專利名稱：一種具有抑制腫瘤細胞多藥耐藥的高活性抗癌新藥甲酰阿地咪的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種具有抗腫瘤活性的化合物甲酰阿地咪4(5-N-formalardeemin)， 能作為腫瘤細胞生長抑制劑和化療增敏劑(多藥耐藥逆轉劑)，單用或與其他抗腫瘤藥物 聯(lián)合使用于治療惡性腫瘤。所述的其他抗腫瘤藥物包括影響腫瘤細胞核酸生物合成的藥 物；直接破壞腫瘤細胞DNA阻止其復制的藥物；嵌入腫瘤細胞DNA中干擾轉錄過程的藥物； 干擾有絲分裂影響腫瘤細胞蛋白質(zhì)合成的藥物，通過抑制環(huán)氧化酶產(chǎn)生抗腫瘤作用的藥
物，以及針對EGFR相關Tyrosine激酶，熱休克蛋白Hsp90，蛋白酶體Proteasome的抑制劑等。 —、實驗材料吲哚生物堿甲酰阿地咪4和乙酰阿地咪2按文獻方法(Qin， Y. et al. J. Org. Chem. 2009， 74， 298，圖1)通過20步全合成獲得。
二、甲酰阿地咪4的抗腫瘤活性研究(圖2)。 1.甲酰阿地咪4可顯著抑制腫瘤細胞增殖，且其作用呈現(xiàn)劑量依賴關系(見實施 例1禾P 2); 2.甲酰阿地咪4與其他抗腫瘤藥物合用，顯著增強腫瘤細胞對藥物的敏感性(見 實施例3); 3.甲酰阿地咪4可有效逆轉多藥耐藥腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的耐藥性，其作用呈 現(xiàn)劑量依賴關系，并且其活性顯著高于乙酰阿地咪2 (見實施例4， 5和6);


圖1是本發(fā)明路線中阿地咪1、乙酰阿地咪2和甲酰阿地咪4的合成方法。
圖2是甲酰阿地咪4逆轉多藥耐藥人乳腺癌細胞株(MCF-7/Adr)對阿霉素(Adr) 和長春新堿(VCR)的耐藥性照片。 圖3是用不同濃度的甲酰阿地咪4處理人乳腺癌MCF-7細胞后，通過MTT比色法 檢測腫瘤細胞存活率。 圖4是用不同濃度的甲酰阿地咪4處理人宮頸癌Siha細胞后，通過MTT比色法檢 測腫瘤細胞存活率。 圖5是用阿霉素(0. 4ii g/ml)和不同濃度的甲酰阿地咪4處理人宮頸癌Siha細 后，通過乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗檢測腫瘤細胞死亡率。 圖6是用阿霉素和甲酰阿地咪4或乙酰阿地咪2處理人乳腺癌多藥耐藥細胞株 MCF-7/Adr后，通過MTT比色法檢測腫瘤細胞存活率。 圖7是用阿霉素和甲酰阿地咪4或乙酰阿地咪2處理人乳腺癌多藥耐藥細胞株MCF-7/Adr后，通過乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗檢測腫瘤細胞死亡率。 圖8是用阿霉素和不同濃度的甲酰阿地咪4處理人乳腺癌多藥耐藥細胞株MCF-7/ Adr后，MTT比色法檢測腫瘤細胞存活率。 圖9是用長春新堿和甲酰阿地咪4或乙酰阿地咪2處理人乳腺癌多藥耐藥細胞株 MCF-7/Adr后，通過MTT比色法檢測腫瘤細胞存活率。 圖10是用長春新堿和甲酰阿地咪4或乙酰阿地咪2處理人乳腺癌多藥耐藥細胞 株MCF-7/Adr后，通過乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗檢測腫瘤細胞死亡率。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明，但本發(fā)明請求保護的范圍不局限于本具體實施方式
的說明。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件， 或按照廠商所建議的條件進行。吲哚生物堿乙酰阿地咪2((-)-acetylardeemin)和甲酰阿 地咪4((-)-formalardeemin)按文獻方法(Qin， Y. et al. J. Org. Chem. 2009， 74， 298)合成 制備。 乙酰阿地咪2((-)-N-Acetylardeemin) :[a ]D20 = -49 ° (c 0. 1， CHC13) ,H NMR (400MHz, CDC13) S 1. 02 (s， 3H) ， 1. 21 (s， 3H) ， 1. 42 (d， J = 7. 6Hz， 3H) ， 2. 67 (s br，3H)， 2. 69-2. 68 (m， 1H) ， 3. 02 (dd， J = 12. 8， 5. 7Hz， 1H) ， 4. 45—4. 43 (m， 1H) ， 5. 16—5. 12 (m， 2H)， 5.37(q， J = 7.6Hz，lH)，5.81(dd， J = 16. 8， 10. 8Hz， 1H) ， 6. 08 (s br， 1H) ， 7. 24—7. 22 (m， 1H) ， 7. 45-7. 42 (m， 2H) ， 7. 55-7. 52 (m， 1H) ， 7. 73 (d， J = 8. 8， 1H) ， 7. 80-7. 78 (m， 1H) ， 8. 08 (s br， 1H) ，8. 29 (d， J = 8. 0， 1H) 甲酰阿地咪4((-)-N-Formalardeemin) :[a ]D20 = -52 ° (c 0. 1， CHC13) ,H 畫R(400MHz， CDC13) S 1. 02(s，3H) ， 1. 18(s，3H) ， 1. 50(d， J = 6. 8Hz， 3H) ， 2. 73 (t， J = 12. 0Hz，lH)，3. 03(dd， J= 13. 2， 6. 0Hz，lH)，4. 57—4. 53 (m， 1H) ， 5. 17—5. ll(m，2H)，5. 46 (q， J = 7. 2Hz， 1H) ，5. 89(dd， J = 17. 2， 10. 8Hz， 1H) ，6. 14 (s， 1H) ， 7. 20 (t， J = 7. 2Hz， 1H)，
7. 37 (t， J = 8. OHz， 1H) ， 7. 42 (d， J = 8. OHz， 1H) ， 7. 51 (t， J = 7. 6Hz， 1H) ， 7. 66 (d， J =
8. 4Hz， 1H) ，7. 78(t， J = 7. 6Hz， 1H) ， 8. 09 (d， J = 8. OHz， 1H) ， 8. 28 (d， J = 7. 6Hz，lH)，
9. lO(s， 1H) ;13C畫R(lOOMHz， CDC13) S 17. 5，22. 3，23. 0，38. 7，41. 1，53. 2，58. 1，60. 6， 77. 3， 115. 5， 117. 3， 120. 5， 124. 9， 125. 0， 127. 0， 127. 2， 127. 4， 129. 6， 132. 3， 134. 8， 141. 1， 142. 4， 147. 0， 150. 1， 159. 8， 161. 8， 166. 2 ;匪S-ESI calcd forC27H26N403Na (M+Na) + 477. 1897， found 477. 1893 ;IR(KBr) 3310， 2895， 1715， 1643， 1410， 1367,755cm—1. 實施例1甲酰阿地咪4對人乳腺癌MCF-7細胞的增殖抑制作用
實驗方法 人乳腺癌MCF-7細胞用含10%胎牛血清的PRMI1640 (Hyclone)培養(yǎng)液培養(yǎng)，置 37°C、5% C02培養(yǎng)箱中。腫瘤細胞0. 7X 104/孔接種于96孔板上，培養(yǎng)24h后，分別加入 終濃度為10 ii M、20 ii M、40 ii M、80 y M、 160 y M的甲酰阿地咪4，對照組加DMSO，另設調(diào)零組 (只加培養(yǎng)液)，每個組設三個復孔。將96孔板置37°C 、5% C02培養(yǎng)箱再培養(yǎng)72h后，采用 MTT比色法檢測腫瘤細胞存活率，即每孔加入5mg/ml MTT(美國Sigma公司)試劑10 yl， 繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸除上清液，用PBS液洗后，每孔加入二甲基亞砜(DMSO) lOOiU，放于震蕩器 上震蕩15min后，用酶標儀(570nm波長)測每孔的OD值。用下列公式計算細胞存活率細<formula>formula see original document page 6</formula>結果以均數(shù)±標準差 表示。
結果 如圖3所示，甲酰阿地咪4劑量依賴性地抑制體外培養(yǎng)的人乳腺癌MCF-7細胞的 生長。 實施例2甲酰阿地咪4對人宮頸癌Siha細胞的增殖抑制作用
實驗方法 人宮頸癌Siha細胞用含10X胎牛血清的PRMI1640(Hyclone)培養(yǎng)液培養(yǎng)，置 37°C 、5% C02培養(yǎng)箱中。腫瘤細胞0. 7X 104/孔接種于96孔板上，培養(yǎng)24h后，按實施例1 加入不同濃度的甲酰阿地咪4，繼續(xù)培養(yǎng)72小時后，按照實施例1中的方法檢測腫瘤細胞存 活率。
結果 如圖4所示，甲酰阿地咪4劑量依賴性地抑制體外培養(yǎng)的人宮頸癌Siha細胞的生 長。 實施例3甲酰阿地咪4顯著增加人宮頸癌Siha細胞對阿霉素的敏感性
實驗方法 人宮頸癌Siha細胞培養(yǎng)條件同實施例2。腫瘤細胞0. 7X 104/孔接種于96孔板 上，培養(yǎng)24h后，分別單獨加入阿霉素(0. 4 g/ml，意法瑪西亞)，或不同濃度的甲酰阿地咪 4 (20 ii M， 40 ii M， 80 y M， 160 y M)，或者同時加入阿霉素和不同濃度的甲酰阿地咪4，對照組 加匿SO，另設調(diào)零組(只加培養(yǎng)液)，每個組設三個復孔。將96孔板置37t:、5XC02培養(yǎng) 箱再培養(yǎng)72h后，通過乳酸脫 氫酶(LDH)釋放實驗，采用乳酸脫氫酶檢測試劑盒(Cyto Tox 96' Non-RadioactiveCytotoxicity Assay,Promega，貨號G1780)，檢測細胞死亡率。具體方法 簡述如下收集每孔的培養(yǎng)上清到一個新的96孔板，加入等體積的底物反應液，室溫孵育 30分鐘后，加入終止液終止反應，用酶標儀(490nm波長)測每孔的0D值，同時加入細胞裂 解液裂解細胞，收集上清，檢測細胞最大釋放值。根據(jù)檢測的0D490值，按照下列公式計算 細胞死亡率細胞死亡率二培養(yǎng)上清LDH釋放(0D490)/LDH最大釋放(0D490)。結果以均 數(shù)±標準差表示。
結果 用阿霉素(0.4iig/ml)和不同濃度的甲酰阿地咪4處理人宮頸癌Siha細胞后，通 過乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗檢測腫瘤細胞死亡率如圖5所示。 實施例4甲酰阿地咪4顯著逆轉人乳腺癌多藥耐藥細胞株MCF-7/Adr對阿霉素的 耐藥性，其活性明顯高于乙酰阿地咪2
實驗方法 人乳腺癌多藥耐藥細胞株MCF-7/Adr培養(yǎng)在含10%胎牛血清PRMI1640 (Hyclone) 培養(yǎng)液中，并加入維持劑量的阿霉素(1P g/ml)，置37t:、5X C02培養(yǎng)箱。腫瘤細胞 0. 7X 104/孔接種于96孔板上，培養(yǎng)24h后，分別單獨加入阿霉素(3 y g/ml)，甲酰阿地咪 4 (40 ii M)，乙酰阿地咪2 (40 ii M)，或者同時加入阿霉素和相應的吲哚生物堿，每組設六個復 孔。將96孔板置37°C 、5% C02培養(yǎng)箱再培養(yǎng)72h后，每個組取三復孔分別加入5mg/ml MTT試劑10iU，采用MTT比色法檢測細胞存活率。另外三個復孔，按實施例3中方法，通過乳酸 脫氫酶(LDH)釋放實驗，檢測細胞死亡率。結果以均數(shù)±標準差表示。
結果 如圖6和圖7，通過檢測細胞存活率和細胞死亡率均顯示，甲酰阿地咪4能夠顯著 逆轉人乳腺癌耐藥細胞株MCF-7/Adr對阿霉素的耐藥性，更重要的是，其逆轉腫瘤耐藥的 活性顯著高于乙酰阿地咪2。 實施例5甲酰阿地咪4能夠劑量依賴性地逆轉人乳腺癌多藥耐藥細胞株MCF-7/
Adr對阿霉素的耐藥性 實驗方法 人乳腺癌多藥耐藥細胞株MCF-7/Adr培養(yǎng)條件同實施例4。按實施例4中條件接 種細胞于96孔板，24h后，分別加入阿霉素(3 ii g/ml)，或不同濃度的甲酰阿地咪4 (20 y M， 40iiM，60iiM)，或者同時加入阿霉素和相應濃度的甲酰阿地咪4。將96孔板置37°C、5% C02培養(yǎng)箱再培養(yǎng)72h后，采用MTT比色法檢測細胞存活率。結果以均數(shù)±標準差表示。
結果 如圖8、通過檢測細胞存活率顯示，甲酰阿地咪4能夠顯著逆轉人乳腺癌耐藥細胞 株MCF-7/Adr對阿霉素的敏感性，其作用呈劑量依賴關系。 實施例6甲酰阿地咪4顯著逆轉人乳腺癌多藥耐藥細胞株MCF-7/Adr對長春新堿 的耐藥性，其活性明顯高于乙酰阿地咪2
實驗方法 人乳腺癌多藥耐藥細胞株MCF-7/Adr培養(yǎng)條件同實施例5。按實施例5中條件接 種細胞于96孔板，24h后，分別加入長春新堿(VCR， 1 ii M)，甲酰阿地咪4 (40 y M)，乙酰阿地 咪2 (40 ii M)，或者同時加入長春新堿和相應的吲哚生物堿，每個組設六個復孔。將96孔板 置37°C、5% C02培養(yǎng)箱再培養(yǎng)72h后，其中三孔采用MTT比色法檢測細胞存活率。另外三 個復孔，通過乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗，檢測細胞死亡率。結果以均數(shù)±標準差表示。
結果 如圖9和圖IO，通過檢測細胞存活率和細胞死亡率均顯示，甲酰阿地咪4能夠顯著 逆轉人乳腺癌耐藥細胞株MCF-7/Adr對長春新堿的敏感性，更重要的是，其逆轉腫瘤耐藥 的活性顯著高于乙酰阿地咪2。
權利要求
如化學結構式所示的吲哚生物堿甲酰阿地咪((-)-5-N-formalardeemin)，及其藥學上可接受的鹽，作為抗腫瘤藥物用于人類惡性腫瘤的治療。FSB00000022522300011.tif
2. 如權利要求1所述的甲酰阿地咪作為抗腫瘤藥物單獨使用，和與其它抗腫瘤藥物組 成藥物組合物聯(lián)合使用治療惡性腫瘤，其特征在于，含有治療有效劑量的如權利要求1所 述的甲酰阿地咪及其藥學上可接受的鹽。
3. 如權利要求2所述的藥物組合物，其特征在于，所述甲酰阿地咪及其藥學上可接受 的鹽的含量為0. 001 99. 9wt%。
4. 如權利要求2 3所述的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物包括一種影響 腫瘤細胞核酸生物合成的藥物；直接破壞腫瘤細胞DNA阻止其復制的藥物；嵌入腫瘤細胞 DNA中干擾轉錄過程的藥物；干擾有絲分裂影響腫瘤細胞蛋白質(zhì)合成的藥物或通過抑制 環(huán)氧化酶產(chǎn)生抗腫瘤作用的藥物；以及EGFR相關的激酶抑制劑，熱休克蛋白Hsp90抑制 劑，Proteasome抑制劑；這些藥物如阿霉素、長春堿、長春新堿、紫杉醇、多烯紫杉醇、順鉑、 Gef itinib (Iressa)、17-DMAG、 Bortezomib。
5. 權利要求2 5所述的藥物組合物，在治療人類惡性腫瘤的藥物中的應用，優(yōu)選作為 惡性腫瘤化療增敏劑使用，以克服惡性腫瘤化療過程中產(chǎn)生的多藥耐藥性問題。
全文摘要
本發(fā)明涉及如化學結構式所示的吲哚生物堿甲酰阿地咪((-)-5-N-formalardeemin)，及其藥學上可接受的鹽，作為抗腫瘤藥物在治療人類惡性腫瘤中的應用。其作為抗腫瘤藥物不僅可直接抑制惡性腫瘤細胞的增長，更為重要的是可作為化療增敏劑，與其它抗腫瘤藥物如阿霉素、長春新堿等聯(lián)用，通過逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥性而達到有效殺滅腫瘤細胞的作用。更有意義的是，其作為化療藥物增敏劑較其直接作為腫瘤細胞生長抑制劑在治療惡性腫瘤方面更為有效，具有重要的臨床應用前景。
文檔編號A61P35/00GK101756992SQ200910164330
公開日2010年6月30日 申請日期2009年9月2日 優(yōu)先權日2009年9月2日
發(fā)明者何彬, 宋顥, 張 林, 林勇, 王霞, 秦勇, 鄭雪蓮 申請人:四川大學