人胃癌二甲雙胍耐藥細(xì)胞株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是人胃癌二甲雙胍耐藥細(xì)胞株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 胃癌（Gastric cancer)是我國的常見腫瘤。據(jù)2012年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，胃癌 新發(fā)病例70 %位于發(fā)展中國家，主要位于我國。其發(fā)病率和死亡率居所有惡性腫瘤第三位。 我國胃癌發(fā)病具有明顯的地域性，西北與東部沿海地區(qū)的發(fā)病率明顯高于南方地區(qū)。胃癌 好發(fā)于50歲以上，男女發(fā)病率之比為2:1。胃癌的預(yù)后與病理分期、組織類型、分化程度、 ?!分期及治療方式密切相關(guān)。近年來胃癌手術(shù)、化療、放療手段的不斷完善，但患者的5 年生存率仍未見明顯提高，多數(shù)患者最終死于腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及其相關(guān)的并發(fā)癥。內(nèi)科治療 作為重要的輔助治療手段，對于延長患者生存、改善患者生活質(zhì)量，起到了重要而積極的作 用。隨著對胃癌生物學(xué)行為的了解，內(nèi)科治療手段也得以不斷豐富和完善。如分子靶向治 療藥物赫賽汀與化療藥物聯(lián)合，提高了晚期進(jìn)展期胃癌患者的生存等等。近年來多項(xiàng)回顧 性臨床研宄表明，抗糖尿病藥二甲雙胍可降低惡性腫瘤（包括胃癌）的發(fā)病率和死亡率，同 時(shí)與化療藥物聯(lián)合可以提高乳腺癌患者新輔助化療的病理完全緩解率，這些研宄為二甲雙 胍在腫瘤中的運(yùn)用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。同時(shí)，關(guān)于其抗腫瘤作用的機(jī)制研宄也不斷深 入。而對于二甲雙胍耐藥機(jī)制研宄，目前少見有文獻(xiàn)報(bào)道。二甲雙胍耐藥人胃癌細(xì)胞株的 建立，可成為研宄胃癌的耐藥機(jī)制、耐藥性逆轉(zhuǎn)、開發(fā)和評價(jià)新的抗癌方法等的重要工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 基于此，有必要提供一種人胃癌二甲雙胍耐藥細(xì)胞株及其應(yīng)用。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0005] 一種人胃癌二甲雙胍耐藥細(xì)胞株BGC823/二甲雙胍，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏 中心，地址：中國，武漢，武漢大學(xué)，保藏編號：CCTCC C2014163,保藏日期為2014年12月26 號。
[0006] 本發(fā)明的細(xì)胞株采用反復(fù)大劑量沖擊聯(lián)合逐步遞增藥物濃度法來建立源于親代 細(xì)胞BGC823的人胃癌二甲雙胍耐藥細(xì)胞株。該方法包括以下步驟：
[0007] (1)細(xì)胞株人胃癌BGC823細(xì)胞系由中科院細(xì)胞室提供，該細(xì)胞加入含10%小牛 血清的DMEM培養(yǎng)液中，置37 °C、5 % CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0. 25 %的胰蛋白消化傳 代；
[0008] (2)取對數(shù)期生長期860823細(xì)胞或當(dāng)860823細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)， 換新鮮DMEM培養(yǎng)液，加入二甲雙胍，形成含二甲雙胍的DMEM培養(yǎng)液，其中二甲雙胍濃度為 25mmol/L，置37°C、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24小時(shí)后棄去含二甲雙胍的 DMEM培養(yǎng)液，并用PBS液清洗2遍，加入新鮮DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，使剩余細(xì)胞恢復(fù)到對數(shù) 生長期或細(xì)胞密度達(dá)到80 %并傳代；
[0009] (3)重復(fù)步驟（2) 3至5次，其中使用含二甲雙胍的DMEM培養(yǎng)液時(shí)，二甲雙胍的濃 度為25mmol/L ;若3至5次重復(fù)培養(yǎng)仍無法達(dá)到穩(wěn)定生長、傳代，可增加重復(fù)培養(yǎng)的次數(shù)， 直到人胃癌BGC823細(xì)胞能在此濃度（二甲雙胍濃度25mmol/L)的含二甲雙胍的DMEM培養(yǎng) 液穩(wěn)定生長、傳代；
[0010] (4)取上一步獲得的對數(shù)期生長期細(xì)胞或當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，換 新鮮DMEM培養(yǎng)液，加入二甲雙胍，形成含二甲雙胍的DMEM培養(yǎng)液，其中二甲雙胍濃度為 5 0 mmo I / L，置3 7 °C、5 % C O2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，2 4小時(shí)后棄去含二甲雙胍的 DMEM培養(yǎng)液，并用PBS液清洗2遍，加入新鮮DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，使剩余細(xì)胞恢復(fù)到對數(shù) 生長期或細(xì)胞密度達(dá)到80 %并傳代；
[0011] (5)重復(fù)步驟（4)3至5次，其中使用含二甲雙胍的DMEM培養(yǎng)液時(shí)，二甲雙胍的濃 度為50mmol/L ;若3至5次重復(fù)培養(yǎng)仍無法達(dá)到穩(wěn)定生長、傳代，可增加重復(fù)培養(yǎng)的次數(shù)， 直到人胃癌BGC823細(xì)胞能在此濃度（二甲雙胍濃度50mmol/L)的含二甲雙胍的DMEM培養(yǎng) 液穩(wěn)定生長、傳代；
[0012] (6)取上一步獲得的對數(shù)期生長期細(xì)胞或當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)， 換新鮮DMEM培養(yǎng)液，加入二甲雙胍，形成含二甲雙胍的DMEM培養(yǎng)液，其中二甲雙胍濃度為 75mmol/L，置37°C、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24小時(shí)后棄去含二甲雙胍的 DMEM培養(yǎng)液，并用PBS液清洗2遍，加入新鮮DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，使剩余細(xì)胞恢復(fù)到對數(shù) 生長期或細(xì)胞密度達(dá)到80 %并傳代；
[0013] (7)重復(fù)步驟（6) 3至5次，其中使用含二甲雙胍的DMEM培養(yǎng)液時(shí)，二甲雙胍的濃 度為75mmol/L ;若3至5次重復(fù)培養(yǎng)仍無法達(dá)到穩(wěn)定生長、傳代，可增加重復(fù)培養(yǎng)的次數(shù)， 直到人胃癌BGC823細(xì)胞能在此濃度（二甲雙胍濃度75mmol/L)的含二甲雙胍的DMEM培養(yǎng) 液穩(wěn)定生長、傳代；
[0014] (8)取上一步獲得的對數(shù)期生長期細(xì)胞或當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，換 新鮮DMEM培養(yǎng)液，加入二甲雙胍，形成含二甲雙胍的DMEM培養(yǎng)液，其中二甲雙胍濃度為 100mm 〇l/L，置37°C、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24小時(shí)后棄去含二甲雙胍的 DMEM培養(yǎng)液，并用PBS液清洗2遍，加入新鮮DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，使剩余細(xì)胞恢復(fù)到對數(shù) 生長期或細(xì)胞密度達(dá)到80 %并傳代；
[0015] (9)重復(fù)步驟（8) 3至5次，其中使用含二甲雙胍的DMEM培養(yǎng)液時(shí)，二甲雙胍的濃 度為lOOmmol/L ;若3至5次重復(fù)培養(yǎng)仍無法達(dá)到穩(wěn)定生長、傳代，可增加重復(fù)培養(yǎng)的次數(shù)， 直到人胃癌BGC823細(xì)胞能在此濃度（二甲雙胍濃度lOOmmol/L)的含二甲雙胍的DMEM培 養(yǎng)液穩(wěn)定生長、傳代；
[0016] (10)取上一步獲得的對數(shù)期生長期細(xì)胞或當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)， 換新鮮DMEM培養(yǎng)液，加入二甲雙胍，形成含二甲雙胍的DMEM培養(yǎng)液，其中二甲雙胍濃度為 125mmol/L，置37°C、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24小時(shí)后棄去含二甲雙胍的 DMEM培養(yǎng)液，并用PBS液清洗2遍，加入新鮮DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，使剩余細(xì)胞恢復(fù)到對數(shù) 生長期或細(xì)胞密度達(dá)到80 %并傳代；
[0017] (11)重復(fù)步驟（10)3至5次，其中使用含二甲雙胍的DMEM培養(yǎng)液時(shí)，二甲雙胍的 濃度為125mmol/L ;若3至5次重復(fù)培養(yǎng)仍無法達(dá)到穩(wěn)定生長、傳代，可增加重復(fù)培養(yǎng)的次 數(shù)，直到人胃癌BGC823細(xì)胞能在此濃度（二甲雙胍濃度125mmol/L)的含二甲雙胍的DMEM 培養(yǎng)液穩(wěn)定生長、傳代；
[0018] (12)取上一步獲得的細(xì)胞在新鮮DMEM培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長、傳代培養(yǎng)1個(gè)月后， 取對數(shù)期生長期細(xì)胞或當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到80 %時(shí)，接入含二甲雙胍的DMEM培養(yǎng) 液，其中二甲雙胍濃度為50mmol/L，直到人胃癌BGC823細(xì)胞能在此濃度（二甲雙胍濃度 50mmol/L)的含二甲雙胍的DMEM培養(yǎng)液穩(wěn)定生長、傳代；即獲得人胃癌二甲雙胍耐藥細(xì)胞 株。
[0019] 對本方法建立的人胃癌二甲雙胍耐藥細(xì)胞株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及生物學(xué)特性鑒定， 結(jié)果顯示人胃癌二甲雙胍耐藥細(xì)胞株細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞體積變大，生長速度減慢，S 期細(xì)胞明顯增多，耐藥指數(shù)為5. 13。
[0020] 所述的人胃癌二甲雙胍耐藥細(xì)胞株可以用于在構(gòu)建體內(nèi)外腫瘤耐藥模型，進(jìn)一步 的可以用于構(gòu)建人胃癌二甲雙胍耐藥機(jī)制的探討及其相關(guān)信號通路的研宄的細(xì)胞模型，進(jìn) 一步的可以用于篩選新的抗腫瘤藥物。
[0021] 本發(fā)明可以用于研宄人胃癌二甲雙胍耐藥細(xì)胞形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特點(diǎn)、研宄腫瘤耐 藥機(jī)制、分析抗腫瘤藥物敏感性及篩選和評估抗腫瘤藥物、開發(fā)腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)藥物、研宄更 有效的腫瘤治療方法等，具有較高的科研和生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值，預(yù)期能產(chǎn)生良好的科研、經(jīng)濟(jì)和 社會效益。
【附圖說明】
[0022] 圖1為人胃癌BGC823活細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下拍攝的照片；
[0023] 圖2為人胃癌二甲雙胍耐藥活細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下拍攝的照片；
[0024] 圖3為人胃癌BGC823細(xì)胞周期分析圖；
[0025] 圖4為人胃癌二甲雙胍耐藥細(xì)胞株細(xì)胞周期分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式 詳予說明。
[0027] 本發(fā)明中涉及的現(xiàn)有試驗(yàn)方法、測試方法及溶液配制方法可以參考《細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指 南》，標(biāo)準(zhǔn)書號：7-03-007598-6/Q. 891原著：[美]D. L.斯佩克特R. D.戈德曼&L.A.萊因萬 德。
[0028] 所述的DMEM培養(yǎng)液優(yōu)選的為高糖型，按照慣常的配置方法配置，或者通過購買市 售商品獲得。
[0029] 實(shí)施例1 :人胃癌二甲雙胍耐藥細(xì)胞株的建立
[0030] 步驟如下：（1)細(xì)胞株人胃癌BGC823細(xì)胞系由中科院細(xì)胞室提供，該細(xì)胞加入含 10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置37°C、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0. 25%的胰蛋 白消化傳代；
[0031] (2)取對數(shù)期生長期860823細(xì)胞或當(dāng)860823細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)， 換新鮮DMEM培養(yǎng)液，加入二甲雙胍，形成含二甲雙胍的DMEM培養(yǎng)液，其中二甲雙胍濃度為 25mmol/L，置37°C、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24小時(shí)后棄去含二甲雙胍的 DMEM培養(yǎng)液，并用PBS液清洗2遍，加入新鮮DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，使剩余細(xì)胞恢復(fù)到對數(shù) 生長期或細(xì)胞密度達(dá)到80 %并傳代；
[0032] (3)重復(fù)步驟（2) 3至5次，其中使用含二甲雙胍的DMEM培養(yǎng)液時(shí)，二甲雙胍的濃 度為25mmol/L ;若3至5次重復(fù)培養(yǎng)仍無法達(dá)到穩(wěn)定生長、傳代，可增加重復(fù)培養(yǎng)的次數(shù)， 直到人胃癌BGC823細(xì)胞能在此濃度（二甲雙胍濃度25mmol/L)的含二甲雙胍的DMEM培養(yǎng) 液穩(wěn)定生長、傳代；
[0033] (4)取上一步獲得的對數(shù)期生長期細(xì)胞或當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，換 新鮮DMEM培養(yǎng)液，加入二甲雙胍，形成含二甲雙胍的DMEM培養(yǎng)液，其中二甲雙胍濃度為 5 0 mmo I / L，置3 7 °C、5 % C O2、飽和濕