專利名稱：：導入了細胞死亡抑制基因的逆境抗性植物及其生產方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及逆境抗性(stressresistant)植物及生產該逆境抗性植物的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及經過將細胞死亡抑制基因導入植物來培育逆境抗性植物。目前，對多細胞生物的程序化細胞死亡(下文簡稱為“PCD”)的研究變得較熱門。PCD預期對生物體的個體發(fā)生，內環(huán)境穩(wěn)定，對逆境的抗性等是必需的。對PCD的研究主要在Caenorhabditiselegans(下文簡稱為“C.elegans”)，果蠅屬和哺乳動物上進行(例如，Miura等，細胞技術，Vol.14.no.2145-153，1995)。例如，對C.elegans的研究揭示了一些細胞死亡基因(例如，ced-3和ced-4)和一些細胞死亡抑制基因(例如，ced-9)。據認為細胞死亡抑制基因對細胞死亡基因具有負調節(jié)活性，從而抑制了隨機細胞死亡。在哺乳動物中發(fā)現的由bcl-2基因編碼的蛋白質(即，Bcl-2蛋白質)在各種系統(tǒng)的細胞(即，淋巴系統(tǒng)，神經系統(tǒng)，生殖系統(tǒng)和上皮系統(tǒng)的細胞)中表現出細胞死亡抑制活性。迄今，已知能以各種方法誘導的細胞死亡受Bcl-2過度表達的抑制(例如，Eguchi等，實驗醫(yī)學，Vol.13，no.16，24-31，1995)。最近，報道了許多編碼Bcl-2相關蛋白和Bcl-2結合蛋白的基因。這些基因被分類成Bcl-2家族。屬于Bcl-2家族的基因的例子包括來自哺乳動物的bcl-2，bax，bcl-xL，bcl-xS，bad，bak，Al和Mcl-1基因，來自C.elegans的ced-9基因，BHRF1基因(來自EpsteinBarr病毒)和LMW5-HL基因(來自非州豬瘟病毒)(Takayama，實驗醫(yī)學，Vol.13.No.16.24-31，1995)。一般來說，本領域已知屬于Bcl-2家族的基因間在核酸序列水平及在氨基酸序列水平上的相同性和相似性極低。例如，Baxα和Bcl-2之間在氨基酸序列水平上的相同性大約為21％，其相似性大約為43％(Yamamoto，“胞間信號轉導”，實驗醫(yī)學，增刊，AdduceCo.，Ltd.)。最近剛開始對高等植物的PCD進行研究(見Fukuda等，KagakuToSeibutsu，34586-594，1996)。植物總是接觸嚴重的逆境。例如，植物可被病毒或細菌感染，可被紫外光輻射，或可受到除草劑引起的超氧化物的影響。為了抵抗這些逆境，例如，在病毒感染的情況下，超敏反應(HR)誘導PCD。HR的特征在于在感染部位迅速出現壞死病灶。盡管HR涉及一些組織損傷，但其結果是為了經過限制感染的傳播而保護植物。另外，據認為植物中的這種PCD涉及細胞死亡基因和細胞死亡抑制基因。由于細胞死亡抑制基因很可能負調節(jié)由逆境或類似情況引起的細胞死亡(即，能防止細胞死亡)，所以據認為細胞死亡抑制基因具有對逆境的抗性。因此，在培育植物時，經過表達細胞死亡抑制基因可賦予對逆境的抗性。提供賦予了對逆境的抗性的植物在農業(yè)領域是一個重要的主題，目前，由于臭氧層的破壞等因素，我們實際接受的紫外(UV-B)光的量每10年增加大約6.8％。很明顯，植物也面臨這一環(huán)境問題。然而，目前，就發(fā)明人所知，在本申請要求優(yōu)先權的日本專利申請?zhí)?-56743和10-8056的申請日之前，對于使用細胞死亡抑制基因獲得對諸如紫外光，產生超氧化物的除草劑和鹽逆境的逆境的抗性尚未進行研究。本發(fā)明涉及導入了細胞死亡抑制基因的逆境抗性植物。用已知的基因重組技術將細胞死亡抑制基因導入植物細胞的DNA。植物細胞的DNA不僅指染色體DNA，也指植物細胞中的各種細胞器(例如，線粒體，葉綠體等)的DNA。根據本發(fā)明的一個方面，提供了一種逆境抗性植物，其中導入了細胞死亡抑制基因。在本發(fā)明的一個實施方案中，細胞死亡抑制基因屬于Bcl-2家族且編碼具有細胞死亡抑制活性的肽。在本發(fā)明的一個實施方案中，細胞死亡抑制基因是Caenorhabditiselegansced-9基因。在本發(fā)明的一個實施方案中，細胞死亡抑制基因是人bcl-xL基因。在本發(fā)明的一個實施方案中，逆境是由紫外輻射引起的逆境。在本發(fā)明的一個實施方案中，逆境是由產生超氧化物的除草劑引起的氧化逆境。在本發(fā)明的一個實施方案中，逆境是由鹽引起的逆境。根據本發(fā)明的另一方面，生產逆境抗性植物的方法包括下列步驟將細胞死亡抑制基因導入植物細胞；及將導入了細胞死亡抑制基因的植物細胞再生成植物體。在本發(fā)明的一個實施方案中，細胞死亡抑制基因是摻入植物表達載體。因此，本文描述的本發(fā)明具有如下優(yōu)點(1)經過將PCD相關基因導入植物而提供了獲得了對各種逆境的抗性的植物；和(2)提供了培育獲得了對各種逆境的抗性的植物的方法，其中PCD相關基因被導入植物中。經過參考附圖閱讀和理解下面的詳細描述，本發(fā)明的這些和其它優(yōu)勢對本領域的技術人員來說將是顯而易見的。圖1是顯示起始載體pBE2113的結構的示意圖。圖2是顯示含人bcl-xL基因的質粒(pM65)和含C.elegansced-9基因的質粒(pM66)的示意圖。圖3是顯示為證實導入的基因在轉基因植物(M66)中的表達而進行的RT-PCR的結果的電泳照片，其中C指對照植物，各數字代表轉基因植物的個體號碼。圖4顯示了為證實人bcl-xL基因產物在轉基因植物(M65)中的表達而使用抗Bcl-xL抗體進行Western印跡分析的結果，其中在該植物中導入了來自動物的細胞死亡抑制基因，圖中C代表對照植物且各數字代表轉基因植物的個體號。圖5是顯示為證實C.elegansced-9基因在轉基因植物(M66)中的表達而進行的Northern印跡分析的放射自顯影照片，其中C代表對照植物，各數字代表轉基因植物的個體號，還顯示了pM66表達載體的示意圖。圖6A是顯示紫外照射處理后4周齡葉片及紫外照射處理后從12周齡葉片獲得的葉圓片的照片。圖6B是顯示UV-B照射處理10天后獲得的小植物的照片。圖7是顯示導入了動物細胞死亡抑制基因的植物的葉綠素含量即使在UV照射處理后也僅略有減少的圖示。圖8是顯示導入了動物細胞死亡抑制基因的植物獲得百草枯抗性的圖示。圖9是顯示導入了動物細胞死亡抑制基因的植物(M65-21和M66-30植物)及野生型煙草植物在鹽逆境中重量改變的圖示。圖10是顯示導入了動物細胞死亡抑制基因的植物(M65-21和M66-30植物)籽苗及35S-GUS植物籽苗的照片。這些植物在各種鹽濃度下放置3天。圖11是顯示導入了動物細胞死亡抑制基因的植物(M65-21和M66-30植物)及35S-GUS植物(對照)的破裂葉片面積的圖示。圖12是顯示導入了動物細胞死亡抑制基因的植物(M65-21和M66-30植物)及35S-GUS植物鹽(O.2MNaCl)抗性的照片，且作為對照，顯示了相同類型的植物吸收水代替鹽的照片。導入了細胞死亡抑制基因的植物獲得了鹽抗性。圖13顯示了野生型植物(對照)和導入了動物細胞死亡抑制基因的植物(M65-21和M66-30植物)在O.2MNaCl條件下放置9天后的照片。植物在莖部切下并放入O.2MNaCl溶液中。導入了細胞死亡抑制基因的植物獲得了鹽抗性。圖14是顯示為證實Bcl-xL蛋白在轉基因植物細胞中的定位而進行Western印跡分析的結果的電泳照片。它顯示了Bcl-xL蛋白質位于線粒體組分中。在下文中，將對本發(fā)明進行更詳細的描述。本文的術語“細胞死亡抑制基因”指針對對PCD以抑制方式發(fā)揮作用的基因，而不管其來源(植物或動物)，只要該基因來自多細胞生物。細胞死亡抑制基因優(yōu)選來自動物，例如，細胞死亡抑制基因可來自線蟲(例如，C.elegans)或包括人類的哺乳動物。細胞死亡抑制基因的例子包括來自C.elegans的ced-9基因，來自哺乳動物例如人，小鼠或雞的bcl-2基因，來自人的bcl-xL基因(Miura等，細胞技術，Vol.14，no.2145-153，1995)。根據本發(fā)明，可使用已知的細胞死亡抑制基因。優(yōu)選的細胞死亡抑制基因包括屬于Bcl-2家族的那些基因(例如，ced-9基因和bcl-xL基因)。使用已知的細胞死亡抑制基因或其片段作探針可獲得的，并與已知細胞死亡抑制基因同源的來自各種類型的生物的基因組或cDNA文庫的基因也可用作細胞死亡抑制基因。為達到該目的，例如，可使用植物DNA文庫，C.elegansDNA文庫和人DNA文庫。本領域的技術人員可適當選擇用于篩選文庫的嚴格條件。本文的“具有同源性的基因”指當在氨基酸水平上與細胞死亡抑制基因相比較時，在特定區(qū)域高度保守的基因。本文使用的術語“高度保守”指，例如，在氨基酸水平上具有大約40％或更多的同源性，優(yōu)選大約70％或更多，更優(yōu)選大約80％或更多，還更優(yōu)選大約90％或更多的同源性。在此概念下，同源性測定表示為所比較的兩個氨基酸序列間不變的氨基酸和保守性取代的氨基酸占總氨基酸的比率。屬于Bcl-2家族的基因具有在氨基酸水平上高度保守的區(qū)域。已知BH1和BH2區(qū)域高度保守，還已知在N端有一個也是高度保守的區(qū)域(即，BH3區(qū)域)。這些區(qū)域在異源性Bcl-2家族(人，小鼠，大鼠和雞)間在進化上保守(Takayama，實驗醫(yī)學，Vol.13，No.16，24-31，1995；和Ohta等，實驗醫(yī)學，Vol.13.No.16，32-37，1995)。特別是已知包括所有BH1，BH2和BH3區(qū)域的蛋白質以其本身抑制細胞程序性死亡(Takayama，實驗醫(yī)學，Vol.13.no.16，24-31，1995)。因此，術語“屬于Bcl-2家族的基因”指屬于Bcl-2家族的已知細胞死亡抑制基因或與其同源的基因。與屬于Bcl-2家族的已知細胞死亡抑制基因同源的基因意在指編碼包括至少一個選自BH1，BH2和BH3區(qū)域的區(qū)域的蛋白質的基因，優(yōu)選編碼包括選自BH1，BH2和BH3區(qū)域的至少兩個區(qū)域的蛋白質的基因，更優(yōu)選編碼包括BH1和BH2區(qū)域的蛋白質的基因，最優(yōu)選編碼包括BH1，BH2和BH3所有區(qū)域的蛋白質的基因。使用商業(yè)上可獲得的計算機分析軟件(GeneWorks，IntelliGeneticsInc.)將感興趣的基因所編碼的氨基酸序列與已知Bcl-2家族蛋白質的氨基酸序列進行序列對比可較容易地尋找和鑒定高度保守的區(qū)域。根據Miura等，細胞技術，Vol.14，No2145-153，1995所述的方法可測定所獲得的基因的細胞死亡抑制活性。具體地說，將該感興趣的基因導入Rat1細胞，已知從培養(yǎng)基中去掉血清可誘導該細胞死亡(Kumar，S.等，基因發(fā)展，81613-1626，1994)，然后從培養(yǎng)基中去掉血清。4天后，觀察重組Rat1細胞的細胞死亡率。如果重組Rat1細胞中的細胞死亡明顯受到抑制，則認為感興趣的基因具有細胞死亡抑制活性。根據Eguchi等，實驗醫(yī)學，Vol.13.No.16，24-31，1995所述的方法也可測定所獲得的基因的細胞死亡抑制活性。具體地說，將感興趣的基因導入來自大鼠嗜鉻細胞瘤細胞系PCl2的細胞，將大約105個細胞接種在6cm平皿上并放入箱中適應低氧濃度。然后，通過使用例如BBLGasPacPlus(BectonDickinson)可減小箱中的氧濃度。使用臺盼蘭在一段時間內定量存活細胞的數目，其中氧濃度減少到100ppm時的時間點定為0。由于已知在100ppm或更低的低氧濃度條件下(即，在誘導細胞程序死亡的條件)培養(yǎng)48小時時大約一半的細胞被殺死，所以當觀察到細胞死亡率明顯受抑制時，認為感興趣的基因具有細胞死亡抑制活性。因此本文使用的術語“具有細胞死亡抑制活性的基因”指根據至少一種上述方法或其相當方法證實為具有細胞死亡抑制活性的基因。生產用于篩選與已知細胞死亡抑制基因同源的基因的DNA文庫的方法，與探針雜交的嚴格條件及克隆基因的方法對本領域的技術人員來說是熟知的。例如，見Maniatis等，分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989。經過，首先從C.elegans分離總RNA，然后用總RNA作模板經RT-PCR獲得ced-9的全長cDNA來篩選ced-9基因。優(yōu)選的是，可將5′-TTGAATTCGAGATGACACGCTGCACGGCGG-3′(SEQIDNO1)用作引物。具體地說，從mRNA合成第一鏈cDNA，然后使用SEQIDNO1的引物和5′-GGGAATTCGTTACTTCAAGCTGAACATCAT-3′(SEQIDNO2)進行PCR，從而獲得感興趣的cDNA。經過使用合適的引物以相似方式可分離bcl-xL基因。按照商業(yè)上可獲得的試劑盒或儀器的廠家說明書或以本領域的技術人員熟知的方法進行PCR。由此獲得的來自動物或其它來源的細胞死亡抑制基因可經與合適的植物表達載體相連而導入植物中。另外，通過使用直接將核酸導入植物的轉化方法(例如，電穿孔方法，粒子槍方法，磷酸鈣方法或聚乙二醇(PEG)方法)可將細胞死亡抑制基因導入植物中。本文使用的術語“植物”包括單子葉和雙子葉植物，特別優(yōu)選的植物的例子包括煙草，青椒，茄子，甜瓜，西紅柿，甜薯，卷心菜，大蔥，硬花球花椰菜，胡蘿卜，黃瓜，柑橘水果，大白菜，萵苣，桃子，水稻，土豆，大麥，小麥，和蘋果。除非另有說明，本文所用的“植物”包括任意一種植物體，植物器官，植物組織，植物細胞和種子。植物器官的例子包括根，葉，莖，花等。植物細胞的例子包括愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細胞。本文使用的術語“植物表達載體”指一種核酸序列，在該序列中諸如調節(jié)細胞死亡抑制基因表達的啟動子的各種調節(jié)元件以在宿主植物細胞中可操作的方式互相連接。優(yōu)選的植物表達載體可包括植物啟動子，終止子，藥師抗性基因和增強子。本領域的技術人員熟知植物表達載體的類型和調節(jié)元件的類型可根據宿主細胞而變化。本發(fā)明使用的植物表達載體可進一步含有T-DNA區(qū)域。T-DNA區(qū)域能使基因經土壤桿菌介導的轉化導入植物基因組。本文使用的術語“植物啟動子”指在植物中表達的啟動子。植物啟動子的例子包括但不限于其表達受某類逆境誘導的啟動子，例如，編碼煙草感染特異性蛋白質PR-1a的基因的啟動子(下文稱為“煙草PR-1a啟動子”)，或以組成型表達的啟動子，例如，花椰菜花葉病毒35S啟動子(下文稱為“CaMV35S啟動子”)和胭脂氨酸合酶啟動子(Pnos)。本文使用的術語“終止子”指位于編碼蛋白質的基因區(qū)下游的序列，它參與mRNA轉錄的終止并添加聚腺苷酸序列。已知終止子負責mRNA的穩(wěn)定性，從而影響基因的表達水平。終止子的例子包括但不限于CaMV35S終止子，胭脂氨酸合酶基因(Tnos)終止子，煙草PR-1a基因的終止子。藥物抗性基因需要使轉基因植物易于選擇。作為藥物抗性基因，優(yōu)選使用賦予卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉移酶II(NPTII)基因，賦予潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉移酶基因等。用于表達藥物抗性基因的啟動子的例子包括但不限于E12Ω啟動子，煙草PR-1a啟動子，CaMV35S啟動子，和胭脂氨酸合酶啟動子。優(yōu)選的是使用E12Ω啟動子，它以高水平組成型表達感興趣的基因。E12Ω啟動子包括串聯(lián)相連的CaMV35S啟動子的2個增強子區(qū)域(En35S-417到-90)，CaMV35S核心啟動子和煙草花葉病毒的Ω區(qū)域(基因217217，1987)，CaMV35S啟動子和Ω區(qū)定位在串聯(lián)增強子區(qū)的下游(見在日本公開公報號7-250685中公開的質粒pST10)。E12Ω啟動子具有比CaMV35S啟動子高10到20倍的活性?？墒褂迷鰪娮釉鰪姼信d趣的基因的表達。作為增強子，優(yōu)選含上述CaMV35S啟動子上游序列的增強子區(qū)。每個感興趣的基因可使用多個增強子。用于本發(fā)明構建植物表達載體的載體可優(yōu)選是pBI型載體，pUC型載體或pTRA型載體。pBI型和pTRA型載體可經土壤桿菌將感興趣的基因導入植物中?？蓛?yōu)選使用pBI型雙向載體或pTRA型中間載體。pBI型載體的例子包括pBI121，pBI101，pBI101.2和pBI101.3。這些載體含來自一個區(qū)域(T-DNA區(qū)域)的基因，其經過土壤桿菌介導的轉化導入植物中。這些載體還含有NPTII基因(用于提供卡那霉素抗性)，它在植物啟動子的控制下表達，用作標記基因。pUC型載體的應用能將基因直接導入植物中。pUC型載體的例子包括pUC18，pUC19和pUC9。本發(fā)明的植物表達載體可使用本領域技術人員熟知的重組DNA技術來生產。優(yōu)選的是，將來自動物的細胞死亡抑制基因導入上述載體啟動子的下游。使用本領域技術人員熟知的方法可將植物表達載體導入植物細胞。例如，經土壤桿菌導入植物表達載體的方法或將植物表達載體直接導入細胞的方法是已知的?？衫?，如在Nanel等，微生物學通訊，67，325，1990中所述進行使用土壤桿菌的方法。根據該方法，首先用例如植物表達載體經電穿孔轉化土壤桿菌，然后以S.B.Gelvin等，植物分子生物學手冊，學術出版社所述的方法將由此轉化的土壤桿菌感染進植物細胞。直接將植物表達載體導入細胞的方法的例子包括電穿孔方法和基因槍方法。這些方法是本領域中熟知的且適合于待轉化的植物的方法可由本領域的技術人員適當選擇。已導入了植物表達載體的細胞的選擇以其藥物抗性如卡那霉素抗性為基礎。此后，可使用常規(guī)方法將細胞再生為植物組織，植物器官或植物體?？蓮闹参矬w獲得種子。使用引物對經PCR分析，可確定細胞死亡抑制基因是否已導入了轉基因植物。例如，當感興趣的基因經含胭脂氨酸合酶終止子的植物表達載體導入轉基因植物時，可使用5′-AGACCGGCAACAGGATTCAA-3′(SEQIDNO5)，(相對于胭脂氨酸合酶終止子的序列)作為3′引物進行PCR。如果感興趣的基因是C.elegansced-9基因，5′引物可以是5′-CCTCTTCGTTTACACATCGC-3′(SEQIDNO3)。如果感興趣的基因是人bcl-xL基因，5′引物可以是5′-ACAAGGAGATGCAGG-3′(SEQIDNO4)。將所得的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，當擴增出與陽性對照具有相同遷移率的DNA時，證實在轉基因植物中存在感興趣的基因。以本領域技術人員熟知的方法可證實導入的細胞死亡抑制基因的表達。例如，使用相應于所導入基因的DNA，即，例如，ced-9或bcl-xL的cDNA或其部分序列作探針對植物葉所提取的總RNA進行Northern印跡分析可證實表達。為了證實來自動物或其它來源的細胞死亡抑制基因產物在植物中的表達，可使用本領域技術人員熟知的方法(例如，Western印跡)。例如，可按如下方法證實表達按Leammli等，自然227680-685，1970所述經SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(下文簡稱為“SDS-PAGE”)分離從轉基因植物提取的蛋白質樣品并轉移到合適的膜上。用抗感興趣蛋白質的抗體溫育膜，經免疫化學檢測感興趣的帶，以而證實感興趣的基因產物的表達。為了檢測人bcl-xL基因產物的表達，經SDS-PAGE分離從葉中提取的蛋白質樣品并轉移到膜上，用抗人bcl-xL蛋白質的多克隆抗體溫育膜，然后，例如，用堿性磷酸酶綴合的抗兔IgG抗體溫育膜。以作為底物的BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸)及NBT(氮藍四唑)的水解觀察反應，從而檢測基因產物的表達。轉基因植物的逆境抗性可根據對紫外輻射處理的抗性，對產生超氧化物的除草劑(例如，1，1-二甲基-4，4-聯(lián)吡啶二氯；以商標“百草枯”出售)處理的抗性和/或對鹽逆境的抗性來檢測。典型地是，可使用UV-B光進行UV輻射處理?？墒褂脰|芝UV-B燈(東芝FK-208E)進行UV-B輻射處理。準備2組各2個紫外燈，各紫外燈的水平距離為20cm。以UV-B燈輻射出的紫外光的波長主要是UV-B(290-320nm)，剩下的是UV-C(260-280nm)和UV-A(340-360nm)。低于290nm的波長可被二乙酸纖維素膜阻斷?？烧{節(jié)UV-B燈與植物頂端間的距離使UV-B輻射的量合適。對UV-B輻射補充強度為100μmol-2S-1的白光(每天輻射16小時)。因此總是在白光存在下進行UV-B光強度的測量。可用Spectroline數字輻射計(SpectronicCorporation，Westbury，NY)測量輻射強度且根據NIST標準品來校正。產生超氧化物的除草劑的例子包括百草枯(商標)。在連續(xù)光照條件下將葉片浸入除草劑溶液中進行除草劑處理。在UV-B處理的情況下，如果與非轉基因植物相比，轉基因植物中的指示表型受抑制則表明轉基因植物獲得了UV-B抗性。這類表型包括用UV輻射的葉片表面的光澤異常，用UV輻射的葉萎蔫和枯萎。另外，與非轉基因植物相比，如果UV-B輻射處理或除草劑處理后轉基因植物葉片的脫色受抑制則發(fā)現轉基因植物獲得了UV-B抗性或除草劑抗性。另外，為檢查UV-B輻射處理或除草劑處理的影響，可測量葉綠素含量。具體地說，在預定期間的上述處理后，使用N，N-二甲基甲酰胺立即從葉中提取葉綠素，然后經分光光度計測量提取物。測量轉基因植物和非轉基因植物的葉綠素含量，如果轉基因植物葉綠素含量高于非轉基因植物，則表明轉基因植物獲得了抗性。本文所述的高鹽濃度指對照植物的生長受抑制的鹽濃度。術語“鹽逆境”指植物在這種高鹽濃度的環(huán)境中生長的情況。高鹽濃度的范圍是本領域技術人員所熟知的。例如，對0.1M或0.2MNaCl濃度的溶液的抗性可以是鹽逆境抗性的指標?？砂慈缦路椒z測對鹽逆境的抗性。轉基因植物和對照植物暴露于高鹽濃度環(huán)境中，例如，將植物浸入鹽水并使其吸收鹽水。生長到30到40cm高度的幼苗或植物可用作植物樣品。比較轉基因植物和對照植物間重量的改變及形態(tài)的改變(例如，褐色或黃化的程度，離層形成的程度)。如果與對照植物相比接觸鹽環(huán)境后轉基因植物的重量改變(典型地是重量減少)及可觀察到的形態(tài)改變受抑制，則表明轉基因植物獲得了對鹽逆境的抗性。本領域技術人員可預料到，可選擇在不同于上述條件但在與其相當的條件下檢測轉基因植物的逆境抗性。根據本發(fā)明，術語“逆境抗性植物”指被賦予了至少一種對紫外輻射處理的抗性；對產生超氧化物的除草劑處理的抗性；和對鹽逆境處理的抗性的轉基因植物。下面將以說明性的實施例的方式描述本發(fā)明。用于下列實施例的限制性酶，質粒等可從商業(yè)來源獲得。實施例1植物表達載體的制備圖1所示的雙向載體pBE2113用作植物表達載體的起始材料。如在日本公開公報號7-250685中所述，使用含藥物抗性基因區(qū)(Pnos，NPTII和Tnos)且其中導入了E12Ω啟動子區(qū)序列的雙向載體pBI121(由Clontech生產)作為起始材料生產植物表達載體。實施例2來自動物的細胞死亡抑制基因的分離及植物表達載體的構建使用TRIsol(生命技術公司)從C.elegans分離總RNA，從mRNA合成第一鏈cDNA。然后，使用5′-TTGAATTCGAGATGACACGCTGCACGGCGG-3′(SEQIDNO1)作引物經RT-PCR合成ced-9全長cDNA。然后，使用Pfu聚合酶(由Stratagene生產)，同時使用SEQIDNO1作5′引物且5′-GGGAATTCGTTACTTCAAGCTGAACATCAT-3′(SEQIDNO2)作3′引物進行PCR。在94攝氏度變性DNA1.5分鐘，在55攝氏度退火2.5分鐘并在72攝氏度進行延伸反應2分鐘，重復該循環(huán)25次。將PCR產物克隆進pBluescript的EcoRI位點，從而獲得質粒pM61。另一方面，使用5′-ATGTCTCAGAGCAACCGGGAGCTGGTGGTT-3′(SEQID.NO6)作5′引物，5′-TCATTTCCGACTGAAGAGTGAGCCCAGCAG-3′(SEQIDNO7)作3′引物經PCR從人cDNA文庫(由Clontech生產)分離人bcl-xL基因，PCR的條件與上面所述相同。將分離的全長人bcl-xLcDNA克隆進pBluescript的EcoRI位點，從而獲得質粒pM21。使用合成接頭將pM21的SalI位點或pM61的HindIII位點改變成BgllII。所得的質粒分別命名為pM21-Bgl和pM61-Bgl。分離pM21-Bgl的BglII-SacI片段或pM61-Bgl的BglII-SacI片段并克隆進pBE2113的E12Ω下游。具有人bcl-xL基因的載體命名為pM65，具有C.elegansced-9基因的載體命名為pM66。表達載體pM65和pM66在圖2中以示意圖表示。實施例3將表達載體導入煙草植物根癌土壤桿菌的轉化在含250μg/ml鏈霉素和50μg/ml利福平的培養(yǎng)基中于28攝氏度培養(yǎng)根癌土壤桿菌。制備細胞懸浮培養(yǎng)物，根據Navel等，微生物學通訊，67，325，1990，所述的方法經電穿孔將表達載體(pM65或pM66)導入上述細菌中。在一個例子中，使用含連接到CaMV-35S啟動子上的GUS(葡糖醛酸酶)基因的質粒(pBI12135S-GUS)，且在另一個例子中，使用含與CaMV35S啟動子融合的POX(來自水稻的超氧化物酶)基因(Ito等，植物細胞報道，13361-366，1994)的質粒(35S-POX)以相同的方式進行轉化以比較轉化效力。煙草的轉化獲得根據上述方法用質粒pM65或pM66轉化的土壤桿菌并在YEB培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)(DNA克隆，Vol.2.p.78)。然后用無菌水將培養(yǎng)基稀釋20倍，隨后與煙草(Nicotianatabacumcv.SamsunNN)葉圓片共同培養(yǎng)。幾天后，將細菌移至含抗生素的培養(yǎng)基中。每隔兩周將葉圓片在選擇培養(yǎng)基上進行傳代培養(yǎng)。以常規(guī)方法選擇并再生轉基因煙草細胞。結果，獲得了20個獨立的導入了人bcl-xL基因(pM65)的卡那霉素抗性轉化子，以及29個獨立的導入了C.eleganceced9基因(pM66)的卡那霉素抗性轉化子。而且，在質粒35S-GUS的例子中獲得了20個獨立的卡那霉素抗性轉化子，在質粒35S-POX的例子中獲得了47個獨立的卡那霉素抗性轉化子。結果在表1中顯示。表1獨立的卡那霉素抗獨立的具有感興趣的百分率(％)性轉化子的數目基因的轉化子的數目M65轉化子(E12Ω-bcl-xL)2020100M66轉化子(E12Ω-ced-9)292897對照轉化子(35S-GUS)201470對照轉化子(35S-POX)473473導入的基因在括號中顯示導入了細胞死亡抑制基因的轉化子具有極高百分率(97％或更高)的感興趣的基因(bcl-xL或ced-9)。從以下描述的PCR也證實了這些結果。另一方面，未導入細胞死亡抑制基因的轉化子僅大約70％具有感光趣的基因(GUS或POX)。這些事實表明，導入了細胞死亡抑制基因的細胞在存活中具有優(yōu)勢。實施例4以PCR方法證實轉化用?，F方法從導入了C.eleganceced-9基因(pM66)的轉基因煙草提取總RNA并合成cDNA然后，使用5′-CCTCTTCGTTTACACATCGC-3′CSEQIDNDNO3)作5′引物，以針對胭脂氨酸合酶終止子的序列5′-AGACCGGCAACAGGATTCAA-3′(SEQIDNO5)作3′引物進行RT-PCR，PCR條件與實施例2相同。將所得的PCR產物在瓊脂糖凝膠上進行電泳以確定是否擴增了與對照具有相同遷移率的DNA片段。結果在圖3中顯示，證實了在轉化子中存在導入的基因。實施例5在轉基因植物中檢測細胞死亡抑制基因產物的表達以Western印跡證實人bcl-xL基因產物的表達。從導入了人bcl-xL基因(pM65)的轉基因煙草SamsunNN和野生型SamsunNN中各獲得的直徑大約為7mm的4個葉圓片在20μl125mMTris-HCl，pH6.8(含0.1％SDS，20％甘油，28mM2-巰基乙醇，10μg/ml溴酚蘭)中研磨，以16,000rpm離心10分鐘，并煮沸5分鐘，收集由此獲得的上清作為蛋白質部分。對蛋白質部分進行12.5％SDS-PAGE，并轉移到Immobilion-P膜(由Milipore生產)上。此后，用抗人bcl-xL蛋白質的兔多克隆抗體(由MBL生產)溫育膜，洗滌膜并與堿性磷酸酶綴合后抗兔IgG抗體(1∶1000稀釋，由KPL實驗室生產)溫育。以作為底物的BCIP及NBT的水解觀察感興趣的帶。結果在圖4中顯示，證實了在轉基因植物中表達人Bcl-xL蛋白質。實施例6以Northerb印跡檢測轉基因植物中的RNA以Northern印跡證實了ced-9基因在轉基因植物中的表達。按照常規(guī)方法，將從再生的煙草葉中提取的總RNA在瓊脂糖甲醛凝膠上進行電泳并印跡到Hybond-N膜(由Amersham生產)上。使用相應于導入基因，例如，ced-9或bcl-xL的cDNA的DNA作探針檢測感興趣的mRNA。結果在圖5中顯示，證實了導入的基因在轉基因植物中的表達。實施例7在轉基因植物中獲得紫外抗性根據實施例6所述的方法，在證實表達細胞死亡抑制基因的轉基因煙草植物中選擇出導入了人bcl-xL基因的M65-21植物及導入了C.elegansced-9基因的M66-30植物。檢查這些植物的UV抗性。使用東芝UV-B燈在上述條件下進行UV輻射處理。首先，用通過濾片光片的UV-B及無濾光片的UV-B輻射野生型煙草植物，發(fā)現直接用UV光(260-360nm)輻射的煙草比經濾光片輻射的煙草具有對UV光更高的敏感性。因此，認為UV-C增強了UV-B的有害影響。將每種M65-21(bcl-xL)，M66-30(ced-9)和野生型煙草植物的第二代自花傳粉植物的4周齡葉，12周齡葉圓片和小植株分別用無濾光片的UV-B輻射。轉基因煙草和野生型煙草(對照)植物與UV-B(25kJ/m2)接觸10天，在處理后4和5天時觀察不到可見的變化。在處理后第7或8天時野生型萎蔫，最終枯萎。轉基因M65-21(bcl-xL)和M66-30(ced-9)植物不顯示出變化或有輕微的形態(tài)學上的破壞。結果在圖6中顯示，圖6A是顯示用UV-B輻射處理10天的4周齡葉和12周齡葉的葉圓片的照片，圖6B是顯示用UV-B光輻射10天的小植株的照片。這些結果表明轉基因植物獲得了對UV-B光的抗性，從而可推斷在天然環(huán)境中表現出對UV輻射的抗性。實施例8在轉基因植物中對葉綠素降解的抑制效應按與實施例7中相同的方式，經過使用無濾光片的UV-B，使M65-21(bcl-xL)植物，M66-30(ced-9)植物和野生型煙草植物的12周齡葉的葉圓片暴露于UV-B燈(32kJ/m2)下10天，UV-B輻射處理后，使用N，N-二甲基甲酰胺從處理的葉圓片中提取葉綠素，并根據Borra等，BiochemicaetBiophysicaActa，975384-394，1989的方法進行測量。具體地說，使用公式13.43×(在663.8nm波長處的吸收值)-3.47×(在646.8nm波長處的吸收值)測量葉綠素a，用公式22.9×(在646.8nm波長處的吸收值)-5.38×(在663.8nm波長處的吸收值)測量葉綠素b，從而獲得葉綠素含量a+b。另外，在126kJ/m2UV-B輻射的條件下也進行了處理。在這一情況下，由于葉片在第3天開始黃化，所以處理只進行了2天。結果在圖7中顯示。在所有處理中，轉基因M65-21(bcl-xL)和M66-30(ced-9)植物的葉綠素保持不降解。實施例9在轉基因植物中對百草枯(商標)的抗性百草枯是在葉綠體中產生超氧化物和自由基的除草劑。由于轉基因M65-21(bcl-xL)和M66-30(ced-9)植物表現出對葉綠素降解的抗性，因此認為它們也具有對百草枯的抗性。在連續(xù)光照條件下將煙草葉圓片浸入0到100μM的百草枯溶液中，按實施例8相同的方式，提取葉綠素并測量葉綠素的濃度。結果在圖8中顯示，轉基因M65-21(bcl-xL)和M66-30(ced-9)煙草植物均表現出對百草枯的抗性。實施例10在轉基因植物中獲得鹽抗性在證實表達細胞死亡抑制基因的轉基因植物中選擇導入了人bcl-xL基因的M65-21植物和導入了C.elegansced-9基因的M66-30植物來評價鹽抗性。(A)M65-21的第二代自花傳粉植物的種子(下文稱為“M65-21-2”)，M66-30的第二代自花傳粉植物的種子(下文稱為“M66-30-3”)和作為對照的35S-GUS的種子分別種植在含50μg/ml卡那霉素的瓊脂培養(yǎng)基上，2個月后，從瓊脂培養(yǎng)基上小心取出幼苗并經洗滌除去根上的瓊脂。然后，將各幼苗放入含2.2ml水，0.1MNaCl溶液或0.20MNaCl溶液的2mlEppendorf管(其中蓋被切除)中，使其根浸入溶液中。將管放在試管架上并放入透明丙烯酸盒中。然后在光照射為3000lux(16小時/天)和溫度為25℃的條件下評價植物對鹽的抗性。另外，作為對照植物，將非轉基因煙草(野生型煙草)植物種植在不含卡那霉素的瓊脂培養(yǎng)基中。(1)在一段時間內測量各幼苗的重量，定量評價各植物對鹽的抗性。結果在圖9中顯示，圖中顯示的值為各植物5株幼苗的平均值。對于浸入水(即，OMNaCl)中的幼苗，移植1天后其重量減少。認為這是由于幼苗不得不在空氣中從密封的培養(yǎng)器中取出并放入試管培養(yǎng)基中。此后，浸入水中的幼苗重量逐漸增加。對于野生型煙草植物，用0.1MNaCl處理的幼苗重量明顯減少，用0.2MNaCl處理的幼苗重量減少更大。在另一方面，對于轉基因植物65-21-2(bcl-xL)植物和M66-30-3(ced-9)植物，用0.1MNaCl處理的幼苗基本上檢測不到重量的減少。即使用0.2MNaCl處理的幼苗，與野生型煙草植物相比其重量的減小也受到抑制。(2)對于在與上面完全相同的條件下處理的35S-GUS植物(對照)，獲得了與野生型煙草植物所獲得的相同的結果。處理后3天拍照(圖10)，在高濃度鹽的條件下35S-GUS植物完全被破壞，其中葉萎蔫且根的生長受到抑制。而與對照植物相比，轉基因煙草植物破壞較小。(3)用立體顯微鏡觀察經上述處理破壞的葉面積。圖11是顯示葉破壞的面積的百分數，該結果表示上述轉基因植物比對照植物獲得了對鹽更高的抗性，M65-21植物幾乎不受0.1MNaCl的影響。(4)新制備與上述實驗(1)至(3)中所用的相同類型的幼苗(即，在播種2個月后獲得的幼苗)。將這些幼苗移到不含卡那霉素的兩個瓊脂培養(yǎng)基中。移植3天后，向一個培養(yǎng)基中加入NaCl水溶液使培養(yǎng)基的最終NaCl濃度為0.2M(NaCl處理的培養(yǎng)基)，向另一培養(yǎng)基(對照培養(yǎng)基)中加入相同量的水。觀察植物在兩種培養(yǎng)基上的生長，移植20天后，在對照培養(yǎng)基中的35-GUS植物和轉基因植物順利生長且產生綠葉(圖12，右側)另一方面，在NaCl處理的培養(yǎng)基中植物的生長總體上受抑制(圖12，左側)。然而，在NaCl處理的培養(yǎng)基中，與對照35S-GUS植物相比轉基因煙草植物被鹽的破壞較小。所有對照植物的葉片均黃化且具有萎黃病的癥狀。另一方面，轉基因植物對20天的鹽處理具有抗性且它們的許多葉片保持綠色。(B)經過切下生長于蛭石中的30至40cm煙草植物的莖并浸入NaCl溶液中使其吸收的方法來進一步評價鹽抗性。另外，定量植物下位葉片的Na+和Cl-濃度以分析植物對鹽逆境的抗性機制。在植物體下方(根以上大約7cm)切下罐栽野生型煙草植物和轉基因M65-21-2及M66-30-3煙草植物的莖。將各植物放入含300ml0.2MNaCl溶液或300ml水(對照)的500ml錐形瓶中使切下的莖浸入溶液中，此后在25℃和3000lux(16小時/天)的條件下維持9天。9天后，野生型煙草植物出現黃化。野生型植物的下部葉被浸軟且因此很可能形成了導致落葉的離層。另一方面，轉基因M65-21-2和M66-30-3植物明顯地有更健康的外觀且不出現下位葉離層的形成(圖13)。收獲上述植物的下位葉，將包括葉柄的總葉片與蒸餾水一起研磨，在10,000xg下離心15分鐘。測量所得上清的離子導電性和Na+及Cl-含量。使用導電性檢測儀(ShimatsuCDD-6A)測量導電性。將100μl上清注射進檢測儀中。顯示的測量值μs/cm除以細胞常數(25)即得導電率S(西門子)。使用DIONEX離子色譜DX-100經CS12A柱定量Na+濃度，使用DIONEX離子色譜2000i經DIONEXAS4A柱定量Cl-濃度。離子導電率的分析結果在表2中顯示，所有吸收0.2MNaCl的植物下位葉片比吸收水而非NaCL的植物(對照)包含更高濃度的電解質。具體地說，兩個野生型煙草植物SNNa和SNNb的電解質含量比吸收水而非NaCl的對照植物SNN的電解質含量分別增加146％和113％。在轉基因煙草植下位葉片中包含的電解質含量比野生型SNN煙草明顯較少，且與原始植物相比最多增加37％到78％因此，認為轉基因煙草植物一旦吸收了NaCl就以某種機制從某些葉組織中排泄掉或吸收較少量的NaCl。另外，測量了Na+和Cl-的濃度。結果，在對照煙草SNN下位葉片中積累的Na+濃度的增加比吸收水的植物大6到8倍。另一方面，在轉基因煙草植物中，Na+濃度的增加極大地受到抑制。特別是在M66植物中，Na+濃度的增加比吸收水的植物僅大2到3倍(表2)對于Cl-濃度獲得了相似的結果(數據未顯示)。表2</tables>這些結果表明過量表達來自動物的細胞死亡抑制基因產物的這些植物經過防止Na+和Cl-的過多積累而表現出對鹽的抗性。(6)為了進一步分析鹽抗性機制，以差速離心分離M65-21植物葉的細胞器，并檢查Bcl-xL蛋白質的定位。以Western印跡分析獲得的結果在圖14中顯示。從這些結果發(fā)現在蛋白質水平上大多數Bcl-xL蛋白質位于線粒體組分中。在動物中，據認為這些細胞死亡抑制基因產物存在于線粒體膜上，從而防止線粒體的功能障礙以抑制細胞死亡。從本發(fā)明的上述實施例獲得的結果顯示，來自動物的細胞死亡抑制蛋白同樣在植物中發(fā)揮功能，且不僅可提供UV抗性及百草枯抗性，也提供鹽抗性，據認為對由逆境引起的胞內細胞器(例如，線粒體)的功能障礙的保護負責該機制。導入了細胞死亡抑制基因的植物表現出對UV輻射的抗性，對產生超氧化物的除草劑的抗性及對鹽逆境的抗性。根據本發(fā)明，提供了被賦予對各種逆境的抗性的植物，該植物在農業(yè)和植物育種中具有優(yōu)勢。而且，根據本發(fā)明，提供了提供被賦予對逆境抗性的植物的方法。在不偏離本發(fā)明的范圍和實質的前提下，各種其它的改進對本領域技術人員而言是顯而易見的且可由他們很容易地做出。因此，無意使本文所附權利要求書的范圍受本文所提供的說明的限制，而應在廣義上理解權利要求書。序列表(1)一般信息(i)申請人農林水產省農業(yè)生物資源研究所(ii)發(fā)明名稱導入了細胞死亡抑制基因的逆境抗性植物及其生產方法(iii)序列數7(iv)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人農林水產省農業(yè)生物資源研究所(B)街道2-1-2，Kannondai(C)城市Tsukuba-shi(D)州茨城縣(E)國家日本(F)郵編305-8602(v)計算機可讀形式(1)媒體類型3.50英寸軟盤，1.4MBformat(2)計算機EPSON(3)操作系統(tǒng)MS-DOS2.11版(4)軟件WordPerfect(ASCIIfile)(vii)在先申請數據(A)申請?zhí)?1)JP9-56743(2)JP10-8056(B)申請日(1)1997年3月11日(2)1998年1月12日(2)SEQIDNO.1信息(i)序列特征(A)長度30(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型其它核酸，引物(xi)序列描述SEQIDNO.1TTGAATTCGAGATGACACGCTGCACGGCGG(2)SEQIDNO.2信息(i)序列特征(A)長度30(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型其它核酸，引物(xi)序列描述SEQIDNO.2GGGAATTCGTTACTTCAAGCTGAACATCAT(2)SEQIDNO.3信息(i)序列特征(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型其它核酸，引物(xi)序列描述SEQIDNO.3CCTCTTCGTTTACACATCGC(2)SEQIDNO.4信息(i)序列特征(A)長度15(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型其它核酸，引物(xi)序列描述SEQIDNO.4ACAAGGAGATGCAGG(2)SEQIDNO.5信息(i)序列特征(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型其它核酸，引物(xi)序列描述SEQIDNO.5AGACCGGCAACAGGATTCAA(2)SEQIDNO.6信息(i)序列特征(A)長度30(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型其它核酸，引物(xi)序列描述SEQIDNO.6ATGTCTCAGAGCAACCGGGAGCTGGTGGTT(2)SEQIDNO.7信息(i)序列特征(A)長度30(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型其它核酸，引物(xi)序列描述SEQIDNO.7TCATTTCCGACTGAAGAGTGAGCCCAGCAG權利要求1.一種逆境抗性植物，其中導入了細胞死亡抑制基因。2.根據權利要求1的逆境抗性植物，其中細胞死亡抑制基因屬于Bcl-2家族，且編碼具有細胞死亡抑制活性的肽。3.根據權利要求2的逆境抗性植物，其中細胞死亡抑制基因是Caenorhabditiselegansced-9基因。4.根據權利要求2的逆境抗性植物，其中細胞死亡抑制基因是人bcl-xL基因。5.根據權利要求1的逆境抗性植物，其中逆境是由UV輻射引起的逆境。6.根據權利要求1的逆境抗性植物，其中逆境是由產生超氧化物的除草劑引起的氧化逆境。7.根據權利要求1的逆境抗性植物，其中逆境是由鹽引起的逆境。8.生產逆境抗性植物的方法，包含下列步驟將細胞死亡抑制基因導入植物細胞；和將導入了細胞死亡抑制基因的植物細胞再生成植物體。9.根據權利要求8的方法，其中細胞死亡抑制基因是摻入進植物表達載體。全文摘要本發(fā)明提供了導入有細胞死亡抑制基因的逆境抗性植物。文檔編號A01H1/00GK1195026SQ9810049公開日1998年10月7日申請日期1998年3月11日優(yōu)先權日1997年3月11日發(fā)明者大橋祐子,光原一朗,卡莫爾·A·馬里克申請人:農林水產省農業(yè)生物資源研究所長