專利名稱：：硼酸抗性給予蛋白質(zhì)及其基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種擬南芥中硼酸抗性給予蛋白質(zhì)及其基因、含有該基因的重組載體、導(dǎo)入了該重組載體的轉(zhuǎn)化體、以及硼酸抗性給予基因的篩選方法。
背景技術(shù)：
：硼是高等植物的必須的微量元素中的一種(例如、非專利文獻(xiàn)1參照)。硼也有毒性，如果過剩攝取，會抑止植物的生長發(fā)育，或者動物也會由于急性中毒而死亡。土壤溶液中的硼以無電荷的分子狀存在。因此比較容易濾去，在農(nóng)作物中容易發(fā)生缺乏癥。現(xiàn)已報(bào)道，在包括日本在內(nèi)的全世界80個(gè)以上的國家中，130個(gè)品種由于硼欠乏癥導(dǎo)致的農(nóng)業(yè)上產(chǎn)量，品質(zhì)的下降(例如、參照非專利文獻(xiàn)2)。此外、已知硼比其它元素的最佳濃度范圍窄，能顯示出欠乏癥狀的濃度與顯現(xiàn)過剩癥狀的濃度差小。因此，在農(nóng)業(yè)上一直難以調(diào)節(jié)硼的施肥量。尤其是，在施了過剩量的硼時(shí)，難以除去硼，在該農(nóng)田的作物生產(chǎn)時(shí)就會帶來障礙。此外，由于水道水中含有硼，因此在干燥地區(qū)通過灌溉進(jìn)行農(nóng)耕時(shí)硼過剩的危害多會形成問題。這樣一來，過剩施加了硼的田地以及世界上硼濃度高的地區(qū)分布廣泛，包括這些地區(qū)在內(nèi)的各個(gè)國家正以針對硼過剩的危害的對策作為農(nóng)業(yè)政策上的重要課題。此外，硼還存在于金屬表面處理劑和漂白劑中，從使用這些物質(zhì)的工廠排出的水中含有大量的硼。人類中，硼的致死量為15-20g，然而已知即使比該致死量更少量的硼也會在消化器官和神經(jīng)系統(tǒng)中引起各種損傷。現(xiàn)在，工業(yè)排水中所含的硼量現(xiàn)已成為問題。最近，漸已清楚了植物中的硼的作用。清楚了硼交聯(lián)細(xì)胞壁的果膠質(zhì)多糖(例如，參照非專利文獻(xiàn)3)。還公開了這種交聯(lián)是植物生長發(fā)育所必須的(例如，非專利文獻(xiàn)4參照)。這就是植物中涉及硼的生理機(jī)能的最早的分子水平的觀點(diǎn)。一方面，植物體內(nèi)的硼輸送機(jī)制中仍然殘留了很多不清楚的地方。一直認(rèn)為硼通過脂質(zhì)雙層膜長期的被動擴(kuò)散進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，通過蒸騰流被輸送到植物體內(nèi)(例如，參照非專利文獻(xiàn)5)。另一方面，已知適于生長發(fā)育的硼營養(yǎng)條件在種間和品種間差異很大。作為其原因的可能性，可以列舉的是吸收和轉(zhuǎn)位，利用效率的不同，但并不清楚作為其要素的分子。近年來，提出了通過導(dǎo)管進(jìn)行輸送(例如、參照非專利文獻(xiàn)6)，但是其根據(jù)只不過是使用非洲爪蟾的卵母細(xì)胞中的表達(dá)系和膜囊的體外實(shí)驗(yàn)、并未顯示出在實(shí)際的個(gè)體中這些導(dǎo)管分子是否與硼輸送相關(guān)。此外，雖然根據(jù)向日葵的根吸收實(shí)驗(yàn)提示存在由運(yùn)載體進(jìn)行的能量輸送(例如，參照非專利文獻(xiàn)7)，但是還未鑒定到承擔(dān)這種作用的運(yùn)載體。本發(fā)明人在生物界中首次從模式植物擬南芥中分離出排出型硼抗性蛋白質(zhì)BOR1(例如，參照專利文獻(xiàn)1)。一般認(rèn)為BOR1承擔(dān)在低硼營養(yǎng)條件下向?qū)Ч芊e極地輸送硼的作用(例如，參照非專利文獻(xiàn)8)。此外，作為承擔(dān)硼輸送作用的抗性，除了BOR1之外，先已知還有酵母的YNL275w(例如，參照非專利文獻(xiàn)9)。此外，如上所述，硼(B)是植物(例如、非專利文獻(xiàn)10參照)及動物(例如、非專利文獻(xiàn)11參照)所必須的微量營養(yǎng)素，但是高濃度下是有毒的(例如，參照非專利文獻(xiàn)12，13)。含有自然產(chǎn)生的高濃度硼的土壤分布于世界各地，硼的施肥、化石燃燒、使用含硼的水的灌溉等人類活動造成了高濃度硼的環(huán)境(例如，參照非專利文獻(xiàn)12，13)。作為植物中由于硼的毒性產(chǎn)生的癥狀，包括葉緣的萎黃病(例如，參照非專利文獻(xiàn)13)，果實(shí)的異常和/或樹皮壞死(例如，參照非專利文獻(xiàn)14)。過剩量的硼使作物的產(chǎn)量和質(zhì)量減少。硼的毒性現(xiàn)已成為世界上農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的極大的障礙。硼以高濃度對動物和微生物有毒?？梢酝贫ㄅ鸬闹滤懒吭诔扇酥袨榧s140mg/kg、在幼兒中為約270mg/kg(例如，參照非專利文獻(xiàn)15，16)。如果經(jīng)過長期攝取高濃度的硼，就會在人體中誘發(fā)食欲不振、惡心、體重的減少、性欲的減退(例如，參照非專利文獻(xiàn)17)?，F(xiàn)在，已表明可以允許的硼的安全攝取量為成人13mg/日(例如，參照非專利文獻(xiàn)18)。由于硼對微生物有殺菌效果，因此食品的防腐劑中逐漸包含硼(例如，參照非專利文獻(xiàn)19)。進(jìn)而，硼作為常年的殺蟲劑，其逐漸被使用于特別是蟑螂殺蟲劑(例如，參照非專利文獻(xiàn)20)。數(shù)十年來，自認(rèn)識到硼的毒性以來，就開始進(jìn)行了用于研究硼的毒性的影響的研究。其中許多是生理學(xué)的研究。例如、大豆的葉中、尿囊酸酰胺加水分解酶的活性由于硼酸而降低(例如，參照非專利文獻(xiàn)21)。珊瑚輪澡(Characorallina)中，觀察到由于硼產(chǎn)生的對蘋果酸脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶活性的抑制(例如，參照非專利文獻(xiàn)22)。此外，還報(bào)道了胎盤中的硼量與涉及卟吩膽色素原(porphobilinogen)(卟啉合成的介質(zhì))合成的新生兒中的Δ氨基乙酰丙酸脫水酶活性負(fù)相關(guān)(例如，參照非專利文獻(xiàn)23)。我們認(rèn)為可溶化硼酸鹽對硼的毒性起重要的作用。細(xì)胞內(nèi)的硼酸由于內(nèi)部pH高而部分轉(zhuǎn)化為硼酸鹽。如果高濃度硼酸被提供給細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)硼酸鹽濃度上升，與包括細(xì)胞內(nèi)的分子的各種cis-diol形成硼酸鹽復(fù)合體。包括分子的這種cis-diol包括NAD+、ATP、S-AdoMet、RNA及幾種糖(例如，參照非專利文獻(xiàn)24，25)。這些分子，由于可以作為多種酶的輔酶和/或基質(zhì)，可能會誘導(dǎo)硼酸鹽的結(jié)合，功能的缺失或者酶活性的改編，生物化學(xué)反應(yīng)的抑制和最終的代謝異常。雖然積累了生物化學(xué)和生理學(xué)的分析，以及關(guān)于硼的毒性影響的推測，但誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的硼的毒性分子機(jī)制還不清楚。專利文獻(xiàn)1特開2002-262872號公報(bào)非專利文獻(xiàn)1Loomis，W.D.；Durst，R.W.(1992)Chemistryandbiologyofboron.Biofactors3229-239非專利文獻(xiàn)2Shorrocks，V.M.(1997)Theoccurrenceandcorrectionofborondeficiency.PlantandSoil193121-148非專利文獻(xiàn)3Matoh，T.；Ishigaki，K.I.；Ohno，K.；Azuma，J.I.(1993)Isolationandcharacterizationofaboron-polysaccharidecomplexfromradishroots.PlantCellPhysiol.34639-非專利文獻(xiàn)4O′Neill，M.A.；Eberhard，S.；Albersheim，P.；Darvill，A.G.(2001)Requirementofboratecross-linkingofcellwallrhamnogalacturonanIIforArabidopsisgrowth.Science294846-849非專利文獻(xiàn)5Marschner，H.(1995)MineralNutritinofHigherPlants，2nded.AcademicPress，SanDiego，CA非專利文獻(xiàn)6Dordas，C.；Chrispeels，M.J.；Brown，P.H.(2000)Permeabilityandchannel-mediatedtransportofboricacidacrossmembranevesiclesisolatedfromSquashroots.PlantPhysiol.1241349-13非專利文獻(xiàn)7Dannel，F(xiàn).；Heidrun，P；Romheld，V.(2000)Characterizationofrootboronpools，boronuptakeandborontranslocationinsunflowerusingthestableisotope10Band11B.Aust.J.PlantPhysiol.156756-非專利文獻(xiàn)8Takano，J.；Noguchi，K.；Yasumori，M.；Kobayashi，M.；Gajdos，Z.；Miwa，K.；Hayashi，H.；Yoneyama，T.；Fujiwara，T.(2002)Arabidopsisborontransporterforxylemloading.Nature420(6913)337-340非專利文獻(xiàn)9Zhao，R.M.；Reithmeier，R.A.F.(2001)ExpressionandcharacterizationoftheaniontransporterhomologueYNL275winSaccharomycescerevisiae.AmericanJournalofPhysiology-CellPhysiology281(1)C33-C4非專利文獻(xiàn)10Warington，K.(1923)Ann.Bot.37，629-672.非專利文獻(xiàn)11Park，M.，Li，Q.，Shcheynikov，N.，Zeng，W.，&Muallern，S.(2004)Mol.Cell16，331-341.非專利文獻(xiàn)12Gupta，U.C.，Jame，Y.W.，Campbell，C.A.，Leyshon，A.J.，&Nicholaichuk，W.(1985)Can.J.SoilSci.65，381-409.非專利文獻(xiàn)13Nable，R.O.，Banuelos，G.S.，&Paull，J.G.(1997)PlantSoil193，181-198.非專利文獻(xiàn)14Brown，P.H.，&Hu，H.(1996).Ann.Bot.77，497-505.非專利文獻(xiàn)15Young，E.G.，Smith，R.P.，&MacIntosh，O.C.(1949)Can.Med.Assoc.J.61.447-450.非專利文獻(xiàn)16Arena，J.M.，&Drew，R.H.(1986)inPoisoning，(C.C.Thomas，Splingfield).pp.131.非專利文獻(xiàn)17Hunt，C.D.(1993)inEncyclopediaofFoodScience，F(xiàn)oodTechnologyandNutrition，vol.1，eds.Macrae，R.，Robinson，R.K.&Sadler，MJ.(AcademicPress，London)，pp440-447.非專利文獻(xiàn)18WHO/FA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發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題通過在植物導(dǎo)入酵母中硼酸抗性給予基因，就有可以制備出對硼過剩具有抗性的植物可能性。我們認(rèn)為硼抗性植物有益于受硼過剩危害的地域的作物增產(chǎn)。此外，也存在通過使用導(dǎo)入這些基因的硼酸抗性提高的藻類和細(xì)菌，也可以在通過使其吸收工業(yè)用水中所含的硼以除去硼等環(huán)境凈化中使用的可能性。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供可以制備對硼過剩具有抗性的植物的給予生物硼酸抗性的基因和蛋白質(zhì)。此外，還在于通過了解硼酸的毒性機(jī)制，提供了高效篩選硼酸抗性給予基因的方法。用于解決技術(shù)問題的方法本發(fā)明人為了解決上述技術(shù)問題進(jìn)行了積極的研究，通過使高等植物擬南芥的幾個(gè)基因在真核生物的模式生物酵母中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了給予酵母硼酸抗性的5種基因，即AtPAB2，AtRBP47，AtRPS20B，AtMYB13，及AtMYB68各基因，從而完成了本發(fā)明完成。此外，硼酸的毒性機(jī)制的關(guān)鍵在于對剪接的特異性抑制，發(fā)現(xiàn)與剪接效率的增強(qiáng)相關(guān)的基因是硼酸抗性給予基因，從而完成本發(fā)明。也就是說，本發(fā)明涉及(1)編碼由序列號2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列構(gòu)成的具有硼酸抗性給予活性的蛋白質(zhì)的DNA和，(2)編碼由序列號2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)、并且具有硼酸抗性給予活性的DNA和，(3)由序列號1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，或29所示的堿基序列或其互補(bǔ)的序列構(gòu)成的硼酸抗性給予基因DNA和，(4)由序列號1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，或29所示的堿基序列中缺失、取代或添加了1個(gè)或數(shù)個(gè)堿基的堿基序列構(gòu)成的并且編碼具有硼酸抗性給予活性的蛋白質(zhì)的DNA和，(5)與權(quán)利要求3記載的DNA在嚴(yán)緊條件下雜交并且編碼具有硼酸抗性給予活性的蛋白質(zhì)的DNA和，(6)由序列號2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列構(gòu)成的具有硼酸抗性給予活性的蛋白質(zhì)和，(7)由序列號2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的，并且具有硼酸抗性給予活性的蛋白質(zhì)和，(8)含有權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)記載的DNA，并且可以表達(dá)硼酸抗性給予蛋白質(zhì)的重組載體和，(9)導(dǎo)入了權(quán)利要求8記載的重組載體，并且表達(dá)硼酸抗性給予蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化體和，(10)權(quán)利要求9記載的轉(zhuǎn)化體，其特征在于轉(zhuǎn)化體是酵母和，(11)權(quán)利要求9記載的轉(zhuǎn)化體，其特征在于轉(zhuǎn)化體是植物和，(12)硼酸抗性給予基因的篩選方法，其特征在于使用基因文庫，缺失YNL275w基因，轉(zhuǎn)化不表達(dá)YNL275w的YNL275w破壞酵母，在含有硼酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化YNL275w破壞酵母，測定并評價(jià)該轉(zhuǎn)化YNL275w破壞酵母的硼酸抗性給予活性和，(13)硼酸抗性給予基因的篩選方法，其特征在于以由硼酸產(chǎn)生的對剪接的特異性抑制為目標(biāo)，測定并評價(jià)剪接效率的增強(qiáng)程度和，(14)權(quán)利要求13記載的硼酸抗性給予基因的篩選方法，其特征在于使被檢物質(zhì)在酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，在硼酸的存在下，培養(yǎng)被檢物質(zhì)表達(dá)，以酵母中含有內(nèi)含子的基因的由硼酸產(chǎn)生的對剪接的特異性抑制的改善程度作為剪接效率的增強(qiáng)程度進(jìn)行測定和評價(jià)和，(15)權(quán)利要求14記載的硼酸抗性給予基因的篩選方法，其特征在于酵母中含有內(nèi)含子的基因是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基因組內(nèi)的RPL7B基因和，(16)權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)記載的DNA作為硼酸抗性給予基因的用途和，(17)權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)記載的DNA用于制備被給予了硼酸抗性的植物或酵母的用途和，(18)權(quán)利要求6或7記載的蛋白質(zhì)作為具有硼酸抗性給予活性的蛋白質(zhì)的用途和，(19)權(quán)利要求6或7記載的蛋白質(zhì)用于制備被給予了硼酸抗性的植物或酵母的用途。發(fā)明的效果通過在植物中導(dǎo)入本發(fā)明的硼酸抗性給予基因，就存在可以制備對硼過剩具有抗性的植物可能性。我們認(rèn)為硼抗性植物有益于受硼過剩危害的地域的作物增產(chǎn)。此外，也存在通過使用導(dǎo)入這些基因的硼酸抗性提高的藻類和細(xì)菌，也可以在通過使其吸收工業(yè)用水中所含的硼以除去硼等環(huán)境凈化中使用的可能性。具體實(shí)施例方式作為本發(fā)明的基因DNA，如果是有(A)編碼由序列號2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列構(gòu)成的具有硼酸抗性給予活性的蛋白質(zhì)的DNA；(B)編碼由序列號2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列構(gòu)成的并且具有硼酸抗性給予活性的蛋白質(zhì)的DNA；(C)由序列號1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，或29所示的堿基序列或其互補(bǔ)的序列構(gòu)成(擬南芥來源的)的硼酸抗性給予基因DNA硼酸抗性給予基因DNA；(D)由序列號1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，或29所示的堿基序列中缺失、取代或添加了1個(gè)或數(shù)個(gè)堿基的堿基序列構(gòu)成的并且編碼具有硼酸抗性給予活性的蛋白質(zhì)的DNA；或(E)與由序列號1，3，5，7，9，11，13.15，17，19，21，23，25，27，或29所示的堿基序列構(gòu)成的硼酸抗性給予基因DNA在嚴(yán)緊條件下雜交并且編碼具有硼酸抗性給予活性的蛋白質(zhì)的DNA；構(gòu)成的硼酸抗性給予基因，沒有特別的限制。此外，作為本發(fā)明的硼酸抗性給予蛋白質(zhì)，如果是(A)由序列號2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列構(gòu)成的具有硼酸抗性給予活性的蛋白質(zhì)；或(B)由序列號2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的，并且具有硼酸抗性給予活性的蛋白質(zhì)；沒有特別的限制，其中所謂“硼酸抗性給予基因”是指給予生物體硼酸抗性的基因，所謂“硼酸抗性給予蛋白質(zhì)”是指給予生物體硼酸抗性的蛋白質(zhì)。上述所謂“具有硼酸抗性給予活性的蛋白質(zhì)”是指給予酵母、植物等生物體對硼酸的抗性的蛋白質(zhì)，高表達(dá)這種蛋白質(zhì)的植物和酵母、即使在高濃度硼酸的存在下也可以生長發(fā)育。作為序列號1所示的堿基序列構(gòu)成的硼酸抗性給予基因，可以例舉有AtPAB2基因，作為序列號2所示的氨基酸序列構(gòu)成的硼酸抗性給予蛋白質(zhì)，可以例舉有AtPAB2，作為序列號3所示的堿基序列構(gòu)成的硼酸抗性給予基因，可以例舉有AtRBP47c’基因，作為序列號4所示的氨基酸序列構(gòu)成的硼酸抗性給予蛋白質(zhì)，可以例舉有AtRBP47c’，作為序列號5所示的堿基序列構(gòu)成的硼酸抗性給予基因，可以例舉有AtRPS20B基因，作為序列號6所示的氨基酸序列構(gòu)成的硼酸抗性給予蛋白質(zhì)，可以例舉有AtRPS20B，作為序列號7所示的堿基序列構(gòu)成的硼酸抗性給予基因，可例舉有AtMYB13基因，作為序列號8所示的氨基酸序列構(gòu)成的硼酸抗性給予蛋白質(zhì)，可例舉有AtMYB13，作為序列號9所示的堿基序列構(gòu)成的硼酸抗性給予基因，可例舉有AtMYB68基因，作為序列號10所示的氨基酸序列構(gòu)成的硼酸抗性給予蛋白質(zhì)，可例舉有AtMYB68，作為序列號11所示的堿基序列構(gòu)成的硼酸抗性給予基因，可例舉有AtRBP45a基因，作為序列號12所示的氨基酸序列構(gòu)成的硼酸抗性給予蛋白質(zhì)，可例舉有AtRBP45a，作為序列號13所示的堿基序列構(gòu)成的硼酸抗性給予基因，可例舉有AtRBP45b基因，作為序列號14所示的氨基酸序列構(gòu)成的硼酸抗性給予蛋白質(zhì)，可例舉有AtRBP45b，作為序列號15所示的堿基序列構(gòu)成的硼酸抗性給予基因，可例舉有AtRBP45c基因，作為序列號16所示的氨基酸序列構(gòu)成的硼酸抗性給予蛋白質(zhì)，可例舉有AtRBP45c，作為序列號17所示的堿基序列構(gòu)成的硼酸抗性給予基因，可例舉有AtRBP45d基因，作為序列號18所示的氨基酸序列構(gòu)成的硼酸抗性給予蛋白質(zhì)，可例舉有AtRBP45d，作為序列號19所示的堿基序列構(gòu)成的硼酸抗性給予基因，可例舉有AtRBP47a基因，作為序列號20所示的氨基酸序列構(gòu)成的硼酸抗性給予蛋白質(zhì)，可例舉有AtRBP47a，作為序列號21所示的堿基序列構(gòu)成的硼酸抗性給予基因，可例舉有AtRBP47b基因，作為序列號22所示的氨基酸序列構(gòu)成的硼酸抗性給予蛋白質(zhì)，可例舉有AtRBP47b，作為序列號23所示的堿基序列構(gòu)成的硼酸抗性給予基因，可例舉有AtRBP47c基因，作為序列號24所示的氨基酸序列構(gòu)成的硼酸抗性給予蛋白質(zhì)，可例舉有AtRBP47c，作為序列號25所示的堿基序列構(gòu)成的硼酸抗性給予基因，可例舉有AtUBP1a基因，作為序列號26所示的氨基酸序列構(gòu)成的硼酸抗性給予蛋白質(zhì)，可例舉有AtUBP1a，作為序列號27所示的堿基序列構(gòu)成的硼酸抗性給予基因，可例舉有AtUBP1b基因，作為序列號28所示的氨基酸序列構(gòu)成的硼酸抗性給予蛋白質(zhì)，可例舉有AtUBP1b，作為序列號29所示的堿基序列構(gòu)成的硼酸抗性給予基因，可例舉有AtUBP1c基因，作為序列號30所示的氨基酸序列構(gòu)成的硼酸抗性給予蛋白質(zhì)，可例舉有AtUBP1c。上述所謂“缺失、取代或添加了1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的氨基酸序列”是指例如缺失、取代或添加了1～20個(gè)、優(yōu)選1～15個(gè)、更優(yōu)選1～10個(gè)、更優(yōu)選1～5個(gè)任意個(gè)數(shù)的氨基酸的氨基酸序列。此外，上述所謂“缺失、取代或添加了1個(gè)或數(shù)個(gè)堿基的堿基序列”是指例如缺失、取代或添加了1～20個(gè)、優(yōu)選1～15個(gè)、更優(yōu)選1～10個(gè)、更優(yōu)選1～5個(gè)任意個(gè)數(shù)的堿基的堿基序列。例如，這些缺失、取代或添加了1個(gè)或數(shù)個(gè)堿基的堿基序列構(gòu)成的DNA(變異DNA)也可以通過化學(xué)合成，基因工程的方法，誘變等本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任意方法制備。具體的是，通過對于由序列號1，3，5，7或9所示的堿基序列構(gòu)成的DNA、采用使之與作為變異原的藥劑接觸作用的方法，照射紫外線的方法，基因工程的方法等，在這些DNA中導(dǎo)入變異，可以獲得變異DNA。基因工程的方法中的一種特異性位點(diǎn)的誘變法由于是可以在特定位點(diǎn)導(dǎo)入特定的變異的方法因而是有用的，可以按照MolecularCloningAlaboratoryMannual，2ndEd.，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY.，1989.(以后簡稱為《分子克隆》第2版)、CurrentProtocolsinMolecularBiology，Supplement1～38，JohnWiley&Sons(1987-1997)等中記載的方法進(jìn)行。通過采用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系使變異DNA表達(dá)，可以獲得缺失、取代或添加了1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)。上述所謂“嚴(yán)緊條件下雜交的堿基序列”是指使用DNA或RNA等核酸作為探針，通過采用克隆雜交法、噬菌斑雜交法或southern雜交法等可獲得的堿基序列，具體可以列舉通過使用固定了克隆或噬菌斑由來的DNA或該DNA的片段的濾膜，在0.7-1.0M的NaCl存在下、65℃下進(jìn)行雜交后，用0.1-2倍左右的SSC溶液(1倍濃度的SSC溶液的組成是150mM氯化鈉、15mM檸檬酸鈉)，在65℃條件下清洗濾膜可以鑒定的DNA?？梢园凑铡斗肿涌寺　返?版等中記載的方法進(jìn)行雜交。例如，作為可以在嚴(yán)緊條件下雜交的DNA，可以列舉有與作為探針使用的DNA的堿基序列具有一定以上的同源性的DNA，可以列舉的最佳例子有例如具有60％或60％以上，優(yōu)選70％或70％以上，更優(yōu)選80％或80％以上，更優(yōu)選90％或90％以上，特別優(yōu)選95％或95％以上，最優(yōu)選98％或98％以上的同源性的DNA。本發(fā)明的基因的獲得方法和制備方法沒有特別的限定，基于本說明書中公開的序列號1，3，5，7，9所示的堿基序列信息或序列號2，4，6，8，10所示的氨基酸序列信息制備適當(dāng)?shù)奶结樅鸵?，用它們通過篩選經(jīng)預(yù)測存在該基因的cDNA文庫可以分離目的基因，或者按照常規(guī)方法通過化學(xué)合成可以制備。具體的是，從分離本發(fā)明的基因的擬南芥中按照常規(guī)方法制備cDNA文庫，然后，通過從該文庫中，使用本發(fā)明的基因所特有的適當(dāng)?shù)奶结樳x出所希望的的克隆，可以獲得本發(fā)明的基因。作為上述cDNA的起源，可以列舉有上述植物來源的各種細(xì)胞或者組織，此外，從這些細(xì)胞或組織分離和純化總RNA、mRNA，獲得cDNA和其克隆等可以按照任一常規(guī)方法實(shí)施。從cDNA文庫中篩選本發(fā)明的基因的方法可以例舉有例如、《分子克隆》第2版等中記載的方法等，本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的方法。此外，作為上述(B)～(F)任一項(xiàng)所示的堿基序列構(gòu)成的本發(fā)明的變異基因或相同基因，可以通過利用具有序列號1，3，5，7或9所示的堿基序列或其一部分的DNA片段，從其它生物體等中在適當(dāng)條件下篩選該DNA的同系物進(jìn)行分離。此外，還可以通過前述的變異DNA的制備方法進(jìn)行制備。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的獲得和制備方法沒有特別的限定，可以是天然來源的蛋白質(zhì)，化學(xué)合成的蛋白質(zhì)，通過基因重組技術(shù)制備的重組蛋白質(zhì)的任一種。在獲得天然來源的蛋白質(zhì)的情況中，通過適當(dāng)組合從表達(dá)這種蛋白質(zhì)的細(xì)胞或組織中分離純化蛋白質(zhì)的方法，可以獲得本發(fā)明的蛋白質(zhì)。通過化學(xué)合成制備蛋白質(zhì)時(shí)，按照例如，F(xiàn)moc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化學(xué)合成法可以合成本發(fā)明的蛋白質(zhì)。此外，利用各種市售的肽合成機(jī)也合成本發(fā)明的蛋白質(zhì)。通過基因重組技術(shù)制備蛋白質(zhì)時(shí)，通過在最佳的表達(dá)系中導(dǎo)入由編碼該蛋白質(zhì)的堿基序列構(gòu)成的DNA，可以制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)。即使在這些方法中，通過比較容易操作的并且可以大量制備的基因重組技術(shù)進(jìn)行制備仍然是優(yōu)選的。例如，通過基因重組技術(shù)，制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)時(shí)，為了從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收純化這種蛋白質(zhì)，可以使用包括硫酸銨或者乙醇沉淀，酸提取，陰離子或者陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水性相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析在內(nèi)的公知方法，優(yōu)選高效液相層析。尤其是，通過使用例如，結(jié)合了針對本發(fā)明的蛋白質(zhì)的單克隆抗體等抗體的柱作為親和層析中使用的柱，或者在上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)上添加常規(guī)的肽標(biāo)記時(shí)，使用結(jié)合了與此肽標(biāo)記具有親和性的某種物質(zhì)的柱作為親和層析中使用的柱，可以獲得這些蛋白質(zhì)的純化物。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)在細(xì)胞膜表達(dá)時(shí)，使細(xì)胞膜分解酶作用后，通過進(jìn)行上述純化處理可以獲得純化制品。進(jìn)而，如果是本領(lǐng)域技術(shù)人員，根據(jù)分別表示編碼序列號2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列的堿基序列的其中一例的序列號1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，或29所示的堿基序列的信息，就可以適當(dāng)制備或獲得由序列號2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)、或與序列號2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列具有60％或60％以上的同源性的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)。例如、以具有序列號1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，或29所示的堿基序列或其一部分的DNA作為探針，從擬南芥以外的生物中通過在適當(dāng)?shù)臈l件下篩選該DNA的同系物，可以將其分離。在克隆這種同系物DNA的全長DNA后，整合到表達(dá)載體中，使之在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)，可以制備由該同系物DNA編碼的蛋白質(zhì)。作為本發(fā)明的重組載體，如果是前述含有本發(fā)明的基因并且可以表達(dá)硼酸抗性給予蛋白質(zhì)的重組載體，沒有特別的限制，本發(fā)明的重組載體、可以通過在表達(dá)載體中適當(dāng)整合本發(fā)明的基因構(gòu)建。作為表達(dá)載體，優(yōu)選可以在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的載體或者可以整合到宿主細(xì)胞的染色體中的載體，此外，可以最佳使用在可以表達(dá)本發(fā)明的基因的位點(diǎn)含有啟動子、增強(qiáng)子、終止子等控制序列的載體。作為表達(dá)載體，可以酵母用表達(dá)載體、植物細(xì)胞用表達(dá)載體、細(xì)菌用表達(dá)載體、動物細(xì)胞用表達(dá)載體等，但是優(yōu)選采用酵母用表達(dá)載體和植物細(xì)胞用表達(dá)載體的重組載體。作為酵母用的表達(dá)載體，可以例舉有，例如、pYES2(Invitrogen)、YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、Ycp5O(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。作為酵母用的啟動子，具體可以例舉有，例如、PHO5啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子、GAL1啟動子、GAL10啟動子、熱激蛋白蛋白質(zhì)啟動子、MFα1啟動子、CUP1啟動子等啟動子。作為植物細(xì)胞用的表達(dá)載體，可以例舉有，例如、Ti質(zhì)粒(腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒，Tumorinducingplasmid)、pSPORT1、pT7Blue-T載體、pIG121-Hm[PlantCellReport，15，809-814(1995)]、pBI121[EMBOJ.6，3901-3907(1987)]等質(zhì)粒、或煙草花葉病毒、菜花花葉病毒、雙生病毒(geminivirus)等植物病毒載體等。作為植物細(xì)胞用的啟動子，可以例舉有，例如、花椰菜花葉病毒35S啟動子[Mol.Gen.Genet(1990)220，389-392]、二磷酸核酮糖羧化酶小亞基啟動子等，作為終止子，可以例舉有例如胭脂堿合成酶基因的終止子。此外，作為本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體，如果是導(dǎo)入了上述本發(fā)明的重組載體并且表達(dá)硼酸抗性給予蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體，沒有特別的限制，可以例舉有轉(zhuǎn)化酵母、轉(zhuǎn)化植物(細(xì)胞、組織、個(gè)體)、轉(zhuǎn)化細(xì)菌、轉(zhuǎn)化動物(細(xì)胞、組織、個(gè)體)，但是優(yōu)選轉(zhuǎn)化酵母和轉(zhuǎn)化植物(細(xì)胞、組織、個(gè)體)。作為制備轉(zhuǎn)化酵母是可以使用的宿主酵母，可以例舉有釀酒酵母(Saccharomycescerevisae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、茁芽絲孢酵母(Trichosporonpullulans)、河岸許旺酵母(Schwanniomycesalluvius)等。作為向酵母宿主導(dǎo)入重組載體的方法，可以例舉有，例如、電穿孔法、原生質(zhì)體法、醋酸鋰法等。在制備轉(zhuǎn)化植物(細(xì)胞、組織、個(gè)體)時(shí)可以使用的宿主植物(細(xì)胞、組織、個(gè)體)，其種類沒有特別的限定，可以從花卉、果實(shí)植物、野菜、根菜、谷類、賞葉植物、包括果樹在內(nèi)的樹木等植物、例如屬于茄科、禾本科，油菜科、菊科、芝麻科、木犀科、桃金娘科、薔薇科、豆科、檳榔科或茜草科的植物和這些植物的培養(yǎng)細(xì)胞、組織(種子、愈傷組織等)中適當(dāng)選擇。為了制備這種轉(zhuǎn)化植物，可以采用使用含有本發(fā)明的基因的上述本發(fā)明的重組載體，在植物細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入該重組載體，在植物細(xì)胞中的基因組DNA中導(dǎo)入本發(fā)明的基因DNA的方法。植物的轉(zhuǎn)化，可以根據(jù)植物種類等，適當(dāng)采用葉盤共存培養(yǎng)法、電穿孔法、農(nóng)桿菌法、基因槍法等公知方法進(jìn)行。此外，也可以采用通過以物理或化學(xué)方式提高植物細(xì)胞的滲透性在受體細(xì)胞中直接獲得本發(fā)明的重組載體來制備轉(zhuǎn)化植物的方法。作為本發(fā)明的硼酸抗性給予基因的篩選方法，如果是采用各種植物、酵母等的基因文庫，缺失YNL275w基因，轉(zhuǎn)化不表達(dá)YNL275w的YNL275w破壞酵母，在硼酸含有培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)化YNL275w破壞酵母，測定和評價(jià)該轉(zhuǎn)化YNL275w破壞酵母的硼酸抗性給予活性的方法，沒有特別的限制。作為硼酸抗性給予活性的測定和評價(jià)，可以例舉有硼酸含有培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化酵母的生長發(fā)育及增殖的程度的測定和評價(jià)。此外，作為YNL275w的破壞株，可最佳例舉有釀酒酵母1169株(Winzeler，E.A.；Shoemaker，D.D.；Astromoff，A.；Liang，H.；Anderson，K.；Andre，B.；Banghsm，R.；Benito，R.；Boeke，J.D.；Bussey，H.；Chu，A.M.；Connelly，C.；Davis，K.；Dietrich，F(xiàn).；Dow，S.W.；ElBakkoury，M.；Foury，F(xiàn).；Friend，S.H.；Gentalen，E.；Giaever，G.；Hegemann，J.H.；Jones，T.；Laub，M.；Liao，H.Liebundguth，N.；Lockhart，D.J.；Lucau-Danila，A.；Lussier，M.；M′Rabeet，N.；Menard，P.；Mittmann，M.；Pai，C.；Rebischung，C.；Revuelta，J.L.；Riles，L.；Roberts，C.J.；Ross-MacDonald，P.；Scherens，B.；Snyder，M.；Sookhai-Mahadeo，S.；Storms，R.K.；Veronneau，S.；Voet，M.；Volckaert，G.；Ward，T.R.；Wysocki，R.；Yen，G.S.；Yu，K.X.；Zimmermann，K.；Philippsen，P.；Johnston，M.；Davis，R.W.(1999)FunctionalcharacterizationoftheSaccharomycescerevisiaegenomebygenedeletionandparallelanalysis.Science285901-906)。篩選中使用的酵母不僅可以使用YNL275w的破壞株，還可以使用其野生型。此外，作為本發(fā)明的硼酸抗性給予基因的篩選方法，可以例舉有以由硼酸產(chǎn)生的對剪接的特異性抑制為目標(biāo)，測定和評價(jià)剪接效率的增強(qiáng)程度的方法，可以舉例說明如下，例如使被檢物質(zhì)在酵母細(xì)胞中表達(dá)，在硼酸存在下，培養(yǎng)被檢物質(zhì)表達(dá)，測定和評價(jià)酵母中含有內(nèi)含子的基因的由硼酸產(chǎn)生的對剪接的特異性抑制的改善程度作為剪接效率的增強(qiáng)程度。作為酵母中含有內(nèi)含子的基因，具體可舉例說明有編碼釀酒酵母基因組內(nèi)必須的核糖體的大亞單位蛋白質(zhì)的基因RPL7B基因(序列號33)。由硼酸產(chǎn)生的對剪接的特異性抑制的改善程度可以通過例如RT-PCR測定，此外，此時(shí)，優(yōu)選以硼酸抗性給予基因AtRBP47c’基因作為陽性對照。本發(fā)明中，包括上述本發(fā)明的DNA的作為硼酸抗性給予基因的用途(方法)、上述本發(fā)明的DNA的用于制備被給予了硼酸抗性的植物或酵母的用途(方法)和、上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)的作為具有硼酸抗性給予活性的蛋白質(zhì)的用途(方法)和、上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)的用于制備被給予了硼酸抗性的植物或酵母的用途(方法)。因而，本發(fā)明的實(shí)施方式中包括在制備被給予了硼酸抗性的植物和酵母時(shí)使用上述本發(fā)明的硼酸抗性給予基因和具有硼酸抗性給予活性的蛋白質(zhì)(硼酸抗性給予蛋白質(zhì))。下面。通過對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明，但是本發(fā)明的技術(shù)范圍不受這些實(shí)施例的限定。實(shí)施例1[供試酵母及質(zhì)粒]作為酵母，使用釀酒酵母1169株(購自ResearchGenetics公司)和釀酒酵母BY4741株(購自ResearchGenetics公司)。其基因型分別是，1169株為MATa；his3Δ1；leu2Δ0；met15Δ0；ura3Δ0；YNL275w∷kanMX4，BY4741株為MATa；his3Δ1；leu2Δ0；met15Δ0；ura3Δ0。此外，質(zhì)粒使用pYES2(購自InvitrogenGenetics公司)和pFL61(由德國、ホ一ヘンハイム大學(xué)的NicolausvonWiren博士提供；MinetM.，DufourM.-E.，andLacrouteF.(1992)ComplementationofSaccharomycescerevisiaeauxotrophicmutantsbyArabidopsisthalianacDNAs.PlantJ.2；417-422.)。使用pFL61以制備擬南芥表達(dá)文庫。對使用的酵母1169株的硼酸抗性能進(jìn)行檢測。用接種環(huán)挑取(かきとり)經(jīng)pYES2和pYES2-BOR1(pYES2載體的GAL1啟動子的下游插入有擬南芥的硼抗性基因BOR1的CDS的載體)轉(zhuǎn)化的酵母1169株的單菌落，在SD液體培養(yǎng)基中振動培養(yǎng)直至OD600的值達(dá)到約1.0。將培養(yǎng)液分別劃線于含有0、20、30、40、50、60、70、80、90、和100mM硼酸的SD固體培養(yǎng)基上。26.5℃下培養(yǎng)16天，檢測酵母是否可以在各培養(yǎng)基上形成菌落。使用擬南芥的表達(dá)文庫(由德國、ホ一ヘンハイム大學(xué)的NicolausvonWiren博士提供；SchaafG.，CatoniE.，F(xiàn)itsM.，SchwackeR.，SchneiderA.，vonWirenN.，andFrommerW.B.(2002)Aputativeroleforthevacuolercalcium/manganeseprotonantiporterAtCAX2inheavymetaldetoxification.PlantBiol.4；612-618.)，通過醋酸鋰法，轉(zhuǎn)化酵母1169株。將轉(zhuǎn)化酵母劃線于加入了80mM硼酸的SD培養(yǎng)基(6.7g/l沒有氨基酸的酵母nitrogenbase，5g/l硫酸銨，20g/l葡萄糖，2g/l組胺酸，2g/l蛋氨酸，3g/l亮氨酸，20g/l瓊脂，pH5.5)上，于26.5℃下培養(yǎng)。10天-14天后，從形成菌落的酵母中回收質(zhì)粒。將回收的質(zhì)粒再次導(dǎo)入酵母，確認(rèn)硼酸抗性能力的再現(xiàn)性。通過斑點(diǎn)測試(spotassay)和液體培養(yǎng)進(jìn)行測定。斑點(diǎn)測試(spotassay)按以下步驟進(jìn)行。在SD液體培養(yǎng)基中振動培養(yǎng)各酵母直至OD600的值達(dá)到0.5-1.0。用SD培養(yǎng)基稀釋成各酵母的OD600的值相同。對OD600的值一致的各酵母培養(yǎng)液，制備1/5、1/25、1/125、和1/625稀釋的稀釋液。用自動移液器(Pipetman)(Gilson)將各稀釋液分別一點(diǎn)一點(diǎn)地將5μl點(diǎn)樣于加入了硼酸的SD固體培養(yǎng)基和作為對照的未加入硼酸的SD固體培養(yǎng)基中，就同一酵母而言，按從左至右濃度變薄的方式點(diǎn)樣。點(diǎn)樣了酵母的平板在30℃下培養(yǎng)約10天，觀察酵母的生長發(fā)育狀況。通過液體培養(yǎng)的測定按如下方式進(jìn)行。30℃下在SD液體培養(yǎng)基中振動培養(yǎng)各酵母直至OD600的值達(dá)到約1.0。將各培養(yǎng)液接種于含有硼酸的SD液體培養(yǎng)基和作為對照的不含硼酸的SD液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)直至OD600的值為0.1。30℃下振動培養(yǎng)，每24小時(shí)測定OD600的值。通過篩選獲得的6個(gè)cDNA克隆的堿基序列的解析按如下方式進(jìn)行。通過熒光染色終止子法進(jìn)行測序反應(yīng)，使用ABI310基因分析儀分析堿基序列。從獲得的堿基序列中通過TAIR(http//www.arabidopsis.org/)的BLAST檢索確定其堿基序列的編碼基因。首先，進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)中使用的酵母1169株的硼酸抗性能力的測定。以pYES2和pYES2-BOR1轉(zhuǎn)化酵母1169。使用pYES2和pYES2-BOR1轉(zhuǎn)化是因?yàn)檫@些載體帶有與接下來的篩選中使用的擬南芥表達(dá)文庫中使用的載體FL61相同的URA3作為篩選標(biāo)記。此外，由于SD培養(yǎng)基不誘導(dǎo)pYES-BOR1的BOR1基因的表達(dá)，應(yīng)該會顯示出經(jīng)pYES2轉(zhuǎn)化相同程度的硼酸抗性。將經(jīng)pYES2和pYES2-BOR1轉(zhuǎn)化的酵母分別命名為“2”和“7”。在SD液體培養(yǎng)基中振動培養(yǎng)“2”和“7”，劃線于含有0、20、30、40、50、60、70、80、90和100mM硼酸的SD固體培養(yǎng)基中。其結(jié)果表明，經(jīng)以上任一載體轉(zhuǎn)化的酵母幾乎不能在含有80mM和80mM以上的硼酸的SD培養(yǎng)基上生長(圖1)。為了分離硼酸抗性給予基因，本實(shí)驗(yàn)中通過使酵母1169株表達(dá)，尋找可以在含有80mM的SD培養(yǎng)基上生長的擬南芥基因。于是，將經(jīng)擬南芥的表達(dá)文庫轉(zhuǎn)化的約120萬酵母劃線于含有80mM的SD培養(yǎng)基上。其結(jié)果是，可以獲得對80mM硼酸顯示出抗性的46、66、72、84、86、和87這6個(gè)轉(zhuǎn)化酵母。通過斑點(diǎn)測試(spotassay)獲得的46、72、84、86、和87的轉(zhuǎn)化酵母的硼酸抗性能示于圖2(對于66，如下所示，由于編碼與46相同的基因，因此結(jié)果僅表示46)。酵母1169株，如圖2的上部所示，含有80mM的SD培養(yǎng)基上幾乎不形成菌落。另一方面，這些轉(zhuǎn)化酵母可以比任一1169株形成更多的菌落。下面，通過液體培養(yǎng)進(jìn)行試驗(yàn)。液體培養(yǎng)中，如圖3所示，46、72、86、87中顯示出比硼酸培養(yǎng)基中的1169株高約3倍的增殖能力。但是，84中生長速度差別大，就硼酸抗性而言沒有發(fā)現(xiàn)與1169株有能力差。此外，在將這些基因?qū)氲浇湍窧Y4741株中時(shí)，與導(dǎo)入到1169株時(shí)同樣也可以給予硼酸抗性。圖4中表示斑點(diǎn)測試(spotassay)的結(jié)果，圖5中表示液體培養(yǎng)的結(jié)果。在導(dǎo)入到BY4741株時(shí)，在所有的轉(zhuǎn)化酵母中，在液體培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)對硼酸抗性存在能力差(圖5)。測定經(jīng)篩選獲得的6個(gè)cDNA克隆的堿基序列，通過BLAST檢索確定它們的編碼基因。其結(jié)果表明，46和66與AtPAB2一致，72與AtMYB68一致，84與AtMYB13一致，86與AtRPS20B一致、87與AtRBP47一致。各基因的序列示于下述序列表中。AtPAB2是編碼聚腺苷酸結(jié)合蛋白質(zhì)的基因，AtMYB13和AtMYB68是編碼MYB樣轉(zhuǎn)錄因子的基因，AtRPS20是編碼核糖體蛋白質(zhì)的基因，AtRBP47是編碼RNA結(jié)合蛋白質(zhì)的基因。實(shí)施例2[酵母株及篩選]本研究中，使用釀酒酵母株BY4741(MATahis3D1leu2D0met15D0ura3D0)，Y01169(MATahis3D1Leu2D0met15D0ura3D0YNL275W∷kanMX4)、Y04443(MATahis3D1leu2D0met15D0ura3D0YGL076C∷kanMX4)、及Y01094(MATahis3D1leu2D0met15D0ura3D0YPL198W∷kanMX4)?？梢酝ㄟ^插入性誘變(insertionalmutagenesis)從BY4741中構(gòu)建Y01169、Y04443、Y01094株(Winzeleretal.，1999)，由EUROSCARF獲得。通過醋酸鋰法(GietzandSchiestl，1995)，以克隆于表達(dá)質(zhì)粒pFL61的擬南芥cDNA文庫轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞(Minetetal.，1992)。由于與對應(yīng)的野生型株相比，缺失了排出型硼運(yùn)載體即對硼酸具有感受性的YNL275W(以下BOR1)，因此Y01169株可以作為宿主使用(未顯示數(shù)據(jù))。在26.5℃下在含有80mM的硼酸的SD固體培養(yǎng)基(Sherman，1991)中篩選轉(zhuǎn)化體。SD培養(yǎng)基含有變異體成長所必需的2％葡萄糖、0.67％不含氨基酸的酵母nitrogenbase、和0.05％硫酸銨、變異體生長所必需的氨基酸(20mg/L的His、30mg/L的Leu、20mg/L的Met)，用Tris將pH調(diào)整成5.5。為了形成固體培養(yǎng)基，添加瓊脂(2％w/v)。通過添加80mM的硼酸，可以完全抑制非轉(zhuǎn)化Y01169(Δbor1)細(xì)胞的菌落形成。轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，在26.5℃下培養(yǎng)2周后，在含有80mM硼酸的SD培養(yǎng)基中選擇形成菌落的細(xì)胞，在80mM硼酸存在下檢查其生長發(fā)育情況，確認(rèn)其抗性。為了確認(rèn)由質(zhì)粒給予的表型，從陽性分離物(positiveisolate)中分離質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化酵母株Y01169。對抗性分離物，進(jìn)行氟乳清酸誘導(dǎo)質(zhì)粒loss(fluoro-oroticacid-inducedplasmidloss)(Boeke，J.D.，LaCroute，F(xiàn).，&Fink，G.R.(1984)Mol.Gen.Genet.197，345-346.)，選擇顯示出質(zhì)粒依賴性的硼酸抗性的克隆。用表1記載的引物組，通過PCR，擴(kuò)增AtRBP47c”相關(guān)基因和RPL7B的ORF序列(參照序列號34)。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pGEM-Teasy載體的亞克隆位點(diǎn)(Promega社制)。用NotI處理這些質(zhì)粒，將組為結(jié)果產(chǎn)生的AtRBP45a、AtRBP47b、AtRBP47c、AtRBP47c’及AtUBP1的ORF片段克隆到表達(dá)載體pFL61的NotI位點(diǎn)中(Minetetal，1992)。此外，將RPL7B的ORF片段克隆到表達(dá)載體pDR195的NotI位點(diǎn)(Rentschetal.，1995)。pFL61及pDR195分別帶有用于表達(dá)的PGK及PMA1啟動子。表1為了分析AtRBP47c”相關(guān)家族基因的硼酸抗性，在釀酒酵母株BY4741中導(dǎo)入表達(dá)質(zhì)粒。作為對照，沒有插入的空載體也導(dǎo)入到BY4741中。使轉(zhuǎn)化體在SD液體培養(yǎng)基中生長至穩(wěn)定期，將培養(yǎng)物的細(xì)胞密度調(diào)整至OD600＝1.0。將調(diào)整了細(xì)胞密度的培養(yǎng)物用SD液體培養(yǎng)基稀釋成1/5、1/25、1/125及1/625，將稀釋的培養(yǎng)液滴到10μl含有或不含有80mM的硼酸的SD培養(yǎng)基中，于30℃下培養(yǎng)7天。為了進(jìn)行培養(yǎng)液內(nèi)的分析，使轉(zhuǎn)化體在SD液體培養(yǎng)基中生長至穩(wěn)定期，用SD液體培養(yǎng)基含有或不含有80mM硼酸的液體培養(yǎng)基稀釋，調(diào)整至OD600＝1.0以檢查高濃度硼酸的抗性能力。為了分析Δrpl7a(Y04443)變異體及Δrpl7b(Y01094)變異體的硼酸抗性，使用含有2％葡萄糖、0.67％氨基酸不含酵母nitrogenbase及0.05％的硫酸銨的SD培養(yǎng)基，用Tris將pH調(diào)整至5.5，再添加必需的氨基酸(20mg/L的His、30mg/L的Leu、20mg/L的Met及20mg/L的Ura)。從EUROSCARF獲得變異體。為了進(jìn)一步調(diào)查硼酸抗性中RPL7B的作用，使RPL7B在酵母株Y04443中過剩表達(dá)。通過上述方式進(jìn)行硼酸抗性分析。酵母細(xì)胞在SD液體培養(yǎng)基中生長至對數(shù)期(OD600＝0.5～1.0)，以80mM的終濃度添加硼酸。30℃下培養(yǎng)24小時(shí)后、取出1ml試樣、通過離心分離回收細(xì)胞、液氮下冷凍，于-80℃保存直至使用。使用RNeasyMiniKit(Qiagen公司制)從酵母細(xì)胞中提取總RNA，使用MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(AppliedBiosystem社制)及olig(dT)16引物逆轉(zhuǎn)錄1μg的總RNA。對RT產(chǎn)物的1/15，以如下循環(huán)進(jìn)行PCR94℃下30秒、45℃下30秒、72℃下1分鐘，進(jìn)行40～50次。在SmartCycler(Cepheid社制)中，使用DNA聚合酶ExTaq(Takara社制)進(jìn)行PCR。該分析中使用的引物組記載于表2中，作為在PNAS的網(wǎng)頁上的補(bǔ)充信息被發(fā)表。在2％瓊脂糖凝膠上分離擴(kuò)增的轉(zhuǎn)錄物，經(jīng)Etd溴染色后檢測。表2對于鹽抗性分析，除了使用含有1.75M或2M的NaCl的SD培養(yǎng)基之外，其余通過上述的硼酸抗性分析進(jìn)行。實(shí)施例2中記載的序列GenBank登陸號如下所示。擬南芥序列AtRBP45a，MN124872；AtRBP45b，MN101037；AtRBP45c，MN118834；AtRBP45d，MN121940；AtRBP47a，MN103848；AtRBP47b，MN112800；AtRBP47c，MN103642；AtRBP47c’，MN103643；AtUBP1a，MN104285；AtUBP1b，MN101598；AtUBP1c，MN112266；及釀酒酵母序列RPL7A，X62627；RPL7B、Z7355。用擬南芥cDNA表達(dá)文庫(Minet，M.，Dufour，M.-E.，&Lacroute，F(xiàn).(1992)PlantJ.2，417-422.)轉(zhuǎn)化釀酒酵母株Y01169株，在含有80mM的硼酸的皿中選擇這些轉(zhuǎn)化體。這種濃度的硼酸，在26.5℃下培養(yǎng)2周后也可以完全抑制Y01169細(xì)胞的菌落形成。通過這種篩選，分離出幾個(gè)顯示出硼酸抗性增強(qiáng)的酵母的菌落。cDNA克隆中的1個(gè)顯示出編碼RNA結(jié)合蛋白質(zhì)AtRBP47c’。AtRBP47c’具有3個(gè)RNA識別基序(RRM)。擬南芥基因組中有11種編碼具有3個(gè)RRM并經(jīng)BLASTP程序計(jì)算對于AtRBP47c’具有100以上的序列同一性得分的蛋白質(zhì)的基因。這些AtRBP47c’相關(guān)家族蛋白質(zhì)的系統(tǒng)樹圖示于圖6A。為了調(diào)查這些擬南芥基因的表達(dá)是否給予酵母硼酸抗性，在表達(dá)載體pFL61中克隆對應(yīng)于6種基因的ORF序列(AtRBP45a、AtRBP47a、AtRBP47b、AtRBP47c、AtRBP47c’及AtUBP1a)。在酵母株BY4741中導(dǎo)入質(zhì)粒，調(diào)查這些轉(zhuǎn)化體的硼酸抗性。如圖6B所示，6種構(gòu)建體在各種范圍內(nèi)，在含有80mM硼酸的SD培養(yǎng)基中均給予酵母柱生長能力。為了比較這些轉(zhuǎn)化體的硼酸抗性水平，在液體培養(yǎng)中分析硼酸存在下的生長率。所有的轉(zhuǎn)化體均比對照更早顯示生長率。圖中，顯示了表達(dá)AtRBP47c’的轉(zhuǎn)化體最早顯示生長率(圖6C)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)AtRBP47c’相關(guān)基因的過剩表達(dá)給予硼酸抗性。擬南芥的這些基因的作用還不清楚，但是其它植物種類的類似基因可給予特征。煙草白花丹(Nicotianaplumbaginifolia)RBP45(Simpson，C.G.，Jennings，S.N.，Clark，G.P.，Thow，G.，&Brown，J.W.S.(2004)PlantJ.37，82-91)及UBP1(Lambermon，M.H.，Simpson，G.G.，WieczorekKirk，D.A.，Hemmings-Mieszczak，M.，Klahre，U.，&Filipowicz，W.(2000)EMBOJ.19，1638-1649)顯示出剪接效率增強(qiáng)。于是，在通過RT-PCR任意選擇的釀酒酵母的20種含有內(nèi)含子的基因中、調(diào)查硼酸對剪接的影響。釀酒酵母基因組內(nèi)的6317種核基因中僅231種基因含有內(nèi)含子(MunichInformationCenterforProteinSequenceshttp//mips.gsf.de/genre/proj/yeast)。被調(diào)查的20種基因中，比較積累的非剪接片段和剪接片段，通過編碼必須核糖體的大亞單位蛋白質(zhì)的基因RPL7B觀察到經(jīng)硼酸處理產(chǎn)生的非剪接片段的增加。這提示經(jīng)硼酸處理的酵母中RPL7B的剪接受到抑制(圖7B)。RPL7B含有2個(gè)內(nèi)含子。非剪接片段的大小顯示出這些片段經(jīng)第1或第2內(nèi)含子的剪接而來(圖7A參照)。為了研究哪一個(gè)內(nèi)含子對硼酸更具感受性，克隆非剪接片段，測定8個(gè)克隆的DNA序列。6個(gè)和2個(gè)的克隆分別含有第1和第2內(nèi)含子。這提示，在第1及第2內(nèi)含子兩者中均發(fā)生抑制，但第1內(nèi)含子對高濃度硼酸更具感受性。這些結(jié)果還表示，2個(gè)內(nèi)含子中的1個(gè)正確剪接，也就是說，這些非剪接片段不是基因組DNA因污染而形成的，是通過RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生的。進(jìn)而，在表達(dá)AtRBP47c’的酵母中沒有觀察到由硼酸產(chǎn)生的對RPL7B的剪接抑制(圖7B)。該結(jié)果提示，AtRBP47c’在高濃度硼酸存在下，使RPL7B的剪接效率上升。剪接效率的增強(qiáng)可能是酵母中硼酸抗性的原因。RPL7B在酵母基因組中具有同源的(バラロゲ)RPL7A(序列號32)。RPL7A基因(序列號31)如RPL7B基因一樣具有2個(gè)內(nèi)含子。調(diào)查了硼酸對RPL7A的剪接的影響。和RPL7B的情況不同，沒有觀察到硼酸產(chǎn)生的剪接抑制(圖7C)。RPL7A及RPL7B雙重破壞的變異體是致死性的(酵母基因組數(shù)據(jù)庫(SaccharomycesGenomeDatabase)http//db.yeastgenome.org)，顯示出RPL7蛋白質(zhì)是酵母生長發(fā)育所必須的。如果考慮2個(gè)基因中硼酸感受性對于剪接的差異，就存在RPL7A破壞變異體與RPL7B破壞變異體的硼酸抗性有差異的可能性。Δrpl7b(Y01094)顯示出與野生型釀酒酵母同等的硼酸抗性水平，但是Δrpl7a(Y04443)的硼酸抗性比野生型更低(圖8A)。即使在液體培養(yǎng)中硼酸抗性的差異也很明顯(圖8B)。這些結(jié)果提示由硼酸產(chǎn)生的RPL7B剪接抑制是由于Δrpl7a的硼酸抗性減少導(dǎo)致的。Δrpl7a的硼酸抗性的減少如果是由于由RPL7B剪接抑制產(chǎn)生的RPL7蛋白質(zhì)水平的減少形成的，無內(nèi)含子RPL7BcDNA的表達(dá)的確使Δrpl7a的抗性上升。調(diào)查Δrpl7a中無內(nèi)含子RPL7B的表達(dá)是否使硼酸抗性上升。將RPL7B的ORF序列克隆到表達(dá)載體pDR195中。接著，將質(zhì)粒導(dǎo)入Δrpl7a，調(diào)查轉(zhuǎn)化體的硼酸抗性。如圖8C所示，無內(nèi)含子RPL7B的表達(dá)使Δrpl7a的硼酸抗性上升。其結(jié)果顯示RPL7B剪接的抑制是由Δrpl7a的高濃度硼酸產(chǎn)生的生長停止的原因。RPL7B在第1內(nèi)含子中具有非典型的分支點(diǎn)序列(表3參照)。231種核含有內(nèi)含子的基因中，發(fā)現(xiàn)了28種含有這種非典型的分支點(diǎn)序列的基因。這28種基因中，9種基因中觀察到與剪接片段相比，經(jīng)硼酸處理產(chǎn)生的非剪接片段的水平上升(圖9)。這些基因是ERV1、ERV41、NYV1、RPS9A、RPS9B、SRB2、YOL048C、YPR098C及YRA1。表3表3中表示，酵母中確認(rèn)的3個(gè)共有序列、5’剪接位點(diǎn)、分支點(diǎn)及3’剪接位點(diǎn)。以黑底白字表示第1內(nèi)含子的分支點(diǎn)中的由A向G的轉(zhuǎn)換點(diǎn)。Y指嘧啶核糖核苷酸(C或U)。分析AtRBP47c’的過剩表達(dá)對由硼酸產(chǎn)生的這些基因的剪接抑制的影響。如圖9所示，在表達(dá)AtRBP47c’的酵母中，NYV1及SRB2的剪接抑制水平受到阻礙。NYV1及SRB2分別編碼v-SNARE蛋白質(zhì)和RNA聚合酶II全酶蛋白質(zhì)。這些結(jié)果強(qiáng)有力地提示AtRBP47c’的過剩表達(dá)給予酵母硼酸抗性的機(jī)制是剪接效率的增強(qiáng)。剪接因子基因的過剩表達(dá)給予酵母及/或植物鹽抗性(Forment，J.，Naranjo，M.A.，Roldan，M.，Serrano，R.，&Vicente，O.(2002)PlantJ.30，511-519.，2002；Serrano，R.，Gaxiola，R.，Rios，G.，F(xiàn)orment，J.，Vicente，O.，&Ros，R.(2003)Monatsh.Chem.134，1445-1464.)。還調(diào)查AtRBP47c’相關(guān)基因是否給予酵母鹽抗性。對于本研究中檢查的6種AtRBP47c’相關(guān)基因，酵母中鹽抗性均沒有上升(圖10A)。進(jìn)而，暴露于高濃度的鹽(highsalt)下的細(xì)胞中沒有觀察到RPL7B的剪接抑制(圖10B)。這些結(jié)果似乎是AtRBP47c’相關(guān)基因?qū)τ邴}抗性沒有功能，RPL7B剪接的抑制對于硼酸處理是獨(dú)特的。通過酵母的互補(bǔ)作用(補(bǔ)完)從擬南芥中分離AtRBP47c’作為給予酵母細(xì)胞硼酸抗性的基因。酵母基因組中，有7種編碼具有3個(gè)RRM并經(jīng)BLASTP程序計(jì)算對于AtRBP47c’具有100以上的序列同一性得分的蛋白質(zhì)的基因。這些的基因中，與AtRBP47c’最類似基因是NAM8。NAM8是作為本來粒線體的剪接缺乏的抑制劑被分離的(Ekwall，K.，Kermorgant，M.，Dujardin，G.，Groudinsky，O.，&Slonimski，P.P.(1992)Mol.Gene.Genet.233，136-144.)，通過其后的分析，顯示出NAM8與UlsnRNA相互作用，這種加工由于存在非典型的5’剪接位點(diǎn)的存在而受到抑制時(shí)，NAM8是5’剪接位點(diǎn)的有效識別所必須的(Gottschalk，A.，Tang，J.，Puig，O.，Salgado，J.，Neubauer，G.，Colot，H.V.，Mann，M.，Seraphin，B.，Rosbash，M.，Luhrmann，R.，&Fabrizio，P.(1998)RNA4，374-393.；Puig，O.，Gottschalk，A.，F(xiàn)abrizio，P.，&Seraphin，B.(1999)Gene.Dev.13，569-580.)。根據(jù)這些觀察結(jié)果，假定AtRBP47c’在硼酸抗性方面與NAM8行使相同作用。但是，NAM8的過剩表達(dá)不給予酵母硼酸抗性，NAM8破壞變異體與野生型同樣，顯示出硼酸抗性，AAtRBP47c’顯示出與剪接加工的其它階段及/或硼酸抗性的其它反應(yīng)(1或多個(gè))相關(guān)的可能性。本研究中，在酵母中任意選擇的20種基因中，發(fā)現(xiàn)硼酸可以抑制RPL7B的剪接(圖7B)。通過分析這種基因的第1內(nèi)含子的DNA序列分析，清楚了第1內(nèi)含子在分支點(diǎn)的共有序列存在轉(zhuǎn)化。如表1所示，分支點(diǎn)共有序列中第2位的A被轉(zhuǎn)化為RPL7B的第1內(nèi)含子中的G。與分支點(diǎn)交聯(lián)蛋白質(zhì)(Branchpointbridgingprotein(BBP)的分支點(diǎn)的結(jié)合是剪接進(jìn)行中重要的步驟(AbovichandRosbash，1997)?，F(xiàn)在已知BBP與分支點(diǎn)序列間的親和性是剪接效率的重要因素(Champion-Arnaud，etal.，1995)。尤其是，據(jù)報(bào)道這種分支點(diǎn)序列的第2核苷酸中A向G的轉(zhuǎn)化使與BBP親和性減少約10％(Berglund，J.A.，Chua，K.，Abovich，N.，Reed，R.，&Rosbash，M.(1997)Cell89，781-787.)。所以，RPL7B似乎是剪接效率較低的基因之一。據(jù)報(bào)道，Hela細(xì)胞的體外剪接系統(tǒng)中、剪接的第2步驟由于硼酸處理而受到抑制(Shomron，N.，&Ast，G.(2003)FEBSLett.552，219-224.)。剪接的第2步驟是將被處理外顯子的3’末端結(jié)扎到下一個(gè)外顯子的5’末端的加工。如果考慮硼酸通過核糖與cis-diol結(jié)合(Ralston，N.V.C.，&Hunt，C.D.(2000)FASEBJ.14，A538.；Nicholasetal.，2001；Ricardo，A.，Carrigan，M.A.，Olcott，A.N.，&Benner，S.A.(2004)Science303，196.)，剪接的第2步驟中的結(jié)扎反應(yīng)似乎由于與硼酸的外顯子的3’末端的結(jié)合而受到抑制。據(jù)上述ShomronandAst(2003)報(bào)道，由于5種不同的mRNA前體物質(zhì)顯示出同樣的抑制，認(rèn)為第2步驟中由硼酸產(chǎn)生的剪接抑制是一般的現(xiàn)象。這種情況，所有的內(nèi)含子的確同樣發(fā)生酵母中剪接抑制。但是，在本研究的最初的步驟中檢查的20種基因中，觀察到抑制的基因僅為RPL7B(圖7B)。這種特異性抑制可以按如下方式說明。第2步驟中酵母的所有含有內(nèi)含子的基因中均發(fā)生由硼酸產(chǎn)生的剪接抑制。該步驟中、在通常進(jìn)行剪接時(shí)應(yīng)當(dāng)立刻減少含有內(nèi)含子的剪接介質(zhì)時(shí)，含有內(nèi)含子的剪接介質(zhì)積累。介質(zhì)的積累抑制常規(guī)的代謝更新。這種情況似乎是具有剪接效率低的內(nèi)含子的基因?qū)τ谟膳鹚岙a(chǎn)生的剪接抑制的感受性強(qiáng)。作為這種基因的1個(gè)實(shí)例，可以例舉有像RPL7B這樣的含有非典型的分支點(diǎn)序列的基因。以具有相同特征的其它基因，通過分析由高濃度硼酸產(chǎn)生的剪接抑制，檢驗(yàn)這種推測(圖9)。這種分析中，發(fā)現(xiàn)高濃度硼酸處理在RPL7B以外的含有非典型的分支點(diǎn)序列的9種基因中抑制剪接。該結(jié)果明確顯示，硼酸的毒性的機(jī)制的1種是具有剪接效率低的內(nèi)含子的基因的剪接抑制。進(jìn)而，這些9種類的基因中，發(fā)現(xiàn)2種基因的剪接抑制由于AtRBP47c’的過剩表達(dá)而受到抑制障害(圖9)。該結(jié)果提示由AtRBP47c’的過剩表達(dá)產(chǎn)生的硼酸抗性也許是通過高濃度硼酸處理中剪接受到抑制的多個(gè)基因的一部分基因的剪接效率的增強(qiáng)實(shí)現(xiàn)的。因此，限定數(shù)目的基因的剪接抑制也許是生長抑制的原因。AtRBP47c’相關(guān)蛋白質(zhì)具有3個(gè)RRM。確認(rèn)了RBP45、RBP47及N.plumbaginifolia的UBP1的RNA結(jié)合活性。這些的蛋白質(zhì)全都有與U-rich序列結(jié)合的傾向(Lambermon，M.H.，Simpson，G.G.，WieczorekKirk，D.A.，Hemmings-Mieszczak，M.，Klahre，U.，&Filipowicz，W.(2000)EMBOJ.19，1638-1649.Lorkovi？，Z.J.，WieczorekKirk，D.A.，Klahre，U.，Hemmings-Mieszczak，M.，&Filipowicz，W.(2000).RNA6，1610-1624.)。進(jìn)而，N.plumbaginifolia的RBP45的缺失分析顯示與RNA的相互作用中需要至少2個(gè)RRM(Lorkovicetal.，2000)?，F(xiàn)在逐漸意識到RRM與RNA結(jié)合相關(guān)，但是一定的蛋白質(zhì)的RRM參與與其它蛋白質(zhì)的相互作用(Kielkopf，C.L.，Lucke，S.，&Green，M.R.(2004)GeneDev.18，1513-1526.)。尤其是，據(jù)報(bào)道含有3個(gè)RRM的剪接因子酵母U2AF65的第3個(gè)RRM與BBP(Rain，J.C.，Rafi，Z.，Rhani，Z.，Legrain，P.，&Kramer，A.(1998)RNA4，551-565.)。這些結(jié)果提示AtRBP47c’也與BBP相互作用的可能性。進(jìn)而，RBP7B的第1內(nèi)含子及SRB2內(nèi)含子序列的分析表明分支點(diǎn)的3’末端存在U-rich序列。如果綜合這些結(jié)果，假定AtRBP47c’通過與BBP結(jié)合，穩(wěn)定BBP與分支點(diǎn)的相互作用，穩(wěn)定分支點(diǎn)的U-rich序列。其結(jié)果是，剪接效率增加。據(jù)報(bào)道，剪接由于鹽壓力而受到抑制。進(jìn)而，據(jù)報(bào)道SR蛋白質(zhì)等的多個(gè)剪接因子的過剩生產(chǎn)增加酵母和植物中鹽抗性(Forment，J.，Naranjo，M.A.，Roldan，M.，Serrano，R.，&Vicente，O.(2002)PlantJ.30，511-519..，2002；Serrano，R.，Gaxiola，R.，Rios，G.，F(xiàn)orment，J.，Vicente，O.，&Ros，R.(2003)Monatsh.Chem.134，1445-1464.)。本研究中，AtRBP47c’相關(guān)基因的過剩表達(dá)不給予酵母鹽抗性(圖10A)，在鹽處理后沒有檢測出RPL7B的剪接抑制(圖10B)。這些結(jié)果提示在鹽處理和硼酸處理中剪接抑制的機(jī)制不同。實(shí)施例2是表明硼酸的毒性機(jī)制的關(guān)鍵是剪接的特異性抑制，與剪接效率的增強(qiáng)相關(guān)的基因帶來硼酸抗性的最早的報(bào)告。但是，確實(shí)存在剪接的抑制以外的毒性的機(jī)制。原因是，即使在未進(jìn)行剪接的原核生物中也觀察到硼酸的毒性的影響。圖1是表示使用酵母1169株的硼酸抗性能力的結(jié)果的圖。用pYES2“2”和pYES2-BORI“7”轉(zhuǎn)化酵母1169株。將各酵母分別劃線于含有0-100mM的硼酸的SD培養(yǎng)基上。顯示了26.5℃下培養(yǎng)16天的結(jié)果。圖2是表示在硼酸過剩培養(yǎng)基中的酵母1169株的生長的結(jié)果的圖。用46，72，84，86和8轉(zhuǎn)化7酵母1169株。液體培養(yǎng)各酵母后，劃線于含有80mM的硼酸的SD培養(yǎng)基上。位點(diǎn)由左向右慢慢稀釋1/5。表示了26.5℃下培養(yǎng)9天的結(jié)果。圖3是表示液體培養(yǎng)基中的酵母1169株的硼酸抗性試驗(yàn)的結(jié)果的圖。用46，72，84，86和87轉(zhuǎn)化酵母1169株。液體培養(yǎng)各酵母后，接種于含有80mM的硼酸的SD培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)直至OD600的值為0.1。30℃下培養(yǎng)4天，測定OD600的值。進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。以與平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差的圖表示。圖4是表示硼酸過剩培養(yǎng)基中的酵母BY4741株的生長結(jié)果的圖。用46，72，84，86和87轉(zhuǎn)化酵母BY4741株。液體培養(yǎng)各酵母后，點(diǎn)樣于含有100mM的硼酸的SD培養(yǎng)基中。位點(diǎn)由左向右慢慢稀釋1/5。表示了26.5℃下培養(yǎng)10天的結(jié)果。圖5是表示液體培養(yǎng)基中的酵母BY4741株的硼酸抗性試驗(yàn)的結(jié)果的圖。用46、72，84、86，和87轉(zhuǎn)化酵母BY4741株。對各酵母液體培養(yǎng)后，接種于含有80mM的硼酸的SD培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)直至OD600的值為0.1。30℃下培養(yǎng)4天，測定OD600的值。進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。以與平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差的圖表示。圖6是表示AtRBP47c’相關(guān)基因轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞的硼酸抗性的結(jié)果的圖。(A)AtRBP47c’相關(guān)家族基因的系統(tǒng)樹圖。系統(tǒng)樹圖表示AtRBP47c’相關(guān)家族蛋白質(zhì)的相對的進(jìn)化距離，采用NJ法制成。條表示0.1氨基酸取代/部位的基因距離。(B)固體培養(yǎng)基中硼酸抗性。酵母細(xì)胞生長至OD600為1.0，連續(xù)稀釋，接著滴入到在10μl添加了0或80mM的硼酸的SD皿中。10天培養(yǎng)后記錄生長。使用經(jīng)空載體pFL61轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞作為對照。(C)液體培養(yǎng)基中硼酸抗性。酵母細(xì)胞生長至OD600為1.0，在添加了0或80mM的硼酸的SD培養(yǎng)基中稀釋至OD600為0.1。30℃下培養(yǎng)稀釋的酵母細(xì)胞，記錄稀釋后的記載小時(shí)OD600的值。橫條表示3次測定的平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖7是表示剪接中硼酸的影響的圖。(A)RPL7B的剪接的略圖。通過剪接可以從RPL7B的pre-mRNA中產(chǎn)出3種mRNA。箭頭指的是RT-PCR中使用的引物的位置。(B)硼酸對RPL7B的剪接的影響。酵母細(xì)胞生長至OD600為1.0，以80mM的終濃度添加硼酸。24小時(shí)后，回收酵母細(xì)胞，分離總RNA。從總RNA中合成cDNA，用作通過PCR進(jìn)行剪接分析的模板。該分析中，使用經(jīng)空載體pFL61轉(zhuǎn)化的酵母株BY4741(野生型)或AtRBP47c’表達(dá)載體(AtRBP47c’)。(C)硼酸對RPL7A的剪接的影響。在經(jīng)PFL61轉(zhuǎn)化的BY4741中通過RT-PCR分析RPL7A的剪接。圖8是表示RPL7A或RPL7B破壞酵母細(xì)胞的硼酸抗性的結(jié)果的圖。(A)固體培養(yǎng)基中硼酸抗性。酵母細(xì)胞生長至OD600為1.0，連續(xù)稀釋，接著滴入到在10μl添加了0或80mM的硼酸的SD皿中。7天培養(yǎng)后記錄生長。(B)液體培養(yǎng)基中硼酸抗性。酵母細(xì)胞生長至OD600為1.0，在添加了0或80mM的硼酸的SD培養(yǎng)基中稀釋至OD600為0.1。稀釋后30℃下培養(yǎng)稀釋的酵母細(xì)胞21小時(shí)(SD)及60小時(shí)(SD+80mM的硼酸)，然后記錄OD600的值。橫條表示3次測定的平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。Δrpl7a及Δrpl7b分別表示RPL7A破壞變異體(Y0443)和RPL7B破壞變異體(Y01094)。(C)RPL7B的過剩表達(dá)對RPL7A破壞酵母中硼酸抗性的影響。酵母細(xì)胞生長至OD600為1.0，連續(xù)稀釋，接著滴入到在10μl添加了0或80mM的硼酸的SD皿中。5天培養(yǎng)后記錄生長。使用經(jīng)空載體pFL61轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞作為對照。圖9是表示硼酸對含有非典型的分支點(diǎn)序列的基因的剪接的影響的圖。酵母細(xì)胞生長至OD600為1.0，接著以80mM的終濃度添加硼酸。24小時(shí)后，回收酵母細(xì)胞，分離總RNA，用作通過PCR進(jìn)行剪接分析的模板。該分析中，使用經(jīng)空載體pFL61轉(zhuǎn)化的酵母株BY4741(野生型)或AtRBP47c’表達(dá)載體(AtRBP47c’)。白和黑的箭頭分別指向的是非剪接片段、剪接片段。圖10是表示鹽對AtRBP47c’相關(guān)基因轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞的生長和對RPL7B的剪接的影響的圖。(A)固體培養(yǎng)基中鹽抗性。酵母細(xì)胞生長至OD600為1.0，連續(xù)稀釋，接著滴入到在10μl添加了0、1.75或2M的NaCl。培養(yǎng)7天后記錄生長。使用經(jīng)空載體pFL61轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞作為對照。(B)鹽對RPL7B的剪接的影響。酵母細(xì)胞生長至OD600為1.0，以分別為2M或80mM的終濃度添加NaCl或硼酸。24小時(shí)后，回收酵母細(xì)胞，分離總RNA。從總RNA中合成cDNA，用作通過PCR進(jìn)行剪接分析的模板。序列表<110>獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)(JapanScienceandTechnologyAgency<120>硼酸抗性給予蛋白質(zhì)及其基因<130>K05327PCT<150>JP2004-073324<151>2004-03-15<160>134<170>PatentInversion3.1<210>1<211>1332<212>DNA<213>擬南芥<400>1atgttgctcaatgacaagcaagtgtatgtgggtcctttcctgaggagacaagaaagagac60tccactgctaacaaaacgaaattcaccaatgtgtatgtgaagaatctcgcggaaagtact120accgatgatgacttgaagaatgcttttggcgagtatggaaagataacaagtgctgtcgtg180atgaaagatggagaagggaagtccaagggctttgggtttgtcaactttgaaaatgctgat240gatgctgctagggctgtggagtctctcaatgggcacaaatttgatgataaggagtggtat300gttggtagagcccagaagaagtcagagagggaaacagaattaagggtccgttatgaacag360aatttgaaggaagctgcagacaagtttcaaagttcaaacttgtatgttaagaatttggat420cctagcatttcagatgagaaacttaaagagatcttttctccttttggtaccgttacatct480agcaaggtgatgcgggatcctaatggaacaagcaaaggctcaggttttgttgctttcgca540actcccgaagaagcaactgaagctatgtcacagttgagcggtaaaatgatcgaaagcaag600ccactctatgtggctattgcacagcggaaggaagacagaagggtcagactacaggctcag660ttttcccaagtgaggccagttgcaatgcagccgtctgttggtccccgcatgccagtgtat720cccccgggtggtcctggtattggacaacaaatgttctatggtcaggcccctcctgccatg780attcctccccagcctgggtatgga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13>人工系列<220><223>primer<400>124tcgccactaactctatttac20<210>125<211>20<212>DNA<213>人工系列<220><223>primer<400>125accatttcaggtacaatgtc20<210>126<211>20<212>DNA<213>人工系列<220><223>primer<400>126cttcggaaatatcgaattcc20<210>127<211>20<212>DNA<213>人工系列<220><223>primer<400>127ctgaaacgataccaacaatg20<210>128<211>20<212>DNA<213>人工系列<220><223>primer<400>128tttgtggtttaggcaatacc20<210>129<211>22<212>DNA<213>人工系列<220><223>primer<400>129atacaaaagtatacaacatgcc22<210>130<211>20<212>DNA<213>人工系列<220><223>primer<400>130tttccaagaaatcttcgacc20<210>131<211>20<212>DNA<213>人工系列<220><223>primer<400>131ctttactgcgaagataaagg20<210>132<211>20<212>DNA<213>人工系列<220><223>primer<400>132gccactataatctgttgttg20<210>133<211>20<212>DNA<213>人工系列<220><223>primer<400>133tcaaaactacggctcatttg20<210>134<211>20<212>DNA<213>人工系列<220><223>primer<400>134tgaacaaaagactcaatccg20權(quán)利要求1.編碼由序列號2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列構(gòu)成的具有硼酸抗性給予活性的蛋白質(zhì)的DNA。2.編碼由序列號2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)、并且具有硼酸抗性給予活性的DNA。3.由序列號1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，或29所示的堿基序列或其互補(bǔ)的序列構(gòu)成的硼酸抗性給予基因DNA。4.由序列號1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，或29所示的堿基序列中缺失、取代或添加了1個(gè)或數(shù)個(gè)堿基的堿基序列構(gòu)成的并且編碼具有硼酸抗性給予活性的蛋白質(zhì)的DNA。5.與權(quán)利要求3記載的DNA在嚴(yán)緊條件下雜交并且編碼具有硼酸抗性給予活性的蛋白質(zhì)的DNA。6.由序列號2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列構(gòu)成的具有硼酸抗性給予活性的蛋白質(zhì)。7.由序列號2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，或30所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的，并且具有硼酸抗性給予活性的蛋白質(zhì)。8.含有權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)記載的DNA，并且可以表達(dá)硼酸抗性給予蛋白質(zhì)的重組載體。9.導(dǎo)入了權(quán)利要求8記載的重組載體，并且表達(dá)硼酸抗性給予蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化體。10.根據(jù)權(quán)利要求9記載的轉(zhuǎn)化體，其特征在于轉(zhuǎn)化體是酵母。11.根據(jù)權(quán)利要求9記載的轉(zhuǎn)化體，其特征在于轉(zhuǎn)化體是植物。12.硼酸抗性給予基因的篩選方法，其特征在于使用基因文庫，缺失YNL275w基因，轉(zhuǎn)化不表達(dá)YNL275w的YNL275w破壞酵母，在含有硼酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化YNL275w破壞酵母，測定并評價(jià)該轉(zhuǎn)化YNL275w破壞酵母的硼酸抗性給予活性。13.硼酸抗性給予基因的篩選方法，其特征在于以由硼酸產(chǎn)生的對剪接的特異性抑制為目標(biāo)，測定并評價(jià)剪接效率的增強(qiáng)程度。14.根據(jù)權(quán)利要求13記載的硼酸抗性給予基因的篩選方法，其特征在于使被檢物質(zhì)在酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，在硼酸的存在下，培養(yǎng)被檢物質(zhì)表達(dá)，以酵母中含有內(nèi)含子的基因的由硼酸產(chǎn)生的對剪接的特異性抑制的改善程度作為剪接效率的增強(qiáng)程度進(jìn)行測定和評價(jià)。15.根據(jù)權(quán)利要求14記載的硼酸抗性給予基因的篩選方法，其特征在于酵母中含有內(nèi)含子的基因是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基因組內(nèi)的RPL7B基因。16.權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)記載的DNA作為硼酸抗性給予基因的用途。17.權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)記載的DNA用于制備被給予了硼酸抗性的植物或酵母的用途。18.權(quán)利要求6或7記載的蛋白質(zhì)作為具有硼酸抗性給予活性的蛋白質(zhì)的用途。19.權(quán)利要求6或7記載的蛋白質(zhì)用于制備被給予了硼酸抗性的植物或酵母的用途。全文摘要提供一種存在可以制備對硼過剩具有抗性的植物的可能性并且可以給予生物硼酸抗性的基因和蛋白質(zhì)。通過使高等植物擬南芥的幾個(gè)基因在真核生物的模式生物酵母中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了5種給予酵母硼酸抗性的基因，即AtPAB2，AtRBP47c’，AtRPS20B，AtMYB13，及AtMYB68，AtRBP45a，AtRBP45b，AtRBP45c，AtRBP45d，AtRBP47a，AtRBP47b，AtRBP47c，AtUBP1a，AtUBP1b，AtUBP1c的各個(gè)基因。此外，發(fā)現(xiàn)了硼酸的毒性機(jī)制的關(guān)鍵在于剪接的特異性抑制，與剪接效率增強(qiáng)相關(guān)的基因是硼酸抗性給予基因。文檔編號C12Q1/68GK1930292SQ20058000730公開日2007年3月14日申請日期2005年3月15日優(yōu)先權(quán)日2004年3月15日發(fā)明者藤原徹,野澤彰申請人:獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)