人肺癌耐百草枯細(xì)胞株的建立方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人類細(xì)胞株，具體涉及一種人肺癌耐百 草枯細(xì)胞株及其建立方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 百草枯（paraquat，PQ)是一種全球廣泛使用的高效能除草劑，其對人體具有很強(qiáng) 的毒性，經(jīng)消化道、皮膚、呼吸道及靜脈等吸收均可造成中毒，臨床上缺乏有效的治療措施， 患者死亡率高達(dá)40~80%。我國PQ的生產(chǎn)和用量均居全球首位。近年國內(nèi)PQ中毒發(fā)病 呈倍數(shù)增長，防治形勢非常嚴(yán)峻。盡管2015年6月我國開始推出逐漸禁止PQ水液的生產(chǎn) 與銷售，但是其他劑型仍將繼續(xù)生產(chǎn)與使用。因此，百草枯中毒仍是我國今后中毒防治的重 要任務(wù)。
[0003] PQ中毒可致全身多個(gè)臟器損傷，其中肺是受累最嚴(yán)重的靶器官，可出現(xiàn)"百草枯 肺"，即早期表現(xiàn)為急性肺損傷，而后期則進(jìn)展為肺間質(zhì)纖維化，是PQ中毒患者死亡的主要 原因。PQ在肺組織的主動攝取和蓄積被認(rèn)為是持續(xù)誘導(dǎo)肺損傷造成患者呼吸衰竭的關(guān)鍵。 然而，迄今對百草枯，在肺細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及蓄積機(jī)制研究一直沒有突破，也沒有找到相應(yīng) 的干預(yù)措施，已成為百草枯解毒研究中的關(guān)鍵問題。
[0004] 近年，有研究通過對耐PQ的突變植株（牛筋草、擬南芥等）相關(guān)耐藥機(jī)制的分析， 闡述了 PQ在植物內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的重要信息。這為研究人體PQ毒理及其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制提供了 新思路。通過構(gòu)建耐百草枯的人體細(xì)胞株，并進(jìn)一步研究其拮抗百草枯毒性機(jī)制機(jī)理，有望 發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)百草枯毒性的新途徑。
[0005] 迄今，未見有以百草枯誘導(dǎo)建立哺乳動物耐藥細(xì)胞株的方法報(bào)道。目前腫瘤耐藥 細(xì)胞株的建立通常有兩種方法，一是逐步增加藥物濃度、持續(xù)誘導(dǎo)法，二是大劑量沖擊間斷 給藥法。一般認(rèn)為，濃度遞增連續(xù)誘導(dǎo)的方法是通過藥物持續(xù)作用，使腫瘤細(xì)胞生理和遺 傳特性發(fā)生改變以逐漸適應(yīng)藥物的毒性，屬于獲得性耐藥。目前國內(nèi)外尚無對百草枯耐藥 的哺乳動物細(xì)胞株，通過耐百草枯細(xì)胞株的建立，可以用于百草枯中毒防治研究提供了重 要的基礎(chǔ)研究模型。通過檢索發(fā)現(xiàn)，目前國內(nèi)外還沒有關(guān)于以人肺癌細(xì)胞株A549為誘導(dǎo)對 象，建立人肺癌耐藥百草枯細(xì)胞株的文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種人肺癌耐藥百草枯細(xì)胞株及其 建立方法，可以用于百草枯毒理機(jī)制、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)研究及發(fā)掘逆轉(zhuǎn)百草枯毒性途徑、研發(fā)百草 枯中毒治療藥物等提供細(xì)胞模型。
[0007] 本發(fā)明的人肺癌耐百草枯細(xì)胞株A549/PQ，已于2015年06月16日在中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號 院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為人肺癌細(xì)胞，保藏編號為 CGMCC No. 10892。
[0008] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0009] 本發(fā)明A549/PQ耐藥細(xì)胞株的按以下步驟建立，采用人肺癌細(xì)胞株A549為誘導(dǎo)對 象，改良連續(xù)誘導(dǎo)法，即采用濃度遞增、周期暴露的方法進(jìn)行PQ暴露建立了人肺癌耐百草 枯細(xì)胞株A549/PQ。該細(xì)胞株已經(jīng)于2015年06月16日在中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC No. 10892。
[0010] 具體地，本發(fā)明涉及的人肺癌耐百草枯細(xì)胞株A549/PQ是按照如下方法建立獲 得：
[0011] (1)人肺癌細(xì)胞株4549細(xì)胞置于培養(yǎng)液（含10%胎牛血清的1?^1-1640培養(yǎng)基）， 37°C，5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。
[0012] (2)取步驟（1)對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，采用濃度遞增、周期暴露的PQ誘導(dǎo) 法建立細(xì)胞耐藥株，PQ在培養(yǎng)基中的濃度首先從100 μ mol/L開始，加藥24h后換液去除藥 物，待細(xì)胞重新生長至對數(shù)期后再次加入相同濃度PQ刺激，如此重復(fù)3次，然后延長暴露時(shí) 間至48h (即100 μ mol/L的PQ暴露48h)，換液，除去藥物，待細(xì)胞重新生長至對數(shù)期后，再 次給予相同藥物相同時(shí)間的暴露，如次重復(fù)3次。隨后再增加 PQ濃度，每個(gè)濃度下誘導(dǎo)的 方案一致，遞增PQ濃度梯度依次為100、200、400、600、800以111〇1/1，連續(xù)培養(yǎng)11個(gè)月，獲得 A549耐PQ細(xì)胞株，人肺癌耐百草枯細(xì)胞株A549/PQ。
[0013] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0014] 光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布、CCK-8法及LDH 釋放實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞生長曲線及對百草枯耐藥性、高效液相色譜分析（HPLC)法檢測細(xì)胞內(nèi) PQ濃度等，我們發(fā)現(xiàn)，與親本細(xì)胞比，人肺癌耐百草枯細(xì)胞株A549/PQ細(xì)胞體積增大、形態(tài) 不規(guī)則、細(xì)胞間隙?。患?xì)胞的倍增時(shí)間明顯延長；細(xì)胞周期分析表明耐藥組G0/G1期細(xì)胞明 顯增多，而S期細(xì)胞明顯減少；CCK-8檢測表明PQ暴露后人肺癌耐百草枯細(xì)胞株A549/PQ存 活率明顯高于親本細(xì)胞，其對PQ的耐藥指數(shù)7. 98,為中度耐藥；LDH釋放實(shí)驗(yàn)也證實(shí)PQ誘 導(dǎo)的人肺癌耐百草枯細(xì)胞株A549/PQ細(xì)胞損傷明顯輕于親本細(xì)胞；流式細(xì)胞檢測表明PQ誘 導(dǎo)的人肺癌耐百草枯細(xì)胞株A549/PQ細(xì)胞早期凋亡率低于親本細(xì)胞；HPLC法測得暴露后人 肺癌細(xì)胞株A549/PQ細(xì)胞內(nèi)PQ濃度明顯低于親本細(xì)胞。表明人肺癌耐百草枯細(xì)胞株A549/ PQ細(xì)胞與親本細(xì)胞間存在明顯的生物學(xué)差異，且細(xì)胞內(nèi)濃度降低預(yù)示耐藥細(xì)胞可能存在拮 抗PQ蓄積的機(jī)制。
[0015] 本發(fā)明在濃度遞增持續(xù)誘導(dǎo)法基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行改良，采用濃度遞增、周期暴露 PQ誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞A549,即充分考慮濃度逐漸遞增的同時(shí)，又在同一濃度下采用逐漸延長 暴露時(shí)間的方法，為A549細(xì)胞激活相關(guān)代償途徑提供緩沖時(shí)間，有利于細(xì)胞逐漸地適應(yīng)PQ 的毒性，從而獲得對PQ的耐藥性，提高誘導(dǎo)成功率。通過該方法，本發(fā)明首次獲得對PQ耐 藥的人肺癌A549細(xì)胞（A549/PQ)，該細(xì)胞株具有明顯的抗PQ毒性特性，為進(jìn)一步研究應(yīng)用 逆轉(zhuǎn)PQ毒性途徑、提取百草枯中毒評價(jià)標(biāo)志物、發(fā)掘抗氧化新途徑等提供了良好的研究應(yīng) 用模型。
【附圖說明】
[0016] 圖1為光鏡下人肺癌細(xì)胞株A549和人肺癌耐百草枯細(xì)胞株A549/PQ的顯微圖
[0017] A :A549 細(xì)胞；B :A549/PQ 細(xì)胞
[0018] 圖2為人肺癌耐百草枯細(xì)胞株A549/PQ及人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞生長曲線圖。
[0019] 圖3為人肺癌耐百草枯細(xì)胞株A549/PQ及人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞倍增時(shí)間圖。
[0020] 圖4為PQ誘導(dǎo)人肺癌耐百草枯細(xì)胞株A549/PQ和人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞死它率 的比較圖。
[0021] a :與 400 ymol/L PQ 誘導(dǎo) A549 組死亡率比 P < 0· 05 ;b :與 800 ymol/L PQ 誘導(dǎo) A549組死亡率比P < 0. 05
[0022] 圖5為PQ暴露后人肺癌耐百草枯細(xì)胞株A549/PQ和人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞生存 率曲線圖。
[0023] 圖6為PQ誘導(dǎo)人肺癌耐百草枯細(xì)胞株A549/PQ和人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞IC50 的比較圖。
[0024] a :與 A549 組比 P < 0· 05
[0025] 圖7為PQ誘導(dǎo)人肺癌耐百草枯細(xì)胞株A549/PQ和人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞內(nèi)PQ 濃度的比較圖。
[0026] A :為標(biāo)注品PQ檢測的HPLC色譜圖；B :檢測標(biāo)本PQ檢測的HPLC色譜圖；C :LDH釋 放實(shí)驗(yàn)檢測PQ誘導(dǎo)細(xì)胞死亡率的比較；D :HPLC檢測細(xì)胞內(nèi)PQ濃度的比較；黑色箭頭：PQ 出峰時(shí)間（6. 70min)。* :表示相同濃度PQ暴露下兩組間比較P < 0. 05 :表示相同濃度 PQ暴露下兩組間比較P < 0. 05
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。本發(fā)明的實(shí)施例僅僅是用于說明本發(fā)明，而 不是對本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對本發(fā)明方法的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求 保護(hù)的范圍。
[0028] 實(shí)施例1人肺癌耐百草枯細(xì)胞株的誘導(dǎo)建立
[0029] 人肺癌耐百草枯細(xì)胞株4549外0按以下步驟建立：（1^549細(xì)胞置于含10%胎牛 血清的1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，條件為37°C，5% CO2。每次取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí) 驗(yàn)。（2)采用濃度遞增、周期暴露的PQ誘導(dǎo)法建立細(xì)胞耐藥株：PQ在培養(yǎng)基中的濃度首先 從100 μ mol/L開始，加藥24h后換液去除藥物，待細(xì)胞重新生長至對數(shù)期后再次加入相同 濃度PQ刺激，如此重復(fù)3次。然后延長暴露時(shí)間至48h (即100 μ mol/L暴露48h)，換液除 去藥物，待細(xì)胞重新生長至對數(shù)期后，再次給予相同藥物相同時(shí)間的暴露，如次重復(fù)3次。 隨后再增加 PQ濃度，每個(gè)濃度下誘導(dǎo)的方案一致。遞增PQ濃度梯度依次為100、200、400、 600、800 μ mol/L，連續(xù)培養(yǎng)11個(gè)月，獲得A549耐PQ細(xì)胞株，命名為人肺癌耐百草枯細(xì)胞株 A549/PQ。
[0030] 當(dāng)細(xì)胞依次對 100 μ mol/L、200 μ mol/L、400 μ mol/L、600 μ mol/L、800 μ mol/L PQ 穩(wěn)定耐藥后，及時(shí)凍存該濃度耐藥細(xì)胞于液氮中。凍存液由20%小牛血清、5% DMS0、75% DMEM培養(yǎng)液組成，凍存過程應(yīng)逐步降溫，采取4°C 30min - -20°C Ih - -70°C過夜一液氮的