一種雞胚前腦神經元的培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及神經元培養(yǎng)，具體是一種雞胚前腦神經元的培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002] 雞胚前腦神經元（CFBN)，類似于哺乳類大腦皮層神經元，來源廣泛，操作簡單，成 本低廉，常用作體外神經細胞毒性檢測的模型之一。早在1993年，Weiss等人就用CFBN模 型做過多中心體外細胞毒性檢測評價(MEIC)，發(fā)現和嚙齒類動物（鼠科）的體外實驗數據高 度相關，并且和嚙齒類動物的體內實驗數據也具有可比性。但是相比于嚙齒動物的大腦皮 層細胞培養(yǎng)，目前對專門對CFBN細胞培養(yǎng)的報道很少。Heidemann等的研究方法主要針對 低密度、短時間的細胞培養(yǎng)。但是低密度的神經網絡很難用微電極陣列（MEA)檢測出電生 理信號。根據嚙齒類皮層細胞體外神經網絡的發(fā)育過程，電生理信號需要在3~4周才能保 持穩(wěn)定，才能用作電生理神經毒性的檢測。因此，需要探索一種CFBN長期培養(yǎng)的方法。
[0003] 雖然鳥類的腦部三維結構比哺乳類的簡單，但是當他們被提取出來并且在體外進 行二維平面培養(yǎng)，神經元的基本功能如軸突和樹突的分化，突觸的行成，電信號的傳遞，突 觸的可塑性等都被保持了，并且在這個水平下，鳥類和哺乳類享有共同的電信號傳遞通道 和受體，因此，假設在體外培養(yǎng)的雞胚神經網絡和哺乳類(嚙齒動物）也應該具有相似的性 質。1981年，Louis等在電鏡下觀察到了體外培養(yǎng)的CFBN的突觸結構。1993年，Tokioka 等用膜片鉗檢測出體外培養(yǎng)CFBN中的突觸后電流，表明形成了的功能性神經網絡。并且用 N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA)受體的拮抗劑CNQX檢測出興奮性突觸后電流，用γ -氨基 丁酸（GABA)受體的拮抗劑檢測到抑制性突觸后電流。另外，多巴胺能，膽堿能的受體也都 在體外CFBN中檢測到。但是，目前基于MEA技術研究CFBN的神經網絡的電生理還未見報 道。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種雞胚前腦神經元高密度長時間培養(yǎng)的方法。
[0005] 為達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案： 一種雞胚前腦神經元的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括：用含小牛血清的Neurobasal培 養(yǎng)基培養(yǎng)雞胚前腦神經元。
[0006] 進一步地，所述培養(yǎng)方法還包括：用聚乙烯亞胺包被培養(yǎng)裝置。
[0007] 進一步地，所述聚乙烯亞胺包被培養(yǎng)裝置具體為：在細胞培養(yǎng)皿、24孔板或者微 電極陣列中加入〇. 〇5wt%聚乙烯亞胺溶液，放入培養(yǎng)箱過夜，第二天用去離子水洗滌，干燥 后待用。
[0008] 0. 05wt%聚乙烯亞胺溶液是聚乙烯亞胺的水溶液。
[0009] 進一步地，所述小牛血清的添加量占培養(yǎng)基2wt%。
[0010] 進一步地，所述雞胚前腦神經元按照以下步驟獲得： S11、取第7~9天的受精雞蛋，消毒，用鑷子將雞蛋頭部敲碎，去殼，撥開殼膜，取出雞胚 放到裝有HBSS的培養(yǎng)皿； 512、 用鑷子將雞胚的頭截斷，放入另一個有HBSS的培養(yǎng)皿； 513、 加雞胚的頭部背面朝上置，壓住中腦部位，并把前腦的腦膜揭開，取出兩團白色的 組織，放于有HBSS的培養(yǎng)皿，將貼附在白色組織外面殘余的腦膜去掉，得到前腦組織； 514、 將前腦組織放入離心管，加入冰療的HBSS溶液； 515、 吸出HBSS溶液，加入溫熱的胰酶EDTA溶液消化； 516、 加入M199培養(yǎng)基終止消化，反復吹打，形成均勻的細胞懸液； 517、 離心取上清，加入M199培養(yǎng)基，吹打均勻。
[0011] 進一步地，所述培養(yǎng)方法具體為：將雞胚前腦神經元的細胞懸浮液加入培養(yǎng)裝置， 均勻分散，然后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，之后將細胞液全部換成含小牛血清的Neurobasal培養(yǎng) 基，以后每1~3天換一半的培養(yǎng)基。
[0012] 進一步地，所述培養(yǎng)方法具體為： 521、 將雞胚前腦神經元懸浮液的細胞密度調節(jié)為3*106/mL，滴20 μ L懸浮液于微電極 陣列中央電極處，最終密度為1500~2000個/mm2; 522、 將微電極陣列放入IOOmm的培養(yǎng)皿，然后放入37°C、5%C02、95%濕度的培養(yǎng)箱培 養(yǎng)； 523、 待細胞完全貼壁后加入ImL M199培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)； 524、 24h后將細胞液全部換成含小牛血清的Neurobasal培養(yǎng)基，之后每3天換一半的 培養(yǎng)基。
[0013] 進一步地，步驟S21后在微電極陣列套上帶有聚全氟乙丙烯膜的密封環(huán)。
[0014] 本發(fā)明具有以下有益效果： 1.細胞需要產生足夠的細胞外基質才能使他們貼附在培養(yǎng)皿表面，由于神經元產生細 胞外基質的能力比較弱，因此需要在培養(yǎng)表面包被一層胞外基質促進貼附。常用的有天然 的胞外基質如膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白等，但是一些帶正電的多聚化合物如多聚賴 氨酸（PLL)、多聚鳥氨酸等，因為價格操作方便，應用范圍更大。在傳統(tǒng)的方案中，使用PLL 作為表面包被材料，但是高密度下培養(yǎng)CFBN很容易結團，尤其是在玻璃表面上。發(fā)明人經 過研究發(fā)現，聚乙烯亞胺（PEI)卻能讓細胞貼附并且鋪展得很好，這可能跟這兩種聚合物表 面的正電荷分布有關，PEI對于貼附性不強的細胞系能更明顯的促進貼附和軸突生長；而 且PEI被廣泛用于細胞病毒轉染，對細胞的毒性較PLL小。對于CFBN高密度長時間培養(yǎng)， 相比于PLL，PEI能避免細胞結團更適合培養(yǎng)表面包被。
[0015] 2.在傳統(tǒng)方案中，使用M199培養(yǎng)基培養(yǎng)CFBN生長。然而，M199不能使細胞長 時間培養(yǎng)，并且在后期出現了軸突珠，這是神經軸突退化的表現。發(fā)明人經過研究，選用 了專門為胚胎神經元設計的Neurobasal培養(yǎng)基，調整了滲透壓和一些氨基酸的比例。在 Neurobasal中培養(yǎng)的神經元軸突更加豐富，細胞存活時間更長，并且和嚙齒類原代皮層神 經元在形貌沒有區(qū)別。
[0016] 3.在Neurobasal培養(yǎng)基中，B27添加劑是用于替代血清，發(fā)明人經過研究，再添 加2%的小牛血清，發(fā)現血清能導致細胞有輕微的結團，但是這樣的結團使神經軸突更加粗 壯有力。并且MEA檢測電信號時發(fā)現，在添加血清之后神經網絡的電信號發(fā)育得更快，并且 信號強度更好。
[0017] 4.在微電極陣列套上一層聚全氟乙丙烯（FEP)膜，FEP膜可以讓CO2透過，而不讓 水分子透過，能很好的保持培養(yǎng)液的滲透壓，再加上膠質細胞的支持作用，雞胚前腦神經元 可以存活長達6個月。
[0018] 綜上所述，本發(fā)明的方案可以使雞胚前腦神經元在高密度條件下長時間培養(yǎng)；免 疫染色結果證明有神經元和膠質細胞共存，并且在第7天已經有突觸的形成；隨著膠質細 胞的增殖，在MEA上的神經網絡最后長成非常致密的細胞層，可存活長達6個月；CFBN神經 網絡對神經活性物質有很好的反應性，可以用作神經毒性檢測平臺。
【附圖說明】
[0019] 圖1是實施例2體外培養(yǎng)的雞胚神經網絡形貌變化過程； 圖2是實施例3雞胚前腦細胞免疫染色結果； 圖3是實施例4不同的培養(yǎng)表面包被條件對細胞生長的影響； 圖4是實施例5不同的培養(yǎng)基對細胞生長的影響； 圖5是實施例6血清對細胞生長的影響。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明： 實施例1 雞胚前腦神經組織解剖 (1) 取第7天到第9天的白色來航雞受精雞蛋，噴70%酒精消毒，將所有解剖用具放入 解剖超凈臺； (2) 用鈍的中號鑷子將雞蛋頭部(大頭）敲碎，并且小心地去掉蛋殼，撥開殼膜，取出雞 胚放到裝有冰涼的HBSS (Gibco)的35mm培養(yǎng)皿里； (3) 用5號鑷子將雞胚的頭截斷，放入另一個新的有HBSS的35mm培養(yǎng)皿里； (4) 將雞胚的頭部背面朝上置，左手用5號鑷子壓住中腦部位，右手用5號鑷子把前腦 的腦膜揭開，然后把兩團白色的組織夾出； (5) 把兩團白色的組織再轉移到一個新的有HBSS的35mm培養(yǎng)皿里，將貼附在白色組織 外面殘余的腦膜去掉，這兩團月牙狀的白色組織即前腦組織； (6) 將前腦組織放入I. 5mL的離心管里，加入ImL冰涼的HBSS并轉移至細胞培養(yǎng)超凈 臺； (7) 吸出HBSS溶液，加入溫熱的ImLO. 25%胰酶EDTA溶液（Sigma)，放入37°C培養(yǎng)箱中 消化3min ; (8) 加入lmLIO%小牛血清（FBS，Gibco)的M199培養(yǎng)液（Sigma)終止消化，用ImL槍頭 反復吹打組織約10次，形成均勻的細胞懸液； (9) 1000 rpm 離心 5min ; (10) 吸出上清液，加入M199培養(yǎng)液，含2%B27 (Gibco)，1%雙抗（Gibco)，吹打均勻。
[0021] 實施例2 微電極整列培養(yǎng)雞胚前腦神經元 (1)微電極陣列（60MEA200/30iR_Ti，Multichannel System，Germany)表面處理： 清洗：如果是已經培養(yǎng)過細胞的MEA重復利用，先用蒸餾水泡lOmin，使細胞溶脹破裂， 然后再用蒸餾水將表面的細胞沖掉。加入0. 5mL胰酶溶液，在37°C放置30min，洗掉多余的 細胞碎片。再加入帶酶的中性洗衣粉水，在室溫下浸泡過夜，然后用蒸餾水沖洗干凈。若還 有非常頑固的碎片，則超聲3min，再用蒸餾水沖洗干凈。最后用去離子水潤洗表面兩次放至 表面干燥。
[0022] 滅菌：紫外滅菌30min。
[0023] 等離子處理：放入等離子表面處理儀（PDC-32G，Harrick)，待抽真空至200mT0RR 以下，通入少量氧氣，以低功率檔處理2~3min。
[0024] 包被：在等離子處理之后IOmin之內，加入700 yL0.0 5wt%PEI溶