專利名稱：一種新的人類神經(jīng)元蛋白及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)生理學(xué)、神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)、和發(fā)育生物學(xué)。具體地，本發(fā)明涉及一種主要在人的腦部表達(dá)的蛋白-人類神經(jīng)元蛋白(hNP25)及其核酸序列，還涉及該蛋白的功能，制備方法和用途。
當(dāng)一個(gè)蛋白僅在一高度特化的細(xì)胞群體中表達(dá)時(shí)，它可能起著高度專一性的功能。神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞屬于高度特化的細(xì)胞群體并具有不同的功能，并且許多細(xì)胞是僅屬于神經(jīng)系統(tǒng)的。行使這些功能的蛋白可能是酶、受體、膜通透性的調(diào)控因子等。對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)專一性蛋白的識(shí)別不僅有助于澄清神經(jīng)系統(tǒng)功能的機(jī)制，還對(duì)揭示神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的新功能有所幫助。人類神經(jīng)元蛋白正是這樣一類主要在腦中表達(dá)的基因。在Human Unigene所公布的30個(gè)EST中，有22個(gè)來(lái)自腦，所以對(duì)這一基因的研究有助與人類對(duì)自身最復(fù)雜的器官-腦的研究。
人類神經(jīng)元蛋白基因，其羧末端含有calponin基序(motif)，是calponin蛋白家族成員之一。calponin基序參與調(diào)控平滑肌的收縮，它可以同肌動(dòng)蛋白(actin)、鈣調(diào)蛋白(calmodulin)、肌鈣蛋白C(troponin C)、原肌球蛋白(tropomyosin)結(jié)合。這一家族成員還包括1.NP25在大鼠腦中發(fā)現(xiàn)的這一基因編碼一個(gè)25KD的神經(jīng)元專一性蛋白--NP25。NP25在大鼠腦中廣泛而又不均一的分布意味著這個(gè)蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)中起著特殊的重要功能(Ren WZ，et a1.Mol brain Res 1994，22(1-4)174-85)。
2.SM22-alpha，又名transgelin，WS3-10。SM22首先在雞砂囊平滑肌中發(fā)現(xiàn)(Lees-Miller JP，et al.J.Biol.Chem 1987，2622988-2993).transgelin則在1993年被克隆(Shapland C，et al.J.Cell.Biol.1993，121(5)1065-1073)。WS3-10則在人類衰老的成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)(Thweatt R，et al，Biochem Biophys Res Commun 1992；187(1)1-7)。后來(lái)，在1997年，人們證明，transgelin及SM22為同一蛋白(LawsonD，et al.Cell motif Cytoskeleton 1997；38(3)；250-7)。這一基因產(chǎn)物的確切功能并未為人們所知。但由于它在平滑肌這一廣泛存在的組織中大量存在，所以推測(cè)它可能對(duì)平滑肌的生理功能有所貢獻(xiàn)。甚至有文獻(xiàn)認(rèn)為在大鼠中，這一基因是高血壓及心臟肥大癥的候選基因(Koike G，et al.Mamm Genome 1998；9(1)76-7)。現(xiàn)已將這一基因定位于人類11q23.2。
3.calponin.是一種平滑肌專一性蛋白，至多有4個(gè)異構(gòu)體。Calponin與肌動(dòng)蛋白在不需要Ca2+的參與下可緊密結(jié)合并附著于細(xì)肌絲(thin filament)上。calponin與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合抑制了肌動(dòng)蛋白的MgATPase活性，但不影響肌球蛋白的磷酸化。當(dāng)PKC或CaM激酶II使Calponin磷酸化后，Calponin與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合被阻斷，同時(shí)，對(duì)MgATPase的抑制作用消除。磷酸化后的Calponin可被2A型的蛋白磷酸酶脫磷酸化而恢復(fù)其原有的特性(Winder SJ，et al.Cell Signal1993；5(6)；677-86)。
4.mp20.果蠅的肌蛋白。在飛行肌中未檢測(cè)到，而在幾乎所有平滑肌中都發(fā)現(xiàn)。此蛋白包含兩個(gè)12個(gè)氨基酸殘基的鈣結(jié)合區(qū)(Ayme-Southgate A，et al.J CellBiol 1989；108(2)521-31)。
5.unc-87.基因unc-87于1994年在線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)。它編碼一個(gè)thin filament相關(guān)蛋白。unc-87基因產(chǎn)物是在線蟲(chóng)體壁肌肉收縮和收縮之后維持網(wǎng)格整體性的結(jié)構(gòu)成分之一(Goetinck S，et al. J Cell Biol 1994；127(1)79-93)。
6.myophilin.細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的平滑肌蛋白。利用被絳蟲(chóng)感染的狗的血清抗體，在絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)的cDNA庫(kù)中分離出包含此基因片斷的克隆。cDNA全長(zhǎng)則是利用PCR技術(shù)擴(kuò)增成體絳蟲(chóng)的λgt22A庫(kù)的cDNA而得到的(Martin RM，et al.MolBiochem Paratitol 1995；70(1-2)139-48)。
對(duì)這些神經(jīng)元蛋白的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)它們具有如下一些功能1.在人類神經(jīng)元蛋白基因的3′UTR區(qū)有6個(gè)重復(fù)的AUUUA序列，這是一個(gè)僅在某些細(xì)胞調(diào)控蛋白，如癌基因，細(xì)胞因子，淋巴因子，轉(zhuǎn)錄激活物等，中存在的保守區(qū)域。因而認(rèn)為人類神經(jīng)元蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能中起著重要的調(diào)控作用。
2.與人類神經(jīng)元蛋白高度同源的基因有SM22-alpha(67.5％，200a.a)，Calponin(43.4％，196a.a)，NP25(93.6％，219a.a)。其中NP25在鼠的腦中表達(dá)，而SM22-alpha，mp20，Calponin等則在各種生物的肌肉組織表達(dá)。這一確實(shí)存在但又難以解釋的現(xiàn)象也許對(duì)找尋肌肉組織及神經(jīng)組織之間的進(jìn)化關(guān)系有一定的幫助。
3.與人類神經(jīng)元蛋白高度同源的NP25(93.6％，219a.a)在大鼠腦中具有廣泛而專一性的分布。NP25主要密集于小腦，同時(shí)在中腦的神經(jīng)核團(tuán)也有分布。杏仁體復(fù)合物的中央核及終紋是NP25分布最多的神經(jīng)核團(tuán)之一。杏仁體被認(rèn)為具有控制大量?jī)?nèi)分泌反應(yīng)及調(diào)節(jié)復(fù)雜行為的功能。而小腦則在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有最復(fù)雜的突觸分布。所以，作為在下丘腦，這一重要的內(nèi)分泌器官中所得到的基因--人類神經(jīng)元蛋白基因，應(yīng)不僅僅是一個(gè)普通的結(jié)構(gòu)蛋白，還至少應(yīng)該在內(nèi)分泌的系統(tǒng)中發(fā)揮重要的功能.
4.與人類神經(jīng)元蛋白同源的SM22-alpha(67.5％，200a.a)，又名WS3-10，這是一種在成人早老癥的HDF(Human diploid fibroblasts)及衰老HDF中相對(duì)與正常的HDF過(guò)量表達(dá)的基因。成人早老癥，也叫維爾納綜合癥，其特征為硬皮病樣皮膚改變，白內(nèi)障，白發(fā)禿頭，皮下鈣化，糖尿病傾向等等。而與人類神經(jīng)元蛋白基因所同源的EST中，有兩個(gè)來(lái)自于衰老的成纖維細(xì)胞。所以，此基因產(chǎn)物與衰老有一定的聯(lián)系。
本發(fā)明的第一目的是提供一種新的人基因hNP25的核酸序列(GenbankAccession No.AF112201)，該基因是一個(gè)神經(jīng)元基因。
本發(fā)明的第二目的是提供一種新的人蛋白hNP25。
本發(fā)明的第三目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)上述的新的人神經(jīng)元蛋白和核酸序列的方法。
本發(fā)明還提供了這種神經(jīng)元蛋白多肽和編碼序列的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有人hNP25蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第27-875位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第27-875位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸第27-875位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離出的人hNP25蛋白質(zhì)多肽，它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)例中該宿主細(xì)胞是大腸桿菌；在另一實(shí)例中，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種產(chǎn)生具有人hNP25蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，該方法包括(1)將編碼具有人hNP25蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人hNP25蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第27-875位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人hNP25蛋白的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)人hNP25蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)分離出具有人hNP25蛋白活性的多肽。
較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.6中第27-875位的序列。
本發(fā)明還提供了與hNP25蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開(kāi)，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“人hNP25蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人hNP25蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.6中第27-875位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO.6序列的編碼框第27-875位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO.6中第27-875位核苷酸序列同源性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO.7所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第27-875位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO.6中從核苷酸第27-875位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與人hNP25相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.6中開(kāi)放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測(cè)量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測(cè)量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“人hNP25蛋白或多肽”指具有hNP25蛋白活性的SEQ IDNO.7序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與人hNP25相同功能的、SEQ ID NO.7序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括hNP25蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明人hNP25多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與人hNP25 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人hNP25多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人hNP25多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括人hNP25多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人hNP25多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
在本發(fā)明中，“hNP25保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.7的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
表1
發(fā)明還提供人hNP25蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人hNP25多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的人hNP25多肽時(shí)，可以將hNP25編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成人hNP25蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
本發(fā)明還提供了對(duì)人hNP25特異的抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。在本發(fā)明中，可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來(lái)制備針對(duì)hNP25特異的抗體。例如，將提純的人hNP25基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動(dòng)物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達(dá)人hNP25或它的抗原片段的細(xì)胞也可以用來(lái)對(duì)動(dòng)物致免疫而產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可以用雜交瘤技術(shù)制備(例如，Kohler et al.，Nature 256495，1975；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6292，1976)。本發(fā)明的抗體包括可以阻抑hNP25功能的抗體，也可以是不影響人hNP25功能的抗體。每一類抗體都可以通過(guò)對(duì)人hNP25基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人hNP25基因產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進(jìn)行合成。與非修飾形式的hNP25基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以通過(guò)用在原核細(xì)胞例如E.coli中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以通過(guò)用在真核細(xì)胞如酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的來(lái)免疫動(dòng)物而得到。
本發(fā)明的人hNP25抗體可以用來(lái)鑒定表達(dá)人hNP25蛋白或多肽的細(xì)胞，如Jurkat T細(xì)胞。例如，可以用一種可檢測(cè)的分子例如熒光素異硫氰酸(FITC)來(lái)標(biāo)記hNP25特異抗體，然后讓人hNP25特異抗體與細(xì)胞樣品接觸，再用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)出與hNP25特異抗體結(jié)合的細(xì)胞。
除了在細(xì)胞表面檢測(cè)人hNP25外，還可以用Western印跡技術(shù)分析該蛋白質(zhì)。細(xì)胞裂解液可以從培養(yǎng)細(xì)胞或取自病人的組織標(biāo)本如下丘腦中提取，并溶解在含有去污劑的裂解緩沖液中。然后用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞提取物(同時(shí)將提純的人hNP25多肽作為陽(yáng)性對(duì)照)，接著通過(guò)電泳雜交將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。為了用Western印跡免疫探測(cè)hNP25多肽，可以使用典型的抗體結(jié)合檢測(cè)方法，例如放射自顯影或堿性磷酸酶檢測(cè)方法。并可使用免疫接種血清或不相關(guān)的單克隆抗體作為非特異反應(yīng)的對(duì)照。
還可用Nothern印跡法技術(shù)分析hNP25基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析人hNP25的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。hNP25基因表達(dá)調(diào)控可以在用細(xì)胞因子如IFN-α、IFN-γ處理細(xì)胞后，分析細(xì)胞中hNP25的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)加以評(píng)價(jià)。
人hNP25 DNA的Nothern印跡分析和人hNP25特異抗體的Western印跡分析還可以聯(lián)合使用，以證實(shí)人hNP25在生物樣本中的表達(dá)。人hNP25 DNA還可以用于Southern印跡分析或原位雜交分析，以將該基因定位于染色體上，并可進(jìn)行遺傳連鎖分析以找出其它可能的疾病相關(guān)基因。
此外，本發(fā)明還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有hNP25核苷酸編碼序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼hNP25的核酸分子。
本發(fā)明還提供了檢測(cè)樣品中是否存在hNP25核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于hNP25核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為20-50個(gè)核苷酸。
此外，根據(jù)本發(fā)明的hNP25核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選hNP25同源基因或同源蛋白。
為了得到與hNP25基因相關(guān)的人cDNAs或基因組DNAs的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選人cDNA或基因組DNA文庫(kù)，這些探針是在低嚴(yán)緊條件下，用32P對(duì)hNP25的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫(kù)是來(lái)自人下丘腦組織的文庫(kù)。來(lái)自參與內(nèi)分泌的其它人體組織或特定人體細(xì)胞株的cDNA文庫(kù)也可用于篩選目的。構(gòu)建來(lái)自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫(kù)的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫(kù)也可以購(gòu)買到，例如購(gòu)自Clontech，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識(shí)別與hNP25相關(guān)的基因家族的核苷酸序列。
根據(jù)核苷酸相似性篩選hNP25同源物可以按如下方法完成。人體下丘腦cDNA文庫(kù)，例如Clontech Cat.#7429-1(Clontech，Palo Alto，Cal.)可以使用一段包含hNP25基因序列的全部或部分的隨機(jī)引物化DNA探針篩選。要完成對(duì)與hNP25序列至少有70％同源性的DNA插入序列的克隆的鑒定，可以使用雜交溫度為55℃的雜交液，然后用0.5×SSC和0.1％SDS清洗。用這種方法識(shí)別的克隆的DNA插入序列可以進(jìn)一步用DNA限制性內(nèi)切酶分析和DNA測(cè)序來(lái)評(píng)價(jià)它與hNP25基因的相似性。組織表達(dá)的分布可以用上述的Northern印跡法技術(shù)分析。
hNP25同源物也可以用針對(duì)hNP25蛋白或多肽的抗體來(lái)識(shí)別。例如，可以用標(biāo)準(zhǔn)的方法對(duì)商品化的或者用已知方法構(gòu)建的，來(lái)自細(xì)胞或者組織例如下丘腦的表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行篩選。將文庫(kù)倒入平皿，菌落轉(zhuǎn)移到一張硝化纖維素膜上，使表達(dá)的重組蛋白結(jié)合到膜上。然后就可以用特異性的人hNP25抗體進(jìn)行典型的抗體結(jié)合和檢測(cè)。用這種方法所識(shí)別出克隆中的DNA插入序列，可以進(jìn)一步用DNA限制性內(nèi)切酶分析和DNA測(cè)序進(jìn)行分析以評(píng)價(jià)它與hNP25基因的相似性。新識(shí)別的基因的組織表達(dá)分布可以同樣地按上述方法進(jìn)行分析。
本發(fā)明的人hNP25核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。


圖1為本發(fā)明的人hNP25與大鼠NP25基因核酸序列(GenBank AccessionNo.M84725)的同源比較(FASTA)圖。其中，相同的核苷酸用“|”標(biāo)出。
圖2為本發(fā)明的人hNP25蛋白與大鼠NP25蛋白(Swiss-Prot AccessionNo.P37805)的氨基酸序列的同源比較(FASTA)圖。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1hNP25基因的克隆1.組織分離(Tissue isolation)下丘腦來(lái)源于5個(gè)正常成年男性供體，在死后四小時(shí)內(nèi)取出下丘腦組織，立即置于液氮中冷凍保存。
2.mRNA的分離(mRNA isolation)取出組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至50ml新管，抽提總RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。用帶Oligo d(T)的纖維素柱分離總RNA中的mRNA，定量。
3.cDNA文庫(kù)的構(gòu)建(Construction of cDNA library)以mRNA為模板，合成雙鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄引物見(jiàn)SEQ ID NO.1。補(bǔ)平末端后，加含EcoRI切點(diǎn)的接頭，接頭序列分別見(jiàn)SEQ ID NO.2和3。磷酸化EcoRI末端后，用XhoI限制性內(nèi)切酶消化1.5小時(shí)，再進(jìn)行片段分離。過(guò)柱篩選長(zhǎng)度＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，無(wú)菌水溶解，連接至Uni-ZAP XR載體(Stratagene，CA9203，USA)，以Zap-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit(Stratagene，CA9203，USA)進(jìn)行包裝，宿主菌使用XL 1-Blue MRF細(xì)菌。涂板并測(cè)定滴度。
4.測(cè)序及數(shù)據(jù)庫(kù)建立(Seqencing and Database Constructing)挑選文庫(kù)中有外源片段插入的克隆，擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒(Qiagen，Germany)，用T3和T7作為3端和5i端的通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測(cè)序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行EST大規(guī)模測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用FACTURA軟件去除載體序列，傳輸?shù)絊UN Ultra 450 Server上進(jìn)行下一步的處理。所有的序列信息再用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(kù)(Genebank+EMBL)，將無(wú)同源性或同源性低于95％的序列視為新基因建立數(shù)據(jù)庫(kù)。
5.基因的全長(zhǎng)克隆(Cloning of Full-length cDNA)在得到的新基因片段序列信息基礎(chǔ)上，進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)克隆，分兩階段進(jìn)行(1)“電子克隆”(Electronic Cloning)以新基因片段序列作為探針?biāo)褜bEST數(shù)據(jù)庫(kù)，將重疊序列＞50bp，同源性在98％以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Tag，簡(jiǎn)稱“EST”)序列認(rèn)為同一序列(consensus sequence)，取出并用AUTOASSEMBLER軟件進(jìn)行拼接，部分EST可以延伸探針序列。再用STRIDER軟件分析被延伸的序列是否具有完整的開(kāi)放閱讀框架(Open Reading Frame，ORF)，用BLAST搜尋Genebank或SwissProt以確定該序列在核苷酸和氨基酸水平上是否與其他物種有同源性，以幫助判別所得到的基因全長(zhǎng)完整性如何。通過(guò)電子克隆的方法，通?？色@取hNP25基因的全長(zhǎng)序列。
(2)cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)如果通過(guò)“電子克隆”方法仍未得到完整的cDNA全長(zhǎng)，則在已有序列的5′或3′端設(shè)計(jì)引物，在人類下丘腦Marathon-Ready cDNA文庫(kù)(Clontech Lab，Inc，USA)中進(jìn)行長(zhǎng)距離PCR反應(yīng)。然后對(duì)PCR產(chǎn)物克隆、測(cè)序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER軟件分析被延長(zhǎng)的序列有無(wú)完整的ORF，如無(wú)，重復(fù)上述過(guò)程直至獲得全長(zhǎng)。
(3)RT-PCR對(duì)于5′和3′端已知的序列，中間尚有一段間隙(gap)無(wú)法從已有的公共數(shù)據(jù)庫(kù)或自身數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，可考慮采用RT-PCR的方法。在序列5′端設(shè)計(jì)引物，3′端引物采用Oligo-dT，在下丘腦總RNA庫(kù)中進(jìn)行擴(kuò)增。然后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序。最后拼接并獲得全長(zhǎng)。
通過(guò)組合使用上述3種方法，獲得了候選的人hNP25蛋白的全長(zhǎng)編碼序列。在拼接得到全長(zhǎng)(至少包含完整的開(kāi)放讀框)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物R15‘-GCGCGTGTCTTCTCTTCTTT-3′(SEQ ID NO.4)為正向引物，寡核苷酸R25’-GGTGCATTCTATAAGTTGAAGAGG-3‘(SEQ ID NO.5)為反向引物，以下丘腦組織的總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，R1/R2的PCR條件為94℃5分鐘，隨之以94℃30秒、55℃30秒和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后以72℃延伸5分鐘。電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得目的片段長(zhǎng)度為937bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序，獲得如SEQ ID NO.6所示的序列。
實(shí)施例2hNP25基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的人hNP25全長(zhǎng)cDNA(GenBank Accession No.AF112201。因申請(qǐng)保密，故在本申請(qǐng)之前未對(duì)公眾公開(kāi))的長(zhǎng)度為937bp，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.6，其中開(kāi)放讀框位于27-875位核苷酸。根據(jù)全長(zhǎng)cDNA推導(dǎo)出hNP25的氨基酸序列，共282個(gè)氨基酸殘基，分子量31454.17，pI為8.08。詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.7。
將hNP25的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與人、大鼠中的基因存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它與大鼠神經(jīng)元蛋白基因的mRNA全編碼序列(GenBank Accession No.M84725)的(42-985)位堿基有85.5％的相同性(圖1)，在氨基酸水平上，它與大鼠神經(jīng)蛋白基因(SwissProtAccession No.P37805)的第1-219位氨基酸殘基有93.6％的相同性和96.8％的相似性(圖2)。由上可見(jiàn)，hNP25基因與大鼠神經(jīng)蛋白基因無(wú)論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，因此兩者在功能上也有很高相似性。
實(shí)施例3hNP25蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究1.將hNP25蛋白的氨基酸序列在PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)(網(wǎng)址為http//www.motif.genome.ad.jp)中檢索基序(motif)，得到以下結(jié)果
(1)在氨基酸序列中，存在以下功能基序(i)下劃線區(qū)(180-182)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(Protein kinase Cphosphorylation site)(ii)雙下劃線區(qū)(138-141)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)(Casein kinase IIphosphorylation site)(iii)斜體區(qū)(59-64，104-109，142-147，175-180，179-184，183-188)N-豆蔻?；稽c(diǎn)(N-myristoylation site)(iv)方框區(qū)(174-193)Calponin家族重復(fù)序列(2)功能分析N端糖基化位點(diǎn)，酪蛋白激酶II型磷酸化位點(diǎn)，N-豆蔻?；稽c(diǎn)，蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)與翻譯后修飾(post-translational modifications)有關(guān)。Calponin家族重復(fù)序列是Calponin家族的特征，說(shuō)明該基因與大鼠NP25一樣，屬Calponin家族成員。
2.將hNP25蛋白的氨基酸序列在blocks數(shù)據(jù)庫(kù)(網(wǎng)址為http//blocks.fhcrc.org)中檢索結(jié)構(gòu)域，得到以下結(jié)果
(1)在氨基酸序列中，存在以下結(jié)構(gòu)模塊區(qū)(i)下劃線區(qū)(3-34,52-77,87-126，174-193)Calponin家族重復(fù)序列以上結(jié)果表明，hNP25蛋白具有Calponin基因家族的特征。
綜上所述，從hNP25蛋白的結(jié)構(gòu)證實(shí)了該基因是Calponin基因家族的成員．由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定了功能特異性的生物化學(xué)原理，因此本發(fā)明的人神經(jīng)元蛋白基因具有與Calponin基因家族成員相似或相同的功能。
本發(fā)明的人hNP25除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人hNP25還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人hNP25的N端與大鼠NP25的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對(duì)本發(fā)明人hNP25的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發(fā)明人hNP25核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人hNP25的表達(dá)水平或者抑制人hNP25的過(guò)度表達(dá)。本發(fā)明的人hNP25蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人hNP25缺失、無(wú)功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
實(shí)施例4hNP25基因的組織表達(dá)譜1.電子Northern表達(dá)譜。按Ton C.等人的方法(Ton C et al.，Biochem BiophysRes Commun 1997 Dec 18；241(2)589-594；Hwang DM，et al.，Circulation 1997 Dec16；96(12)4146-4203)，將hNP25 cDNA序列在GCG軟件包中的dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)中做BLAST檢索，在得到的人類EST中，概率值＜10e-10、相同性＞95％的EST有43個(gè)，可視為該基因在組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)本，由此得出表達(dá)該基因的組織譜，發(fā)現(xiàn)其在腦、乳腺、小腦、結(jié)腸、成纖維細(xì)胞、心臟、腎臟、肺、骨髓、黑色素細(xì)胞、松果體、胎盤、前列腺和睪丸中均有表達(dá)。這表明這種蛋白在人體許多組織中都有表達(dá)。約50％的EST來(lái)源于人腦，這也說(shuō)明了它在腦中發(fā)揮重要作用。
實(shí)施例5hNP25多肽的制備和提純?cè)谠搶?shí)施例中，將hNP25全長(zhǎng)編碼序列或片段構(gòu)建入商品化的蛋白質(zhì)融合表達(dá)載體之中，以表達(dá)和提純重組蛋白。
1.hNP25蛋白或多肽可以以GST融合蛋白的形式在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)。
原核表達(dá)載體的構(gòu)建，以及轉(zhuǎn)化大腸桿菌根據(jù)人hNP25的全長(zhǎng)編碼序列(SEQ ID NO.6)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物(分別對(duì)應(yīng)于編碼序列5′和3′端的約20個(gè)以上核苷酸)，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將hNP25基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pGEX-2T載體(Pharmacia，Piscataway，NJ)。鑒定好的表達(dá)載體利用CaCl2方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，篩選鑒定得到含有pGEX-2T-hNP25表達(dá)載體的工程菌DH5α-pGEX-2T-hNP25。
表達(dá)GST-hNP25重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的DH5α-pGEX-2T-hNP25工程菌于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)過(guò)夜，按1∶100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的LB培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)約3小時(shí)，至OD600達(dá)0.5后，加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續(xù)于37℃分別培養(yǎng)0，1，2，3小時(shí)。取培養(yǎng)時(shí)間不同的1ml菌液離心，在細(xì)菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細(xì)菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預(yù)期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導(dǎo)時(shí)間增加而增加的菌株即為表達(dá)GST-hNP25融合蛋白的工程菌。
GST-hNP25融合蛋白的提取純化按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)GST-hNP25融合表達(dá)蛋白的工程菌DH5α-pGEX-2T-hNP25。誘導(dǎo)后的細(xì)菌離心沉淀，按每400ml菌加入20ml PBS重懸細(xì)菌，超聲破碎細(xì)菌。破菌完全的超聲液按每毫升加入20微升的量加入PBS飽和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B，37℃振搖結(jié)合30分鐘，10000rpm/min離心10分鐘沉淀結(jié)合了GST-hNP25的谷胱苷肽Sepharose 4B，棄上清。按每毫升超聲液所得沉淀加入100μl PBS的量清洗兩次，而后按每毫升超聲液所得沉淀加入10μl還原型谷胱苷肽洗脫液，室溫置10分鐘，10000rpm/min離心10分鐘，上清即為洗脫的融合蛋白。重復(fù)洗脫兩次。洗脫的上清保存于-80℃，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測(cè)純化效果。在約31-32kDa處的蛋白質(zhì)條帶即為hNP25蛋白。
實(shí)施例6hNP25蛋白或多肽在昆蟲(chóng)細(xì)胞中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)1.hNP25桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞株根據(jù)人hNP25的全長(zhǎng)編碼序列(SEQ ID NO.6)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將hNP25 cDNA在保證閱讀框架的前提下克隆至pVL1392載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鑒定好的表達(dá)載體3μg，野生型線性桿狀病毒DNA(BaculoGoldTMACMNPV DNA，Pharmingen，San Diego，CA)1μg和Lipofection(Gibco-BRL，NY)25μl，加入1ml無(wú)血清的昆蟲(chóng)培養(yǎng)基中，振蕩15秒混勻，室溫孵育15分鐘備用。取1ml(2×106)Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞懸液于60mm組織培養(yǎng)板中，貼壁1小時(shí)后換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，室溫孵育15分鐘后棄培養(yǎng)基，加入前面制備好的DNA載體轉(zhuǎn)染混合物，Parafilm密封培養(yǎng)板，于室溫27℃振搖培養(yǎng)4小時(shí)，而后換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，收集上清備用。
2.轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體的昆蟲(chóng)細(xì)胞株的篩選鑒定轉(zhuǎn)染3天后的昆蟲(chóng)細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液(2×106/1ml)，取1ml細(xì)胞懸液置于60mm組織培養(yǎng)皿中，加入3ml培養(yǎng)基，100μl收集的培養(yǎng)上清，貼壁1小時(shí)，棄2ml培養(yǎng)基，繼續(xù)室溫培養(yǎng)1小時(shí)，棄去所有的培養(yǎng)基，加入預(yù)熱的含20μl 4％ X-gal的3ml半固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)5-7天后挑取白色細(xì)胞克隆于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)3-5天，而后吸取上清感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞。
收集感染的細(xì)胞進(jìn)行Western鑒定。將細(xì)胞裂解后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后的膠于Pharmacia的Multiphor II半干電轉(zhuǎn)移儀中將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，將硝酸纖維膜置于封閉液中封閉1小時(shí)，而后于抗hNP25的抗體溶液中封閉1小時(shí)，TBS液振搖清洗5分鐘共2次，而后將膜置于生物素標(biāo)記的抗hNP25一抗的第二抗體溶液中振搖1小時(shí)，TBS清洗，加入親和素-堿性磷酸酶復(fù)合物反應(yīng)30分鐘，TBS清洗2次，加入新鮮配制的顯色液顯色觀察蛋白條帶。
挑取高表達(dá)hNP25的Sf9細(xì)胞克隆。
3.hNP25蛋白的提取純化用高表達(dá)hNP25的Sf9細(xì)胞克隆的上清大量感染Sf9細(xì)胞，感染48小時(shí)后收集細(xì)胞，PBS洗滌。每2×108細(xì)胞加入20ml細(xì)胞裂解液(0.5％ Triton X-100，20 mM Na3PO4(磷酸鈉，pH7.8)，500mM NaCl，1mM Na3VO4(釩酸鈉)，1mMPefabloc，1μg/ml胃蛋白酶抑制劑，亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)破細(xì)胞，12000×g離心20min去除細(xì)胞碎片，上清按每2×108的細(xì)胞加入2ml NTA-瓊脂糖(Qiagen，Germany)，4℃吸附1小時(shí)。而后用含100nM咪唑的His緩沖液洗滌兩次，用含20mM N，N′-二哌嗪，500mM NaCl，300mM咪唑的緩沖液洗脫以得到純化的蛋白。洗脫液保存于4℃，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)提取的hNP25蛋白的純度。在約31-32kDa處的蛋白質(zhì)條帶為hNP25蛋白。
實(shí)施例7抗人hNP25抗體的制備1.免疫小鼠和脾細(xì)胞的制備將實(shí)施例5和6中獲得的hNP25重組蛋白用層析法進(jìn)行分離后備用，也可以用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中割下，并用等體積的完全Freund′s佐劑乳化。取6-8周齡Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化過(guò)的蛋白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund′s佐劑乳化的同樣抗原對(duì)小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量再加強(qiáng)免疫一次，3-5天后用于融合。其中，脾細(xì)胞制備見(jiàn)鄂征主編，《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》，北京出版社，第210頁(yè)。
2.按《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》(同上)，第211頁(yè)中的方法，制備飼養(yǎng)細(xì)胞。
3.按《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》(同上)，第213頁(yè)中的方法，進(jìn)行細(xì)胞融合。
4.抗體的檢測(cè)在細(xì)胞融合10-15天后，需逐孔進(jìn)行檢查，一旦發(fā)現(xiàn)旺盛的雜交細(xì)胞集落生長(zhǎng)，就應(yīng)用hNP25蛋白做抗體活性的初步篩選，常用的方法有免疫熒光試驗(yàn)、發(fā)射免疫試驗(yàn)(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。檢查出抗體活性的孔后，立刻進(jìn)行克隆培養(yǎng)，并分離出抗體。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人國(guó)家人類基因組南方研究中心(ii)發(fā)明名稱一種新的人類神經(jīng)元蛋白及其編碼序列(iii)序列數(shù)目7(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(ix)序列描述SEQ ID NO.1GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT 50(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(ix)序列描述SEQ ID NO.2AATTCGGCAC GAG 13(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度9bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(ix)序列描述SEQ ID NO.3GCCGTGCTC 9(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(ix)序列描述SEQ ID NO.4GCGCGTGTCT TCTCTTCTTT 20(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(ix)序列描述SEQ ID NO.5GGTGCATTCTATAAGTTGAAGAGG24(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度937bp(B)類型核苷酸
(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型核苷酸(ix)序列描述SEQ ID NO.61 GCGCGTGTCT TCTCTTCTTT CCAGAGATGG CTAACAGGGG CCCGAGCTAT51 GGCTTAAGCC GAGAGGTGCA GGAGAAGATC GAGCAGAAGT ATGATGCGGA101 CCTGGAGAAC AAGCTGGTGG ACTGGATCAT CCTGCAGTGC GCCGAGGACA151 TAGAGCACCC GCCCCCCGGC AGGGCCCATT TTCAGAAATG GTTAATGGAC201 GGGACGGTCC TGTGCAAGCT GATAAATAGT TTATACCCAC CAGGACAAGA251 GCCCATACCC AAGATCTCAG AGTCAAAGAT GGCTTTTAAG CAGATGGAGC301 AAATCTCCCA GTTCCTAAAA GCTGCGGAGA CCTATGGTGT CAGAACCACC351 GACATCTTTC AGACGGTGGA TCTATGGGAA GGGAAGGACA TGGCAGCTGT401 GCAGAGGACC CTGATGGCTT TAGGCAGCGT TGCAGTCACC AAGGATGATG451 GCTGCTATCG GGGAGAGCCA TCCTGGTTTC ACAGGAAAGC CCAGCAGAAT501 CGGAGAGGCT TTTCCGAGGA GCAGCTTCGC CAGGGACAGA ACGTAATAGG551 CCTGCAGATG GGCAGCAACA AGGGAGCCTC CCAGGCGGGC ATGACAGGGT601 ACGGGATGCC CAGGCAGATC ATGTTAGGAC GCGGCATCCT GCCCCTGGTA651 GAGAGGACGA ATGTTCCACA CCATGGTCTC TACGAAAAAG AAATAGTTAG701 TCACCTTCTG ACCTTCTCCT CTTTCTCAAA GCCTTCTGTC CCTGGTTTTT751 GCAAGTGCTG CATTTCCGCC GAGAATCCGC GTTGCCTACT GCTGCCACCT801 CCTGTTCATT TAGAACTATG CAAAGACTCC GCTTCCGTTT TCCTGAGCTC851 CTCGGGCCCC AGAGTCTCTG TTTGATTATT TATTTATTTA TTTATTTATT901 TGCCAAAAAT TCTCCTCTTC AACTTATAGA ATGCACC(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度282氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(ix)序列描述SEQ ID NO.71 Met Ala Asn Arg Gly Pro Ser Tyr Gly Leu Ser Arg Glu Val Gln16 Glu Lys Ile Glu Gln Lys Tyr Asp Ala Asp Leu Glu Asn Lys Leu31 Val Asp Trp Ile Ile Leu Gln Cys Ala Glu Asp Ile Glu His Pro46 Pro Pro Gly Arg Ala His Phe Gln Lys Trp Leu Met Asp Gly Thr61 Val Leu Cys Lys Leu Ile Asn Ser Leu Tyr Pro Pro Gly Gln Glu76 Pro Ile Pro Lys Ile Ser Glu Ser Lys Met Ala Phe Lys Gln Met91 Glu Gln Ile Ser Gln Phe Leu Lys Ala Ala Glu Thr Tyr Gly Val106 Arg Thr Thr Asp Ile Phe Gln Thr Val Asp Leu Trp Glu Gly Lys121 Asp Met Ala Ala Val Gln Arg Thr Leu Met Ala Leu Gly Ser Val136 Ala Val Thr Lys Asp Asp Gly Cys Tyr Arg Gly Glu Pro Ser Trp151 Phe His Arg Lys Ala Gln Gln Asn Arg Arg Gly Phe Ser Glu Glu166 Gln Leu Arg Gln Gly Gln Asn Val Ile Gly Leu Gln Met Gly Ser181 Asn Lys Gly Ala Ser Gln Ala Gly Met Thr Gly Tyr Gly Met Pro196 Arg Gln Ile Met Leu Gly Arg Gly Ile Leu Pro Leu Val Glu Arg211 Thr Asn Val Pro His His Gly Leu Tyr Glu Lys Glu Ile Val Ser226 His Leu Leu Thr Phe Ser Ser Phe Ser Lys Pro Ser Val Pro Gly241 Phe Cys Lys Cys Cys Ile Ser Ala Glu Asn Pro Arg Cys Leu Leu256 Leu Pro Pro Pro Val His Leu Glu Leu Cys Lys Asp Ser Ala Ser271 Val Phe Leu Ser Ser Ser Gly Pro Arg Val Ser Val
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人hNP25蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第27-875位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第27-875位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼具有SEQ IDNO.7所示的序列的多肽。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸第27-875位的核苷酸序列。
4.一種分離出的人hNP25蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.一種產(chǎn)生具有人hNP25蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(1)將編碼具有人hNP25蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人hNP25蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第27-875位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人hNP25蛋白的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)人hNP25蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)分離出具有人hNP25蛋白活性的多肽。
9.一種能與權(quán)利要求7所述的人hNP25蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
10.一種探針?lè)肿?，其特征在于，它包含?quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在人體正常下丘腦組織中表達(dá)的新的神經(jīng)元蛋白hNP25,及其編碼序列,本發(fā)明還提供了該蛋白和核酸序列的制備方法,以及在樣品中檢測(cè)hNP25核酸序列和多肽的方法。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1272546SQ99113668
公開(kāi)日2000年11月8日 申請(qǐng)日期1999年4月29日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月29日
發(fā)明者施錦繡, 彭永德, 黃長(zhǎng)輝, 俞亞萍, 董輝, 傅剛, 陳竺 申請(qǐng)人:國(guó)家人類基因組南方研究中心