專利名稱：新的促神經營養(yǎng)因子及其編碼序列,及制法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及神經學和基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的大鼠蛋白和核苷酸編碼序列。更具體地說，本發(fā)明涉及一種新的促神經生長因子tropic 1808及其cDNA序列。本發(fā)明還涉及這些多核苷酸和多肽的應用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產方法。
近10年來，腦與神經科學領域飛速發(fā)展，其中有關神經損傷修復及抗衰老的課題更是該領域的研究熱點，并且?guī)由窠浬飳W、臨床解剖學、創(chuàng)傷外科學等前沿學科的發(fā)展。在該領域的任何研究進展，無論是對于實驗室的基礎理論研究；抑或是對于醫(yī)院臨床應用，都有著重要的意義。
目前，對于神經科千百萬罹患老年性癡呆、外周神經退行性病變、截癱、外傷后神經損傷等疾病的病人而言，可以接受的有效治療方法極為有限。其中，就常規(guī)使用的藥物而言，譬如用于營養(yǎng)神經的維生素B12，以及地巴唑、激素類和神經節(jié)苷脂等，無論是品種還是效果都非常有限。
雖經過多年研究，但是目前已知的、具有促進神經生長作用的蛋白主要僅包括神經營養(yǎng)因子(TNF)、腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)，神經營養(yǎng)因子3和4(NT-3和NT-4)等。因此，人們對神經發(fā)育生長和修復過程中所涉及的因子和多肽還知之甚少，迫切需要找到與神經發(fā)育、營養(yǎng)及損傷修復等有關的各種因子和/或多肽，以便設計和制造出造福于人類的藥物。
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼一種新的促神經生長因子，本發(fā)明的促神經生長因子成員被命名為tropic 1808。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種新的大鼠的促神經生長因子，該蛋白被命名為tropic 1808蛋白。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種生產所述的新的大鼠tropic 1808多肽的方法。
本發(fā)明還提供了這種大鼠tropic 1808核酸序列和多肽的應用。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有tropic 1808蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸101-928位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸101-928位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.1中從核苷酸101-928位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的tropic 1808蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉化的宿主細胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產生具有tropic 1808蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有tropic 1808蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成tropic 1808蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸101-928位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成tropic 1808蛋白的重組細胞；(c)在適合表達tropic 1808蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有tropic 1808蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為2196個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO.1，其中開放讀框位于101-928位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發(fā)明中，術語“tropic 1808蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有tropic 1808蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中101-928位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的編碼框101-928位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.1中101-928位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.2所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳地在高度嚴緊條件下，與SEQ ID NO.1中從核苷酸101-928位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQ ID NO.1中從核苷酸101-928位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與tropic 1808相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質或多肽是指其至少占樣品總物質的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術語“tropic 1808蛋白或多肽”指具有tropic 1808蛋白活性的SEQID NO.2序列的多肽。該術語還包括具有與tropic 1808相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括tropic 1808蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與tropic 1808 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗tropic 1808多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含tropic 1808多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了tropic 1808多肽的可溶性片段。通常，該片段具有tropic1808多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供tropic 1808蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然tropic 1808多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“tropic 1808保守性變異多肽”指與SEQ ID No.P的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行氨基酸替換而產生。
表1
本發(fā)明還包括tropic 1808多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用于抑制細胞內tropic 1808的表達。
本發(fā)明還包括一種可用作探針或引物的核酸分子，該分子通常具有tropic1808多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼tropic 1808的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測tropic 1808核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產物，其中PCR擴增引物對應于tropic 1808多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，可以形成蛋白表達載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對tropic 1808 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于tropic 1808基因產物或片段。較佳地，指那些能與tropic 1808基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結合并抑制tropic 1808蛋白的分子，也包括那些并不影響tropic 1808蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的tropic 1808基因產物結合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的tropic 1808基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達tropic 1808或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷tropic 1808功能的抗體以及不影響tropic 1808功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用tropic 1808基因產物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與tropic 1808基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
本發(fā)明的tropic 1808核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆人載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
在本發(fā)明的發(fā)明人，通過對比大鼠正常神經組織和損傷后神經組織的蛋白質表達情況，意外地發(fā)現有一種分子量約為18kDa的蛋白在受損傷后的神經組織有特異性地高表達。分離后該18kDa蛋白，將其作為免疫原來制備單克隆抗體。利用獲得的抗體，對SD品系大鼠損傷性周圍神經的cDNA表達文庫進行混合篩選，得到12個陽性克隆。測序后發(fā)現有6個克隆含有相同或部分相同的序列，其中8號克隆含有2196bp的片段并含有828bp的完整閱讀框。根據測序結果，設計引物(SEQID No.3和4)，分別以8號陽性克隆和新生大鼠周圍神經組織mRNA為模板，通過PCR或RT-PCR擴增后得到了含tropic 1808編碼序列的片段。經瞬時表達，測定了表達產物對大鼠背根神經節(jié)的影響，發(fā)現本發(fā)明的新蛋白有明顯的促神經生長作用。
本發(fā)明所提供的新的tropic 1808多肽和編碼序列，為進一步研究tropic 1808在生物體內的功能以及由該類基因引起的疾病提供了基礎，并為將來的疾病治療提供了新的前景。
本發(fā)明提供了一個新的tropic 1808的同源基因，該基因的發(fā)現為進一步研究tropic 1808在生物體內的功能以及由該類基因引起的疾病，進而為將來的疾病治療提供了新的前景。
本發(fā)明的tropic 1808除了可作為該家族一員用于進一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產生融合蛋白。此外，本發(fā)明tropic 1808還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產生新的蛋白。
針對本發(fā)明tropic 1808的抗體，用于篩選與tropic 1808同源的蛋白，或者用于親和純化相關蛋白。
此外，本發(fā)明tropic 1808核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細胞，以提高tropic 1808的表達水平或者抑制tropic 1808的過度表達。本發(fā)明的tropic 1808蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因tropic 1808缺失、無功能或異常而導致的有關病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進行有關的診斷或預后判斷。
在附圖中，

圖1為本發(fā)明的含有pcDNA3-tropic 1808表達載體的CHO細胞與新生SD大鼠背根神經節(jié)在無血清培養(yǎng)基中聯合培養(yǎng)的照片。
圖2是含有空載pcDNA3的CHO細胞與新生SD大鼠背根神經節(jié)在無血清培養(yǎng)基中聯合培養(yǎng)的照片。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1tropic 1808蛋白的分離取將大鼠正常及損傷后的周圍神經組織，均漿化后，5000rpm/min離心2分鐘，取上清液分別進行非變性-PAGE電泳。經對比發(fā)現損傷后的神經組織含有一種特異性的、分子量大小約為18kDa的蛋白。
實施例2制備抗tropic 1808的單克隆抗體將實施例1中18kDa蛋白從電泳凝膠上分離出來，作為抗原，按常規(guī)方法免疫小鼠，將免疫過小鼠的脾臟細胞(含有大量抗體產生細胞)與在體外培養(yǎng)的骨髓瘤細胞(不產生抗體，但具有無性繁殖能力)在聚乙二醇(PEG)的作用下進行融合，通過選擇培養(yǎng)基的篩選，用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測有無抗體分泌，將產生抗體的細胞移至24孔培養(yǎng)板增殖，進行克隆化。由此建立起能夠分泌單克隆抗體的細胞株，通過體外培養(yǎng)或將上述細胞培養(yǎng)物注入小鼠腹腔繁殖，將可獲得大量單克隆抗體。共制備7株單克隆抗體。
實施例3大鼠損傷性周圍神經cDNA的制備按譚湘陵，顧曉松，印其友等人?！按笫髶p傷性周圍神經組織cDNA文庫的構建”?！督馄蕦W報》，1998，29(2)139-144的方法，以SD大鼠手術損傷后的坐骨神經組織為材料，提取mRNA，逆轉錄合成cDNA，以λgt11為載體，構建cDNA表達文庫，測定該文庫的容量為1.5×106，滴度為1.4×1012(pfu/ml)。
實施例4tropic 1808編碼核苷酸序列的獲得利用實施例2制備的單克隆抗體，在SD大鼠損傷性周圍神經的cDNA文庫中混合篩選、尋找與神經生長相關的新基因。參照Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的“篩選構建于λ噬菌體載體的表達文庫”方法。將文庫以10000個噬斑/皿的密度鋪培養(yǎng)平皿，出現噬菌斑后原位印跡到浸過IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)的硝酸纖維素膜上，用免疫組化方法篩選那些可以被誘導表達與已知抗體相互作用蛋白的噬斑，進一步擴增為陽性克隆。共獲得12個陽性克隆，測序發(fā)現其中有6個陽性克隆為相同或部分相同序列，插入片段在1.8kb-2.7kb之間。
其中一個陽性克隆8號有2196bp的插入片段(SEQ ID No.1)，并有完整的828bp的閱讀框架ORF(即SEQ ID No.1中第101-928位)，該ORF編碼一個275個氨基酸的多肽(SEQ ID No.2)。
將如上獲得的核酸序列和氨基酸序列(SEQ ID No.1和2的序列)，在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數據庫以及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR等數據庫中用BLAST程序進行核酸和蛋白同源檢索。結果未發(fā)現與其他已知蛋白有明顯的同源性。因此，該序列是為未見報道的新序列，并將其命名為tropic 1808，GenBank登錄號為AF078811828bp(因申請保密，故在本申請之前序列未公開)。
實施例5制備tropic 1808編碼序列分別用以下兩種方法來制備含有tropic 1808的cDNA編碼序列片段(1)人工合成寡核苷酸引物，即為TAAAGCTTCA AGATGAATTTGGCTCAAATC GC(SEQ ID NO.3)和GCGGAATTCA GATATGACTAAGGTTAGTGT CG(SEQ ID NO.4)，分別作為上下游引物。以獲得的含有tropic 1808完整編碼序列的陽性克隆8號的DNA作為模板，使用GENE公司的TaqDNA聚合酶(5U/μl，Cat.#GT-TAQ251)，進行PCR擴增。結果，獲得含有完整tropic 1808結構基因的DNA片段，長度為864bp，且上游攜帶Hind III酶切位點，下游攜帶EcoR I酶切位點。
(2)如上合成寡核苷酸引物，即為TAAAGCTTCA AGATGAATTTGGCTCAAATC GC(SEQ ID NO.3)和GCGGAATTCA GATATGACTAAGGTTAGTGT CG(SEQ ID NO.4)，分別作為上下游引物。使用GENE公司的Taq DNA聚合酶(5U/μl，Cat.#GT-TAQ251)，以1月齡SD大鼠周圍神經組織的mRNA作為模板，寡核苷酸引物GCGGAATTCA GATATGACTAAGGTTAGTGT CG(SEQ ID NO.4)作為逆轉錄引物，進行RT-PCR擴增。先進行逆轉錄反應(cDNA第一鏈的合成)在50μl反應體積中含有純化的mRNA200ng，逆轉錄引物300ng，4mmol/L dNTP及20U的MMLV逆轉錄酶(20U/μl，Promega公司產品)。37℃反應60min，合成cDNA第一鏈。加入PCR擴增引物，91℃變性5min后加入Taq酶，然后進行PCR擴增，每100μl反應體系中包括逆轉錄反應產物10μl，上下游寡核苷酸引物各100pmol，及10mmol/L Tris-Hcl(pH8.3，20℃)，1.5mmol/L MgCl2，50mmol/L KCl，2mmol/L dNTP，20μg/ml BSA，2.5單位Taq DNA聚合酶，再覆蓋100μl液體石蠟。在PERKINELMER/CETUS公司的DNA ThermalCycler480上94℃變性1min，55℃退火1min及72℃延伸3min，共進行30個循環(huán)，最后在72℃保溫10min。取5μl反應產物在1.2％瓊脂糖凝膠進行電泳，EB染色，紫外燈下觀察鑒定。獲得含有完整tropic 1808結構基因的DNA片段，長度為864bp，且上游攜帶Hind III酶切位點，下游攜帶EcoR I酶切位點。
經將如上獲得的PCR擴增片段分別進行測序，結果證實擴增產物除去兩端酶切位點之外的序列，與SEQ ID No.1中第98-961位的序列相一致。
實施例6tropic 1808的Northern-Blot檢測使用GIBCO BRL公司TRIzol ReagentRNA提取試劑(Cat.#15596-026)，從新生SD大鼠腦及損傷后神經組織中分別提取mRNA，按常規(guī)進行Northern-blot檢測。先進行RNA甲醛變性凝膠電泳，再轉印尼龍膜，用已經用同位素標記的實施例5中所述含有tropic 1808編碼序列的cDNA作為探針，進行雜交，再經過放射自顯影。檢測結果發(fā)現tropic 1808基因mRNA全長約為3.8kb。
實施例7原位雜交檢測用實施例5中獲得的含有tropic 1808的編碼序列的cDNA，用BOEHRINGERMANNHEIM公司DIG DNA Labeling and Detection(地高辛標記)試劑盒(Cat.#1093637)，標記為非同位素探針，然后分別對正常及損傷后的大鼠周圍神經組織進行原位雜交。
結果發(fā)現，tropic 1808的mRNA在大鼠損傷后坐骨神經的部分雪旺氏細胞中表達增強，而且tropic 1808基因表達陽性的細胞，特異性地排成束狀，提示該因子具有特定的生物學功能。而tropic 1808基因在正常的成年大鼠坐骨神經中基本無表達。
實施例8tropic 1808基因的表達情況1.在損傷神經中的表達情況用RT-PCR方法研究tropic 1808的mRNA在大鼠周圍神經損傷后的表達規(guī)律。分別提取損傷后不同時間點的大鼠損傷神經的mRNA，參照前述實施例5(2)中的RT-PCR反應條件和方法，進行擴增。最后根據PCR產物的量，來確定tropic 1808在大鼠周圍神經損傷后不同時間的表達情況。
結果發(fā)現，大鼠周圍神經損傷后1周即有tropic 1808的表達；損傷后2周表達水平達到最高；損傷后4周表達下降。正常成年大鼠坐骨神經中未見tropic 1808基因的表達。
2.在中樞神經發(fā)育過程中的表達情況按如上基本相同的方法，通過RT-PCR方法研究tropic 1808基因mRNA在中樞神經發(fā)育過程中的表達規(guī)律。
結果發(fā)現新生大鼠的大腦、腦干、脊髓中可見tropic 1808基因的表達；1月齡大鼠的大腦、腦干、脊髓中tropic 1808基因表達量明顯上升；2月齡大鼠僅在脊髓中有少量表達，在大腦、腦干中未見表達。新生大鼠及1月齡、2月齡大鼠的小腦組織中均未見tropic 1808基因的表達。
實施例9tropic 1808編碼產物在真核表達系統CHO細胞株中的表達將實施例5(2)中的獲得的含有tropic 1808的編碼序列的cDNA，經Hind III+EcoR I雙酶切，克隆人經同樣酶切的Invitrogen公司表達載體pcDNA3(Cat.#V790-20)中，經酶切及DNA測序證實插入片段大小及方向正確無誤后，轉染CHO細胞，進行瞬時表達。
用已經制備的單克隆抗體檢測瞬時表達產物免疫原性的West-blot試驗為陽性，用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小約為18KDa。此外，用常規(guī)方法對達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發(fā)現與SEQ ID NO.2的序列一致。
實施例10重組表達產物的活性檢測首先分離新生SD大鼠的背根神經節(jié)。按常規(guī)準備不含有血清的DMEM基礎培養(yǎng)液，經0.22μm濾膜過濾，保存于4℃。另取少量于37℃孵育2天，觀察有無污染。用鼠尾膠包被96孔培養(yǎng)板，回收多余的膠。37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱孵育過夜。用基礎培養(yǎng)液洗滌上述培養(yǎng)板3-4次，于超凈臺自然風干備用。選用新生SD大鼠(出生24-48hr內)，取材前在75％乙醇中浸泡10min。于無菌條件下，將鼠斷頭處死，用無菌脫脂棉充分吸凈血液。用眼科剪自鼠背部正中剪開皮膚，將棘突兩側的肌肉及軟組織仔細剝離、剔除。仔細剪開椎管，盡量剪短并修齊椎弓，小心剝離脊髓，暴露位于兩側椎間孔中的背根神經節(jié)。輕柔取出背根神經節(jié)，置于裝有基礎培養(yǎng)液的無菌平皿中，小心去除其它組織，用基礎培養(yǎng)液盡量沖洗干凈。將上述背根神經節(jié)置于已經處理的培養(yǎng)板中。
活性檢測時，分別將含有pcDNA3-tropic 1808表達載體的CHO細胞和只含有空載pcDNA3的CHO細胞與新生SD大鼠背根神經節(jié)在無血清基礎培養(yǎng)基中聯合培養(yǎng)。將培養(yǎng)板置于5％ CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育24-48hr。在顯微鏡下觀察培養(yǎng)后的背根神經節(jié)，觀察是否有明顯神經突起生長。
參見附圖，圖1為含有pcDNA3-tropic 1808表達載體的CHO細胞與新生SD大鼠背根神經節(jié)在無血清培養(yǎng)基中聯合培養(yǎng)的照片，圖中可檢查到有許多神經纖維自神經節(jié)中心、呈放射狀向外生長，這說明本發(fā)明的tropic 1808具有明顯的促神經生長作用。而圖2中只含有空載pcDNA3的CHO細胞與新生SD大鼠背根神經節(jié)在無血清培養(yǎng)基中聯合培養(yǎng)則無類似效應。因此，本發(fā)明的tropic 1808是一種新的促神經生長因子，具有明顯的促神經生長效應，并在神經發(fā)育與再生過程中起著促進神經生長的重要作用。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人上海醫(yī)學生命科學研究中心有限公司南通醫(yī)學院(ii)發(fā)明名稱新的促神經營養(yǎng)因子及其編碼序列，及制法和用途(iii)序列數目4(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度2196bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)序列描述SEQ ID NO.11 GGGCAACACA GCAGCACCGG CGGCACCCGC AACTAATACT GCGACAACTT ATACGGTTAA61 AGCCGGTGAT ACACTATCAA GAATCGCGGC TCAGTTTAAG ATGAATTTGG CTCAAATCGC121 TGCGTTGAAT CAAATTTCAA ATTTGAATGC AATCCGCGTG GGACAAGTTT TGAAGGTATC181 TAACGCCGCC GGTTCAAATA ATACGCAAAA TACAACCCAG CCTTCTGCAG GGGTACCAAC241 GAATACGGCG TCAAGCACAA CAGGTTATAC TGTTAAGTCT GGGGATACGT TGTCAGCAAT301 CGCTGCGGCA AACGGTGTTT CATTGGCGAA CTTGCTCAGC TGGAACAACT TGTCATTGCA361 AGCCATTATC TATCCTGGAC AAAAGTTAAC GATTCAAAAC GCTAACAATG CCACGGTCAC421 AACGCCAAAC GCACCGACAA GTACGCCAAC GGTTATGCCA TCAACGAACG GTAGTTACAC481 GGTGAAGTCA GGCGATACAT TGTATGGTAT TGCAGCAAAG CTAGGGACGA ACGTGCAAAC541 GTTGCTATCT TTGAATGGTT TGCAATTGTC AAGCACCATT TATGTGGGGC AAGTTTTGAA601 AACAACAGGC GCACCAGTTG CTGGTGCTGG AACTGCCACA TCAACACCAA CACCAGTAAC661 ACCAACAGTC TCAAAACCGG CTGCAGCAAA CGGTGTGTCA ACAGCTGGCT TAAGTGCTGC721 GCAAGCCGCA TGGTTGCGGA CAGCGGTTGT TGATGCGCAA GCGGCAACAG CAGGGACGGG781 CGTTTTGGCA TCCGTAACGG TTGCTCAAGC GATTCTTGAA AGCGGTTGGG GACAATCAGC841 GTTGGCTTCA GCACCATACC ATAACTTTAA TTTATATTTA ATAAAGGTGA AAAACACATG901 GAAATTGATG ACATTGCTGC TATCGTAAAA ATATTAAACG ACAATAACCT TAGTCATATC961 TCATTTAAAA AAGGTGATTC GAAAATTAGT GTCTCAAAAA ACATTAATCG TGAGATTCAA1021 ATAGCTGACA GCATAGATAT TGCAAAAGAA CAACCACAGC AAGAGATGCG TTACATCGTA1081 TCACCAACAA TTGGCACGTT TTATGCCGCG TCTGATCCTG AATCGTCACC CTTTGTTACA1141 GTGGGACAGA CAGTAACTCA ATCGACTGTA GTTGGTATTG CAGAAGCCAT GAAAATGATG1201 ACCAACATCT TAGCAGATAA TGAGGGCGTG ATTGCTGAGG TTTTAGTTCA AGATGGTGAT1261 GTAATTGAAT TTGGACAAAA ATTGTTTAGG TTGTCGTGAT GCGCAGTACA GTAGAACACA1321 ACTTTAAAAT TTTAATTGCT AACCGTGGTG AAATTGCGGT CAGAATTATT CGAGCGGCAA1381 AAACATTGGG GTTCACAACA GTAGCGGTTT ATTCGTCCGC CGACAAAGCA TCGCTACATG1441 TCGCAATGGC CGACGAGGCC GTCCAAATAG GTCCTGCAAA TGCGATTGAT AGCTATTTGA1501 ACCAACATGC AATTTTAGCG GCAGCAGAGA TTACACATGC GGATGCCATT CATCCTGGTT1561 ATGGCTTTTT GTCTGAAAAC GCGGATTTTG CCAGTAAAGT CGAATCAATG GGTCTTACAT1621 TTATTGGCCC AACAAGTGAT ACCATTTCTC AAATGGGAGA TAAGGCTAGT GCACGTCAAT1681 TTATGTCAGA AACCGGCGTA CCGATTGTGT CTGGAAGTGA TGTTTTTTTT GATAATGTAC1741 ATGCTGGTTT GACACAGGCT AATCAAATTG GTTATCCTGT GATGCTTAAG TCTGTTGCTG1801 GTGGCGGCGG AAAAGGTATG CGACTGATTC CAAGCCAAGA TAGTTTTCAA TCATTATTCG1861 AGCTTGCCCA GAACGAAATT AAAGCGTCAG TTGGTGATGG TCGTATGTAT CTTGAGAAAT1921 TCATTGATCA GCCACGGCAT ATTGAAGTAC AGGTATTAGG TGATGGGTTA GGAGATGCCA1981 TTGTCTTGGG TGAACGTGAC TGCACTATTC AAAGTCATCA TCAAAAAGTT ATTGAAGAAG2041 CCCCCAGTCA GTACCTGGAT GCAGCCACAC GCTCTGAGAT GTTAGATGTC GCGTTGAAAG2101 CGACAAAAAA GATGGCCTAT CGTAGTGCAG GTACTTTTGA ATTTTTGTAT CAAGGCCCTG2161 GTCGTTATTA TTTCATGGAG ATGAATACAC GATTG(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度275個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(iii)序列描述SEQ ID NO.21 Met Asn Leu Ala Gln Ile Ala Ala Leu Asn Gln Ile Ser Asn Leu16 ASn Ala Ile Arg Val Gly Gln Val Leu Lys Val Ser Asn Ala Ala31 Gly Ser Asn Asn Thr Gln Asn Thr Thr Gln Pro Ser Ala Gly Val46 Pro Thr Asn Thr Ala Ser Ser Thr Thr Gly Tyr Thr Val Lys Ser61 Gly Asp Thr Leu Ser Ala Ile Ala Ala Ala Asn Gly Val Ser Leu76 Ala Asn Leu Leu Ser Trp Asn Asn Leu Ser Leu Gln Ala Ile Ile91 Tyr Pro Gly Gln Lys Leu Thr Ile Gln Asn Ala Asn Asn Ala Thr106 Val Thr Thr Pro Asn Ala Pro Thr Ser Thr Pro Thr Val Met Pro121 Ser Thr Asn Gly Ser Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asp Thr Leu Tyr136 Gly Ile Ala Ala Lys Leu Gly Thr Asn Val Gln Thr Leu Leu Ser151 Leu Asn Gly Leu Gln Leu Ser Ser Thr Ile Tyr Val Gly Gln Val166 Leu Lys Thr Thr Gly Ala Pro Val Ala Gly Ala Gly Thr Ala Thr181 Ser Thr Pro Thr Pro Val Thr Pro Thr Val Ser Lys Pro Ala Ala196 Ala Asn Gly Val Ser Thr Ala Gly Leu Ser Ala Ala Gln Ala Ala211 Trp Leu Arg Thr Ala Val Val Asp Ala Gln Ala Ala Thr Ala Gly226 Thr Gly Val Leu Ala Ser Val Thr Val Ala Gln Ala Ile Leu Glu241 Ser Gly Trp Gly Gln Ser Ala Leu Ala Ser Ala Pro Tyr His Asn256 Phe Asn Leu Tyr Leu Ile Lys Val Lys Asn Thr Trp Lys Leu Met271 Thr Leu Leu Leu Ser(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長度32堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.3TAAAGCTTCA AGATGAATTT GGCTCAAATC GC 32(2)SEQ ID NO.4的信息
(i)序列特征(A)長度32堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.4GCGGAATTCA GATATGACTA AGGTTAGTGT CG 3權利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有tropic 1808蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸101-928位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸101-928位的核苷酸序列雜交。
2.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼—多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。
3.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.1中從核苷酸101-928位的核苷酸序列。
4.一種分離的tropic 1808蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求1所述的DNA。
7.一種用權利要求6所述載體轉化的宿主細胞。
8.一種產生具有tropic 1808蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有tropic 1808蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成tropic 1808蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸101-928位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成tropic 1808蛋白的重組細胞；(c)在適合表達tropic 1808蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有tropic 1808蛋白活性的多肽。
9.一種能與權利要求4所述的tropic 1808蛋白多肽特異性結合的抗體。
10.一種探針分子，其特征在于，它含有權利要求1所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的大鼠蛋白及其編碼核苷酸序列。更具體地說,本發(fā)明涉及大鼠蛋白tropic1808的cDNA序列,該序列所編碼的蛋白是一種促神經生長因子。本發(fā)明還涉及這些多核苷酸和多肽的應用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產方法。
文檔編號C12N15/12GK1263156SQ9911347
公開日2000年8月16日 申請日期1999年2月11日 優(yōu)先權日1999年2月11日
發(fā)明者顧曉松, 顧建新, 張沛云, 譚湘陵, 丁斐, 陳淳 申請人:上海醫(yī)學生命科學研究中心有限公司, 南通醫(yī)學院