成人骨髓中Muse細(xì)胞誘導(dǎo)為神經(jīng)前體細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種細(xì)胞的分離和誘導(dǎo)分化，具體即從成人 骨髓中分離出Muse細(xì)胞并體外誘導(dǎo)成神經(jīng)前體細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 脊髓損傷后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞大量凋亡、死亡，僅存的極少 量神經(jīng)干細(xì)胞無法足量補充丟失的神經(jīng)細(xì)胞，且受損的神經(jīng)元再生能力也相對較弱，這是 導(dǎo)致軸突再生和功能恢復(fù)障礙的重要原因之一。為了補充丟失的神經(jīng)細(xì)胞，有必要對損傷 脊髓進行細(xì)胞治療，而如何選取合適的種子細(xì)胞則是細(xì)胞治療面臨的首要和關(guān)鍵問題。各 種干細(xì)胞因為具有多向分化潛能和自我復(fù)制能力而被廣泛應(yīng)用，目前已報道的應(yīng)用研究于 神經(jīng)損傷的干細(xì)胞有：（1)成體干細(xì)胞：由于是天然的多能干細(xì)胞，曾被認(rèn)為能安全應(yīng)用于 臨床，但是由于它們最初在活體器官中的角色是維持和修補其所在組織的細(xì)胞類型，因此 分化能力較為局限，尤其在來源較方便、研究較多的中胚層干細(xì)胞跨胚層分化方面更是如 此；即使是同一分化方向的神經(jīng)干細(xì)胞，也由于取材困難同樣較難應(yīng)用于臨床。（2)胚胎干 細(xì)胞（embryonic stem cell，ES cell):是從胚泡內(nèi)細(xì)胞群分離得到的全能干細(xì)胞，能經(jīng)誘 導(dǎo)分化為機體幾乎所有的細(xì)胞類型，但由于倫理學(xué)問題和致瘤性而備受爭議。（3)誘導(dǎo)多 能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell, iPS cell):可以從體細(xì)胞得到在細(xì)胞倍增能 力、分化能力等方面都與ES細(xì)胞相似的多能干細(xì)胞，且沒有倫理學(xué)爭議；但是添加4個重新 編程基因或取代疾病細(xì)胞中有缺陷基因的方法都可能有致瘤的副作用，目前還沒有明確的 檢測和消除其所含未分化致瘤細(xì)胞的方法。（4)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells， MSCs):存在于人體發(fā)生、發(fā)育過程的多種組織中，如真皮、骨髓、脂肪組織和臍帶等中均可 分離和制備MSCs。與造血干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞等一般成體干細(xì)胞不同，MSCs的成分復(fù)雜， 且各種細(xì)胞分化能力差異較大，其中僅少部分細(xì)胞的分化方向較廣泛，具有向內(nèi)、中、外三 個胚層分化和自我更新的干細(xì)胞特性，且與ES細(xì)胞相比沒有倫理學(xué)的困擾，因此成為細(xì)胞 替代治療和組織工程的熱點細(xì)胞。目前研究最多的是骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，大部分報 道是通過差速貼壁法來分離獲取這種細(xì)胞，實際上得到的是骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cells, BMSCs)，免疫表型鑒定為 CD29、CD49、CD73、CD90、CD105 和 Stro-I 陽性， ⑶Ilb和⑶45陰性。雖然BMSCs已被證明在體外、體內(nèi)能分化為神經(jīng)細(xì)胞，我們前期試驗也 發(fā)現(xiàn)體內(nèi)移植BMSCs可以少部分分化為neurofilament (NF)免疫反應(yīng)陽性的神經(jīng)細(xì)胞，但分 化率僅5%左右。所以實際上BMSCs中存在的MSCs僅是一群數(shù)量少、且分化能力有差異的 干細(xì)胞亞群，僅通過貼壁這種簡單的篩選方法得到的原代培養(yǎng)細(xì)胞大多是異種間充質(zhì)細(xì)胞 群，含有大比例的多種不同表型和功能的非干細(xì)胞；當(dāng)移植到體內(nèi)，能真正分化為所在組織 相關(guān)細(xì)胞的數(shù)量極少，多數(shù)報道僅為百分之幾，而更多的陽性效果可能是由于移植細(xì)胞分 泌細(xì)胞因子等方面的間接作用，因此這種方法得到的BMSCs作為種子細(xì)胞移植并不能充分 發(fā)揮干細(xì)胞治療的優(yōu)勢。當(dāng)采用BMSCs作為脊髓損傷修復(fù)應(yīng)用的種子細(xì)胞時，植入前即有 必要對其進行純化，篩選出其中真正的多能干細(xì)胞，以進一步提高干細(xì)胞移植治療的效果。
[0003] 2010年，Mari Dezawa等從BMSCs和皮膚纖維母細(xì)胞中分離出多系分化持續(xù)應(yīng) 激細(xì)胞（multilineage differentiating stress enduring cells, Muse cells), Muse 細(xì)胞可以從間充質(zhì)中，如皮膚、脂肪組織、骨髓中分離得到，對胰蛋白酶長時間孵育等限制 性的培養(yǎng)條件有很好的適應(yīng)力。Muse細(xì)胞表現(xiàn)未分化胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物一階段特異性 胚胎抗原（stage-specific embryonic antigen-3，SSEA-3)陽性，以及間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記 物⑶105、⑶29、⑶90陽性。Muse細(xì)胞在黏附培養(yǎng)基中呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài)；單個Muse 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)后，細(xì)胞開始增殖并形成細(xì)胞球，其形態(tài)類似于ES細(xì)胞的胚狀體，并表達 多能干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物，如0ct3/4、Sox2、Nanog和ALP等；但不表達其他干細(xì)胞的標(biāo)記 物，如造血干細(xì)胞（⑶34、⑶117)、皮膚前體細(xì)胞（Snail、Slug)、神經(jīng)嵴前體細(xì)胞（⑶271、 SoxlO)、血管周細(xì)胞（NG2、CD146)和內(nèi)皮前體細(xì)胞（CD31、von Willebrand factor)等， 表明Muse細(xì)胞與骨髓、真皮等間充質(zhì)中的已知干細(xì)胞不同。通過實驗確認(rèn)Muse細(xì)胞至 第5代仍具有自我更新的能力。當(dāng)Muse細(xì)胞球轉(zhuǎn)移至明膠培養(yǎng)基中，可自發(fā)分化為三 個胚層的細(xì)胞：內(nèi)胚層細(xì)胞（肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞），中胚層細(xì)胞（骨細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞）， 外胚層細(xì)胞（表皮細(xì)胞）。雖然都具有向三個胚層分化的潛能，但與ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞 不同的是，Muse細(xì)胞移植進入免疫缺陷小鼠體內(nèi)并不會形成畸胎瘤（參見文獻：Kuroda Y，Kitada Mj Wakao S，et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 ； 107 (19):8639 - 43. ；Kitada MjWakao Sj Dezawa M. Muse cells and induced pluripotent stem cell: implication of the elite model. Cell Mol Life Sci. 2012 ;69 (22) :3739 - 50. ;Wakao S，Kitada M，Kuroda Y，et al. Multilineage-differentiating stress-enduring(Muse)cells are a primary source of induced pluripotent stem cells in human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA. 2011 ;108(24) :9875-80.) ?
[0004] 綜上所述，Muse細(xì)胞是在天然單細(xì)胞水平上具有多能干細(xì)胞特性和自我更新能力 的干細(xì)胞，它同時克服了 ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞以及其他成體干細(xì)胞在體內(nèi)移植治療研究中的 許多不足。Muse細(xì)胞作為理想的種子細(xì)胞已被用于一些小鼠損傷的模型修復(fù)研究中，如人 Muse細(xì)胞修復(fù)骨骼肌退變、糖尿病、急性重癥肝炎等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Muse細(xì)胞在這些損傷組織 中能順利和宿主組織整合并分別向相應(yīng)胚層的細(xì)胞分化，最終促成組織重建。
[0005] 但Muse細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)中，尤其是脊髓損傷方面的應(yīng)用研究還未見報道，也無 文獻報道從成人骨髓中分離出Muse細(xì)胞并體外誘導(dǎo)成神經(jīng)前體細(xì)胞（neural precursor cells, NPCs)。
[0006] 本領(lǐng)域也一直致力于尋找在神經(jīng)系統(tǒng)損傷后進行細(xì)胞治療和組織工程治療的合 適的種子細(xì)胞，種子細(xì)胞需要尋找取材方便、增殖力強、無倫理學(xué)問題的新的細(xì)胞來源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種從成人的骨髓中分離出Muse細(xì)胞，并體外誘導(dǎo)成神 經(jīng)前體細(xì)胞（Muse-NPCs)的方法，本發(fā)明的另一目的在于提供上述方法制備得到的神經(jīng)前 體細(xì)胞。
[0008] 新近發(fā)現(xiàn)的Muse細(xì)胞是不同于已知干細(xì)胞的獨特亞群，存在于骨髓、BMSCs等間 充質(zhì)或間充質(zhì)細(xì)胞中，可以從自體方便獲取，具有多能干細(xì)胞標(biāo)志及生物學(xué)特性。從骨髓中 分離出Muse細(xì)胞，并經(jīng)體外誘導(dǎo)為Muse-NPCs作為種子細(xì)胞，可以為神經(jīng)系統(tǒng)損傷的干細(xì) 胞治療和組織工程治療提供有力的支持。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)關(guān)鍵在于，如何將成人骨髓中的Muse細(xì)胞篩選、分離出來，如何將 Muse細(xì)胞在體外成功誘導(dǎo)成Muse-NPCs。
[0010] 本發(fā)明提供了一種從成人的骨髓中分離Muse細(xì)胞并誘導(dǎo)分化為神經(jīng)前體細(xì)胞 (Muse-NPCs)的方法，流程如圖1所示，具體步驟如下：
[0011] A、從成人骨髓中分離、培養(yǎng)Muse細(xì)胞：
[0012] 將健康成人骨髓采用密度梯度離心法分離骨髓單核細(xì)胞，所述的密度梯度離心 法，為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，可參見 Sch〖ick LM, Noack S, Weist R, Jagodzinski M, Krettek Cj Buettner M，Hoffmann A. Analysis of surface protein expression in human bone marrow stromal cells:new aspects of culture-induced changes, inter-donor differences and intracellular expression. Stem Cells Dev.2013Dec 15 ； 22(24) :3226-35.
[0013] 采用差速貼壁法，24小時后BMSCs貼壁，倒去懸浮的未貼壁細(xì)胞，加入新的 DMEM/F12完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)5天至10天（最優(yōu)為7天），所述的差速貼壁法，為本 領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，可參見 Mareddy Sl，Crawford R，Brooke G，Xiao Y. Clonal isolation and characterization of bone marrow stromal cells from patients with osteoarthritis. Tissue Eng. 2007Apr ；13 (4):819-29.
[0014] 用0· 25% Trypsin-EDTA重懸貼壁細(xì)胞，并以IO5Ail的密度接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng) 6小時至10小時（最優(yōu)為8小時），終止胰酶反應(yīng)后洗滌，MC培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以8X IO3/ ml的密度，每孔Iml接種于預(yù)先經(jīng)過polyHEM包被處理的培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)，3-7天后