膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87R-D0X。
[0045] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種耐阿霉素U87細(xì)胞模型，其特征在于，所述的耐阿霉素U87細(xì)胞模型的保藏號(hào)為 CCTCC C201531。2. 權(quán)利要求1所述的耐阿霉素U87細(xì)胞模型的用途，其特征在于，用于研宄腦膠質(zhì)瘤耐 藥機(jī)制、尋找腦膠質(zhì)瘤耐藥逆轉(zhuǎn)的靶點(diǎn)、篩選治療腦膠質(zhì)瘤或解除腦膠質(zhì)瘤耐藥的藥物。3. 權(quán)利要求1所述的耐阿霉素U87細(xì)胞模型的用途，其特征在于，用于腦膠質(zhì)瘤引起的 難治性癲癇的機(jī)制研宄、尋找腦膠質(zhì)瘤引起的癲癇的耐藥逆轉(zhuǎn)靶點(diǎn)、篩選治療腦膠質(zhì)瘤引 起的癲癇或解除腦膠質(zhì)瘤引起的癲癇耐藥的藥物。4. 權(quán)利要求1所述的耐阿霉素U87細(xì)胞模型的建立方法，其特征在于，它包括以下步 驟： a) 培養(yǎng)U87細(xì)胞； b) U87細(xì)胞用阿霉素開(kāi)始干預(yù)，然后換無(wú)阿霉素培養(yǎng)基，至細(xì)胞生長(zhǎng)恢復(fù)正常即細(xì)胞穩(wěn) 定生長(zhǎng)、形態(tài)飽滿、無(wú)漂浮死細(xì)胞、傳代密度為30%的情況下3至5天可長(zhǎng)至90%后再開(kāi)始 正常傳代并提高阿霉素的濃度，每次阿霉素的干預(yù)時(shí)間均為24小時(shí)； c) 對(duì)干預(yù)后的U87細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，獲得耐阿霉素U87細(xì)胞模型。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種耐阿霉素U87細(xì)胞模型及其應(yīng)用。本發(fā)明用阿霉素干預(yù)U87細(xì)胞，然后換無(wú)阿霉素培養(yǎng)基，至細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)、形態(tài)飽滿、無(wú)漂浮死細(xì)胞、傳代密度為30％的情況下3至5天可長(zhǎng)至90％后再開(kāi)始正常傳代并提高阿霉素的濃度，每次阿霉素的干預(yù)時(shí)間均為24小時(shí)，最后對(duì)干預(yù)后的U87細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，獲得耐阿霉素U87細(xì)胞模型，其保藏號(hào)為CCTCC NO：C201531。該細(xì)胞模型耐藥性強(qiáng)，耐藥系數(shù)高，且耐藥穩(wěn)定性很好，可用于研究腦膠質(zhì)瘤耐藥機(jī)制、尋找腦膠質(zhì)瘤耐藥逆轉(zhuǎn)的靶點(diǎn)、篩選治療腦膠質(zhì)瘤或解除腦膠質(zhì)瘤耐藥的藥物，也可用于腫瘤引起難治性癲癇的機(jī)制研究、尋找癲癇耐藥逆轉(zhuǎn)的靶點(diǎn)、篩選治療癲癇或解除癲癇耐藥的藥物。CCTCC NO：C20153120150401
【IPC分類】C12Q1/02, C12N5/09
【公開(kāi)號(hào)】CN104946593
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510215901
【發(fā)明人】邵一葉, 陳英輝
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院
【公開(kāi)日】2015年9月30日
【申請(qǐng)日】2015年4月30日