專利名稱：修飾的溶瘤病毒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及修飾的溶瘤小RNA病毒以及治療受試者的方法。
背景技術：
病毒與細胞表面分子的結合是病毒復制的啟動步驟，因此，特異性細胞病毒受體是病毒組織嗜性的主要決定因素。衰變加速因子(DAF/CD55)是一種由四個細胞外短共有重復序列(SCRs)組成的70kDa糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定補體調節(jié)蛋白，它起到多種人類腸病毒膜結合蛋白的作用，其包括幾種腸病毒(EV)、B型柯薩奇病毒(CVB)和柯薩奇病毒A21(CVA21)。通常，病毒單獨與DAF結合并不足以使腸病毒感染，與DAF的相互作用不誘導產生135S異常(A)顆粒，后者被認為是侵入細胞的必要條件。DAF的腸病毒感染生理作用被認為是一種膜結合受體，其結合感染性病毒并使其集中，通過與第二功能性細胞侵入受體的相互作用導致細胞侵入的可能性增加。
類似許多其它的小RNA病毒受體(脊髓灰質炎病毒、主要受體組(major receptor group)鼻病毒和B型柯薩奇病毒使用)，CVA21細胞內化受體細胞間粘附分子-1(ICAM-1/CD54)是免疫球蛋白超家族成員，其結合在圍繞五重軸的外殼峽谷內。峽谷底病毒受體之間的相互作用使外殼不穩(wěn)定，并誘導病毒脫殼的前奏——構象變化。
CVA21(Kuykendall)的原型病毒株是呼吸道感染的元兇，其既與ICAM-1結合，又與DAF結合。但是，CVA21原型病毒株與表面表達的DAF的結合不足以啟動生產性感染或A-顆粒的形成，它與ICAM-1的相互作用是侵入細胞所必需的。當表面DAF通過導向DAF非病毒性結合區(qū)的單克隆抗體(mAb)交聯(lián)時，在CVA21感染過程中觀察到DAF的更多功能，使得感染在不存在ICAM-1的情況下發(fā)生。
本申請人以前開發(fā)了使用識別ICAM-1的溶瘤病毒治療惡性腫瘤的新方法(WO01/37866)。通過在許多類型的癌細胞上使用多種A型柯薩奇病毒株，獲得了出色的治療結果。為了擴大可能的癌癥治療并提供更有效的治療，本發(fā)明者已經(jīng)通過修飾和生物選擇獲得了新的溶瘤和殺傷特性提高的溶瘤病毒。

發(fā)明內容
在第一個方面，本發(fā)明提供一種能夠在基本上不存在細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細胞或誘導細胞凋亡的分離、選擇的小RNA病毒。
優(yōu)選地，選擇的小RNA病毒能夠通過細胞上的衰變加速因子(DAF)溶解性地感染細胞。
優(yōu)選地，小RNA病毒選自腸病毒的原型病毒株和臨床分離物，所述的腸病毒包括柯薩奇病毒、艾柯病毒、脊髓灰質炎病毒、未分類腸病毒、鼻病毒、副腸弧病毒(Paraechovirus)、肝病毒和心病毒。
在一個優(yōu)選方式中，小RNA病毒為柯薩奇病毒。優(yōu)選地，柯薩奇病毒為A或B型，更優(yōu)選為A型柯薩奇病毒，更加優(yōu)選地，柯薩奇病毒為柯薩奇病毒A21。
在一個優(yōu)選方式中，小RNA病毒為艾柯病毒。優(yōu)選地，艾柯病毒為艾柯病毒6、7、11、12、13或29。
在一個優(yōu)選方式中，小RNA病毒為脊髓灰質炎病毒。優(yōu)選地，脊髓灰質炎病毒為1、2或3型脊髓灰質炎病毒。
在一個優(yōu)選方式中，小RNA病毒為鼻病毒。優(yōu)選地，鼻病毒是主要組鼻病毒或次要組鼻病毒的成員。
在一個優(yōu)選方式中，小RNA病毒是通過下列方法生物選擇的將表達DAF、無ICAM-1的細胞系中的不能夠在不存在ICAM-1的情況下溶解性地感染細胞的小RNA病毒傳代，并回收選擇的能夠在不存在ICAM-1的情況下溶解性地感染細胞的小RNA病毒。
在另一個優(yōu)選方式中，小RNA病毒可以通過任何已知方法(例如定點誘變，或者在使用抗ICAM-1抗體阻斷ICAM-1入口的細胞中進行傳代)被改變、突變或修飾。
優(yōu)選地，與野生型病毒相比，選擇的小RNA病毒的一個或多個外殼蛋白發(fā)生了改變。例如在，柯薩奇病毒中，外殼蛋白選自VP1、VP2和VP3。更優(yōu)選地，突變選自VP3R96H；VP3E101A；VP3A239S；VP2S164L和VP2V209中的一種或多種。
優(yōu)選地，細胞為腫瘤，更優(yōu)選地，腫瘤為表達DAF的腫瘤。例子包括但不限于肺癌、前列腺癌、結直腸癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、肝癌、白血病、黑色素瘤、癌前細胞、食管癌、乳癌、腦癌、卵巢、胃癌和腸癌。
在第二個方面，本發(fā)明提供一種能夠在基本上不存在細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細胞的分離的小RNA病毒的核酸分子。在一個實施方式中，核酸分子可以來自小RNA病毒，并可以是病毒的單鏈RNA或互補DNA。優(yōu)選地，核酸分子包括選自SEQID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5和SEQ ID NO7的核酸序列。
在第三個方面，本發(fā)明提供一種對能夠在基本上不存在細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細胞的小RNA病毒進行生物選擇的方法，該方法包括將不能夠在基本上不存在細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細胞的小RNA病毒培養(yǎng)在合適的細胞系中進行足夠多次的傳代，選擇能夠在基本上不存在細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細胞的小RNA病毒。
優(yōu)選地，細胞系選自人類癌，例如橫紋肌肉瘤、肺癌、前列腺癌、結直腸癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、肝癌、白血病、黑色素瘤、癌前細胞、食管癌、乳癌、腦癌、卵巢癌、胃癌和腸癌。更優(yōu)選地，細胞系為不表達ICAM-1的表達DAF的細胞系。
典型地，足夠多的傳代次數(shù)通常為大約10代。但是，應當認識到，根據(jù)小RNA病毒和細胞類型，可以使用1至100或更多次的傳代。在一個實施方式中，使用4次傳代。在另一個實施方式中，使用5次傳代。在再另一個實施方式中，使用6、7或8次傳代。
在第四個方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明第三個方面的方法得到的小RNA病毒。
在第五個方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明第一個或第四個方面的分離的小RNA病毒、以及合適的藥物可接受賦形劑或稀釋劑。
在第六個方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明第二個方面的病毒核酸的病毒核酸分子或互補DNA拷貝(copy)、以及合適的藥物可接受賦形劑或稀釋劑。
在第七個方面，本發(fā)明提供一種治療患腫瘤哺乳動物的腫瘤的方法，該方法包括在導致病毒介導的腫瘤細胞溶解的條件下，用有效量的根據(jù)本發(fā)明第一個或第五個方面的分離的小RNA病毒為哺乳動物給藥。
優(yōu)選地，腫瘤為表達DAF的腫瘤。例子包括但不限于肺癌、前列腺癌、結直腸癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、肝癌、白血病、黑色素瘤、癌前細胞、食管癌、乳癌、腦癌、卵巢癌、胃癌和腸癌。
在第八個方面，本發(fā)明提供一種治療患腫瘤哺乳動物的腫瘤的方法，該方法包括在導致病毒介導的腫瘤細胞溶解的條件下，用有效量的根據(jù)本發(fā)明第二個方面的病毒核酸的核酸分子或互補DNA拷貝或者根據(jù)本發(fā)明第六個方面的藥物組合物為哺乳動物給藥。
優(yōu)選地，腫瘤為表達DAF的腫瘤。例子包括但不限于肺癌、前列腺癌、結直腸癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、肝癌、白血病、黑色素瘤、癌前細胞、食管癌、乳癌、腦癌和卵巢癌。
在第九個方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明第一個或第五個方面的分離的小RNA病毒在治療方法或治療中的用途。
在第十個方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的第二個方面的核酸分子在治療方法或治療中的用途。
在第十一個方面，本發(fā)明提供本文所定義的CVA21-DAFv形式的分離、選擇的小RNA病毒、或其修飾或變化形式。
在第十二個方面，本發(fā)明提供能夠在基本上不存在細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細胞或誘導細胞凋亡的分離篩選的小RNA病毒在制造治療哺乳動物腫瘤的藥物中的用途。在優(yōu)選的實施方式中，提供產生本發(fā)明的小RNA病毒的接種物在制造用小RNA病毒治療哺乳動物腫瘤以殺死一些腫瘤細胞的藥物中的用途。
在本發(fā)明的第十三個方面，提供一種將接種物提供給哺乳動物以產生治療哺乳動物腫瘤的病毒的施用器，其中所述的施用器包括充滿接種物的區(qū)域，使得接種物可以與哺乳動物接觸，所述的病毒是能夠在基本上不存在細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細胞或誘導細胞凋亡的分離、選擇的小RNA病毒。
本文所述的病毒樣品根據(jù)布達佩斯條約的條款保藏在AustralianGovernment Analytical Laboratories(澳大利亞國家分析實驗室)(National Measurement Institute，1Suakin Street(PO Box385)PymbleNSW2073Australia)。分離物CVA21#272101(編號NM05/43993)、CVA21#275238(編號NM05/43991)、和CVA21#272598(編號NM05/43992)的保藏日為2005年1月14日。CVA21-DAFv的保藏日為2005年1月17日，編號為NM05/43996。
在本說明書中，除非上下文另外指出，詞語“包括(comprise)”或其變化形式如“comprises”或“comprising”應當理解成表示包含所述的要素、整體或步驟，或一組要素、整體或步驟，但是不排除任何其它的要素、整體或步驟，或一組要素、整體或步驟。
在本說明書中所包括的文件、條例、材料、裝置、文章或類似物的任何論述，目的僅在于為本發(fā)明提供文字內容。不應當認為任何一項或所有這些內容形成現(xiàn)有技術的一部分，或者在本申請的優(yōu)先權日之前為本發(fā)明相關領域所普遍公知。
為更清晰地理解本發(fā)明，參考下列附圖和實施例對優(yōu)選實施方式進行說明。


圖1.在存在和不存在抗-ICAM-1抗體的情況下，[35S]-蛋氨酸標記的CVA21原型(Kuykendall)和三種CVA21的臨床分離物(#272101、#275238、#272598)與下列細胞的結合(A)表達DAF的CHO細胞和(B)表達ICAM-1的CHO細胞。[35S]-蛋氨酸標記病毒的結合水平通過液體閃爍計數(shù)進行測定。結果表示成三份樣品的平均值+SD。Y軸顯示結合的病毒(cpm x102)。
圖2.在存在和不存在抗-DAF SCR1MAb、抗-ICAM-1結構域1MAb、和/或PI-PLC處理的情況下，[35S]-蛋氨酸標記的CVA21原型Kuykendall(A)和臨床分離物#272101(B)與HeLa細胞的結合。[35S]-蛋氨酸標記病毒的結合水平通過液體閃爍計數(shù)進行測定。結果表示成三份樣品的平均值+SD。Y軸顯示結合的病毒(cpm x102)。
圖3.[35S]-蛋氨酸標記的CVA21原型(Kuykendall)和三種CVA21臨床分離物(#272101、#275238、#272598)與單獨表達DAF、或ICAM-1、或同時表達二者的CHO細胞的結合。(A)表面DAF和ICAM-1表達的流式細胞儀分析。轉染的CHO細胞與單獨的綴合物、抗-DAF MAb(IH4)或抗-ICAM-1MAb(WEHI)一起培育，在FACStar分析儀上測定特異性結合。封閉直方圖表示綴合物的結合，空心直方圖代表抗-DAF MAb的結合，虛線直方圖代表抗-ICAM-1MAb的結合。(B)[35S]-蛋氨酸標記病毒的結合水平通過液體閃爍計數(shù)進行測定。結果表示成三份樣品的平均值+SD。Y軸顯示結合的病毒(cpm x102)。
圖4.在存在抗-DAF MAbs IA10(SCR1)、VIIIA7(SCR2)、IH4(SCR3)和IIH6(SCR4)的情況下，CVA21原型(Kuykendall)和臨床分離物(#272101、#275238、#272598)對ICAM-1陰性RD細胞的溶解性感染。向培養(yǎng)于96孔板的RD細胞單層中加入抗-DAF MAbs(20μg/ml)。在37℃下培育1h后，用大約103TCID50/孔的CVA21分離物攻擊細胞，在37℃下培育48h。用結晶紫/甲醇溶液對細胞單層進行染色，然后在540nm處測量吸光度，對細胞溶解進行評價。結果表示成兩個孔的平均溶解百分比。
圖5.原型CVA21Kuykendall病毒株和臨床分離物#272101、#275238和#272598的VP1、VP2和VP3外殼蛋白的多序列排比。臨床分離物相對于Kuykendall病毒株的氨基酸變化以黑體表示。使用Clustal X程序進行序列排比。構成CVA21-ICAM-1結合足跡的單個氨基酸用閉合框突出顯示。
圖6.CVA21親代和CVA21-DAFv對SkMel28和RD細胞的感染。(A)RD和SkMel28細胞上ICAM-1和DAF表達的流式細胞儀分析。實線直方圖代表單獨的綴合物的結合，虛線直方圖代表抗-ICAM-1mAb的結合，實心直方圖表示抗-DAF mAb的結合。(B)96孔板中的SkMel28和RD細胞單層用CVA21親代和CVA21-DAFv的10倍稀釋液進行接種。培育72h后，固定單層，用結晶紫溶液染色。+表示通過顯微鏡觀察檢測到的CPE。(C)典型的CVA21親代和CVA21-DAFv在SkMel28細胞上的噬斑形態(tài)學與CVA21-DAF變體在RD細胞上的形態(tài)學的比較。將細胞用病毒的連續(xù)稀釋液感染，感染后1h，用含0.7％瓊脂糖的DMEM覆蓋。培養(yǎng)板在37℃下培育，并在感染后48h用結晶紫染色。
圖7.抗-DAF和抗-ICAM-1mAb對CVA21-DAFv結合和溶解性感染的影響。(A)CHO、CHO-DAF、CHO-ICAM-1和DOV13細胞上DAF和ICAM-1表面水平的流式細胞儀分析。實線直方圖代表僅有綴合體的結合，虛線直方圖代表抗-ICAM-1mAb的結合，實心直方圖顯示抗-DAF mAb的結合。與CHO、CHO-ICAM-1、CHO-DAF、RD和DOV13細胞上表面表達的ICAM-1(B)和DAF(C)結合的放射性同位素標記的病毒通過液體閃爍計數(shù)進行測定。結果表示成三份樣品+SD。(D)DAF的mAb交聯(lián)對RD和DOV13細胞的CVA21溶解性感染的影響。在用CVA21親代和CVA21-DAFv(1-106TCID50/孔)攻擊之前，將96孔板中的單層與抗-DAF SCR3mAb預培育。在37℃下培育72h后，固定細胞單層，并用結晶紫溶液染色。+表示通過顯微鏡檢查檢測的CPE。*病毒效價小于101TCID50/ml。
圖8.從DAF洗脫CVA21-DAFv。(A)比較CVA21親代和CVA21-DAFv與表面DAF結合的嚴格性。將CHO-DAF細胞與放射性同位素標記的病毒在4℃下培育2h，然后將與細胞結合的病毒用不同濃度的抗-DAF SCR1mAb(IA10)在冰上洗脫1h。監(jiān)測上清液中洗脫病毒的水平，結果表示成放射性同位素標記的病毒被洗脫的細胞的％。(B)結合DAF和ICAM-1的CVA21-DAFv病毒體的沉淀。將CHO-DAF和CHO-ICAM-1細胞與放射性同位素標記的CVA21-DAFv病毒體在4℃下培育2h，將與細胞結合的病毒在37℃下洗脫2h。洗脫的病毒體沉淀在5-30％蔗糖梯度上進行分析。使用成熟病毒體(160S)和原病毒體(125S)作為內遷移參照。
圖9.CVA21-DAFv溶解性感染被抗DAF SCR1mAb和可溶性DAF(sDAF)抑制。(A)用CVA21-DAFv感染之前，將成片的RD單層細胞與抗-DAF SCR1mAb IA10培育。在37℃下培育24h后，觀察細胞的溶解情況并拍照。(B)將CVA21-DAFv與sDAF(85μg/m)在37℃下培育1h，并將其加入至RD細胞單層。在37℃下培育48h后，觀察細胞的溶解情況并拍照。
圖10.預計的CVA21的受體-病毒結合表面的近觀。(A)表示成等值面的一個CVA21啟動子的俯視圖，其中VP1繪成黃色，VP2繪成粉紅色，VP3繪成紫紅色。數(shù)字表示二十面體5-、3-、和2-重軸的相應位置。相互作用的ICAM-1和DAF分子顯示成蠕蟲樣圖，DAF為麥色，與峽谷結合的ICAM-1為綠色。CVA21親代(空間填充模式)中VP3 R96殘基的位置被VP1C-端環(huán)所部分覆蓋，僅有精氨酸側鏈上的一個氮原子(緊靠星號的藍色表面)可以從病毒表面上看到。(B)CVA21啟動子的側視圖，蛋白上的顏色如上述，VP3殘基R96和E101用以空間填充模式突出顯示。圖像用pymol程序(http://www.pymol.org)生成。
圖11.放射性同位素標記的CVA21與嵌合DAF/CD46受體的結合。(A)野生型DAF、CD46和DAF/CD46嵌合分子的示意圖。(B)mAbs與DAF和CD46的單個SCR結合的流式細胞儀分析。抗-DAFmAbs為IA10(SCR1)、IH4(SCR3)、IIH6(SCR4)，抗-CD46mAb(SCR1)為MCI20.6。與合適的mAbs培育后，將細胞用PBS沖洗，重新懸浮在100μl PBS(DAKO A/S，Denmark)中的綴合有R-藻紅蛋白的羊抗鼠免疫球蛋白F(ab′)2片段中，在冰上培育20min。如上文所述對細胞進行沖洗并沉淀，重新懸浮在PBS中，并使用FACStar分析儀(Becton Dickenson，Sydney，Australia)對DAF和CD46表達進行分析。(C)放射性同位素標記的CVA21與表達DAF、CD46或嵌合DAF/CD46分子的結合。將細胞與大約2×105cpm35S-標記的CVA21在37℃下培育1h，然后用PBS沖洗四次。與細胞結合的CVA21的量通過液體閃爍來測定。結果表示成三份樣品的平均值+SD。
圖12.從表達DAF的CHO細胞洗脫CVA21對時間、溫度和培養(yǎng)基pH的反應。(A)CVA21與細胞表面表達的DAF在4℃下結合，溫度升高至37℃后2h繼續(xù)洗脫0、1、5、15、30和60分鐘。洗脫的CVA21的水平通過液體閃爍計數(shù)進行測定。(B)CVA21與細胞表面表達的DAF在4℃下結合2h，然后在適當溫度下培育，繼續(xù)洗脫30分鐘。(C)CVA21與細胞表面表達的DAF在4℃下結合2h，在適當pH的培養(yǎng)基中在37℃下培育，繼續(xù)洗脫30分鐘。
圖13.自DAF和ICAM-1洗脫后CVA21的感染性。(A)與細胞表面表達的DAF和ICAM-1在4℃下結合的[35S]-蛋氨酸標記的CVA21的水平，隨后在37℃下培育后從每個受體上洗脫放射性同位素標記的病毒。結合的[35S]-蛋氨酸標記病毒的水平在1450Microbeta TRILUX(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)上通過液體閃爍計數(shù)進行測定。結果表示成三份樣品+SD。(B)與從細胞表面表達的DAF和ICAM-1結合并洗脫后CVA21對RD-ICAM-1細胞的溶解性感染。通過用結晶紫/甲醇溶液染色，從四個孔對細胞存活率進行定量，染色細胞單層的相對吸光度在multiscan酶聯(lián)免疫吸附試驗平板讀數(shù)儀(Flow Laboratories，McLean，Virginia，USA)上在540nm處進行讀數(shù)。使用Reed和Muench法計算50％終點效價，如果吸光度小于無病毒對照物減去標準誤差的3倍，則該孔被記為陽性。
圖14.自交聯(lián)DAF洗脫后CVA21的感染性。(A)在0℃下和37℃下，從RD細胞上細胞表面表達的ICAM-1(RD-ICAM-1)和RD細胞上mAb交聯(lián)的DAF上洗脫[35S]-蛋氨酸標記的CVA21。洗脫的[35S]-蛋氨酸標記病毒的水平在1450Microbeta TRILUX(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)上通過液體閃爍計數(shù)進行測定。結果表示成從三份樣品上洗脫的病毒的百分比+SD。(B)與對照CVA21相比，與ICAM-1或mAb交聯(lián)DAF結合并洗脫后CVA21對RD-ICAM-1細胞的溶解性感染。通過用結晶紫/甲醇溶液染色，從四個孔對細胞存活率進行定量，染色細胞單層的相對吸光度在multiscan酶聯(lián)免疫吸附試驗平板讀數(shù)儀(FlowLaboratories，McLean，Virginia，USA)上在540nm處進行讀數(shù)。如圖13所述計算50％終點效價。(C)CVA21與ICAM-1或交聯(lián)DAF結合的嚴格性。將RD-ICAM-1細胞或DAF-交聯(lián)RD-細胞[與抗-DAFSCR3(IH4)mAb預培育的RD細胞]與大約2×105cpm35S-標記的CVA21在0℃下培育2h。用冷PBS沖洗4次后，將細胞分在多個管中，并與不同濃度(0-100μg/ml)的抗-DAF SCR1mAb或抗-ICAM-1結構域1mAb在0℃下培育1h。通過液體閃爍計數(shù)監(jiān)測細胞和上清液的放射活性，結果表示成35S-標記CVA21被洗脫的細胞的％。
圖15.在延遲誘導ICAM-1表達后，CVA21誘導的RD細胞溶解性感染。(A)腺病毒轉導的ICAM-1表達的時間進程。通過用2.5×107TCID50/ml含人ICAM-1cDNA的重組腺病毒進行轉導，誘導RD細胞表達人ICAM-1。在腺病毒接種后的不同時間，通過流式細胞儀使用抗-ICAM-1結構域mAb(IH4)測定細胞的ICAM-1表達。(B)在偽轉導或用含人ICAM-1或CD36cDNA的重組腺病毒進行轉導后的24h，對顯示DAF、ICAM-1和CD36表面表達的RD細胞進行流式細胞儀分析。閉合直方圖表示DAF表達，粉紅色直方圖表示ICAM-1表達，藍色直方圖表示CD36表達。使用Adeno-quest試劑盒(QuantumBiotechnologies Inc)，根據(jù)制造商的說明書構建含有ICAM-1cDNA或CD36cDNA的重組腺病毒。(C)經(jīng)由遲至24h后的ICAM-1表達的延遲，RD細胞的CVA21溶解性感染。在CVA21(moi＝1.0TCID50)與DAF結合后的0、6和24h，通過用2.5×107TCID50/ml含有ICAM-1或CD36cDNA的重組腺病毒進行轉導，誘導RD細胞表達ICAM-1或CD36受體。以未轉導的RD細胞作為對照物。通過用結晶紫/甲醇溶液染色，從四個孔對細胞存活率進行定量，染色細胞單層的相對吸光度在multiscan酶聯(lián)免疫吸附試驗平板讀數(shù)儀(Flow Laboratories，McLean，Virginia，USA)上在540nm處進行讀數(shù)。。使用Reed和Muench法計算50％終點效價，如果吸光度小于無病毒對照物減去標準誤差的3倍，則該孔被記為陽性。(D)CVA21誘導的溶解性感染。在與CVA21(moi＝1.0TCID50)培育后立即進行偽轉導或用含有人ICAM-1或CD36cDNA的重組腺病毒進行轉導后的24h，對RD細胞單層進行顯微拍照(X200)。
圖16.乳腺、卵巢、前列腺和結腸癌細胞系中的受體表達。在3種人乳腺、卵巢、前列腺和結腸癌細胞系中對ICAM-1和DAF的表達進行流式細胞儀分析。黑色實線直方圖代表僅有綴合物，灰色直方圖表示ICAM-1的表達，黑色空心直方圖表示DAF的表達。
圖17.CVA21-DAFv的體內溶瘤作用。對CVA21-DAFv-誘導的人乳腺、卵巢、前列腺和結腸癌細胞體外培養(yǎng)物的感染進行顯微拍照。細胞單層用CVA21親代或CVA21-DAFv感染，并監(jiān)測細胞的病變效應。感染后的72小時，對單層進行拍照。
圖18.對CVA21-DAFv在人乳腺、卵巢、前列腺和結腸癌細胞系中的溶瘤能力進行定量。將96孔板中的單層癌細胞用CVA21親代或CVA21-DAFv母液的10倍稀釋液進行接種。培育72小時后，觀察細胞單層中病變效應的存在。將顯微鏡下可檢測到細胞病變效應(CPE)的孔記為陽性，使用Reed和Muench法計算50％感染終點效價。
圖19.CVA21-DAFv對人前列腺異源移植物的體內溶瘤作用。對注射2×106PC3細胞后攜帶有生長于側腹部的皮下PC3腫瘤(大約50-100mm3)的SCID(嚴重的合并免疫缺陷)小鼠靜脈內注射單次劑量的CVA21親代、CVA21-DAFv或PBS。使用卡鉗從外部測量平均腫瘤大小，使用球體公式估計腫瘤的體積。腫瘤體積表示成6只被處理小鼠的平均值+/-SE。
圖20.CVA21#272598分離物的外殼編碼區(qū)的序列。(A)核苷酸序列和(B)翻譯的氨基酸序列，其分別對應于SEQ ID NO1和SEQ IDNO2。
圖21.CVA21#275238分離物的外殼編碼區(qū)的序列。(A)核苷酸序列和(B)翻譯的氨基酸序列，其分別對應于SEQ ID NO3和SEQ IDNO4。
圖22.CVA21#272101分離物的外殼編碼區(qū)的序列。(A)核苷酸序列和(B)翻譯的氨基酸序列，其分別對應于SEQ ID NO5和SEQ IDNO6。
圖23.CVA210-DAFv的外殼編碼區(qū)的序列。(A)核苷酸序列和(B)翻譯的氨基酸序列，其分別對應于SEQ ID NO7和SEQ IDNO8。
具體實施例方式
盡管已知一些天然的小RNA病毒和其它病毒如呼腸病毒適用于治療有限種類的癌癥，但仍需要開發(fā)改良的治療方法。為擴大可能的癌癥治療范圍，并提供更有效的治療，通過修飾和生物選擇，當前的發(fā)明人獲得了溶瘤特性提高的新的溶瘤小RNA病毒。
如本文所述，當前發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，野生型小RNA病毒可以加以生物選擇，以溶解性地感染表達DAF但不表達ICAM-1的細胞，這種細胞通常對野生型小RNA病毒感染有抗性。細胞對小RNA病毒感染的“抗性”表示用病毒感染細胞不引起顯著的病毒產生或收率?！耙赘小钡募毎潜憩F(xiàn)出誘導細胞病變效應、病毒蛋白合成、和/或病毒產生的細胞。
基于這些發(fā)現(xiàn)，當前發(fā)明人已開發(fā)出獲得適用于治療哺乳動物腫瘤的新的小RNA病毒的方法。哺乳動物可以是人，或者是有社會、經(jīng)濟或研究意義的任何種屬的個體，這些種屬包括但不限于小鼠、狗、貓、綿羊、山羊、牛、馬、豬、非人靈長類和人。在優(yōu)選的實施方式中，哺乳動物是人。
小RNA病毒可以是天然的或修飾的。當從天然來源中分離并且沒有在實驗室中被人刻意修飾過時，小RNA病毒是“天然的”。例如，小RNA病毒可以獲自“野生來源(field source)”即，來自人類患者。
小RNA病毒可以是修飾的，但其仍能夠溶解性地感染表達DAF和/或ICAM-1的哺乳動物細胞。可以通過下列方法對小RNA病毒進行生物選擇將天然的小RNA病毒在細胞系中培養(yǎng)傳代多次，直至獲得修飾的小RNA病毒。合適的細胞系包括表達DAF的細胞，如癌細胞系。應當認識到，其它細胞系也是合適的。
小RNA病毒可以在為受試者細胞給藥之前進行化學或生物化學上的預處理(例如，用蛋白酶如糜蛋白酶或胰蛋白酶處理)。用蛋白酶預處理除去病毒的外殼或外殼，可以增強病毒的感染性。小RNA病毒可以包覆在脂質體或微團中，以減少或防止對小RNA病毒已產生免疫性的哺乳動物的免疫反應。例如，可以在形成烷基硫酸鹽去垢劑濃縮物的微團的存在下，將病毒體用糜蛋白酶處理，以產生新的感染性亞病毒體顆粒。
小RNA病毒可以是來自兩種或多種類型的具有不同致病表型的小RNA病毒的重組小RNA病毒，使得它就含有不同的抗原決定子，從而減少或防止之前暴露于小RNA病毒亞型的哺乳動物的免疫反應。這種重組病毒體可以通過哺乳動物細胞與不同亞型的小RNA病毒共感染產生，生成的不同亞型的外殼蛋白重新分選并結合到生成的病毒體外殼中。
小RNA病毒可以通過參入突變外殼蛋白來進行修飾，例如VP1、VP2和VP3進入病毒體外外殼。蛋白可通過置換、插入或缺失而突變。置換包括插入不同的氨基酸來代替天然氨基酸。插入包括在一個或多個位點將額外的氨基酸殘基插入到蛋白中。缺失包括蛋白中一個或多個氨基酸殘基的缺失。這些突變可通過本領域已知的方法產生。例如，其中一個外殼蛋白的編碼基因的寡核苷酸定點誘變可以導致生成所需的突變外殼蛋白。在感染小RNA病毒的哺乳動物細胞中體外表達突變蛋白將導致突變蛋白參入小RNA病毒病毒體顆粒。
小RNA病毒還可以修飾成減小或消除對小RNA病毒的免疫反應。這樣修飾的小RNA病毒被稱為“免疫保護的小RNA病毒”。這種修飾可以包括將小RNA病毒包裝在脂質體、微團或其它載體中，使小RNA病毒被掩蔽不受哺乳動物免疫系統(tǒng)影響。另外可選地，小RNA病毒體顆粒的外外殼可以去除或改變，因為存在于外外殼上的蛋白是宿主體液和細胞反應的主要決定因素。
在本發(fā)明的方法中，用小RNA病毒為個體哺乳動物的腫瘤給藥?？梢允褂玫娜诵NA病毒的代表類型包括腸病毒、柯薩奇病毒、艾柯病毒、脊髓灰質炎病毒和未分類腸病毒、鼻病毒、副腸弧病毒、肝病毒和心病毒。在優(yōu)選的方式中，小RNA病毒為柯薩奇病毒。優(yōu)選地，柯薩奇病毒為A型，更優(yōu)選為柯薩奇病毒A21?？梢允褂貌煌逍秃?或不同病毒株的小RNA病毒的組合，例如來自不同動物種屬的小RNA病毒。小RNA病毒是“天然的”即，它是從天然來源中分離的，并且沒有在實驗室中被人刻意修飾過。例如，小RNA病毒可以是從“野生來源”生物選擇的即，來自人類患者。如果需要的話，在為腫瘤給藥之前可以對小RNA病毒進行化學或生物化學上的預處理(例如，用蛋白酶如糜蛋白酶或胰蛋白酶處理)。這種預處理除去了病毒的外殼或外殼，可以增強病毒的感染性。
腫瘤可以是實體腫瘤(例如，肉瘤或癌)，或者是影響造血系統(tǒng)的癌性生長物(“造血系腫瘤”；例如淋巴瘤或白血病)。腫瘤是一種異常組織生長物，它通常形成明顯的塊狀，并通過遠遠快于正常組織生長的速度進行細胞增殖而生長。腫瘤部分或完全地表現(xiàn)出結構組織和與正常組織功能協(xié)調的缺乏。如本文所用，“腫瘤”也指“瘤(tumor)”，其用來包括造血系腫瘤和實體腫瘤。至少腫瘤的一些細胞表達DAF和/或ICAM-1。對本發(fā)明方法的治療特別易感的一種腫瘤是黑色素瘤。其它對本發(fā)明方法的治療特別易感的腫瘤包括乳癌、腦癌(例如成膠質細胞瘤)、肺癌、前列腺癌、結直腸癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、肝癌、白血病、卵巢癌、胃癌和腸癌等。
通常將小RNA病毒在生理學可接受的載體或媒介(如磷酸鹽緩沖鹽水)中為腫瘤給藥。“為腫瘤給藥”是指小RNA病毒的給藥方式是使其與腫瘤的細胞接觸(本文也稱為“腫瘤細胞”)。小RNA病毒給藥的途徑、劑型、載體或媒介取決于腫瘤的位置及類型?？梢圆捎梅秶軐挼慕o藥途徑。例如，對于可觸及的實體腫瘤，可以通過注射將小RNA病毒直接為腫瘤給藥。對于造血系腫瘤，例如，可以將小RNA病毒靜脈內或血管內給藥。對于體內不容易觸及的腫瘤，例如轉移灶或腦腫瘤，小RNA病毒的給藥方式是使其可以通過哺乳動物機體全身輸送，從而到達腫瘤(例如，鞘內、靜脈內或肌肉內)。另外可選地，可以將小RNA病毒為單個實體腫瘤直接給藥，然后它通過機體經(jīng)全身輸送至轉移灶。小RNA病毒也可以經(jīng)皮下、腹膜內、局部(例如對黑色素瘤)、口服(例如口腔或食管腫瘤)、經(jīng)直腸(例如對于結直腸腫瘤)、經(jīng)陰道(例如，宮頸或陰道腫瘤)、經(jīng)鼻或通過噴霧吸入(例如對于肺腫瘤)給藥。
通常，可以根據(jù)本領域普通技術人員公知的方法制備合適的組合物，因此可以包括藥物可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑。
這些組合物可以通過標準途徑來給藥。通常，組合物可通過胃腸外(例如，靜脈內、椎管內、皮下或肌肉內)、口服或局部途徑給藥。更優(yōu)選地，通過胃腸外途徑給藥。
就與組合物的其它成分相容而言，載體、稀釋劑和佐劑必須是“可接受的”，對其接受者是無害的。
藥物可接受載體或稀釋劑的例子是去離子水或蒸餾水；鹽水溶液；植物油如花生油、紅花油、橄欖油、棉籽油、玉米油、芝麻油、如花生油、紅花油、橄欖油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油或椰子油；硅油類，包括聚硅氧烷，如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；揮發(fā)性硅酮類；礦物油，如液狀石蠟、凡士林或角鯊烷；纖維素衍生物，如甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、或羥丙基甲基纖維素；低級烷醇，例如乙醇或異丙醇；低級芳烷醇(aralkanol)；低級聚烷撐二醇或低級烷撐二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，如棕櫚酸異丙酯、肉豆蔻酸異丙酯、或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；瓊脂；黃蓍膠或阿拉伯樹膠、和礦脂。典型地，一種或多種載體可以占組合物重量的10％至99.9％。
本發(fā)明的組合物可以是適合注射給藥的形式、適合口服攝取的形式(如膠囊、片劑、囊片、酏劑)、適合局部給藥的軟膏劑、霜劑或洗劑的形式、適合作為滴眼液輸送的形式、適合吸入給藥(如通過經(jīng)鼻吸入或經(jīng)口吸入)的氣霧劑形式、適合胃腸外給藥(即皮下、肌肉內或靜脈內注射)的形式。
對于以可注射溶液或懸液給藥，胃腸外可接受的無毒稀釋劑或載體可以包括林格氏溶液、等滲鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、乙醇和1，2-丙二醇。
一些口服使用的合適載體、稀釋劑、賦形劑和佐劑的例子包括花生油、液體石蠟、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、海藻酸鈉、阿拉伯樹膠、黃蓍膠、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、明膠和卵磷脂。此外，這些口服劑型可以包含合適的調味劑和著色劑。當以膠囊形式使用時，膠囊可以用延緩崩解的化合物(如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯)包覆。
佐劑典型地包括潤滑劑、乳化劑、增稠劑、防腐劑、殺菌劑和緩沖劑。
口服給藥的固體劑型可以含有人類和獸醫(yī)制藥領域中可接受的粘合劑、甜味劑、崩解劑、稀釋劑、調味劑、包衣劑、防腐劑、潤滑劑、和/或延時劑。合適的粘合劑包括阿拉伯樹膠、明膠、玉米淀粉、黃蓍膠、海藻酸鈉、羧甲基纖維素或聚乙二醇。合適的甜味劑包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜或糖精。合適的崩解劑包括玉米淀粉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜爾膠、黃原膠、膨潤土、藻酸、或瓊脂。合適的稀釋劑包括乳糖、山梨糖醇、甘露醇、葡萄糖、高嶺土、纖維素、碳酸鈣、硅酸鈣或磷酸氫鈣。合適的調味劑包括薄荷油、冬青油、櫻桃味、橙味、或樹莓味調味劑。合適的包衣劑包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或其酯的聚合物或共聚物、蠟、脂肪醇、玉米蛋白、蟲膠、或谷蛋白。合適的防腐劑包括苯甲酸鈉、維生素E、α-生育酚、抗壞血酸、對羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯或亞硫酸氫鈉。合適的潤滑劑包括硬脂酸鎂、硬脂酸、油酸鈉、氯化鈉或滑石。合適的延時劑包括單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
口服給藥的液體劑型除上述試劑以外還可以包括液體載體。合適的液體載體包括水、油類，例如橄欖油、花生油、芝麻油、向日葵油、紅花油、花生油、椰子油、液體石蠟、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、異丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯、或其混合物。
口服給藥的懸液可以進一步包括分散劑和/或懸浮劑。合適的懸浮劑包括羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸鈉、或乙?；肌：线m的分散劑包括卵磷脂、脂肪酸的聚氧乙烯酯，如硬脂酸、聚氧乙烯山梨醇單或二油酸酯、-硬脂酸酯、或-月桂酸酯、聚氧乙烯去水山梨糖醇單或二油酸酯、-硬脂酸酯、或-月桂酯和類似物。
口服給藥的乳液可以進一步包括一種或多種乳化劑。合適的乳化劑包括上文例舉的分散劑或天然樹膠，如瓜爾膠、阿拉伯樹膠或黃蓍膠。
胃腸外給藥組合物的方制備法對于本領域專業(yè)技術人員是顯而易見的，例如，更詳細地見述于Remington′s Pharmaceutical Science，第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，在此將其引入作為參考。
本發(fā)明的局部用藥制劑包括活性成分以及一種或多種可接受的載體，任選地包括任何其它治療成分。適合局部用藥的制劑包括適合透過皮膚到達需治療部位的液體或半液體制劑，例如擦劑、洗劑、霜劑、軟膏劑或糊劑，以及適合眼、耳或鼻給藥的滴劑。
根據(jù)本發(fā)明的滴劑可包括無菌水性或油性溶液或懸液?？梢酝ㄟ^將活性成分溶解在殺菌劑和/或抗真菌劑和/或任何其它合適防腐劑的水溶液(其任選地包括表面活性劑)中來制備這些。然后可以將得到的溶液通過過濾澄清，轉移到合適的容器中并消毒。消毒可以通過下列方法完成高壓滅菌法，或者在90℃-100℃下維持半小時，或者通過過濾、然后通過無菌技術轉移至容器中。適合包含在滴劑中的殺菌劑和抗真菌劑的例子是硝酸苯汞或醋酸苯汞(0.002％)、苯扎氯銨(0.01％)和醋酸洗必泰(0.01％)。油性溶液制劑的合適溶劑包括甘油、稀釋的乙醇和丙二醇。
根據(jù)本發(fā)明的洗劑包括適合用于皮膚或眼部的劑型。眼洗劑可包括無菌水溶液，其可任選地含有殺菌劑，可以通過與上述滴劑制備相似的方法進行制備。用于皮膚的洗劑或擦劑還可以包括加速干燥和使皮膚涼爽的試劑，例如乙醇或丙酮、和/或潤濕劑如甘油、或油類如蓖麻油或花生油。
根據(jù)本發(fā)明的霜劑、軟膏劑或糊劑是外用的活性成分的半固體劑型。它們可以通過下列方法制備將單獨的、或者水性或非水性液體的溶液或懸液中的磨碎或粉末形式的活性成分與油質或非油質基質混合?；|可以包括碳氫化合物，如硬石蠟、軟石蠟或液體石蠟，甘油、蜂蠟、金屬皂；膠漿劑；天然來源的油，如杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油、或橄欖油；羊毛脂或其衍生物，或者脂肪酸如硬脂酸或油酸，以及醇，如丙二醇或聚乙二醇。
組合物中可以加入任何合適的表面活性劑如陽離子、陰離子或非離子型表面活性劑，例如去水山梨糖醇酯或其聚氧乙烯衍生物。還可以包括懸浮劑，例如天然樹膠、纖維素衍生物或無機物如硅酸鹽，以及其它成分如羊毛脂。
將小RNA病毒或者獲自或源自小RNA病毒的核酸以足夠治療腫瘤的量(例如，“有效量”)給藥。用小RNA病毒為腫瘤細胞給藥實現(xiàn)腫瘤細胞溶解，引起腫瘤的大小減少、或腫瘤完全消失時，腫瘤得以“治療”。腫瘤大小的減少、或優(yōu)選的腫瘤消失通常是腫瘤細胞被小RNA病毒溶解(“溶瘤作用”)造成的。有效量可以根據(jù)個體的情況確定，可以至少部分考慮小RNA病毒的類型；個體的大小、年齡、性別；以及腫瘤的大小和其它特征。例如，對于人類的治療，根據(jù)存在腫瘤的類型、大小和數(shù)量，可以使用大約102至1012蝕斑形成單位(PFU)的小RNA病毒。優(yōu)選地，接種物含有大于約105PFU，例如，在大約105至106PFU之間、或大約106至107PFU之間。更優(yōu)選地，接種物可以含有大約1×106至大約5×106PFU，如大約3×106PFU。例如，對于人黑色素瘤的治療，可以使用一種或多種大約3×106PFU的接種物?？梢詫⑿NA病毒以單次劑量或多次劑量(即，劑量超過一次)給藥。多次劑量可以同時給藥，或連續(xù)給藥(例如，在幾天或幾周的時間內)。典型地，在治療性應用中，治療要根據(jù)疾病狀態(tài)的持續(xù)時間維持一段時間，例如，至少直至通過常規(guī)手段檢查不到腫瘤。還應當考慮到，在檢查不到腫瘤以后可能需要繼續(xù)進行治療，例如，治療醫(yī)師懷疑存在有未檢查到的腫瘤。也可以將小RNA病毒或核酸為同一個體內的一個以上的腫瘤給藥。
需要用小RNA病毒多次給藥時，可以每次用不同的病毒給藥，以避免對之前所給藥病毒的任何免疫反應的影響或將這種影響降至最低，治療周期可以持續(xù)1至2周或更長時間，這一點可以由主治醫(yī)生確定。最優(yōu)選地，可以用哺乳動物之前未接觸過的病毒或者哺乳動物對其產生的免疫反應相對較小的病毒給藥，這一點可以通過標準技術確定。
本發(fā)明包括能夠在基本上不存在細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細胞的分離的小RNA病毒核酸分子。在一個實施方式中，核酸分子可以源自小RNA病毒，也可以是來自病毒的單鏈RNA或互補DNA。應當認識到，本發(fā)明的核酸序列包括來源于小RNA病毒的核酸序列，例如，包括編碼病毒基因組的核酸序列、或者其足以使病毒產生或能夠在細胞內引起溶解性感染的序列。例如，核酸分子可以包括單個病毒RNA或DNA分子，例如互補DNA分子、或編碼不同病毒序列的多種上述分子。
本文所用的術語“聚核苷酸”是指單鏈或雙鏈的脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸堿基、已知的類似物、或天然核苷酸、或其混合物的聚合物。
應當理解到，在本說明書的上下文中，術語“源自”包括序列可以是直接從小RNA病毒分離的病毒RNA、合成的RNA、對應于所分離序列的cDNA。該術語還包括與野生型序列或親代序列相比在序列上包括一個或多個突變(其包括，例如外殼蛋白的突變)的合成聚核苷酸。
可以使用任何合適的分離病毒RNA的方法，其包括基于使用苯酚/氯仿提取的方法，例如市售的病毒RNA分離試劑盒如TrizolLSreagent(GIBCO BRL，Life Technologies Grand Island，NY，USA)所提供的方法；采用基于磁珠分離的分離方法，例如Ambion MagMaxTM病毒RNA分離試劑盒。病毒RNA的分離方法通常見述于例如，Ausubel，F(xiàn).等人主編，Current Protocols in Molecular Biology(現(xiàn)代分子生物學方法).1992，Green Publishing Associates and Wiley-lnterscience，JohnWileyand SonsNew York和Sambrook等人，(1989)，Molecular CloningALaboratory Manual(分子克隆實驗手冊)，第二版，Cold Spring HarbourLaboratory Press，New York。
應當認識到，無論核酸序列(如病毒RNA)是從病毒中直接分離的、合成的、呈現(xiàn)為質粒分子、還是在體外產生(如使用噬菌體T7RNA聚合酶從cDNA模板產生)，本發(fā)明不要求其不含污染物質(如細胞碎片)，其在本說明書的文中被認為是“分離的”。因此，在本說明書的上下文中，當原料中的非RNA成分(如細胞蛋白)已經(jīng)部分或全部地從RNA中除去時，RNA被視為是分離的。例如，當超過50％的非RNA物質被除去時，RNA被視為是“分離的”。優(yōu)選超過60％的非RNA物質被除去，更優(yōu)選超過70％、80％或90％的非RNA物質被除去。典型地，RNA含有小于10％的污染物質，更典型地，小于5％的污染物質。因此，優(yōu)選地，病毒RNA的RNA純度大于95％，更優(yōu)選純度大于97％或純度大于99％。
優(yōu)選地，核酸分子包括選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ IDNO5和SEQ ID NO7的核酸序列。本領域技術人員將會認識到，考慮到遺傳密碼的簡并性，這些聚核苷酸分子之間可能有相當大的序列上的變化。
本發(fā)明還提供與在此公開的聚核苷酸(SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5和SEQ ID NO7)基本相似的分離的聚核苷酸序列，這些序列包括或提供能夠在基本上不存在細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細胞的小RNA病毒。聚核苷酸序列變體與SEQID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5和SEQ ID NO7中的一個或多個具有性質相同的生物學活性。本文所用的術語“基本相似”是指與SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5和SEQ ID NO7中的任意一個所示序列的序列同一性為至少大約60％、更優(yōu)選為至少大約70％、再更優(yōu)選為至少大約80％的序列。典型地，這種序列與SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5和SEQ ID NO7中的任意一個的同一性更優(yōu)選為至少大約90％，最優(yōu)選為至少大約95％或更高。
本文所用的“序列同一性”是指當通過本領域公知的計算機程序(例如GCG程序包(Program Manual for the Wisconsin Package，Version8，August1996，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-453)提供的GAP)在特定的比較窗中進行最大一致性排比時，兩個序列中的殘基是相同的。
除上文對本發(fā)明序列的描述以外，應當認識到，本發(fā)明的序列包括變異的序列，例如，對于多肽序列來說，序列包括一個或多個氨基酸置換、缺失和/或改變(如保守氨基酸的改變)，對于聚核苷酸序列來說，序列編碼包括一個或多個氨基酸置換、缺失和/或改變的(如一個或多個保守氨基酸的改變)的多肽序列。優(yōu)選地，這些改變的性質微小，即，保守氨基酸的置換和其它置換不會顯著影響到序列的活性，例如使病毒能夠在基本上不存在細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細胞。保守氨基酸的置換及其引入方法是本領域公知的，通常，是指將多肽鏈(蛋白的一級序列)中的一個氨基酸置換或替換性質相似的另一個氨基酸。例如，帶電的谷氨酸(Glu)替換成帶有相似電荷的氨基酸天冬氨酸(Asp)便為保守氨基酸取代?？梢允褂孟铝斜砀褡鳛橹笇П?保守氨基酸置換

變異的序列包括，例如，本文所述的外殼蛋白變更的保守置換。例如，可以預計包括突變體VP3R96H的保守置換(如VP3R96K)的序列具有所需的特性。類似地，可以預計包括突變體VP3E101A的保守置換(如VP3E101G、VP3E101T、VP3E101S、或VP3E101M)的一個或多個序列具有所需的特性。作為其它例子，可以預計包括突變體VP3A239S的保守置換(如VP3A239G、VP3A239T、或VP3A239M)的一個或多個序列具有所需的特性。仍然是其它例子，可以預計包括突變體VP2S164L的保守置換(如VP2S1641或VP2S164V)的一個或多個序列具有所需的特性。
如本文所述，根據(jù)本發(fā)明，很容易檢測變異序列的功能性。
還應當認識到，可以通過使用RNA基因組或基因組的互補DNA拷貝而將小RNA病毒間接給藥。給藥時，小RNA病毒仍然能夠在細胞中復制，并造成期望的溶解性感染和致死。
因此，除完整病毒之外，可以將參入產生病毒的核酸的病毒或其它質?；虮磉_載體注射到腫瘤中，以被腫瘤細胞攝取，在細胞內產生完整的病毒以發(fā)揮治療作用。合適的表達載體包括能夠表達編碼產生病毒所必需的病毒蛋白的DNA(例如基因組DNA或cDNA)插入片斷的質粒。表達載體典型地包括與插入的核酸可操作式連接的轉錄調節(jié)控制序列?！翱刹僮魇竭B接”是指核酸插入片斷與轉錄調節(jié)控制序列連接，使得插入的序列可以在不進行插入片斷讀框移位的情況下進行轉錄。這種轉錄調節(jié)控制序列包括促進RNA聚合酶的結合以啟動轉錄的啟動子、以及使核糖體能夠與轉錄的mRNA結合的表達控制元件。
更具體地，本文所用的術語“調節(jié)控制序列”應當理解成包括任何參與驅動轉錄和控制(即調節(jié))指定DNA序列轉錄水平的DNA。例如，5′調節(jié)控制序列是位于編碼序列上游的DNA序列，其可以包括啟動子和5′不翻譯的前導序列。3′調節(jié)控制序列是位于編碼序列下游的DNA序列，其可以包括合適的包括一個或多個加A信號的轉錄終止(和/或)調節(jié)信號。如本文所用，術語“啟動子”包括任何在轉錄啟動過程中被依賴DNA的RNA聚合酶所識別并與其結合結合(直接或間接)的DNA序列。啟動子包括轉錄啟動位點、和轉錄啟動因子和RNA聚合酶的結合位點，其可以包括各種可以結合基因表達調節(jié)蛋白的其它位點或序列(如增強子)。
大量適于轉染哺乳動物細胞的表達載體是本領域已知的。適于轉染哺乳動物細胞的表達載體包括pSV2neo、pEF-PGk.Puro、pTk2、和參入聚腺苷酸化位點和延伸因子1-x啟動子的非復制腺病毒穿梭載體、和更優(yōu)選參入巨細胞病毒(CMV)啟動子的基于pAdEasy的表達載體(例如，見He等人，1998)。還可以使用采用多肽延伸因子-α2作為啟動子的質粒pEFBOS。編碼產生病毒所必需的病毒蛋白的cDNA可以通過下列方法制備使用本領域公知的重組技術，例如Sambrook等人(1989)，Molecular CloningA Laboratory Manual(分子克隆實驗手冊)，第二版，Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York和Ausubel等人，(1994)，Current Protocols in Molecular Biology(現(xiàn)代分子生物學方法)，USA，Vol.1and2中所述，逆轉錄病毒RNA基因組或其片段，并參入到合適的載體中。
除cDNA之外，細胞可以用自純化的病毒體中提取的病毒RNA轉染，或者，例如，如Ansardi，D.C.等人，2001所述，在體外使用噬菌體T7RNA聚合酶從cDNA模板產生RNA轉錄物。
類似地，可以以單個質?；騌NA分子給藥，以表達病毒蛋白和產生病毒，或者以編碼不同病毒蛋白的多種質?；騌NA分子給藥，以轉染細胞和產生病毒。
可以將質?；騌NA通過，例如局部給藥或注射，為腫瘤給藥，以便在不存在促進細胞轉染的載體媒介或與這種媒介結合的情況下被腫瘤細胞攝取。合適的載體媒介包括脂質體，典型地提供成本領域公知的水包油乳劑。脂質體典型地包括脂類、特別是磷脂的組合，例如相變溫度高的磷脂，其通常具有一個或多個類固醇或類固醇前體(如膽固醇)，以便為脂質體提供膜穩(wěn)定性。用于提供脂質體的脂類的例子包括磷脂?；衔铮缌字８视?、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、鞘脂、磷脂酰乙醇胺、腦苷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂。特別合適的是磷脂酰甘油二酯(diacyl phosphateidylglycerol)，其中脂質部分含有14至18個碳原子，更優(yōu)選為16至18個碳原子，并且是飽和的。
可以將小RNA病毒或包括小RNA病毒的組合物可以脂質體的形式給藥。脂質體通常來源于磷脂或其它脂類物質，由分散在水相介質中的單層或多層水合液晶形成?？梢允褂萌魏文軌蛐纬芍|體的無毒、生理可接受、且可代謝的脂類。脂質體形式的組合物可以含有穩(wěn)定劑、防腐劑、賦形劑和類似物。優(yōu)選的脂類是天然或合成的磷脂和磷脂酰膽堿(卵磷脂)。形成脂質體的方法是本領域公知的，與此相關可以查閱以下文獻Prescott主編，Methods in Cell Biology(細胞生物學方法)，Volume XIV，Academic Press，New York，N.Y.(1976)，33頁以后，在此并入其內容作為參考。
脂質體與靶細胞的相互作用可以是被動的或主動的。主動靶向涉及在脂質體膜中引入與靶細胞表達的相應配體結合或相互作用的特異性配體對脂質體進行修飾。這種配體包括，例如，單克隆抗體或其結合片段(例如，F(xiàn)ab或F(ab′)2片段)、糖或糖脂部分、或者特別優(yōu)選的對DAF有特異性的病毒蛋白或單克隆抗體。
可以將小RNA病毒與其它的治療劑結合給藥。例如，可以將小RNA病毒可與一種或多種不同血清型或病毒株的小RNA病毒結合給藥。其它血清型或病毒株的小RNA病毒對細胞感染的受體要求與本發(fā)明的小RNA可以是相同的，也可以是不同的。
作為其它例子，可以小RNA病毒或其組合與一種或多種能夠調節(jié)或抑制被治療個體的免疫反應的藥物結合給藥。以這種方式，個體對病毒感染的天然免疫反應可以被改變，因此優(yōu)選地使病毒感染和/或溶瘤結果更有效。典型地，能夠改變免疫反應的藥物是能夠抑制免疫反應的藥物。能夠調節(jié)或抑制個體(如人類個體)免疫反應的藥物見述于例如，The Merck Index，第13版，Merck&Co.Inc，WhitehouseStation，NJ，USA.，再次并入其內容作為參考。
小RNA病毒或其組合可以與一種或多種化療藥物(也稱為抗腫瘤藥)聯(lián)合使用?？鼓[瘤藥見述于例如，The Merck Index，第13版，Merck&Co.Inc，Whitehouse Station，NJ，USA。例如，可以將小RNA病毒與下列化療藥物結合給藥，例如阿霉素、紫杉醇、氟尿嘧啶、美法侖(melphalan)、順鉑(cisplatin)、α-干擾素、COMP(環(huán)磷酰胺、長春新堿、甲氨喋呤和強的松)、依托泊甙(etoposide)、mBACOD(甲氨喋呤、博來霉素、多柔比星(doxorubicin)、環(huán)磷酰胺、長春新堿、地塞米松)、PROMACE/MOPP(強的松、甲氨喋呤(w/leucovin rescue)、多柔比星、環(huán)磷酰胺、紫杉醇、依托泊甙/mechlorethamine、長春新堿、強的松和甲基芐肼)、長春新堿、長春花堿、血管抑制素(angioinhibins)、TNP-470、硫酸戊聚糖鹽(pentosan polysulfate)、血小板因子4、血管抑制素(angiostatin)、LM-609、SU-101、CM-101、Techgalan、沙立度胺(thalidomide)、SP-PG、和類似物。其它的化療藥物包括烷化劑，例如，氮芥，包括mechloethamine、melphan、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺和異環(huán)磷酰胺；亞硝脲，包括卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、和鏈脲霉素；烷基磺酸鹽，包括白消安(busulfan)；三嗪類，包括達卡巴嗪；ethyenimines，包括硫替派(thiotepa)和六甲蜜胺；葉酸類似物，包括甲氨喋呤；嘧啶類似物包括5-氟尿嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷；嘌呤類似物，包括6-巰基嘌呤和6-硫代鳥嘌呤；抗腫瘤抗生素，包括放線菌素D；蒽環(huán)類，包括多柔比星、博來霉素、絲裂霉素C、和methramycin；激素和激素拮抗劑，包括他莫西芬(tamoxifen)和皮質醇(cortiosteroids)；混雜藥物，包括順鉑和布喹那(brequinar)。小RNA病毒可以與博來霉素、長春地辛、長春新堿、dactamycin、丙卡巴肼、洛莫司汀或達卡巴嗪中的一種或多種結合給藥，以治療，例如，黑色素瘤。小RNA病毒可以與順鉑和卡鉑中的一種或多種結合給藥，以治療，例如，卵巢癌。其它可以與小RNA病毒結合使用以治療，例如乳腺癌的化療藥物的例子包括環(huán)磷酰胺(Cytoxan)、甲氨喋呤(Amethopterin、Mexate、Folex)、和氟尿嘧啶(Fluorouracil、5-FU、Adrucil)[縮寫為CMF]；環(huán)磷酰胺、多柔比星(Adriamycin)、和氟尿嘧啶[縮寫為CAF]；多柔比星(Adriamycin)和環(huán)磷酰胺[縮寫為AC]；多柔比星(Adriamycin)和環(huán)磷酰胺及紫杉醇(Taxol)；多柔比星(Adriamycin)，然后是CMF；環(huán)磷酰胺、表柔比星(Ellence)、和氟尿嘧啶。用于治療例如女性乳腺癌的其它化療藥物包括，例如，多烯紫杉醇(Taxotere)、長春瑞賓(Navelbine)、吉西他汀(Gemzar)、和卡培他汀(Xeloda)。
應當認識到，小RNA病毒與一種或多種其它藥物(如一種或多種其它的小RNA病毒、一種或多種能夠調節(jié)或刺激免疫反應的藥物、或一種或多種抗腫瘤藥物)的“結合”使用給藥，是指以小RNA病毒和其它藥物具有治療作用(如重疊暫時作用)的方式使用或給藥?？梢詫⒔Y合的成員同時給藥，或者以任何次序單獨給藥，以達到所需的治療作用。當考慮結合治療時，小RNA病毒和其它藥物可以是物理混合物的形式，或者單獨提供，例如，以帶有或不帶有使用說明書的試劑盒的形式。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒還可以包括其它實施本發(fā)明的方法所需的成分，如緩沖液和/或稀釋液。典型地，試劑盒包括容納多種組件的容器或和使用本發(fā)明方法中試劑盒成分的說明書。
應當認識到，本發(fā)明的藥物組合物包括小RNA病毒與一種或多種其它治療藥物物理混合的組合物，以及僅包括小RNA病毒作為治療活性藥物的組合物。
還應當認識到，在本發(fā)明的方法中，小RNA病毒可以與其它的腫瘤治療方法結合使用，例如腫瘤的外科減積或切除和/或化療和/或放療。例如，需要治療實體腫瘤時，小RNA病毒可以作為腫瘤外科減積或切除的輔助用藥使用。
如本文所用，無論是天然病毒還是人類刻意或非刻意修飾的病毒，“分離的”病毒是指已經(jīng)除去和其一起被發(fā)現(xiàn)的某些或所有的成分，或者從和其一起被發(fā)現(xiàn)的某些或所有成分中除去。這些成分是指污染的成分。應當認識到，“分離的”病毒并不需要是病毒的純制劑，純制劑的含義是所有污染成分已經(jīng)被除去。因此，當非病毒成分已經(jīng)部分或全部地從病毒中除去時，病毒將被視為是“分離的”。例如，當超過大約50％的污染物質被除去時，病毒將被視為是“分離的”。優(yōu)選超過60％的污染物質被除去，更優(yōu)選超過70％的污染物質被除去。典型地，分離的病毒超過大約80％或超過大約90％的污染物質被除去。更典型地，超過大約95％、或大約97％污染物質被除去。在一個實施方式中，超過99％的污染物質被除去。
如本文所用，用于細胞時，“在基本上不存在ICAM-1的情況下”是指細胞表達很少的ICAM-1，或不表達ICAM-1。特別地，應當理解到，這種細胞表達的ICAM-1不足以為細胞被病毒溶解性感染提供基礎，所述病毒的感染要求存在有ICAM-1。
如本文所用，使細胞與病毒“接觸”是指將病毒置于細胞培養(yǎng)液中，使病毒有機會與細胞接觸，這可以導致病毒成功地細胞或通過凋亡誘導細胞死亡。
如本文所用，“病毒感染”是指病毒侵入細胞，隨后病毒在細胞中復制或通過凋亡誘導細胞死亡。
如本文所用，“感染復數(shù)”是指當病毒與細胞接觸時，病毒數(shù)目與細胞數(shù)目的比例。
如本文所用，“細胞溶解”是指細胞的細胞膜破壞，隨后釋放出細胞的所有或部分內容物，或者通過凋亡誘導細胞死亡。
如本文所用，“完全溶解”是指多細胞培養(yǎng)物中的每個細胞的溶解。
如本文所用，“培養(yǎng)條件”是指培養(yǎng)細胞所用的條件，包括單不限于溫度、培養(yǎng)容器的種類、濕度、CO2或任何培養(yǎng)容器中使用的其它氣體的濃度、培養(yǎng)基的種類、培養(yǎng)細胞的初始密度、以及細胞是否被病毒感染、初始的感染復數(shù)。
如本文所用，“細胞關聯(lián)”的病毒是指吸附于其中已經(jīng)生成病毒的細胞的一部分中或包繞在其中的病毒。因此，宿主細胞溶解前病毒是細胞關聯(lián)的。當細胞開始溶解時，病毒可以仍然吸附于破裂細胞的一部分或包繞在其中，保持與細胞關聯(lián)。但是，當病毒被釋放至培養(yǎng)基中時，便不再與細胞關聯(lián)。
如本文所用，當細胞膜破裂，并且從細胞中釋放出至少一些細胞內容物時，細胞被“破壞”。例如，可以通過冷凍-復溫、超聲或去污劑處理來破壞細胞。
如本文所用，“收取”病毒是指從之前已經(jīng)被病毒感染的細胞培養(yǎng)物中收集生成的病毒的行為。如果病毒仍然與細胞關聯(lián)，回收病毒可以涉及破壞宿主細胞?？蛇x擇但并非優(yōu)選地，可以從培養(yǎng)基中收取已經(jīng)釋放至培養(yǎng)基中的病毒粒子。
如本文所用，細胞變得腫脹、外觀呈顆粒狀、細胞膜破壞表示“細胞病變作用”。顯示細胞病變作用的細胞在活細胞計數(shù)染色時為陰性，因為它們攝取了染色染料，或者細胞DNA發(fā)生降解。
如本文所用，“粘附細胞”是在細胞培養(yǎng)中粘附于培養(yǎng)容器的細胞。粘附細胞的例子包括單層細胞，其為在培養(yǎng)容器表面上形成細胞單層的細胞?！皯腋〖毎被颉皯腋〉募毎笔侵冈诩毎囵B(yǎng)中不粘附于培養(yǎng)容器的細胞。懸浮細胞可以“旋轉培養(yǎng)”的方式生長，這是一種在培養(yǎng)過程中對培養(yǎng)基進行連續(xù)攪拌的培養(yǎng)方法。
如本文所用，“細胞的生存力”或“活細胞百分比”是指在種群中未顯示細胞病變作用的細胞的百分比。
如本文所用，“收取時間”是指收集和純化小RNA病毒的時間點。優(yōu)選地，當效價足夠高、病毒仍然與細胞關聯(lián)的時候收取病毒。盡管即使在細胞完全溶解后也可以收取病毒，仍需在病毒從細胞釋放之前收取病毒，以簡化純化過程。因此，對細胞生存力進行定期測量，以作為病毒是否仍與細胞關聯(lián)的指征。通常，當至少5％的細胞存活時收取病毒。優(yōu)選地，當20-95％的細胞存活、更優(yōu)選為35-90％的細胞存活、最優(yōu)選為50-80％的細胞存活時收取病毒。
為更清晰地理解本發(fā)明，參考下列實施例和附圖對優(yōu)選方式進行描述，其不應當理解成對本發(fā)明的范圍進行限定。
材料和方法細胞和病毒柯薩奇病毒A21(CVA21)原型病毒株Kuykendall和三個臨床分離株(#272101、#272598和#275238)從Dr Margery Kennett，Entero-respiratory Laboratory，F(xiàn)airfield Hospital，Melbourne，Victoria，Australia處獲得。分離株#272101從一名26歲的男性HIV感染者中獲得，分離株#275238從一名死于嬰兒猝死綜合癥的3個月嬰兒中獲得，分離株#272598從一名患有急性哮吼的8歲男孩中分離。臨床CVA21分離株在Hela細胞和/或人肺成纖維細胞或HeLa-T細胞中大約傳代三次，在表達ICAM-1的橫紋肌肉瘤(RD)細胞(RD-ICAM-1)中傳代一次(Shafren，D.R.，D.J.Dorahy，R.A.Ingham，G.F.Burns和R.D.Barry.1997.Coxsackievirus A21 binds to decay-accelerating factor butrequires intercellular adhesion molecule1for cell entry(柯薩奇病毒A21與衰變加速因子結合但需要細胞間粘附分子1以侵入細胞).J.Virol.714736-4743)。CVA21的原型病毒株在HeLa和/或人肺成纖維細胞或HeLa-T細胞中大約傳代10次，在RD-ICAM-1細胞中傳代3-4次。
CVA21原型病毒株(Kuykendall，GenBank編號AF465515)從Dr Margery Kennett處獲得，在SkMel28(在此指定為CVA21親代)細胞中進行雙噬斑純化。對CVA21-DAFv進行生物選擇，通過如本文所述在RD細胞中進行連續(xù)傳代在ICAM-1陰性細胞中生長。體內研究用的病毒在SkMel28(CVA21親代)或RD細胞(CVA21-DAFv)的單層中制備，并如上文所述，通過以5-30％的蔗糖梯度進行速度離心來純化，將峰值餾分匯集在一起，使用PBS透析，并儲存在-80℃下。使用Reed和Muench終點法，在SkMel28細胞上測定病毒母液(CVA21親代和CVA21-DAFv)的效價。
HeLa細胞從American Type Culture Collection(美國典型培養(yǎng)物收藏中心)Manassas，VA，USA獲得；同時，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞從Dr Bruce Loveland，Austin Research Institute，Heidelberg，Victoria，Australia處獲得。
人黑色素瘤細胞系SkMel28從Dr.S.J.Ralph(Department ofBiochemistry and Molecular Biology，Monash University，Victoria，Australia)獲得；橫紋肌肉瘤(RD)細胞從Dr Margery Kennett(Entero-respiratory Laboratory，F(xiàn)airfield Hospital，Melbourne，Victoria，Australia)處獲得；中國倉鼠卵巢(CHO)細胞從Dr Bruce Loveland(Austin Research Institute，Heidelberg，Victoria，Australia)處獲得；卵巢癌細胞系DOV13從Dr lan Campbell(Peter MacCallum Cancer Centre，Melbourne，Australia)處獲得。CHO細胞穩(wěn)定地表達ICAM-1或DAF(CHO-DAF和CHO-ICAM-1細胞)。CVA21原型病毒株(Kuykendall，GenBank編號AF465515)從Dr Margery Kennett處獲得，并在SkMel28細胞中繁殖。
人乳腺癌細胞系(MDA-MB157、MDA-MB453、ZR-75-1)、上皮卵巢癌細胞系(OVHS-1、OAW-42、DOV13)和無限增殖化的正常人卵巢表面上皮細胞系(HOSE)從Peter MacCallum Cancer Centre(Melboume，Australia)獲得；人前列腺細胞系(PC3和DU145)從Garvan Institute，Sydney，Australia處獲得，LNCaP細胞從ElizabethWilliams，Bernard O′Brien Institute of Microsurgery，Melbourne，Australia處獲得；人結直腸癌細胞系(HCT116、SW620)從Peter MacCallumCancer Centre獲得，HT-29從John Hunter Hospital(Newcastle，Australia)獲得。
抗體對ICAM-1的第一個結構功能區(qū)有特異性的抗-ICAM-1MAbWEHI(Berendt，A.R.，A.McDowell，A.G.Craig，P.A.Bates，M.J.E.Sternberg，K.Marsh，C.1.Newbold，和N.Hogg.1992.The binding siteon ICAM-1 for Plasmodium faiparum-infected erythrocytes overlaps，butis distinct from the LFA-1 binding site(惡性瘧原蟲感染的紅細胞的ICAM-1結合位點覆蓋LFA-1結合位點，但與其不同).Cell6871-81)由Dr Andrew Boyd，Queensland Institute of Medical Research，Queensland，Australia提供?？?DAF MAb IA10(IgG2a)識別DAF的第一個短共有重復片斷(SCR)，VIIIA7(IgG1)識別第三個SCR和第二個SCR的一部分(Kinoshita，T.，M.E.Medof，R.Silber和V.Nussenzweig.1985.Distribution of decay accelerating factor in theperipheral blood of normal individuals and patients with paroxysmalnocturnal hemoglobinuria(正常個體和陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿患者外周血中衰變加速因子的分布).J.Exp.Med.16275-92)，IH4(IgG1)識別DAF的第三個SCR(Coyne，K.E.，E.S.Hall，M.A.Thompson，M.A.Arce，T.Kinoshoita，T.Fujita，D.J.Anstee，W.Rosse，和D.M.Lublin.1992.Mapping of epitopes，glycosylation sites，and complement regulatorydomains in human decay accelerating factor(人衰變加速因子表位、糖基化位點、和補體調解功能結構區(qū)的分析).J.Immunol.1492906-2913)，而IIH6(IgG1)識別第四個SCR(Kinoshita，T.，M.E.Medof，R.Silber和V.Nussenzweig.1985.Distribution of decay accelerating factor in theperipheral blood of normal individuals and patients with paroxysmalnocturnal hemoglobinuria(正常個體和陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿患者外周血中衰變加速因子的分布).J.Exp.Med.16275-9)。MAbs IA10、VIIIA7和IIH6由Dr Taroh Kinoshita，Department of Immunoregulation，Osaka University，Osaka，Japan饋贈。MAb IH4由Dr Bruce Loveland，Austin Research Institute，Heidelberg，Victoria，Australia饋贈。
對DAF的SCR3有特異性的抗-DAF mAb IH4(Coyne，K.E.，S.E.Hall，S.Thompson，M.A.Arce，T.Kinoshita，T.Fujita，D.J.Anstee，W.Rosse，和D.M.Lublin.1992.Mapping of epitopes，glycosylation sites，and complement regulatory domains in human decay accelerating factor(人衰變加速因子表位、糖基化位點、和補體調解功能結構區(qū)的基因定位分析).J.Immunol.1492906-2913)和人重組可溶性DAF(sDAF)由Dr Bruce Loveland饋贈；指向SCR1的抗-DAF mAb IA10由Dr TarohKinoshita(Department of Immunoregulation，Osaka University，Osaka，Japan)饋贈；抗-ICAM-1WEHI mAb指向ICAM-1的N-端結構功能區(qū)(Hoover-Litty，H.和J.M.Greve.1993.Formation of rhinovirus-solubleICAM-1complexes and conformational changes in the virion(形成鼻病毒可溶性ICAM-1復合體和病毒體中的構象變化).J Virol.67390-397)，由Dr Andrew Boyd(Queensland Institute for Medical Research，Queensland，Australia)提供。
病毒純化和放射性同位素標記結合試驗將6孔組織培養(yǎng)板中的匯合成片的RD-ICAM-1細胞單層在37℃下用500μl合適的CVA21病毒株(1×105TCID50/ml)接種1h。用不含蛋氨酸/半胱氨酸的DMEM(ICN Biochemicals，Aurora，Ohio，USA)沖洗三次，除去未結合的病毒，然后加入不含蛋氨酸/半胱氨酸的DMEM，將細胞單層繼續(xù)培育2h，然后加入300μCi[35S]-蛋氨酸/半胱氨酸Trans-Label(ICN Radiochemicals，Irvine，California，USA)。然后將感染的單層在37℃下在5％CO2的環(huán)境中培育12h。在三次冷凍/復溫循環(huán)后，將病毒溶解物在5-30％的蔗糖梯度下進行純化(Shafren，D.R.，R.C.Bates，M.V.Agrez，R.L.Herd，G.F.Burns和R.D.Barry.1995.Coxsackieviruses B1，B3andB5use decay accelerating factor as a receptorfor cell attachment(柯薩奇病毒B1、B3和B5使用衰變加速分子作為細胞吸附的受體).J.Virol.693873～3877)。從各試管的底部收集餾分，并在1450Microbeta TRILUX(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)上通過液體閃爍計數(shù)進行監(jiān)測，對放射性同位素標記病毒結合試驗中使用的160S峰餾分進行定位。
使用HeLa細胞的放射性同位素標記病毒結合試驗在24孔組織培養(yǎng)板中進行(Shafren等人，1995)。使用細胞懸液進行轉染CHO細胞的病毒結合試驗。在存在300μl(大約1×105CPM)的[35S]-蛋氨酸標記病毒的情況下，在室溫下將大約1×106細胞在800μl含有1％牛血清白蛋白(BSA)的DMEM中培育2小時。然后將細胞用溶解在200μl0.2MNaOH-1％十二烷基硫酸鈉(SDS)中的無血清DMEM沖洗四次，然后通過液體閃爍計數(shù)測定[35S]-蛋氨酸標記病毒的結合量。當需要時，在加入放射性同位素標記的病毒之前，將細胞與20μg/ml抗-DAF或抗-ICAM-1MAb或磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)(SigmaChemicals，Sydney，New South Wales，Australia)(每5×106細胞1.0U)(Davitz，M.A.，M.G.Low和V.Nussenzweig.1986.Release ofdecay-accelerating factor (DAF)from the cell membrane byphosphatidylinositol-specific phospholipase C(PI-PLC).Selectivemodification of a complement regulatory protein(通過磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)從細胞膜上釋放衰變加速因子(DAF)。補體調控蛋白的選擇性修飾).J.Exp.Med.1631150-1161)在37℃下預培育1小時。
病毒感染性測定在96孔組織培養(yǎng)板中，將匯合成片的RD和RD-ICAM-1細胞單層用含有1％胎牛血清(FCS)的DMEM中的CVA21的10倍連續(xù)稀釋液(100μtl/孔，四份)接種，并在37℃、5％CO2的環(huán)境下培育48小時。通過用100μl/孔結晶紫/甲醇溶液(0.1％結晶紫、20％甲醇、4.0％甲醛/PBS)對接種的單層染色24小時，對細胞生存力進行定量。在蒸餾水中沖洗后，在multiscan酶聯(lián)免疫吸收測定平板讀數(shù)儀(FlowLaboratories，McLean，Virginia，USA)上在540nm處讀取染色細胞單層的相對吸光度。如果吸光度值小于對照無病毒孔的標準誤差的3倍，則該孔被記為陽性，使用Reed和Muench法計算50％終點效價(Reed，L.J.和H.A.Muench.1938.A simple method of estimating fifty per centendpoints(一種估計50％終點的簡單方法).Am.J.Hyg.27493-497)。
需要用抗-受體MAb對細胞單層進行預處理時，將細胞在存在MAb(1μg/ml)的情況下在37℃下培育1h。然后將細胞單層用合適病毒的四份樣品接種，在37℃、5％CO2的環(huán)境中培育48h，然后如上文所述進行染色。
細胞轉染如上文所述，對CHO和RD細胞進行轉染，以表達ICAM-1和/或DAF(Shafren，D.R.，D.J.Dorahy，S.J.Greive，G.F.Burns和R.D.Barry.1997.Mouse cells expressing human intercellular adhesionmolecule-1 are susceptible to infection by coxsackievirus A21(表達人細胞間粘附分子-1的小鼠細胞易于被柯薩奇病毒A21感染).J.Virol.71785-789)。簡言之，將500μl等份細胞(5×106至1×107細胞/ml)重新懸浮在電穿孔緩沖液(20mM HEPES、137mM NaCI、5mM KCl、0.7mM Na2PO4、6mM葡萄糖，pH7.05)中，并與75μg編碼DAF或ICAM-1的pEF-BOS(Mizushima，S.和S.Nagata.1990.pEF-BOS，apowerful mammalian expression vector(一種強力的哺乳動物表達載體pEF-BOS，).Nucl.Acid.Res.185322)和5μg pcDNA.neo在電穿孔池(Bio-Rad，Richmond，California，USA)中混合。用Bio-Rad基因脈沖器在300V和250μF的條件下對細胞進行脈沖，然后接種在組織培養(yǎng)瓶中，在37℃下培育48h，直至形成匯合連片的單層。表達受體的轉染細胞在含有G-418(400μg/ml)的DMEM中進行選擇，并使用合適的抗-受體MAb通過熒光活化細胞分選進行進一步富集。
流式細胞術通過流式細胞儀對轉染細胞上的DAF和ICAM-1表面表達進行分析。簡言之，將分散的細胞(1×106)與適當?shù)腗Abs(PBS中5μg/ml)在冰上培育20分鐘。然后將細胞用PBS沖洗，在1000xg下沉淀5分鐘，重新懸浮在100μl稀釋在PBS中的綴合有R-藻紅蛋白的羊抗鼠免疫球蛋白F(ab′)2片段(DAKO A/S，Denmark)中，在冰上培育20分鐘。將細胞如上文所述進行沖洗和沉淀，重新懸浮在PBS中，用FACStar分析儀(Becton Dickenson，Sydney，Australia)進行DAF和ICAM-1表達的分析。
將分散的細胞(1×106)與抗-DAF IH4或抗-ICAM-1mAbs(5μg/ml，稀釋在磷酸鹽緩沖鹽水[PBS]中)在冰上培育20分鐘。然后將細胞用PBS沖洗，在1000xg下沉淀5分鐘，并重新懸浮在100μl PBS中以1∶100稀釋的綴合有R-藻紅蛋白的羊抗鼠免疫球蛋白F(ab′)2片段(DAKO A/S，Denmark)中，在冰上培育20分鐘。將細胞如上文所述進行沖洗和沉淀，重新懸浮在PBS中，用FACStar分析儀(BectonDickenson，Sydney，Australia)進行DAF和ICAM-1表達的分析。
病毒RNA序列分析將CVA21分離株在RD-ICAM-1細胞的匯合單層中繁殖。將病毒細胞溶解物通過低速離心預澄清，通過在4℃下在SW41Ti旋轉器中以40000rpm超速離心3h，沉淀上清液中的病毒體。病毒沉淀重新懸浮在TE緩沖液(10mM Tris-HCI、1mM EDTA，pH7.5)中，使用TRIZOL Ls試劑(Gibco BRL Life Technologies)從每株中分離RNA，使用前述的長距離策略對基因組的P1區(qū)進行擴增(Lindberg，A.M.，C.Polack和S.Johansson.1997.Amplification and cloning of completeenterovirus genomes by long distance PCR(通過長距離PCR擴增和克隆全部腸病毒基因組).J.Virol.Meth.65191-199)。使用引物步移策略，采用ABI Prism BigDyeTMterminator cycle sequencing ready reaction試劑盒(PE Biosystems，Sweden)(Lindberg等人1997)根據(jù)各制造商的說明書，從純化的PCR擴增子測定CVA21P1區(qū)的核苷酸序列。使用Clustal X程序生成核苷酸序列排比(Thompson，J.D.，D.G.Higgins和T.J.Gobson.1994.Clustal_W-improving the sensitivity of progressivemultiple sequence alignment through sequence weighting，position-specificgap penalties and weight matrix choice(Clustal_W通過序列加權/位置特異性缺口補償和權矩陣選擇提高漸進多序列排比的敏感性).NucleicAcids Res.224673-4680)。
核苷酸編號本研究中所述的CVA21臨床分離株#272101/#275238和#272598的P1區(qū)(外殼編碼區(qū))核苷酸序列已經(jīng)提交Genbank，指定的編號分別是AY319942、AY319943和AY319944。
病毒的分子特征和結構模擬使用QlAamp病毒RNAmini試劑盒從CVA21親代和CVA21-DAFv病毒株中提取病毒RNA，使用CVA21特異性引物根據(jù)每個生產廠商的說明書用一步RT-PCR(Qiagen一步RT-PCR試劑盒)對外殼編碼區(qū)進行擴增。使用ABI Prism BigDyeTMterminator cycle sequencing readyreaction試劑盒(PE Biosystems)，根據(jù)每個生產廠商的說明書，使用純化的PCR產物(QlAquick Gel提取試劑盒，QIAGEN GmbH)在循環(huán)測序反應中測定核苷酸序列。
CVA21主要結構蛋白(VP1-3)的模型用Modeller程序在DEC-α工作站上建立，其方式類似于脊髓灰質炎病毒受體結構的預測。CVA21親代序列與同源的腸病毒外殼蛋白進行排比，后者的分子結構此前已經(jīng)確定，并含有50％以上的序列同一性，包括脊髓灰質炎病毒1、EV1、EV11、CVB3、CVA9和豬水泡病病毒(PDB代碼分別為1AR7、1EV1、1H8T、1COV、1D4M和1OOP)，通過FASTA生成排比。ICAM-1和DAF相對CVA21-DAFv外殼的位置分別根據(jù)其配體與人鼻病毒3和EV12的接觸進行排比。
病毒感染性測定將96孔板中的匯合細胞單層用100μl病毒的10-倍連續(xù)稀釋液接種，在37℃下培育72小時。為了對細胞生存率進行定量，在用結晶紫/甲醇溶液進行固定之前，對通過顯微鏡對培養(yǎng)板進行觀察。使用Reed和Muench法計算50％終點效價(Reed，L.J和H.A.Muench.1938.Asimple method of estimating fifty per cent endpoints(一種估計50％終點的簡單方法).Am.J.Hyg.27493-497)。為了評價mAb對病毒介導的細胞溶解的影響，在加入病毒之前，將細胞單層與50μl抗-DAF SCR3IH4(5μg/ml)mAb在37℃下培育1小時，如上文所述對細胞溶解進行定量。對于用抗-DAF SCR1mAb阻斷的細胞溶解測定，在用病毒(106TCID50)攻擊前，將6孔板中的RD細胞單層用抗-DAF SCR1mAb(15μg/ml)進行預處理。在37℃下培育1小時后，未結合的病毒被除去，將單層用Dulbecco′s Modified Eagle′s Media(DMEM)覆蓋。通過SkMel28細胞上的滴定研究病毒產量，評價抗-DAF SCR1 mAb的抑制作用。
放射性同位素標記病毒結合試驗將親代和CVA21-DAFv病毒株分別在SkMel28和RD細胞中用35S-蛋氨酸進行放射性同位素標記，并在5-30％的蔗糖梯度下純化。將分散的細胞(1×106)與mAb(20g/ml稀釋在含有1％牛血清白蛋白[BSA]的DMEM中)在室溫下預培育1小時，然后在含有2％胎牛血清(FCS)的DMEM中與35S-標記的蔗糖純化病毒(5×105cpm)在室溫下培育1小時。用DMEM-2％FCS沖洗三次后，在1450Microbeta TRILUX(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)上通過液體閃爍計數(shù)測定35S-蛋氨酸標記病毒的結合量。
結合DAF和ICAM-1的病毒體的沉淀將純化的放射性同位素標記的160S CVA21-DAFv病毒體(2.5×106cpm)與CHO-DAF或CHO-ICAM-1細胞(2×107)在DMEM-1％BSA中在4℃下培育2小時。用DMEM-2％FCS沖洗四次，除去未結合的病毒體，在37℃下使結合細胞的病毒體洗脫2小時。離心除去細胞，被洗脫的病毒體在5-30％蔗糖梯度上被分層，在SW41Ti旋轉器中在4℃下以36,000rpm離心95分鐘。從梯度底部收集餾分(～700μl)，通過液體閃爍計數(shù)測定放射活性。
通過抗-DAF mAb洗脫結合細胞的病毒將CHO-DAF細胞(3×106)與放射性同位素標記的病毒(4×105cpm)在4℃下培育2小時。用冰冷的DMEM-2％FCS沖洗四次，除去未結合的病毒體，將細胞重新懸浮在100μl DMEM-2％FCS中，并與不同濃度(0-50μg/ml)的抗-DAF SCR1mAb(IA10)培育。在冰上mAb競爭1小時后，細胞沉淀。收取上清液，監(jiān)測被洗脫病毒的水平，結果表示成放射性同位素標記病毒被洗脫的細胞的百分比。
用可溶性DAF中和病毒將人重組sDAF(85μg/ml，稀釋在PBS中)與1,000 50％組織培養(yǎng)物感染劑量(TCID50)的CVA21-DAFv培育。在37℃下培育1小時后，將病毒-DAF混合物提供給96孔板中的RD細胞單層，繼續(xù)培育48小時。
前列腺腫瘤異種移植物的CVA21-DAFv治療根據(jù)University ofNewcastle Animal Care and Ethics Committee(紐卡斯爾大學動物中心和倫理委員會)批準的方案，將SCID小鼠在無病原體的條件下圈養(yǎng)。PC3細胞在體外生長，收取，用PBS沖洗兩次，并懸浮在無菌PBS中。如臺盼藍染色法所評價，用于異種移植的細胞的95％以上是存活的。在異種移植之前，將動物用3％的異熒烷(isofiuorane)麻醉。通過在側腹部皮下注射2×106PC3細胞，將腫瘤細胞異種移植到被麻醉的7周齡SCID小鼠側腹部。每天監(jiān)測異種移植物的生長，并用卡鉗測量。使用球體公式計算腫瘤體積的估計值。一旦發(fā)展成可觸及的腫瘤(50-100mm3)，通過靜脈注射將CVA21親代、CVA21-DAFv(3×107TCID50)或PBS給予PC3腫瘤，并監(jiān)測42天。通過病毒感染性測定監(jiān)測血清中的病毒效價。
結果I.腸病毒外殼相互作用CVA21臨床病毒株與DAF和ICAM-1結合為了確定CVA21的臨床分離株與DAF和ICAM-1的結合方式與原型Kuykendall病毒株是相似還是不同，在放射性同位素標記病毒結合實驗中使用被穩(wěn)定轉染成表達DAF或ICAM-1的CHO細胞。對于所有的CVA21分離株，在不存在DAF或ICAM-1的情況下沒有觀察到與CHO細胞的顯著結合(圖1)。所有的CVA21病毒株與表達DAF的CHO細胞結合(圖1A)，該相互作用此前在原型CVA21 Kuykendall病毒株中得到證明。如預計，所有的臨床CVA21分離株還與CHO細胞表面上表達的ICAM-1結合(圖1B)。通過抗-ICAM-1結構功能區(qū)1特異性MAb完全消除病毒與ICAM-1結合的作用，證實了CVA21/ICAM-1相互作用的特異性(圖1B)?？傊?，這些結果證實，CVA21的臨床分離株以類似于原型病毒株的方式與兩種獨立的細胞受體DAF和ICAM-1結合。
為了進一步表征CVA21臨床分離株與DAF/ICAM-1的相互作用，在廣泛共同表達DAF和ICAM-1的HeLa細胞上進行CVA21病毒結合試驗。通過獨立受體的MAb阻斷或結合的MAb阻斷對CVA21的結合進行評價(圖2)。將原型Kuykendall病毒株(圖2A)的細胞粘附與CVA21臨床分離株#272101(圖2B)進行比較，在不存在MAb受體阻斷的情況下，二者均顯示出很高的與HeLa細胞的結合水平(圖2)。DAF SCR1的特異性MAb阻斷部分地阻斷了病毒結合，但是，由于與ICAM-1的相互作用，不能完全消除病毒的粘附。當與ICAM-1的接觸被MAb阻斷抑制時，病毒結合降低，臨床分離株#272101比原型病毒株更明顯(圖2B)，但是由于病毒可選擇與DAF粘附，從而并未被完全抑制?？?DAF SCR1和抗+ICAM-1結構功能區(qū)1MAb抑制病毒粘附的能力可以達到與用磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(其切割GPI-連接蛋白)和抗-ICAM-1MAb結合對細胞進行預處理相同的程度，從而證明了CVA21臨床和原型病毒株對DAF和ICAM-1 N-端功能結構區(qū)的特異性。綜合在一起，這些結果證實，臨床分離株#272101與原型病毒株類似，與DAF的第一個SCR和ICAM-1的N-端結構功能區(qū)結合。CVA21與DAF和ICAM-1的結合不是累加性的對CVA21臨床分離株與DAF或ICAM-1單獨結合或一起結合進行評價，以確定宿主細胞表面上兩種受體的存在是否會促成累加性病毒體細胞粘附。為解決這一問題，將CHO細胞轉染成單獨表達DAF或ICAM-1、或二者均表達。流式細胞儀分析顯示，在單獨表達受體或一起表達受體的細胞上DAF或ICAM-1表達水平是可比的(圖3A)。對于所有的CVA21病毒株，均觀察到與CHO細胞本底結合的最低水平。所有的CVA21病毒株均表現(xiàn)出與單獨表達的DAF或ICAM-1有顯著的結合水平(圖3B)。出人意料地，與這些受體單獨表達時的結合量相比，與共同表達DAF和ICAM-1的CHO細胞結合的放射性同位素標記病毒的量顯著降低(圖3B)。
CVA21的臨床分離株可以通過與DAF的相互作用誘導ICAM-1陰性細胞的溶解性感染ICAM-1是CVA21原型病毒株成功侵入宿主細胞的主要決定子。但是，在存在MAb交聯(lián)DAF的情況下，CVA21介導的缺少ICAM-1表達的細胞溶解性感染是可能的。我們考察了CVA21臨床分離株是否能夠通過分立的與交聯(lián)DAF的相互作用而溶解性地感染ICAM-1陰性的細胞。在用單一導入復數(shù)(single input multiplicity)的CVA21攻擊之前，RD細胞單層不經(jīng)處理，或者用導向單個SCR 1、2、3、或4的特異性MAb或者抗-DAF SCR1和SCR3的組合進行預處理。
在用導向DAF SCR2、3和4的MAb預處理過的RD細胞培養(yǎng)中觀察CVA21-介導的溶解性感染(圖4)。通過向用抗SCR3 DAF MAb預處理過的細胞中加入抗-SCR1 DAF MAb完全阻斷細胞溶解這一發(fā)現(xiàn)，證實了特異性CVA21外殼/DAF相互作用確實介導著溶解性細胞感染。
有趣的是，兩種CVA21臨床分離株#275238和#272598能夠在不存在抗-DAF MAb交聯(lián)的情況下溶解性地感染ICAM-1陰性的RD細胞(圖4)。通常，腸病毒與DAF結合被認為是病毒體因與其它內化受體的相互作用而螯合，因此目前沒有闡明僅經(jīng)由與DAF的相互作用介導的細胞溶解性感染的結論性報道。在不存在DAF和ICAM-1二者抗體交聯(lián)的情況下，CVA21臨床分離株#275238和#2727598溶解性地感染細胞的能力是該受體用途的首次發(fā)現(xiàn)。用抗DAF SCR1 MAb阻斷后，細胞溶解被完全抑制(圖4)，這些CVA21病毒株生成的子代病毒顯著減少，這進一步證實了該發(fā)現(xiàn)的完整性。
為了進一步分析這種新的DAF用途，在單獨表達DAF(RD)或共同表達ICAM-1(RD-ICAM-1)的單層細胞培養(yǎng)物上，對CVA21的臨床和原型病毒株的溶解感染性進行滴定。所有的CVA21病毒株在表達DAF和ICAM-1二者的細胞中均表現(xiàn)出很高的細胞溶解活性水平，同時，僅有分離株#275238和#2727598被觀察到在僅表達DAF的RD細胞中誘導的溶解效價與RD-ICAM-1細胞中所得到的是可比的。實際上，分離株#275238在RD細胞中獲得的溶解效價比在RD-ICAM-1細胞中高大約20倍。有趣的是，在很高的病毒導入復數(shù)(viral inputmultiplicityes)下，分離株#272101對僅表達DAF的RD細胞另外顯示出水平顯著的溶解性感染。原型病毒株在RD細胞中的活性水平最小但可以檢出，這可能是由于它是DAF利用表型增強的病毒體的最小群體。
CVA21臨床分離株ICAM-1結合足跡的分析由于所有考察的CVA21病毒株均顯示出很強的ICAM-1吸附/內化表型(圖1)，因此我們研究了它們是否具有保守的ICAM-1結合足跡。構成CVA21-ICAM-1受體結合足跡的殘基之前已經(jīng)使用低溫電子顯微鏡用純化的ICAM-1和原型Kuykendall病毒體進行了鑒定。所有CVA21病毒株P1編碼區(qū)的氨基酸序列分析表明存在有保守ICAM-1足跡，與之前公開的足跡相同，除了VP2168處的保守編碼變化，Ala改變?yōu)閂al(圖5)。
為了解釋CVA21臨床分離株相對于原型病毒株在不存在ICAM-1的情況下溶解性感染表達DAF的細胞的能力增強(圖4)，我們搜索了ICAM-1結合足跡之外的氨基酸差異(圖5)。在P1區(qū)檢測到三個CVA21臨床株和原型病毒株之間的大量氨基酸改變(圖5)。在VP4編碼區(qū)內沒有檢測到任何CVA21病毒株之間的氨基酸改變。在VP3、VP2和VP1外殼蛋白中，所有的臨床分離株在相同位置檢測到13個相對于原型病毒株的相同改變。另外，分離株#272101在位點VP3 239顯示出不同的改變(Ser，相對的其它兩個臨床分離株為Ala)，并且與原型病毒株相比進一步具有9個獨立的分散在VP1、VP2、VP3中的氨基酸改變(圖5)。分離株#272598和#272238在氨基酸水平上是相同的，而在核苷酸水平上檢測到二者之間有許多沉默突變。
II.柯薩奇病毒A21變異體的生物選擇和分子特征不依賴ICAM-1作用而溶解性地感染細胞的CVA21變異體的生物選擇CVA21原型病毒株的細胞吸附是通過與DAF和/或ICAM-1的結合介導的。僅有ICAM-1相互作用加速細胞內化，CVA21和DAF之間的相互作用并不能誘導生產性的溶解性細胞感染，除非DAF被抗-DAFmAb交聯(lián)。當細胞用ICAM-1轉染時，CVA21也可以溶解性地感染表達DAF的RD細胞，這表明CVA21不能在RD細胞中復制僅僅是在細胞侵入層面上。人黑色素瘤細胞系SkMel28支持CVA21原型病毒株生長至很高的病毒效價，流式細胞分析顯示ICAM-1和DAF(幾何平均熒光強度[GMF]43.2)表面表達的水平都很高(圖6A)。
通過重復傳代(4代)，使SkMel28細胞(在此指定為CVA21親代)中雙噬斑純化的CVA21原型病毒株制劑適于產生RD細胞的快速溶解性感染。流式細胞分析表明，RD細胞表達的DAF水平(GMF64.0)較SkMel28細胞高，但不表達表面ICAM-1(圖6A)。親代CVA21在RD細胞中連續(xù)傳代，從親代群體中生物選擇出能夠在不存在ICAM-1的情況下導致快速溶解性感染的CVA21變異體(稱為CVA21-DAFv)。雙重表達ICAM-1和DAF的SkMel28細胞支持親代和CVA21-DAFv發(fā)生效價超過107TCID50/ml的溶解性感染，同時僅有CVA21-DAFv在RD細胞中誘導相當?shù)娜芙庑r(圖6B)。
CVA21-DAFv的表型特性對ICAM-1陰性RD細胞進行適應之后，CVA21-DAFv在SkMel28和RD細胞單層(5×107PFU/ml)上產生效率相似的噬斑。盡管病毒導入復數(shù)很高(SkMel28細胞上1×108PFU/ml)，RD細胞上并沒有觀察到親代病毒株的噬斑。在不同的細胞底物上，CVA21-DAFv誘導的噬斑有輕微的表型差異；在RD細胞上，在感染后2天內觀察到混濁噬斑，而在SkMel28細胞上僅觀察到高清晰度的小噬斑(圖6C)。CVA21-DAFv在SkMel28細胞中連續(xù)回復傳代10次，未能選擇出CVA21-DAFv仍能夠在低感染復數(shù)(1TCID50/96孔，數(shù)據(jù)未顯示)下溶解性地感染RD細胞的親代表型回復體。因此，CVA21-DAFv的DAF利用增強似乎是一種穩(wěn)定和合意的表型。更有趣的是以下發(fā)現(xiàn)與親代病毒株(102TCID50)相比，CVA21-DAFv(102TCID50)需要集中更高水平的免疫球蛋白以被中和(1∶63與1∶178)，這表示CVA21-DAFv的血清特異性在RD細胞中生物選擇的過程中發(fā)生了部分改變。CVA21-DAFv與DAF和ICAM-1的N-端結構功能區(qū)結合CVA21原型病毒株與ICAM-1和DAF二者的N-端結構功能區(qū)均能結合。為了考察CVA21-DAFv是否以類似于原型病毒株的方式與ICAM-1和/或DAF直接結合，使用穩(wěn)定表達ICAM-1或DAF的CHO細胞、RD細胞和卵巢癌細胞系DOV13進行放射性同位素標記結合實驗。流式細胞研究顯示，在分別轉染的CHO細胞系上DAF或ICAM-1的表面表達水平很高(CHO-DAF細胞上DAF表達的GMF為296.2)，而RD和DOV13細胞表面上僅表達DAF(RD和DOV13細胞上DAF表達的GMF分別為64.0和84.0)(圖6A和圖7A)。CVA21親代病毒株與ICAM-1和DAF二者均結合(圖7B和7C)。CVA21-DAFv與CHO-DAF和CHO-ICAM-1細胞結合的水平均很顯著，而CHO細胞則僅僅觀察到本底結合(圖7B和7C)。通過病毒吸附的特異性抗-DAF和抗-ICAM-1mAb阻斷，證實了病毒與轉染CHO細胞上表面表達的ICAM-1和DAF相互作用的特異性。由于抗-ICAM-1(WEHI)和抗-DAFSCR1(IA10)mAb阻斷將病毒的結合降低至本底水平，而抗-DAFSCR3(IH4)mAb阻斷不影響CVA21制劑與轉染CHO細胞的病毒結合(圖7B和7C)，因而得出結論與親代病毒株類似，CVA21-DAFv可以與ICAM-1和DAF的N-端結構功能區(qū)結合。
抗體交聯(lián)DAF不增強CVA21-DAFv的細胞感染性為了考察CVA21親代和CVA21-DAFv病毒株之間在DAF結合/利用方面，如果有的話，是否存在輕微的差異，采用放射性同位素標記病毒結合試驗評價在存在和不存在表面DAF交聯(lián)的情況下與RD和DOV13細胞吸附的相對水平。親代CVA21和CVA21-DAFv二者均與高水平表達表面DAF的CHO細胞結合(圖7)，而CVA21原型病毒株與表達DAF的ICAM-1陰性RD細胞的結合則很差。這最有可能是因為在本研究中使用的CHO-DAF細胞上表面表達DAF的水平高于RD和DOV13細胞(圖6A和圖7A)。生物選擇的CVA21-DAFv顯示出與RD和DOV13細胞的吸附水平均很顯著，而親代病毒株則幾乎觀察不到或觀察不到與這些細胞的吸附(圖7C)。與CHO-DAF細胞類似，通過用抗-SCR1mAb進行預處理，CVA21-DAFv與RD和DOV13細胞的特異性結合被降低至本底水平(圖7C)。
表面表達的DAF與導向DAF非病毒結合SCR3功能結構區(qū)的mAb交聯(lián)增加了原型CVA21與RD細胞的結合，使該細胞更容易被溶解性感染。接下來，我們考察了CHO-DAF和DOV13細胞表面上的DAF的交聯(lián)是否如RD細胞所觀察的那樣，導致病毒結合的增加?？?SCR3預處理使RD細胞上的親代CVA21病毒結合增加了8倍，在DOV13細胞上則增加4倍(圖7C)。對于CVA21-DAFv，抗-DAF SCR3預處理對增強與RD或DOV13細胞的結合作用極小或沒有作用。實際上，觀察到CVA21-DAFv與DOV13細胞的結合有輕微的下降(圖7C)。在不存在mAb交聯(lián)DAF的情況下CVA21-DAFv與RD和DOV13細胞以顯著水平結合的能力表明，與親代病毒株相比，CVA21-DAFv的DAF結合表型增強。兩種病毒與CHO-DAF細胞的病毒吸附均不受抗-DAF SCR3mAb預處理的影響(圖7C)。穩(wěn)定轉染的CHO-DAF細胞上DAF表面表達的水平顯著高于瞬時表達DAF的CHO細胞，為抗-DAF SCR3mAb預處理為什么不能增加親代CVA21的病毒吸附給出了一種可能的解釋。
為了確定抗-DAF SCR3mAb預處理對RD和DOV13細胞對溶解性感染的易感性是受CVA21親代還是CVA21-DAFv的影響，病毒攻擊之前，將RD和DOV13細胞的匯合單層與抗-DAF SCR3mAb預培育。在評價單層的溶解性感染之前，在37℃下使病毒感染進行3天。在不存在抗-DAF SCR3mAb交聯(lián)的情況下，即使病毒導入復數(shù)很高(106TCID50/孔)，RD和DOV13細胞對CVA21親代病毒株的感染均有抵抗力。與此相反，通過用抗DAF SCR3mAb進行預處理，RD和DOV13細胞均對親代CVA21的溶解性感染易感(圖7D)。CVA21-DAFv在ICAM-1陰性RD和DOV13細胞中均誘導溶解性病毒效價(＞105.5TCID50/ml)。出人意料地，與不存在mAb時觀察到的效價相比，抗-DAFSCR3mAb預處理將RD和DOV13細胞中的CVA21-DAFv的溶解效價減少～100倍(圖7D)。用抗-DAF SCR3mAb預處理未增強CVA21-DAFv與DAF表達細胞的結合(圖7C)，對于DOV13，則引起吸附減少。這些發(fā)現(xiàn)表明，DAF SCR3的mAb阻斷干擾了DAF SCR1結合CAV21-DAFv的細胞侵入機制(圖7)。ICAM-1而不是DAF的相互作用誘導CVA21-DAFv的外殼構象變化針對CVA21-DAFv與DAF結合和溶解性感染ICAM-1陰性細胞的能力增強的本底(圖6和圖7)，我們比較了親代CVA21病毒株和CVA21-DAFv的DAF相對結合嚴格性。將放射性同位素標記的病毒體在4℃下與CHO-DAF細胞結合2小時，然后除去未結合的病毒體，將與細胞結合的病毒體用濃度漸增的抗-DAF SCR1mAb從細胞中洗脫。與CVA21親代病毒體相比，從CHO-DAF細胞表面將CVA21-DAFv病毒體移位需要大約10倍以上濃度的抗-DAF SCR1mAb(圖8A)。這一發(fā)現(xiàn)表明，與CVA親代相比，CVA21-DAFv與DAF在更易接近的外殼位點上結合，或者與DAF結合的親合性更高。
假定DAF起到腸病毒螯合受體的作用，通常，DAF-腸病毒相互作用不能誘導形成可檢測的外殼構象改變。為了考察CVA21-DAFv A-顆粒的形成是否是由與表面表達的DAF或ICAM-1的相互作用誘導的，將純化的160S病毒體與CHO-DAF或CHO-ICAM-1細胞在4℃下培育2小時。除去未結合的病毒體之后，與細胞結合的病毒體在37℃下洗脫2小時，然后在5-30％的蔗糖梯度上進行速度離心。從ICAM-1洗脫的CVA21-DAFv病毒體表現(xiàn)出沉降系數(shù)減少，表明A顆粒的形成，感染性保留極少或未保留感染性，這與CVA21原型病毒株觀察到的情況類似。盡管CVA21-DAFv的DAF相互作用增強，但是從DAF洗脫的CVA21-DAFv病毒體沒有任何可檢測的構象變化(圖8B)，病毒體保留著高水平感染性。
DAF阻斷抑制RD細胞中CVA21-DAFv的溶解性感染溶解性細胞感染和競爭性結合實驗表明，與親代CVA21病毒株相比，表面表達的DAF和CVA21-DAFv之間的相互作用增強(圖7和圖8)。由于這種觀察到的增強的相互作用，我們考察了與親代病毒株相比，抗-DAF SCR1mAb是否能阻斷CVA21-DAFv對RD細胞的溶解性感染。即使導入復數(shù)高達106TCID50/孔，抗-DAF SCR1mAb也能保護RD細胞完全免受CVA21-DAFv誘導的溶解性感染(圖9A)。而且，將RD細胞用抗-DAF SCR1mAb預處理顯著地抑制子代病毒的產生。
為了進一步證實CVA21-DAFv的細胞感染性需要直接與表面DAF相互作用，對人重組sDAF(Dr.Bruce Loveland，未公開的交流)抑制RD細胞感染的能力進行評價?？扇苄訢AF與CVA21-DAFv的相互作用顯著地抑制了細胞的溶解性感染，但是對于降低非DAF結合的CVA20的感染則沒有可檢測的降低作用。盡管CVA20也與ICAM-1結合，它需要一種未得到確認的受體來侵入細胞(圖9B)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)證明，CVA21-DAFv溶解性感染被抗-DAF SCR1mAb和sDAF抑制，證實了DAF相互作用在CVA21-DAFv侵入中的重要性。使CVA21-DAFv具有DAF表型的分子決定子為了進一步研究擴展的細胞向性和CVA21-DAFv的DAF利用增強顯型，對CVA親代病毒株和CVA21-DAFv的外殼編碼區(qū)核苷酸序列進行測定。將外殼蛋白序列與CVA21Kuykendall原型病毒株相比，后者與DAF和ICAM-1的相互作用已經(jīng)被充分闡明。對雙噬斑純化的親代病毒株外殼編碼區(qū)的序列分析表明，與CVA21原型序列(GenBankAF465515)相比，在VP2(S164L)處有一個編碼置換。與原型病毒株相比，CVA親代病毒株的DAF和ICAM-1結合特性(圖7)并沒有被這一VP2氨基酸置換所改變。在RD細胞中進行生物選擇后，VP2L164殘基保留在CVA21-DAFv中，而VP3中檢測到兩處其它的氨基酸置換(R96H和E101A)，VP2中有一處沉默突變(V209)。由于VP2L164氨基酸置換在親代病毒株和CVA21-DAFv中均存在，它不可能參與增強CVA21-DAFv的DAF結合表型。CVA21-DAFv在核苷酸位點2038(VP3 101)處表現(xiàn)出混合種群(C/A)，導致Ala/Glu，而該位點僅有A(Glu)由親代CVA21編碼。
因為CVA21的分子結構尚未在原子分辨度下得到確定，在與之前確定的相關小RNA病毒結構相似的基礎上，我們模擬了親代CVA21的結構，以試圖解釋CVA親代和CVA21-DAFv之間在DAF結合上的差異。可能增強CVA21-DAFv DAF結合顯型的突變(VP3 R96H和E101A)預測被包埋在外殼蛋白VP1、VP2和VP3的界面處(圖5和圖10)。VP3殘基R96和E101被一側的VP3C-端和頂部的VP1C-端覆蓋，僅有精氨酸(R96)的側鏈氮原子可以與溶劑接觸(圖10A中的藍色球體)。假設CVA21-DAFv與DAF的吸附發(fā)生在外殼峽谷的外部，如EV12中那樣。盡管CVA21-DAFv的VP3H96和A101突變并不是直接位于提出的EV12-DAF結合位點，它定位仍然可以使DAF結合足跡具有增強的構象，或者容易接觸，導致其與DAF的親合力比親代病毒株提高(圖8A)。
III.DAF和柯薩奇病毒A21介導的細胞感染CVA21與DAF的N-端結構功能區(qū)結合對DAF的獨立短共有重復片斷(SCR)的初步抗體阻斷研究表明CVA21與DAF SCR1結合。但是，對腸病毒DAF結合表位定位的分析可能受與DAF結合的mAb的空間位阻的間接影響這一可能性是存在的。為了解決這些問題，表面表達的嵌合DAF分子和DAF缺失構建體被用來對EV70的DAF結合結構功能區(qū)至SCR1(Karnauchow，T.M.，S.Dawe，D.M.Lublin，K.Dimock 1998，Short consensus repeatdomain 1 of decay-accelerating factor is required for enterovirus 70binding(衰變加速因子的短共有重復結構功能區(qū)1是腸病毒70結合所必需的).J.Virol.729380-9383)、CVB3SCR2-3(Bergelson，J.M.，J.G.Mohanty，R.L.Crowell，N.F.St.John，D.M.Lublin，R.W.Crowell 1995.Coxsackievirus B3 adapted to growth in RD cells binds to decay-accelerating factor(CD55)(適應在RD細胞中生長的柯薩奇病毒B3與衰變加速因子(CD55)結合).J.Virol.691903-1906)和EV7至SCR3(Powell，R.M.，T.Ward，D.J.Evans，J.W.Almond 1997.Interactionbetween echovirus 7 and its receptor，decay-accelerating factor(CD55)evidence for a secondary cellular factor in A-particle formation(艾柯病毒7及其受體衰變加速因子(CD55)之間的相互作用A顆粒形成中第二種細胞因子的證據(jù)).J.Virol.719306-9312)進行分析。在試圖對CVA21-DAF結合區(qū)定位進行證實的嘗試中，我們采用了嵌合DAF/CD46受體(圖11A)，其中CD46膜輔因子蛋白(MCP[CD46])結構功能區(qū)被相應的結構功能區(qū)DAF替換，并評價了它們與放射性同位素標記CVA21結合的能力。使用對單個DAF SCR和對CD46有特異性的mAb通過流式細胞分析對嵌合和野生型受體的表面表達相對水平進行評價(圖11B)?？?DAF SCR1(IA10)、SCR3(IH4)和SCR4(IIH6)mAb僅與野生型DAF和分別攜帶DAF SCR1/2、SCR3或SCR4的DAF/CD46嵌合受體結合。抗-DAF mAb中無一與野生型CD46結合。識別CD46的SCR1的抗-CD46mAb(MCI20.6)僅與野生型CD46或攜帶CD46的SCR1的DAF/CD46嵌合受體結合。放射性同位素標記的CVA21與野生型DAF和DAF SCR1/CD46嵌合受體均有顯著水平的結合，但是與野生型CD46或其它嵌合構建體不結合(圖11C)。通過用抗-DAF SCR1mAb進行抗體阻斷，CVA21與野生型DAF和嵌合DAF SCR1/CD46分子二者的結合均被抑制。盡管本項研究沒有獲得DAF SCR2/CD46嵌合受體，但是上述發(fā)現(xiàn)清楚地證明類似于EV70，CVA21的外殼結合表位最可能位于DAF分子的第一個SCR上。
CVA21與DAF的結合和從其上洗脫小RNA病毒細胞吸附和隨后侵入細胞的特征是在初始吸附之后很高水平的病毒顆?？蓮钠涮禺愋约毎砻媸荏w上洗脫，表明受體介導的病毒洗脫在小RNA病毒感染的發(fā)病機理中具有重要地位。與許多小RNA病毒類似，當CVA21從其天然內化受體(在本文的情況下為ICAM-1)上脫落時，它的感染性顯著降低，因此使其啟動隨后感染的能力降至最低。但是，直接從表面表達的DAF上洗脫的CVA21顆粒的相對動力學特征和感染性之前并未闡明。因此，我們的研究集中在時間、溫度和pH對CVA21從DAF上洗脫的影響，在此使用表達DAF的CHO細胞作為CVA21結合底物進行放射性同位素標記病毒結合實驗。15分鐘時CVA21從DAF上洗脫達到最高水平，在此之后洗脫沒有進一步的明顯增加(圖12A)。從DAF上洗脫的CVA21的量隨著溫度從4℃逐漸升高至42℃而不斷增加，其間洗脫時間保持恒定的30分鐘(圖12B)。在這種環(huán)境中，在42℃下CVA21的洗脫達到最高水平。并不出乎意料地，42℃下洗脫的病毒的感染性顯著低于37℃下洗脫的病毒。溫度高于37℃對病毒體的完整性可能有負面影響，導致受體結合減少，從而使感染能力降低。將洗脫環(huán)境的pH從pH5.5升高至pH8.0，其間保持洗脫時間為30分鐘、溫度為37℃，導致CVA21從DAF上洗脫的水平持續(xù)升高(圖12C)。
從DAF上洗脫的CVA21保持感染性由于結合細胞的病毒體發(fā)生特異性受體介導的外殼構象變化，大部分洗脫的小RNA病毒體通常被認為無感染性。為了比較與表面表達的DAF或ICAM-1結合和從其上洗脫對CVA21感染性的相對影響，使用CHO-DAF和CHO-ICAM-1表達細胞作為CVA21結合底物，進行放射性同位素標記病毒結合試驗和細胞溶解試驗。流式細胞分析顯示，在合適的轉染CHO細胞表面上DAF和ICAM-1表達的水平很高。放射性同位素標記的CVA21與轉染細胞表面上的DAF和ICAM-1結合以及從其上洗脫的水平相似(圖13A)。與從ICAM-1上洗脫的病毒相反，僅有從DAF上洗脫的CVA21表現(xiàn)出顯著的感染性保留(＞105TCID50/100CPM)(圖13B)。為了確定從交聯(lián)DAF上脫落之后CVA21是否保留著高水平感染性，采用相似的試驗方案，DAF通過用抗-DAFSCR3mAb(IH4)預處理進行交聯(lián)。從用ICAM-1轉染的RD細胞(RD-ICAM-1)評價ICAM-1上的洗脫。在0℃下從兩種受體上洗脫的CVA21水平最低，而在37℃下，15％至20％的結合病毒從兩種受體上洗脫(圖14A)。但是，如上文中觀察到的(圖13A)，從ICAM-1上洗脫的CVA21感染性極低(＜1.0TCID50/100CPM)，而從交聯(lián)DAF上洗脫的CVA21則表現(xiàn)出顯著的感染性(＞102.5TCID50/100CPM)(圖14B)。盡管RD-ICAM-1細胞表面上存在有低水平的DAF，病毒洗脫物中不存在感染性CVA21表明當兩種受體在細胞表面上共同表達時，CVA21優(yōu)先結合ICAM-1，其次才是DAF。
為了評價CVA21與表面DAF和ICAM-1結合的相對嚴格性，放射性同位素標記的病毒體在0℃下與RD-ICAM-1細胞上的ICAM-1、或者RD細胞表面上的mAb交聯(lián)DAF結合。除去未結合的病毒體之后，向適當?shù)谋磉_交聯(lián)DAF或ICAM-1的細胞懸液中加入濃度漸增的阻斷mAb(抗-DAF SCR1或抗-ICAM-1結構功能區(qū)1)的CVA21受體。向RD-ICAM-1細胞中加入抗-ICAM-1結構功能區(qū)1mAb對代替與ICAM-1結合的CVA21影響極小或沒有影響(圖14C)。與此相反，用濃度低至0.1μg/ml的抗-DAF SCR1mAb對交聯(lián)DAF的RD細胞進行處理促使釋放出大約50％的與DAF結合的CVA21，當mAb濃度增加至1.0μg/ml時，導致基本上所有與DAF結合的病毒被排出(圖14C)。CVA21可以與DAF結合，保留感染性，并在ICAM-1的延遲表達后引發(fā)生產性感染已經(jīng)確定，從表面表達的DAF上洗脫的CVA21保留了很高的感染性水平(圖13和圖14)，研究集中于DAF洗脫的病毒是否在天然CVA21感染的發(fā)病機理中具有積極作用。需要解決的具體問題是被表面表達的DAF螯合的病毒是否可以通過采用細胞表面ICAM-1的延遲誘導來引發(fā)生產性感染。通常人們認為，人體中內源性ICAM-1的表面表達相對較低，要等待炎性細胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-1β的作用來誘導。為了模擬這種環(huán)境，在CVA21與表面DAF結合后的0、6和24小時，將正常情況下對CVA21溶解性感染有抵抗力的表達DAF的RD細胞(ICAM-1陰性)轉導成表達ICAM-1或CD36(使用重組腺病毒載體)。流式細胞分析表明，轉導后的4小時有水平顯著的表面ICAM-1表達，大約在腺病毒接種后的16小時這種表達的水平達到最高(圖15A)。另外的流式細胞分析(圖15B)和蛋白質印跡檢驗證實，通過攜帶重組腺病毒的適當受體轉導后24小時，RD細胞的ICAM-1和CD36二者的表達水平均很高，而所有細胞之間的內源性DAF表達是相當?shù)?。進行病毒感染性實驗，以比較病毒與內源性DAF結合后的0、6或24小時在存在轉導ICAM-1和CD36受體表達的情況下繁殖的子代CVA21的水平。最初用CVA21接種后的0、6或24小時，誘導成表達ICAM-1的RD細胞產生的病毒產量顯著高于(大約200-倍)誘導成表達偽受體(CD36)的細胞或未轉導的RD細胞(圖15C)。DAF結合后的0、6、24小時，在轉導成表達ICAM-1的RD細胞中的多周期CVA21復制造成了細胞單層的完全溶解性破壞，而在表達CD36的細胞或未轉導細胞中沒有觀察到細胞溶解(圖15D)。
IV.柯薩奇病毒A21DAF變異體(CVA21-DAFv)體外溶解人乳腺、前列腺、結腸和卵巢癌細胞CVA21原型病毒株能夠快速地靶向和溶解表達高水平CVA21細胞受體、細胞間粘附分子(ICAM-1)和衰變加速因子(DAF)的惡性黑色素瘤細胞。最近，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，生物選擇的CVA21-DAFv病毒株表現(xiàn)出更強的受體特異性，并且能夠快速地感染和溶解表達ICAM-1或DAF或這二者結合的細胞。在本研究中，對一組12個不同組織來源的人癌細胞系進行了病毒受體表達方面的研究；三個腫瘤細胞系來自人乳腺癌(MDA-MB157、MDA-MB453、ZR-75-1)，三個卵巢癌細胞系(DOV13、OAW-42、OVHS-1)，三種前列腺癌細胞(DU145、LNCaP、PC3)和三種人結腸癌細胞(HCT116、HT-29、SW620)。如通過流式細胞儀所測定，在3/3乳腺、1/3卵巢、2/3前列腺和3/3結腸癌細胞系上檢測到水平顯著的ICAM-1，而發(fā)現(xiàn)所有12個細胞系均表達高水平的DAF(圖16)。
為了研究CVA21-DAFv是否顯示出比CVA21親代病毒株更廣泛的溶瘤能力，CVA21-DAFv被用來攻擊一組乳腺、卵巢、前列腺和結腸癌細胞。顯微鏡觀察表明，所有12種用CVA21-DAFv攻擊的體外培養(yǎng)物均表現(xiàn)出圓形表型(細胞病變作用的特征)，最終導致細胞死亡。與此相反，用親代CVA21病毒株攻擊的癌細胞系中僅有7/12觀察到細胞病變作用(圖17)。對CVA21-DAFv的溶瘤作用進行定量，證明了CVA21-DAFv對所有12個被測體外培養(yǎng)物均引起效價＞103TCID50/ml的溶解性感染，而CVA21親代病毒株僅在7/12個癌細胞系(2/3乳腺、1/3卵巢、2/3前列腺和2/3結腸癌細胞)中引發(fā)顯著的溶解性感染(＞104TCID50/ml)(圖18)。據(jù)觀察，表面ICAM-1表達量可忽略不計的細胞系(ZR-75-1、DOV13、OAW-42、LNCaP和HCT116)不能維持CVA21親代病毒株的復制，而這些細胞系很容易被CVA21-DAFv感染。由于生物篩選的CVA21-DAFv病毒株進行溶解性感染僅需要存在有表面DAF，而不是ICAM-1，因此顯然該病毒株較親代CVA21病毒株能更有效地殺死范圍更廣泛的人癌細胞系。
V.CVA21-DAFv在體內溶解人前列腺腫瘤異種移植物體內數(shù)據(jù)表明，CAV21-DAFv特異性且有效地靶向細胞表面上表達ICAM-1和/或DAF的人癌細胞。為了考察體外觀察到的對一組癌細胞的溶瘤作用是否預示CVA21-DAFv可作為體內抗癌藥物，我們評價了CVA21-DAFv對前列腺腫瘤異種移植物的治療作用。攜帶已形成的PC3前列腺異種移植物(50-100mm3)的SCID小鼠接受單次靜脈劑量的CVA21-DAFv、CVA21親代、或PBS，對腫瘤負荷進行為期42天的評價(圖19)。在用病毒給藥后早期的11天，用CVA21-DAFv或CVA21親代治療的小鼠均觀察到腫瘤體積的顯著減小。出于倫理學原因，由于其腫瘤負荷達到University Animal Ethics committee(大學動物倫理委員會)強制規(guī)定的上限，治療后的14天對用PBS治療的小鼠進行安樂死。如溶解性病毒感染性檢驗所測定(數(shù)據(jù)未顯示)，CVA21-DAFv和CVA21親代治療的小鼠均觀察到相似的血清病毒載量(大約105至107TCID50/ml)。這些結果證明，CVA21-DAFv與CVA21親代病毒株在降低人前列腺異種移植物腫瘤負荷方面同樣有效。
討論I.腸病毒外殼相互作用CVA21原型病毒株的生產性細胞感染是由分立的與表面表達的DAF和ICAM-1的獨立作用介導的。在這種關系中，DAF的作用是將CVA21螯合在細胞表面，以便隨后與誘導外殼構象改變并侵入細胞的ICAM-1相互作用。但是，體外多次細胞傳代是否對這種受體利用模式起積極作用的問題是倍受關注的主題。具體地，考慮到種系發(fā)生相關的原型A型柯薩奇病毒A13、A15、A18和A20(其同樣采用ICAM-1作為細胞內化受體，與表面表達的DAF不結合)，DAF結合表型是一個頗受猜測的領域。因此，進行了許多研究，以觀察CVA21原型病毒株Kuykendall的DAF結合表型在體外低代數(shù)CVA21臨床分離株中是否是保守的，或者僅僅是細胞培養(yǎng)物多次傳代的人工產物。
在此所述的放射性同位素標記病毒結合實驗表明，CVA21的三種臨床分離株顯示出與原型CVA21病毒株(Kuykendall)相似的受體吸附方式，其特征在于能夠獨立地與DAF或ICAM-1結合(圖1)。MAb對DAF或ICAM-1的阻斷不能完全抑制病毒結合(圖2)，這表明兩種受體在CVA21臨床分離株的吸附/感染過程中發(fā)揮重要的作用。同時，對高水平DAF和ICAM-1共同表達的環(huán)境中的CVA21結合的研究表明，病毒結合程度較在兩種受體單獨表達的環(huán)境中低(圖3)。這些發(fā)現(xiàn)表明，多個受體的高水平共同表達確實可以對最佳溶解性感染有抑制作用。在宿主細胞表面上被共同表達時，DAF和ICAM-1的密切接近可能引起空間位阻，導致有效的受體結合位點減少。如果是這樣的話，可以推斷，盡管兩種受體在宿主細胞上的高水平表達并不需要與吸附水平的增加相關，兩種不同細胞受體對一種病毒的表達水平不同的環(huán)境可能潛在地是有益的。這種環(huán)境可能發(fā)生在人腸道的粘膜表面，在此DAF的表達是廣泛存在的，其水平顯著高于ICAM-1，后者的內源性表達水平相對較低，等待被適當?shù)募毎蜃诱T導。
本項研究一個出乎意料的發(fā)現(xiàn)是，通過在不存在抗體交聯(lián)的情況下僅經(jīng)由DAF結合而溶解性地感染RD細胞，低代數(shù)臨床CVA21分離株能夠以更具有功能性的作用利用DAF相互作用(圖4)。對這些新的發(fā)現(xiàn)的一種可能的解釋是臨床CVA21分離株的病毒外殼能夠以比原型病毒株更重要的方式與DAF交聯(lián)，使病毒內化，其機制類似于抗-DAF MAb的人工交聯(lián)作用(圖4)。類似地，在CVB3原型和低代數(shù)臨床分離株之間也觀察到受體利用方面的差異。最近，有報道稱口蹄疫病毒(FMDV)的實驗室和野外病毒株之間存在著不同αv整合蛋白利用方面的差異，說明病毒分離株對其細胞受體的親合性可以發(fā)生改變。
在此，我們證實了在不存在ICAM-1的情況下，MAb交聯(lián)的DAF的作用是原型和臨床CVA21分離株的功能性內化受體(圖4)。之前已經(jīng)提出，MAb交聯(lián)的DAF介導的CVA21侵入經(jīng)由細胞窖發(fā)生，與ICAM-1病毒相互作用中采用的網(wǎng)格蛋白-有被小窩侵入途徑相反。CVA21通過含有交聯(lián)DAF的細胞窖侵入的假設由以下證據(jù)支持MAb集聚的DAF在募集至細胞窖后被胞吞。DAF相互作用在細胞窖介導的CVA21侵入中的可能作用已經(jīng)被最近的報道證實，該報道稱EV11的DAF結合株經(jīng)由脂筏和/或細胞窖被細胞內化。
DAF在哺乳動物體內的廣泛表達為與DAF親合性較高并利用該受體進行內化的病毒提供了適應性優(yōu)勢。由于在紅細胞上進行DAF表達，為DAF結合病毒提供了一種現(xiàn)成的向人體全身輸送的運載體，因此這種病毒與其他病毒株相比致病性更高。有趣的是，柯薩奇病毒B3和B5分離株在極性上皮細胞(其天然的內化受體柯薩奇和腺病毒受體位于細胞-細胞緊密連接處，DAF位于上表面)中的連續(xù)傳代可以選擇DAF結合變異體，表明DAF在上皮細胞粘膜表面感染中的重要作用。
編碼外殼結構蛋白的基因組P1區(qū)的遺傳分析，在臨床CVA21分離株和原型病毒株的推算氨基酸序列之間檢測到許多差異(圖5)。所觀察到的編碼變化無一定位成之前確定的ICAM-1足跡，差異散布在VP1、VP2和VP3中。構成ICAM-1足跡的殘基在原型Kuykendall病毒株和所有的臨床分離株中都是保守的，除了VP2中的氨基酸168(圖5)。VP2的168位點處，Val至Ala的氨基酸置換是保守的，可能在ICAM-1結合位點的構象中意義極少。臨床分離株#272101在僅表達DAF的RD細胞中顯示出顯著的溶解活性，但是不如其余臨床分離株的活性大，其具有所有臨床分離株相對于原型病毒株之間觀察到的14個編碼改變中的13個。與其它臨床分離株相比，#272101中進一步存在有9處其它改變，這可能對分離株#275238和#2727598所顯示的DAF利用增強顯型具有某種類型的抑制作用。在DAF和ICAM-1二者水平都高的環(huán)境中DAF利用顯型升高的臨床CVA21分離株的體外重復細胞傳代可以對ICAM-1利用增強的病毒體的生物選擇施加壓力，其代價是功能性DAF相互作用降低。產生這種病毒體群體可以確定決定受體利用改變顯型的關鍵P1氨基酸改變。
分離株#272101的DAF利用降低的一種可能解釋由下列報道提供其中生物選擇的喪失其DAF結合顯型的EV11變異體在VP1的BC環(huán)和VP2的疏松區(qū)(puff region)具有特異性的氨基酸改變。我們的序列分析顯示，#272101在VP1的BC環(huán)和VP2的疏松區(qū)存在有這些獨特差異，在其它CVA21臨床分離株的相同外殼區(qū)則不存在這種差異(圖5)。盡管不是結論性的，但是在病毒吸附/侵入細胞的環(huán)境中，這些所有臨床分離株和原型株之間觀察到的13處氨基酸改變可能在DAF利用增強顯型的發(fā)展過程中具有潛在的作用。但是，盡管沒有在本研究中解決，不能排除位于病毒基因組其他區(qū)(如5′未翻譯區(qū))的其它改變參與介導細胞的溶解性感染。
但是，DAF/EV7、DAF/CVB3相互作用和DAF/CVA21相互作用之間的顯著差異是DAF SCR2、3或4參與EV和CVB結合，而DAFSCR1參與CVA21吸附。假定EV7、CVB3和CVA21外殼之間的整體結構相似，則CVA21外殼上分別具有其各自結合位點的兩個獨立受體(即DAF和ICAM-1)的N-端結構功能區(qū)在感染過程中的任何階段均可以參與。但是，DAF SCR2-4參與EV7/CVB3的結合表明，對于CVB3來說，與其它受體(如CAR)的相互作用可以在DAF相互作用之后發(fā)生，使得對與病毒外殼上特異性DAF結合表位接觸的干擾將至最低。令人感興趣的一個發(fā)現(xiàn)可能是，檢測到原型病毒株VP1相對于能夠溶解性地感染ICAM-1陰性RD細胞的臨床分離株的遷移的微小差異。同樣，在RD細胞中連續(xù)傳代后產生的CVB3原型的變異體(CB3-RD)與原型相比VP1遷移率發(fā)生變化，與親代病毒株相比與DAF的受體特異性發(fā)生變化。
綜合在一起，本研究的結果表明，臨床分離株與其細胞受體的總體結合能力對于原型病毒株是保守的，但是在臨床CVA21分離株利用這些受體的能力方面存在一些個別的差異。與CVB3野生病毒株類似，臨床CVA21分離株具有在細胞溶解性感染中促進DAF利用增加的顯型，這最可能是在人類中傳代的結果。CVA21利用DAF和ICAM-1對宿主細胞進行吸附和/或感染的能力表明，有益顯型的保守性使得單個和/或多個受體得以利用，從而擴大病毒的組織嗜性，并顯著增加了生產性感染的機會。
II.柯薩奇病毒A21變異體的生物選擇和分子特性盡管生產性CVA21感染需要有ICAM-1，如同許多其它腸病毒那樣，DAF起到CVA21原型病毒株吸附受體的作用。在本研究中，我們描述了在ICAM-1陰性細胞中體外生物選擇的CVA21變異體，其獲得了改變且擴大的細胞嗜性(圖6和7)。本文所示的放射性同位素標記病毒結合實驗表明，盡管在ICAM-1陰性RD細胞中進行多次傳代，CVA21-DAFv仍然保留了獨立結合ICAM-1的N-端結構功能區(qū)或DAFSCR1的能力(圖7)。在表面表達DAF水平極高的環(huán)境中(即，選擇表達水平最高的CHO-DAF細胞)，親代和CVA21-DAFv與DAF結合的水平相似，而CVA21-DAFv僅與RD細胞和內源性DAF表面表達顯著減少的DOV13細胞吸附。根據(jù)之前的研究，抗-DAF SCR3mAb與DAF的mAb交聯(lián)顯著地增加了親代CVA21與表達DAF的RD和DOV13細胞的結合，并在不存在ICAM-1的情況下促進溶解性感染(圖7)。但是，沒有觀察到CVA21-DAFv與mAb交聯(lián)RD或DOV13細胞的病毒結合或溶解性感染。這一發(fā)現(xiàn)表明，與親代病毒株相比，生物選擇的CVA21-DAFv與DAF的相互作用已經(jīng)被優(yōu)化，使得這種相互作用不會進一步被mAb交聯(lián)DAF增強。數(shù)據(jù)表明，在與表位競爭性抗-DAF SCR1mAb培育的過程中，親代CVA21病毒體較CVA21-DAFv更容易從表面表達的DAF上移位，這進一步支持了CVA21-DAFv的DAF結合顯型比親代病毒株增強的假說(圖8)。
推測對于CVA21原型病毒株來說，DAF的作用是將病毒保持在感染狀態(tài)，等待與侵入受體ICAM-1相互作用，僅與DAF的直接結合并不能引發(fā)CVA21原型病毒株的生產性感染。盡管轉染CHO細胞表面上的DAF或ICAM-1表面表達水平很高(圖7A)，但是觀察不到可檢測的細胞被親代CVA21或CVA21-DAFv感染(數(shù)據(jù)未顯示)。但是，ICAM-1陰性RD和DOV13細胞的溶解性感染提供了CVA21-DAFv的DAF利用增強的證據(jù)，這種溶解性感染即使在病毒導入值很高時也可以被單獨的抗-DAF SCR1mAb阻斷所完全阻斷(圖9)。而在DAF和ICAM-1共表達的多受體環(huán)境中使用的CVA21原型株中觀察到的被同樣的mAb部分阻斷則與此相反，其中需要DAF和ICAM-1二者的mAb來完全阻斷感染。這些發(fā)現(xiàn)支持了以下假設CVA21-DAFv采用表面DAF作為功能性細胞受體。CVA21-DAFv感染在與之前顯示對腸病毒感染有抑制作用的濃度相當?shù)臐舛认卤籹DAF抑制，這一觀察結果進一步突出了DAF在RD細胞的CVA21-DAFv感染中的重要性(圖9)。另外，它提供了推翻以下可能性的證據(jù)在生物選擇過程中，CVA21-DAFv在不存在ICAM-1的情況下適于使用其它尚未確定的另一種細胞受體參與細胞內化。與親代CVA21相比，不僅在RD細胞中，而且在表達DAF的卵巢癌細胞(DOV13)中，CVA21-DAFv的DAF結合顯型增強(圖7和8)似乎已經(jīng)轉變成細胞的溶解性感染增強(圖7)。
許多人腸病毒與DAF的結合作用中有大量不同的差異。CVB3、EV7和EV12病毒體上的DAF結合位點推測位于二十面體二重對稱軸上的外殼峽谷外部。盡管EV11也與峽谷區(qū)的外部的DAF相互作用，DAF結合足跡被推測位于病毒體5重軸附近。在與DAF吸附的人類腸病毒當中，僅有腸病毒70和CVA21與DAF N末端SCR1結構功能區(qū)結合，其它的DAF結合腸病毒則與中央結構功能區(qū)(SCR2-4)相互作用。除與DAF結合的腸病毒位于峽谷外部這一事實之外，據(jù)報道這些相互作用并不會引起細胞感染或A顆粒的形成。對于EV11(其與DAF的結合已經(jīng)被定量評價過)，與DAF的相互作用親和力很低，這與在峽谷結合鼻病毒的ICAM-1分子相反，后者的親和力相近，但動力學較慢。
盡管CVA21-DAFv顯示了DAF結合增強的顯型，在外殼編碼區(qū)僅有兩處氨基酸與親代病毒株不同。在生物選擇過程中，CVA21-DAFv保留了與ICAM-1結合的能力(圖7)。因此，并不出乎意料，觀察到的外殼突變無一位于之前確定的ICAM-1結合足跡中，后者被假定為橫跨北部和南部的峽谷邊緣。觀察到的CVA21-DAFv突變據(jù)推測位于被VP2EF-環(huán)和VP1和VP3的C-端圍繞的VP3α-螺旋(CD-環(huán))中外殼峽谷的外部(圖10)。兩個突變據(jù)推測通過VP1R270和VP3H329的相互作用與VP1和VP3的C-端緊密接觸。我們提出CVA21-DAFvVP3中觀察到的突變可能參與了增強VP3α-螺旋和VP1C-端區(qū)的構象，后者對應于EV12表面上的DAF結合足跡。這種構象上的變化將使得CVA21-DAFv外殼和DAF之間更好地接觸。由于VP3H96和A101的存在使DAF和CVA21-DAFv病毒體雙重凹陷之間的親和力增加這一假設與下列發(fā)現(xiàn)相一致通過用抗-DAF SCR1mAb攻擊，CVA21-DAFv比親代病毒體更難以從表面表達的DAF上移位(圖8A)。低代數(shù)CVA臨床分離株在不存在mAb交聯(lián)DAF和ICAM-1表達的情況下可以不同程度地溶解感染表達DAF的RD細胞，它們也編碼在CVA21-DAFv中觀察到的VP3H96，但沒有A101突變。與之相比，原型CVA21病毒株編碼VP3R96。放射性同位素標記的CVA21-DAFv病毒體與表面DAF吸附能力的增強反映了在外殼編碼區(qū)內發(fā)生了突變，而不是有其它的病毒基因組區(qū)參與。
交聯(lián)DAF介導的原型CVA21細胞溶解性感染發(fā)生的速率比經(jīng)由ICAM-1相互作用介導的細胞溶解性感染慢，因此認為細胞侵入經(jīng)由不同的侵入機制發(fā)生。交聯(lián)DAF介導的原型CVA21侵入無需形成可檢測的A顆粒便可以發(fā)生，推測其與細胞窖有關，這是最近發(fā)現(xiàn)的EV1和EV11的DAF結合株的侵入所涉及的一種新的侵入途徑。EV1與其受體α2β1在細胞表面上的吸附引起整合蛋白的集聚，被認為以與原型CVA21通過交聯(lián)DAF介導侵入相似的方式促進病毒侵入。在mAb交聯(lián)之后，推測DAF以更有利的構象被呈遞在細胞表面上，從而使細胞容易被原型CVA21感染。CVA21-DAFv與表面DAF的結合似乎是在不形成可檢測A顆粒的情況下發(fā)生的(圖8B)。對這一發(fā)現(xiàn)的一種可能的解釋是以與之前假設的低代數(shù)臨床CVA21分離株(也具有VP3H96殘基)相似的方式，CVA21-DAFv病毒體可以有效地交聯(lián)DAF，從而通過與交聯(lián)mAb人工作用有關的機制進入細胞。表觀上缺乏從細胞表面洗脫的可檢測CVA21-DAFv A顆粒并不能證明沒有A顆粒的形成。如果隨后的脫殼發(fā)生速度比初始DAF介導的160S至135S顆粒的轉變快，A顆粒將不能積聚。使用α2β1整合蛋白進入細胞的EV1與外殼峽谷中α2β1整合蛋白的功能性α21結構功能區(qū)結合。盡管是一種典型的峽谷結合受體，EV1與α21的相互作用并不能引起病毒脫殼，這與可溶形式的脊髓灰質炎病毒受體與脊髓灰質炎病毒、ICAM-1與鼻病毒的結合相反。表達α2β1的細胞和EV1之間的相互作用已經(jīng)提示介導了病毒體的構象變化，但是EV1脫殼是否還需要其它的細胞分子尚不清楚。同樣，不能排除CVA21-DAFv脫殼需要其它的細胞蛋白，或者如果病毒外殼中存在突變則可能使外殼不穩(wěn)定，因而便不再需要受體介導的構象變化。
CVA21-DAFv溶解性感染兩種顯型和組織來源不同的癌細胞系(RD和DOV13)的能力突出說明，使用DAF作為功能受體并不限于生物選擇過程中所用的特定細胞底物。相對于正常細胞，DAF和其它補體調控蛋白在許多不同來源的腫瘤細胞表面上的表達都得到增強，以保護細胞不受補體介導的攻擊。因此我們認為，由于DAF結合顯型增強，CVA21-DAFv介導的經(jīng)由外殼與表面表達的DAF之間的特異性相互作用的溶瘤作用潛在可以有效地控制一些人類惡性腫瘤。經(jīng)由ICAM-1和DAF(二者均在惡性黑色素瘤細胞表面上過度表達)靶向的原型病毒株CVA21(其有效地控制黑色素腫瘤)的成功應用支持了這一策略。本研究的主要發(fā)現(xiàn)是病毒的生物選擇可能是一種有生命力的可選方法，以便在新型腫瘤靶向溶瘤性腸病毒的開發(fā)中對基因操作進行指導。
III.柯薩奇病毒A21-DAF介導的細胞感染性原型和臨床分離株之間的腸病毒與DAF的相互作用似乎有所不同。在不存在ICAM-1表達和抗體交聯(lián)DAF的情況下，CVA21的臨床分離株可能是經(jīng)由特異性病毒外殼作用通過DAF交聯(lián)而不同程度地引起宿主細胞的溶解性感染。然而，盡管詳細描述了許多臨床腸病毒分離株的DAF相互作用，溶解性感染中DAF的直接功能性作用尚未闡明。許多對腸病毒-DAF相互作用的研究一致認為DAF起到病毒螯合受體的作用，從而增強了病毒向其他功能性內化受體的呈遞。
在本研究中我們證實，與結合DAF的艾柯病毒和B型柯薩奇病毒不同，CVA21與DAF的N-端SCR結合(圖11)?？疾炝松镂锢韰?shù)如時間、溫度和pH對從DAF洗脫CVA21的影響，結果顯示，CVA21顆粒相對較快地從DAF上洗脫，這種洗脫對溫度和pH的增加是易感的(圖12)。CVA21從ICAM-1上洗脫的特征在于與從DAF洗脫的病毒體相比，病毒的感染性大幅度下降(圖13和圖14)。由于受體的結合，從ICAM-1上洗脫的CVA21病毒粒子經(jīng)歷了不可逆的外殼構象改變，使它們失去了結合和引發(fā)溶解性感染的能力。與此相反，CVA21與mAb交聯(lián)DAF的相互作用則不會引起A顆粒的形成。受體結合時非感染性A顆粒的構象變化是許多小RNA病毒(如PV、主要組HRV和CVB3)的特征。DAF洗脫顆粒能夠保持感染性最可能的原因是DAF不能誘導CVA21外殼的構象變化。從表達DAF的CHO細胞上洗脫的CVA21顆粒在蔗糖梯度中的沉降系數(shù)與感染性160S顆粒相似，而從表達ICAM-1的CHO細胞上洗脫的CVA21顆粒表現(xiàn)出的沉降系數(shù)減小，更接近于135S改變的顆粒。CVA21的感染性在DAF相互作用之后仍然保持的原因可能在于與參與ICAM-1結合的情況相比，病毒體外殼的不同區(qū)域參與了DAF結合。CVA21峽谷是ICAM-1的附著位點，而DAF據(jù)推測在更容易接觸到的外殼雙重凹陷(twofold depression)內結合，這一提議最近在EV7中使用低溫電子顯微鏡重建得到證實。同樣，推測EV11也在峽谷外部的外殼區(qū)域與DAF結合，但是在這種情況下，結合被認為涉及二十面體5重軸。這些發(fā)現(xiàn)支持了以下理論由于推測雙重凹陷中的結合并不能引起外殼構象的可檢測變化，主要由DAF參與細胞吸附。
DAF與腸病毒外殼結合的特性被認為是親和力很低，其原因在于解離速率常數(shù)非?？臁Ｏ喾?，ICAM-1與結構相似的病毒外殼的相互作用親和力相當，但在動力學上顯著變慢，這與結合位點外殼峽谷相對較難接近相符合。在與mAb接觸競爭其受體結合表位的過程中，DAF-結合的病毒體比ICAM-1結合的病毒體更容易移位，這一結果表明與ICAM-1的結合比DAF更嚴格。因此，mAb介導的DAF結合CVA21移位的明顯差異是外殼表面上受體結合位點的各個位置的相對接近造成的，即，由于mAb接近雙重凹陷(twofold depression)內的可能性增加，病毒的DAF結合更容易解離，由于mAb與外殼峽谷的接近受限制，病毒的ICAM-1結合難以解離。
(ICAM-1陰性細胞上)CVA21與DAF結合并保持感染狀態(tài)直至24小時的能力突出了CVA21與DAF相互作用的可逆性質。當出現(xiàn)ICAM-1表達延遲時，感染性的保留使得結合DAF的病毒粒子能夠進入細胞并隨后溶解細胞(圖15)。在不存在可檢測細胞病理學變化的情況下，在研究過程中RD細胞單層和用腺-CD36(圖15C)轉導的RD細胞上的感染性CVA21始終保持相對較高的水平；最有可能是由于與DAF結合的保留感染性的殘余病毒接種物造成的(圖13和圖14)。另一種解釋是，在CVA21原型制劑中存在顯型DAF利用增強的病毒體亞群，使DAF交聯(lián)，并引發(fā)隨后的緩慢感染，這是之前對CVA21臨床分離株所述的一個發(fā)現(xiàn)。
假定DAF在哺乳動物體內特別是在紅細胞上廣泛分布，CVA21利用DAF作為吸附受體并保持高度感染性的能力是一種非常有益的機制。在這種情況下，表達DAF的紅細胞為病毒提供了一種現(xiàn)成的運輸載體向全身輸送，感染性病毒可以離開紅細胞表面，與表達ICAM-1的細胞相互作用進行溶解性感染。在存在炎性細胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-1β的情況下，細胞表面的ICAM-1表達得以強。在天然人鼻病毒感染過程中，被感染的細胞釋放處這些介導周圍細胞ICAM-1表達增強的細胞因子。
在此給出的數(shù)據(jù)證實，CVA21溶解性感染過程中DAF的主要作用是作為螯合受體，使病毒保持在感染狀態(tài)，等待經(jīng)由ICAM-1相互作用進入細胞的機會。相對較短的結合和洗脫循環(huán)周期表明，細胞感染過程中CVA21最有可能與DAF結合并從其上洗脫許多次。我們認為，從DAF上洗脫并不會損害CVA21在后期引發(fā)生產性感染的能力，實際上它增加了該病毒通過至少兩種不同的機制實現(xiàn)侵入宿主細胞的可能。首先，病毒可以與DAF結合并洗脫，同時仍然保持受體結合能力，從而保持細胞感染性。其次，CVA21可以與DAF結合，等待在同一細胞或鄰近細胞上達到顯著水平的ICAM-1表達，從而使病毒內化，隨后發(fā)生溶解性感染。就病毒進化和發(fā)病機理兩個方面而言，結合DAF的能力必須被認為最有利于CVA21原型株和其他DAF結合腸病毒使細胞感染性最大，在有毒力的臨床CVA21分離株中保留甚至增強的顯型。
IV.柯薩奇病毒A21DAF變異體(CVA21-DAFv)體外溶解人乳腺、前列腺、結腸和卵巢癌細胞在此展現(xiàn)的工作描述了通過體外選擇方法分離的CVA21-DAFv的特異性溶瘤能力。使用一組12個人癌細胞系，我們已經(jīng)證明，這種生物選擇的病毒株迅速地感染所有來源于腫瘤的被測細胞。相反，CVA21-DAFv所源自的CVA21親代病毒株，僅僅在被測的12個癌細胞系中的7個中介導著溶瘤作用。重要的是，CVA21-DAFv相對于親代CVA21更出色的溶瘤活性并不限于產生該生物選擇病毒株的RD細胞，而是在大多數(shù)被測的來源于不同組織的其它人癌細胞系中均有觀察到(圖18)。我們觀察到，與需要存在ICAM-1來進入細胞的親代CVA21相比，CVA21-DAFv溶解性地感染大量被測腫瘤細胞系可能具有深遠的臨床意義。人類實體腫瘤通常是一大團聚集的細胞，其往往不表達ICAM-1。而且，已經(jīng)顯示ICAM-1的表達與前列腺癌細胞的轉移潛能相關，即，與轉移性較小的LNCaP細胞相比，轉移性較強的細胞系DU145和PC3上表達有ICAM-1。在研究中我們已顯示，LNCaP細胞對CVA21的親代病毒株的感染有抵抗力，該細胞系以及DU145和PC3則被生物選擇的變異體CVA21-DAFv溶解。
V.CVA21-DAFv對人前列腺腫瘤異種移植物的體內溶瘤作用盡管CVA21-DAFv比CVA21親代病毒株針對范圍更寬的癌細胞系表現(xiàn)出溶瘤活性，在人前列腺腫瘤異種移植物的體內模型中，生物選擇的病毒株的單次劑量同樣有效地減小腫瘤的負荷?？傊?，在此所展現(xiàn)的證據(jù)表明，CVA21-DAFv具有用作多種異種癌細胞種類的有效生物治療藥物的潛力。
摘要已經(jīng)顯示，低細胞培養(yǎng)代數(shù)的CVA21臨床分離株除與ICAM-1結合之外，還與DAF結合，具有DAF結合顯型，因此，不可能從細胞培養(yǎng)物的多次傳代得到。越來越多的證據(jù)表明，DAF在腸病毒感染中發(fā)揮更多的功能作用，這種臨床CVA21分離株的DAF利用增強顯型在不存在抗-DAF mAb交聯(lián)或ICAM-1表面表達的情況下，具有溶解性地感染DAF表達細胞的能力。
我們研究了生物選擇成溶解性地感染ICAM-1陰性橫紋肌肉瘤(RD)細胞的CVA21變異體CVA21-DAFv的受體利用性質。我們發(fā)現(xiàn)，在表達DAF的RD細胞中進行多次傳代后，與親代病毒株相比，CVA21-DAFv表現(xiàn)出的結合DAF的能力增強，同時還保留著結合ICAM-1的潛力。RD細胞的溶解性感染被抗-DAF SCR1mAb阻斷完全消除，這表明單是與DAF的相互作用介導了溶解性感染。為了更好地認識CVA21-DAFv細胞相互作用的分子基礎，對CVA21-DAFv外殼編碼區(qū)的核苷酸序列進行測定，并與親代CVA21的序列進行比較。序列比較顯示，CVA21-DAFv的VP3中有兩個獨特的氨基酸取代，預計這使得病毒外殼與DAF的相互作用得以增強。
本領域專業(yè)技術人員將會認識到，可以在不偏離本發(fā)明精神或廣義描述范圍的前提下，對本發(fā)明的具體實施方式
進行大量的變動和/或修改。因此，本文的實施方式在所有方面均應被視為是說明性的，而絕不是限制性的。
序列表<110>維若塔歌私人有限公司<120>修飾的溶瘤病毒<130>699860C<150>US60/552,095<151>2004-03-11<160>8<170>PatentIn version3.2<210>1<211>2637<212>DNA<213>柯薩奇病毒A<400>1atgggggctc aagtctcaac tcaaaagacc ggtgcgcacg agaatcaaaa cgtggcagct 60aatggatcca ccattaatta tactactatc aattactaca aagatagcgc gagtaattcg 120gccactagac aagatctttc ccaagatcca tcaaaattca cggaaccggt taaggactta 180atgttgaaaa cagcaccagc tttaaattca ccaaatgtgg aagcatgtgg atacagtgac 240cgtgtaagac aaattaccct gggtaactca accattacca cacaagaagc agctaatgct 300attgttgctt atggtgagtg gcctacttac ataaatgact cagaagcaaa cccagtagat 360gcacccactg aaccagacgt tagtagcaac aggttttaca ccctagaatc ggtgtcttgg 420aagactacct caaggggttg gtggtggaaa ctaccagact gtctaaaaga catgggaatg 480tttggtcaga acatgtacta ccactactta ggacgctctg gttataccat tcatgtccag 540tgcaatgcct caaaatttca ccaaggggca ttaggagttt ttctgatacc agagtttgtc 600atggcctgca acactgagag caaaacatca tatgtttcat acattaacgc aaatcctggt 660gagaggggcg gtgagttcac aaacacctac aacccatcaa acacagatgc tagtgagggc 720agacaattcg cagcactaga ctatctgctg ggttctggcg ttctagctgg aaacgcattt 780gtgtacccgc accagatcat taacttgcgt accaataaca gtgcaacaat cgtggtgcca 840tatgtgaact cacttgtcat tgattgcatg gcaaaacata ataactgggg cattgtcatt 900ctaccactgg cacccttggc ctttgctgca acatcgtcac cacaggtgcc tattacagtg 960accattgcac ccatgtgcgc agaattcaat ggattgagaa acatcaccat cccagtgcat1020caagggttgc caacaatgaa tacacctggt tccaatcaat tcctcacatc tgatgacttc1080cagtcaccct gcgccttacc caattttgat gtcactccgc caatacacat acccggagaa1140
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<212>PRT<213>柯薩奇病毒A<400>6Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Thr Gly Ala His Glu Asn Gln1 5 10 15Asn Val Ala Ala Asn Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr20 25 30Tyr Lys Asp Ser Ala Ser Asn Ser Ala Thr Arg Gln Asp Leu Ser Gln35 40 45Asp Pro Ser Lys Phe Thr Glu Pro Val Lys Asp Leu Met Leu Lys Thr50 55 60Ala Pro Ala Leu Asn Ser Pro Asn Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp65 70 75 80Arg Val Arg Gln Ile Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu85 90 95Ala Ala Asn Ala Ile Val Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Thr Tyr Ile Asn100 105 110Asp Ser Glu Ala Asn Pro Val Asp Ala Pro Thr Glu Pro Asp Val Ser115 120 125Ser Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Glu Ser Val Ser Trp Lys Thr Thr Ser130 135 140Arg Gly Trp Trp Trp Lys Leu Pro Asp Cys Leu Lys Asp Met Gly Met145 150 155 160Phe Gly Gln Asn Met Tyr Tyr His Tyr Leu Gly Arg Ser Gly Tyr Thr165 170 175Ile His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Gly180 185 190Val Phe Leu Ile Pro Glu Phe Val Met Ala Cys Asn Thr Glu Ser Lys195 200 205Thr Ser Tyr Val Ser Tyr Ile Asn Ala Asn Pro Gly Glu Arg Gly Gly210 215 220Glu Phe Thr Asn Thr Tyr Asn Pro Ser Asp Thr Asp Ala Asn Glu Gly225 230 235 240Arg Gln Phe Ala Ala Leu Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Gly Val Leu Ala245 250 255Gly Asn Ala Phe Val Tyr Pro His Gln Ile Ile Asn Leu Arg Thr Asn260 265 270Asn Ser Ala Thr Ile Val Val Pro Tyr Val Asn Ser Leu Val Ile Asp275 280 285
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595 600 605Thr Ser Gly Ala Asn Ser Gln Glu Val Pro Ala Leu Thr Ala Val Glu610 615 620Thr Gly Ala Ser Gly Gln Ala Ile Pro Ser Asp Val Met Glu Thr Arg625 630 635 640His Val Ile Asn Tyr Lys Thr Arg Ser Glu Ser Cys Leu Glu Ser Phe645 650 655Phe Gly Arg Ala Ala Cys Val Thr Ile Leu Ser Leu Thr Asn Ser Ser660 665 670Glu Arg Gly Glu Glu Arg Lys His Phe Asn Ile Trp Asn Ile Thr Tyr675 680 685Thr Asp Thr Val Gln Leu Arg Arg Lys Leu Glu Phe Phe Thr Tyr Ser690 695 700Arg Phe Asp Leu Glu Met Thr Phe Val Phe Thr Glu Asn Tyr Pro Ser705 710 715 720Thr Ala Ser Gly Glu Val Arg Asn Gln Val Tyr Gln Ile Met Tyr Ile725 730 735Pro Pro Gly Ala Pro Arg Pro Ser Ser Trp Asp Asp Tyr Thr Trp Gln740 745 750Ser Ser Ser Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Met Tyr Gly Asn Ala Pro Pro755 760 765Arg Met Ser Ile Pro Tyr Val Gly Ile Ala Asn Ala Tyr Ser His Phe770 775 780Tyr Asp Gly Phe Ala Arg Val Pro Leu Glu Gly Glu Asn Thr Asp Ala785 790 795 800Gly Asp Thr Phe Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asn Asp Phe Gly Val Leu805 810 815Ala Val Arg Ala Val Asn Arg Ser Asn Pro His Thr Ile His Thr Ser820 825 830Val Arg Val Tyr Met Lys Pro Lys His Ile Arg Cys Trp Cys Pro Arg835 840 845Pro Pro Arg Ala Val Leu Tyr Arg Gly Glu Gly Val Asp Met Ile Ser850 855 860Ser Ala Ile Leu Pro Leu Thr Glu Val Asp Ser Ile Thr Thr Phe865 870 875<210>7<211>2637<212>DNA<213>柯薩奇病毒A
<400>7atgggggctc aagtttcaac gcaaaagacc ggtgcgcac9 agaatcaaaa cgtggcagcc 60aatggatcca ccattaatta cactactatc aactattaca aagacagtgc gagtaattcc 120gctactagac aagacctctc ccaagatcca tcaaaattca cagaaccggt taaggactta 180atgttgaaaa cagcaccagc tctaaactcg cctaacgtgg aagcatgtgg gtacagtgac 240cgtgtgaggc aaatcacttt aggcaactcg actattacta cacaagaagc agccaatgct 300attgttgctt acggtgaatg gcccacttac ataaatgatt cagaagctaa tccggtagat 360gcacccactg agccagatgt tagtagcaac cggttttaca ccctagaatc ggtgtcttgg 420aagaccactt caaggggatg gtggtggaag ttaccagatt gtttgaagga catgggaatg 480tttggtcaga atatgtacta tcactacttg gggcgctctg gttacaccat tcatgtccag 540tgcaacgctt caaaatttca ccaaggggcg ttaggagttt ttctgatacc agagtttgtc 600atggcttgca acactgagag taaaacgtca tacgtttcat acatcaatgc aaatcctggt 660gagagaggcg gtgagtttac gaacacctac aatccgttaa atacagacgc cagtgagggc 720agaaagtttg cagcattgga ttatttgctg ggttctggtg ttctagcagg aaacgccttt 780gtgtacccgc accagatcat caacctacgt accaacaaca gtgcaacaat tgtggtgcca 840tacgtaaact cacttgtgat tgattgtatg gcaaaacaca ataactgggg cattgtcata 900ttaccactgg cacccttggc ctttgccgca acatcgtcac cacaggtgcc tattacagtg 960accattgcac ccatgtgtac agaattcaat gggttgagaa acatcaccgt cccagtacat1020caagggttgc cgacaatgaa cacacctggt tccaatcaat tccttacatc tgatgacttc1080cagtcgccct gtgccttacc taattttgat gttactccac caatacacat acccggggaa1140gtaaagaata tgatggaact agctgaaatt gacacattga tcccaatgaa cgcagtggac1200gggaaggtga acacaatgga gatgtatcaa ataccattga atgacaattt gagcaaggca1260cctatattct gtttatccct atcacctgct tctgataaac gactgagcca caccatgttg1320ggtgmaatcc taaattatta cacccattgg acggggtcca tcaggttcac ctttctattt1380tgtggtagta tgatggccac tggtaaactg ctcctcagct attccccacc gggagctaaa1440ccaccaacca atcgcaagga tgcaatgcta ggcacacaca tcatctggga cctagggtta1500caatccagtt gttccatggt tgcaccgtgg atctccaaca cagtgtacag acggtgtgca1560cgtgatgact tcactgaggg cggatttata acttgcttct atcaaactag aattgtggta1620cctgcttcaa cccctaccag tatgttcatg ttaggctttg ttagtgcgtg tccagacttc1680agtgtcagac tgcttaggga cactccccat attagtcaat cgaaactaat aggacgtaca1740caaggcattg aagacctcat tgacacagcg ataaagaatg ccttaagagt gtcccaacca1800
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<221>misc_feature<222>(442)..(442)<223>Xaa可是是任何天然氨基酸<400>8Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Thr Gly Ala His Glu Asn Gln1 5 10 15Asn Val Ala Ala Asn Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr20 25 30Tyr Lys Asp Ser Ala Ser Asn Ser Ala Thr Arg Gln Asp Leu Ser Gln35 40 45Asp Pro Ser Lys Phe Thr Glu Pro Val Lys Asp Leu Met Leu Lys Thr50 55 60Ala Pro Ala Leu Asn Ser Pro Asn Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp65 70 75 80
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1.一種能夠在基本上不存在細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細胞或誘導細胞凋亡的分離、選擇的小RNA病毒。
2.根據(jù)權利要求1所述的小RNA病毒，其中所述選擇的小RNA病毒能夠通過細胞上的衰變加速因子(DAF)溶解性地感染細胞。
3.根據(jù)權利要求1所述的小RNA病毒，其中所述的小RNA病毒選自腸病毒的原型和臨床分離株，所述的腸病毒包括柯薩奇病毒、艾柯病毒、脊髓灰質炎病毒、未分類腸病毒、鼻病毒、副腸弧病毒、肝病毒和心病毒。
4.根據(jù)權利要求1所述的小RNA病毒，其中所述的小RNA病毒為柯薩奇病毒。
5.根據(jù)權利要求4所述的小RNA病毒，其中所述的柯薩奇病毒為A型柯薩奇病毒。
6.根據(jù)權利要求4所述的小RNA病毒，其中所述的柯薩奇病毒為柯薩奇病毒A21。
7.根據(jù)權利要求1所述的小RNA病毒，其中所述的小RNA病毒為艾柯病毒。
8.根據(jù)權利要求7所述的小RNA病毒，其中所述的艾柯病毒為艾柯病毒6、7、11、12、13或29。
9.根據(jù)權利要求1所述的小RNA病毒，其中所述的小RNA病毒為脊髓灰質炎病毒。
10.根據(jù)權利要求9所述的小RNA病毒，其中所述的脊髓灰質炎病毒為1、2或3型脊髓灰質炎病毒。
11.根據(jù)權利要求1所述的小RNA病毒，其中所述的小RNA病毒為鼻病毒。
12.根據(jù)權利要求11所述的小RNA病毒，其中所述的鼻病毒是主要組鼻病毒或次要組鼻病毒的成員。
13.根據(jù)權利要求1所述的小RNA病毒，其中所述的小RNA病毒是通過以下方法生物選擇的將表達DAF、無ICAM-1的細胞系中的不能在不存在ICAM-1的情況下溶解性地感染細胞的小RNA病毒傳代，并回收選擇的能夠在不存在ICAM-1的情況下溶解性地感染細胞的小RNA病毒。
14.根據(jù)權利要求1所述的小RNA病毒，其中所述的小RNA病毒通過例如定點誘變或者在使用抗-ICAM-1抗體阻斷ICAM-1入口的細胞中進行傳代被改變、突變或修飾。
15.根據(jù)權利要求1所述的小RNA病毒，其中所述的選擇的小RNA病毒與野生型病毒相比在一個或多個外殼蛋白中發(fā)生了改變。
16.根據(jù)權利要求15所述的小RNA病毒，其中所述的小RNA病毒是包括選自VP1、VP2和VP3的外殼蛋白的改變的柯薩奇病毒。
17.根據(jù)權利要求16所述的小RNA病毒，其中所述的突變選自VP3 R96H；VP3 E101A；VP3 A239S；VP2 S164L和VP2 V209中的一種或多種。
18.根據(jù)權利要求1所述的小RNA病毒，其中所述的選擇的小RNA病毒包括由選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5和SEQ ID NO7的核酸序列編碼的外殼蛋白。
19.根據(jù)權利要求1所述的小RNA病毒，其中所述的細胞為腫瘤。
20.根據(jù)權利要求19所述的小RNA病毒，其中所述的腫瘤為表達DAF的腫瘤。
21.根據(jù)權利要求20所述的小RNA病毒，其中所述的腫瘤選自肺癌、前列腺癌、結直腸癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、肝癌、白血病、黑色素瘤、癌前細胞、食管癌、乳癌、腦癌、卵巢癌、胃癌和腸癌。
22.一種源自能夠在基本上不存在細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細胞或誘導細胞凋亡的分離的小RNA病毒的核酸分子。
23.根據(jù)權利要求22所述的核酸分子，其中所述的核酸分子是單鏈RNA或互補DNA。
24.一種對能夠在基本上不存在細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細胞的小RNA病毒進行生物選擇的方法，該方法包括將不能夠在基本上不存在細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細胞的小RNA病毒培養(yǎng)在合適的細胞系中進行足夠多次的傳代，選擇能夠在基本上不存在細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細胞的小RNA病毒。
25.根據(jù)權利要求24所述的方法，其中所述的細胞系選自人類癌，例如橫紋肌肉瘤、肺癌、前列腺癌、結直腸癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、肝癌、白血病、黑色素瘤、癌前細胞、食管癌、乳癌、腦癌、卵巢癌、胃癌和腸癌。
26.根據(jù)權利要求25所述的方法，其中所述的細胞系是不表達ICAM-1、表達DAF的細胞系。
27.根據(jù)權利要求24所述的方法得到的小RNA病毒。
28.一種藥物組合物，其包括能夠在基本上不存在細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細胞或誘導細胞凋亡的分離的小RNA病毒、以及合適的藥物可接受賦形劑或稀釋劑。
29.一種藥物組合物，其包含能夠在基本上不存在細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細胞或誘導細胞凋亡的小RNA病毒的病毒核酸分子、以及合適的藥物可接受賦形劑或稀釋劑。
30.一種治療患腫瘤哺乳動物的腫瘤的方法，該方法包括在導致病毒介導的腫瘤細胞溶瘤作用的條件下，用有效量的能夠在基本上不存在細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細胞或誘導細胞凋亡的分離的小RNA病毒為哺乳動物給藥。
31.根據(jù)權利要求30所述的方法，其中所述的腫瘤是表達DAF的腫瘤。
32.根據(jù)權利要求30所述的方法，其中所述的腫瘤選自肺癌、前列腺癌、結直腸癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、肝癌、白血病、黑色素瘤、癌前細胞、食管癌、乳癌、腦癌、卵巢癌、胃癌和腸癌。
33.一種治療患腫瘤哺乳動物的腫瘤的方法，該方法包括在導致病毒介導的腫瘤細胞溶瘤作用的條件下，用有效量的源自能夠在基本上不存在細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細胞或誘導細胞凋亡的分離的小RNA病毒的核酸分子為哺乳動物給藥。
34.根據(jù)權利要求33所述的方法，其中所述的腫瘤是表達DAF的腫瘤。
35.根據(jù)權利要求33所述的方法，其中所述的腫瘤選自肺癌、前列腺癌、結直腸癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、肝癌、白血病、黑色素瘤、癌前細胞、食管癌、乳癌、腦癌和卵巢癌。
36.一種能夠在基本上不存在細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細胞或誘導細胞凋亡的分離的小RNA病毒在治療方法或治療中的用途。
37.一種源自能夠在基本上不存在細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細胞或誘導細胞凋亡的分離的小RNA病毒的核酸分子在治療方法或治療中的用途。
38.一種能夠在基本上不存在細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細胞或誘導細胞凋亡的分離、選擇的小RNA病毒在治療哺乳動物腫瘤的藥物制造中的用途。
39.一種將接種物提供給哺乳動物以產生治療哺乳動物腫瘤的病毒的施用器，其中所述的施用器包括充滿接種物的區(qū)域，使得接種物可以與哺乳動物接觸，所述的病毒是能夠在基本上不存在細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的情況下溶解性地感染細胞或誘導細胞凋亡的分離、選擇的小RNA病毒。
40.一種本文所定義的CVA21-DAFv形式的分離、選擇的小RNA病毒。
41.一種本文所定義的CVA21病毒株形式的分離、選擇的小RNA病毒，其選自CVA21#272101、275238和272598。
全文摘要
本發(fā)明提供一種能夠在基本上不存在細胞間粘附分子－1(ICAM－1)的情況下溶解性地感染細胞或誘導細胞凋亡的分離、選擇的小RNA病毒；以及治療受試者的方法。
文檔編號C12N9/50GK101027394SQ200580007825
公開日2007年8月29日 申請日期2005年1月17日 優(yōu)先權日2004年3月11日
發(fā)明者E·S·周翰生, D·R·雪弗倫 申請人:維若塔歌私人有限公司