專利名稱：：截短型人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子活性片段及其融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及重組融合蛋白與其制備方法，具體涉及蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽融合截短型人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子活性片段編碼核酸，以及蛋白的原核表達(dá)制備方法。本發(fā)明還涉及所述轉(zhuǎn)導(dǎo)肽融合截短型人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子活性片段的蛋白或核酸分子各自及其藥物組合物，可以用于治療神經(jīng)退行性疾病、視網(wǎng)膜退行性疾病、肥胖癥或與肥胖癥相關(guān)的疾病，及神經(jīng)損傷相關(guān)疾病中的用途。技術(shù)背景睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Ciliaryneurotrophicfactor,CNTF)最初由Helfand等在1976年發(fā)現(xiàn)，1984年Barbin等從雞睫狀神經(jīng)元提取獲得，因可維持雞副交感神經(jīng)節(jié)的存活而得名。CNTF能促使多種神經(jīng)細(xì)胞的存活，是笫一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的能維持在體和離體脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活及突起生長(zhǎng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。人CNTF基因位于人第11號(hào)染色體長(zhǎng)臂近端11ql2，為單拷貝基因。沒(méi)有信號(hào)肽，沒(méi)有糖基化的通用序列，只在第17位有一個(gè)非活性必需的半胱氨酸殘基。與白血病抑制因子(LIF)、IL-6、0SM及粒細(xì)胞集落剌激因子(G-CSF)等的分子結(jié)構(gòu)有一定的相似性，屬于神經(jīng)性細(xì)胞因子家族。CNTF的經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)途徑是CNTF與其受體oc亞基結(jié)合后再與細(xì)胞膜上亞基gpl30和LIFRP聚合，形成受體復(fù)合物，激活膜內(nèi)側(cè)的JAK激酶，使STAT磷酸化，進(jìn)入核內(nèi)，與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成。CNTF在體內(nèi)具有多種生物學(xué)功能，主要作用對(duì)象是神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)睫狀神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、交感神經(jīng)元、脊神經(jīng)節(jié)的感覺(jué)神經(jīng)元、脊髄運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、膽堿能神經(jīng)元、多巴胺神經(jīng)元等多種神經(jīng)細(xì)胞都有作用，可促進(jìn)這些神經(jīng)細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)，支持其生存，促進(jìn)神經(jīng)損傷后的再生和修復(fù)。1.CNTF與疾病1.1CNTF與神經(jīng)退行性病變阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)是一種進(jìn)4亍性致命性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。主要破壞腦細(xì)胞，引起漸進(jìn)性記憶力和認(rèn)知力減退、語(yǔ)言障礙，思考和行為能力下降，精神行為異常，影響工作、生活及社交活動(dòng)，病情呈進(jìn)行性加重，逐漸喪失獨(dú)立生活能力，發(fā)病后多因并發(fā)癥而死亡。目前全世界患阿爾茨海默病的人數(shù)已超1800萬(wàn)，患病人數(shù)仍在不斷地增加。我國(guó)阿爾茨海默病患病人數(shù)已超過(guò)500萬(wàn)，而且隨著我國(guó)人口老齡化進(jìn)程的加快，這個(gè)數(shù)字將更為龐大。隨著年齡的增長(zhǎng)，癡呆的發(fā)病率和患病率均呈逐漸增高的趨勢(shì)。在60歲以上的老年人群中，年齡每增加5歲，阿爾茨海默病的患病危險(xiǎn)就可增加1.85倍，阿爾茨海默病已經(jīng)成為21世紀(jì)威脅人類的最嚴(yán)重疾病之一。盡管病人數(shù)目在增加，目前尚沒(méi)有治愈措施，全世界都加快腳步尋找更好的治療方法，延緩發(fā)病或者阻止疾病進(jìn)展。阿爾茨海默病人大腦中特定區(qū)域的某些類型神經(jīng)細(xì)胞呈進(jìn)行性變性死亡，易感區(qū)包括杏仁核、海馬及海馬周圍區(qū)，受染細(xì)胞群體包括兒茶酚胺能、5羥色胺能及膽堿能神經(jīng)細(xì)胞。CNTF可阻止體內(nèi)這些神經(jīng)元的退行性喪失，能促進(jìn)遭受神經(jīng)病學(xué)損傷或神經(jīng)變性疾病損傷的中樞神經(jīng)元存活，CNTF還對(duì)亨延頓(Huntington)舞蹈癥、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)、帕金森綜合癥、黑質(zhì)退行性病變、多系統(tǒng)委縮癥和脊髄性肌萎縮(SMA)等有治療作用。1.2CNTF與視網(wǎng)膜退行性疾病CNTF對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞具有保護(hù)作用。在眾多的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子中，CNTF是唯一能有效促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞再生的營(yíng)養(yǎng)因子，CNTF可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞再生.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究均已證明，CNTF是感光細(xì)胞(視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞)發(fā)育過(guò)程中所必需的營(yíng)養(yǎng)因子。玻璃體內(nèi)注射CNTF可以對(duì)感光細(xì)胞產(chǎn)生明顯的保護(hù)作用。CNTF也可治療青光眼.肥胖是一種嚴(yán)重危害人體健康的慢性疾病，肥胖可以大大提高患糖尿病、心臟病、高血壓、中風(fēng)和癌癥等疾病的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CNTF降低小鼠的體脂，從而使小鼠體重下降。CNTF與位于丘腦部位的受體結(jié)合，通過(guò)STAT3信號(hào)傳導(dǎo)途徑，能使缺乏leptin的肥胖小鼠(ob/obmice)脂肪減少，體重降低；對(duì)于飲食誘導(dǎo)的肥胖模型小鼠(DIOmice)，CNTF也能使之體重下降，這種小鼠模型更能代表人類肥胖癥的實(shí)際情況。CNTF可能使丘腦的體重調(diào)節(jié)點(diǎn)下調(diào)，從而抑制食物攝入，與通過(guò)嚴(yán)格控制飲食減肥及其他的治療方法相比，CNTF不會(huì)發(fā)生停藥后過(guò)量攝入食物而引起體重反彈，因此，CNTF有望開(kāi)發(fā)成為一種新型、高效的減肥藥品，具有廣闊的臨床應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。1.4CNTF與神經(jīng)損傷相關(guān)疾病外周神經(jīng)雪旺細(xì)胞中存在大量的CNTF，當(dāng)外周神經(jīng)受損時(shí)，CNTF得以釋放進(jìn)入細(xì)胞間隙，這些CNTF可通過(guò)軸突逆向轉(zhuǎn)運(yùn)到胞體獨(dú)自發(fā)揮作用，也可和肌肉中存在的可溶性CNTFRA形成復(fù)合物而發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)的作用。外周神經(jīng)切斷可引起相應(yīng)脊髓皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡，應(yīng)用CNTF能支持部分脊髓皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活。CNTF促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突在正常肌肉中分支發(fā)芽。CNTF能防止初生大鼠因軸突切斷導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的死亡，切斷面神經(jīng)的實(shí)驗(yàn)顯示，CNTF能有效的防止面神經(jīng)核大部分神經(jīng)細(xì)胞的退變。2.重組人CNTF的研究現(xiàn)狀CNTF目前主要應(yīng)用于治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病如肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)。但臨床應(yīng)用的效果卻并不令人滿意。將裝有能分泌CNTF的活細(xì)胞的半透膜微囊植入病變局部，可提高局部CNTF濃度，降低血藥濃度、減輕副作用.包被細(xì)胞輸送CNTF療法的一期實(shí)驗(yàn)顯示出CNTF對(duì)治療色素性視網(wǎng)膜炎有效。CNTF治療其他CNS疾病的研究較少，CNTF在CNS大部分區(qū)域的水平均較低，人體內(nèi)自然產(chǎn)量極低，基因工程是獲得大量高純度CNTF的可靠手段。3.CNTF與血腦屏障血腦屏障是存在于血液和腦組織之間的屏障系統(tǒng)，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞間的緊密連接是血腦屏障的基本構(gòu)成成分。在正常生理情況下只允許氣體分子及相對(duì)質(zhì)量小于0.6kD的脂溶性小分子通過(guò)。從神經(jīng)生長(zhǎng)因子發(fā)現(xiàn)以來(lái)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NTFs)已有20余種。但半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，由于血腦屏障的作用，NTFs的臨床應(yīng)用仍很有限。目前臨床上仍缺乏一條合理有效的中樞給藥途徑。已報(bào)道的給藥途徑主要包括外周系統(tǒng)給藥、大腦實(shí)質(zhì)直接注射、側(cè)腦室給藥、鞘內(nèi)注射及經(jīng)鼻給藥幾種。外周給藥，創(chuàng)傷性小，但受到血腦屏障的嚴(yán)重影響，進(jìn)入大腦實(shí)質(zhì)的量非常有限。大腦實(shí)質(zhì)直接注射、側(cè)腦室給藥、鞘內(nèi)注射給藥量容易控制，作用部位直接，但創(chuàng)傷性給藥風(fēng)險(xiǎn)大，應(yīng)用困難。CNTF是蛋白質(zhì)大分子，很難透過(guò)血腦屏障，從而限制了其在中樞的治療應(yīng)用，目前開(kāi)展的一些細(xì)胞移植和基因治療方面的研究雖然在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得了一些進(jìn)展，由于這些治療方案都采取手術(shù)和腦室注射等創(chuàng)傷性手段，離臨床應(yīng)用尚有很大的距離。本發(fā)明選擇蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽為CNTF運(yùn)載體，采用基因工程技術(shù)將CNTF基因進(jìn)行改構(gòu)，使克隆表達(dá)的CNTF蛋白N端缺失14個(gè)氨基酸，以增高其活性，并去掉C端15個(gè)氨基酸，以增加穩(wěn)定性和可溶性。通過(guò)活性檢測(cè)，證明截短的CNTF蛋白活性片段比市售rhCNTF顯示出更高的生物活性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種具有跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)功能并且具有更高生物活性的截短型人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子活性片段，所述蛋白特征為人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子n端缺失14個(gè)氨基酸同時(shí)融合了蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽，并去掉了C端15個(gè)氨基酸。所述蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽融合截短型人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子活性片段(下文縮寫(xiě)成CNTFt)，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其中截短型活性片段的氨基酸序列如sbqidN0,2所示，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了編碼所述蛋白的核酸序列，其中蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽融合截短型人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子活性片段的核酸序列如SEQIDN0.3所示，而截短型活性片段的核酸序列如SEQIDN0.4所示。本發(fā)明進(jìn)一步提供制備CNTFt蛋白的方法，所述方法包括通過(guò)對(duì)CNTF分子及其與受體結(jié)合的關(guān)鍵部位的分析，同時(shí)綜合比較分析CNTF蛋白的溶解性、穩(wěn)定性及免疫原性，設(shè)計(jì)并獲得CNTF截短型活性片段的cDNA;結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的強(qiáng)大透膜優(yōu)勢(shì)，將TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽與CNTF截短型活性片段融合，獲得本發(fā)明的CNTFt的基因序列，構(gòu)建了原核表達(dá)栽體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，包涵體經(jīng)洗滌稀釋復(fù)性后，獲得高純度的CNTFt活性蛋白。因而提供了含有CNTFt的核酸分子的重組表達(dá)載體，包含被任何所迷載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以及由其衍生的新的林系或細(xì)胞系。本發(fā)明還展示了CNTFt的透膜能力和生物活性。CNTFt能透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入SH-SY5Y細(xì)胞，并能通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，可用于穿越皮膚、粘膜、角膜、漿膜、肌膜、血管及淋巴膜、脈絡(luò)膜、神經(jīng)膜、血腦屏障等一切細(xì)胞膜及生物膜的治療用途；能促進(jìn)TF-1細(xì)胞的生長(zhǎng)與存活，促進(jìn)各種神經(jīng)元的生長(zhǎng)及存活，包括海馬神經(jīng)元，皮層神經(jīng)元等，并促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)和再生，減少神經(jīng)元的正常死亡以及學(xué)習(xí)記憶能力的下降。本發(fā)明提供CNTFt多種疾病的治療用途。CNTFt能用于阿爾茨海默病、帕金森綜合癥、黑質(zhì)退行性病變、多發(fā)性硬化癥、亨延頓舞蹈癥、脊髓性肌萎縮和肌萎縮性側(cè)索硬化癥等運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病，及神經(jīng)損傷相關(guān)疾病等；CNTFt能降低體重，可用于肥胖癥或與肥胖癥相關(guān)的疾??；CNTFt能用于治療視網(wǎng)膜退行性疾病和青光眼。本發(fā)明進(jìn)一步提供含有CNTFt及其核酸分子作為活性成分的藥物組合物，所述藥物組合物包含藥學(xué)上可接受的載體，對(duì)患者沒(méi)有危險(xiǎn)，不偉有效成分失活或者不干擾有效成分的作用。含CNTFt蛋白的藥物組合物可以配制成通過(guò)包括靜脈內(nèi)、皮下、肌肉、鞘內(nèi)、鼻腔粘膜、口腔粘膜、舌下含服或者直腸粘膜等方式給藥，優(yōu)選本發(fā)明藥物組合物借助胃腸外制劑施用，其施用的有效方法包括吸入霧劑、皮膚涂抹劑、滴眼液劑、注射劑或其緩控釋制劑。圖l.SOE-PCR擴(kuò)增出目的CNTF基因的1.2%瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道l:DNAmarker;泳道2:CNTFt。圖2.雙酶切鑒定pBV220-CNTFt質(zhì)粒。泳道l、2和3:pBV220-CNTFt酶切后；泳道4:DNAMarker。圖3.CNTFt的表達(dá)。1:蛋白Marker;2:全菌；3:上清；4:沉淀；5:包涵體洗滌液I洗后沉淀；6:包涵體洗滌液I洗后上清；7:包涵體洗滌液n洗后上清；8:包涵體洗滌液n洗后沉淀。圖4.包涵體經(jīng)稀釋透析復(fù)性后的SDS-PAGE電泳圖。泳道l:蛋白Marker;泳道2-4:CNTFt。圖5.Westernblot分析CNTFt的結(jié)果。圖6.CNTFt對(duì)TF-1細(xì)胞的活性測(cè)定。圖7熒光免疫組化顯示CNTFt透過(guò)SH-SY5Y細(xì)胞膜。A:CNTFt;B:rhCNTF對(duì)照品。圖8.熒光免疫組化顯示CNTFt透過(guò)小鼠血腦屏障。A:CNTFt給藥組的海馬齒狀回；B:rhCNTF對(duì)照品組的海馬部位。圖9.Morris水迷宮檢測(cè)CNTFt對(duì)Ap誘導(dǎo)的阿爾茨海默病模型小鼠的治療作用。*，p<0.01。具體實(shí)施例方式本發(fā)明將通過(guò)下列實(shí)施例得到更清楚的說(shuō)明，這些實(shí)施例只是說(shuō)明性的，不應(yīng)當(dāng)理解成限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例一CNTFt的構(gòu)建以健康成人白細(xì)胞基因組DNA為模板，重疊延伸PCR(S0E-PCR)擴(kuò)增目的基因。以引物P1和P4擴(kuò)增出全長(zhǎng)CNTF基因，反應(yīng)條件為951C預(yù)變性5分鐘；941C變性1分鐘，551C退火1分鐘，72"C延伸4分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后于721C延伸10分鐘結(jié)束反應(yīng)。1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，得到CNTF帶內(nèi)含子的全片段；回收；以所得CNTF為模板，P1與P2組成一對(duì)引物擴(kuò)增外顯子1，P3與P4擴(kuò)增外顯子2。其中各引物序列為PI(CGGGTACCATGGACCTCTGTAGCCGCTCTATCTG);P2(GCCCTGATGCTTCACATAGGATTCCGTAAGAGCAG);P3(CTCTTACGGAATCCTATGTGAAGCATCAGGGCCTG);P4(CGCGTCGACTTACCCAGTCTGATGAGAAG)EXONl的PCR條件為95n預(yù)變性5分鐘；94'C變性l分鐘，55'C退火l分鐘，72'C延伸15秒，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后于72°C延伸10分鐘結(jié)束反應(yīng)。2°/。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，切膠回收；EXON2的PCR條件為95X:預(yù)變性5分鐘；94C變性l分鐘，60'C退火l分鐘，72X:延伸30秒，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后于72。C延伸10分鐘結(jié)束反應(yīng)。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，切膠回收。分別回收純化上述外顯子1和外顯子2的擴(kuò)增產(chǎn)物，各取ljiL作為模板，Pl和P4作為引物各取ljiL,采用2xpfu-MasterMix10pL，加水6jiL使反應(yīng)體系為2(VL，行PCR擴(kuò)增出所需目的基因。PCR條件為95。C預(yù)變性5分鐘；94X:變性1分鐘，48'C退火1分鐘，72X:延伸80秒，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)；94匸變性1分鐘，58匸退火1分鐘，72。C延伸80秒，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；最后于72X:延伸10分鐘結(jié)束反應(yīng)。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，在60Qbp處可見(jiàn)一條明顯的擴(kuò)增帶(圖1)，與所需目的片段大小符合?；厥赵噭┖谢厥铡；厥掌魏螅cpBV220載體同時(shí)雙酶切，回收后連接，構(gòu)建pBV220-CNTFt，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中。酶切鑒定獲得pBV220-CNTFt質(zhì)粒(圖2)。核普酸序列測(cè)定證明與理論值一致。實(shí)施例二CNTFt的表達(dá)與復(fù)性1.重組基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)經(jīng)鑒定構(gòu)建正確的PBV220-CNTFt重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21/pLysS(DE3)感受態(tài)的細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性菌落置3mL含氨,青霉素IOOmg/L的LB培養(yǎng)液中，30*0搖床培養(yǎng)過(guò)夜，取活化菌液10%接種于lOmLLB培養(yǎng)液(含氛芐青霉素100mg/L)中，培養(yǎng)至OD55。為0.6時(shí)，將溫度調(diào)至37-47lC誘導(dǎo)表達(dá)。收集誘導(dǎo)表達(dá)4-8小時(shí)的菌體，10OOOg離心IO分鐘收集表達(dá)菌體，超聲破碎，離心分離上清與沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖3)。2.包涵體處理液包涵體洗滌液I:2mol/L尿素，50mmol/LNaCl，50mmol/LTris-HCl，5mmol/LEDTA，pH7.0-9.0;包涵體洗滌液II:4mol/L尿素，50mmol/LNaCl,50mmol/LTris-HCl，5mmol/LEDTA，pH7.0-9.0;包涵體溶解液10mol/L尿素，10mmol/L檸檬酸緩沖液pH3.0-5.0;包涵體復(fù)性液10mmol/LTris-HCl，0.2mol/LL-精氨酸，0.1mmol/L還原型谷胱甘肽，0.01mmol/L氧化型谷胱甘肽pH8.0-9.0;3.包涵體的稀釋透析復(fù)性超聲破碎后的沉淀包涵體分別用包涵體洗滌液i和n洗滌，4r過(guò)夜。將洗滌后的包涵體溶于包涵體溶解液中，10000g離心10分鐘，將上清以1:20的體積比緩慢加入復(fù)性液中，于4匸孵育一周。10000g離心15分鐘，取上清液緩慢透析，并經(jīng)濾膜除菌后儲(chǔ)存。稀釋復(fù)性沉淀的大部分是雜蛋白，離心后的上清能回收絕大部分的目的蛋白(圖4)，所以稀釋復(fù)性在復(fù)性的同時(shí)去除了雜蛋白，是一種方便、簡(jiǎn)單而且易行的適合放大生產(chǎn)的好方法。稀釋復(fù)性的方法大大增加了樣品處理量，因此更省時(shí)，更利于放大且回收率高，適合進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化研究的需要。4.CNTFt分子量的測(cè)定按照2000年版《中國(guó)生物制品規(guī)程》附錄方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳。CNTFt電泳的表觀分子量為22kD，理論分子量為21.4kD，符合要求。5.CNTFt免疫印跡檢測(cè)表達(dá)的蛋白進(jìn)行蛋白免疫印跡檢測(cè)，結(jié)果顯示抗CNTF單克隆抗體能與所表達(dá)蛋白特異性結(jié)合(圖5)，說(shuō)明構(gòu)建、表達(dá)和純化是成功的。實(shí)施例三CNTFt的生物學(xué)活性檢測(cè)人紅白血病細(xì)胞TF-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清和10ng/mlGM-CSF的16"培養(yǎng)基中，使用前，先用無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM洗細(xì)胞4次，用DMEM培養(yǎng)基稀釋至濃度為4x105/ml，以每孔100ji1細(xì)胞加入上述96孔板，CNTFt樣品用無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM倍比稀釋，每孔加樣lOOyl，使終濃度為O.10，0.50，1，5，10，50，100，500，1000，2000ng/ml，于37。C、5%0)2條件下培養(yǎng)48小時(shí)左右，每孔加20p1MTT，再培養(yǎng)5小時(shí)后，加入20°/。SDS80pl，充分溶解結(jié)晶顆粒后在酶聯(lián)儀上測(cè)D570。同樣條件測(cè)定參照品rhCNTF的活性作對(duì)照。實(shí)施例四CNTFt越過(guò)細(xì)胞膜，穿越血腦屏障入腦為確證CNTFt是否通透細(xì)胞膜，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞中分別加入CNTFt和市售rhCNTF作用l小時(shí)后，進(jìn)行熒光免疫組化鑒定，同時(shí)設(shè)PBS對(duì)照。結(jié)果顯示，CNTFt處理細(xì)胞中出現(xiàn)明亮的綠色熒光，而rhCNTF處理的細(xì)胞綠色熒光較弱(圖7)，說(shuō)明CNTFt能跨越細(xì)胞膜進(jìn)入胞質(zhì)。為確證CNTFt是否通過(guò)血腦屏障，將CNTFt腹腔注入小鼠后1小時(shí)處死取腦組織行冰凍切片，以抗CNTF為一抗做熒光免疫組織化學(xué)檢測(cè)。CNTFt組的大腦皮層及海馬切片顯示有綠色熒光發(fā)布，而rhCNTF組在大腦實(shí)質(zhì)中未見(jiàn)到熒光(圖8)，結(jié)果表明CNTFt可透過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)。實(shí)施例五CNTFt對(duì)阿爾茨海默疾病模型小鼠的療效阿爾茨海默疾病動(dòng)物模型的制作將Ap(25-35)溶于lml滅菌生理鹽水中，濃度為1.0mg/ml。密封后于37。C培養(yǎng)箱中96小時(shí)，使其成為有毒性的凝聚態(tài)后。進(jìn)行小鼠側(cè)腦室內(nèi)Ap注射，注射劑量為每只小鼠3W，假手術(shù)組注射相同體積的生理鹽水。注射第ll天對(duì)小鼠進(jìn)行Morris水迷宮檢測(cè)，連續(xù)5天，水迷宮實(shí)驗(yàn)潛伏期大于120秒的小鼠，為造模成功小鼠。將造模成功的小鼠用于實(shí)驗(yàn)。Morris水迷宮水迷宮自動(dòng)控制儀裝置為由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制，水池直徑100cm，水深35cm，水溫控制在(23±2)。C'將安全平臺(tái)置于Morris水迷宮的第三象限，作為小鼠入水后搜索的目標(biāo)，以第一、二象限為小鼠入水點(diǎn)，水面高出安全平臺(tái)約lcm。水池上空通過(guò)攝像機(jī)與計(jì)算機(jī)相連，計(jì)算機(jī)自動(dòng)采集數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)每天訓(xùn)練2次，每次訓(xùn)練3分鐘。每次入水前將小鼠置于安全平臺(tái)上15秒，訓(xùn)練結(jié)束，再次停留15秒，以加強(qiáng)記憶效果。如果小鼠在入水120秒以內(nèi)未能找到水池中的安全平臺(tái)，可將其放置于安全平臺(tái)上休息30秒后，再進(jìn)行下一次訓(xùn)練，共訓(xùn)練5天。水迷宮實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求安靜，避免一切外界干擾。將小鼠從入水至找到安全平臺(tái)的時(shí)間(即潛伏期)為定量標(biāo)準(zhǔn)來(lái)衡量其空間記憶能力。模型小鼠被隨機(jī)分為AD模型生理鹽水對(duì)照組、rhCNTF腹腔治療組及直腸治療組和CNTFt腹腔治療組及直腸治療組。每組1只小鼠。給藥量100jig/kg/day，連續(xù)給藥10天。Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AD模型小鼠無(wú)論是腹腔注射還是直腸給予CNTFt均能顯著縮短其潛伏期，與AD模型生理鹽水組比較差異極為顯著(p<0.01);而rhCNTF組未能改善AD模型小鼠的潛伏期，與AD模型生理鹽水組比較無(wú)顯著性差異(p>0.05)(圖9)。實(shí)施例六CNTFt的抗肥胖作用取若干只小鼠(斷乳KM小鼠，雌雄各半，10-15克)，隨機(jī)選擇15只作為正常對(duì)照組，給予普通飼料，其余喂以高能飼料(膽固醇1%、蛋黃粉10%、豬油10%、基礎(chǔ)飼料79%)，造成DIO模型(飲食誘導(dǎo)型肥胖模型)，第1周每天每只給予8克營(yíng)養(yǎng)飼料，以后每周增加2克，自由飲水，共造模8周。造模期間，每周用電子天平測(cè)體重1次以觀察小鼠的造模情況。第8周末，以模型組小鼠體重超過(guò)正常組小鼠體重的20%為DIO模型成功，從造模成功的小鼠中選出50只，隨機(jī)分成5組，分別為模型對(duì)照組、腹腔給藥高低劑量組和直腸給藥高低劑量組，從正常小鼠中選出10只作為正常對(duì)照。低劑量CNTFt給藥為100fig/kg/day，高劑量給藥1000ng/kg/day，共10天。對(duì)照組給予同等量的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)期間隨時(shí)注意動(dòng)物行為變化，觀察小鼠每天的飲食情況，精神活動(dòng)及糞便干稀程度。末次給藥并禁食24小時(shí)后，稱取動(dòng)物體重，并按(終末體重-初始體重)/初始體重xlOW，計(jì)算體重增加率，將小鼠用乙醚麻醉后，準(zhǔn)確測(cè)量小鼠從鼻尖到肛門(mén)處的距離即體長(zhǎng)，并根據(jù)下式計(jì)算Lee，s指數(shù)Lee，s指數(shù)公式-(體重g)1/3x1000/體長(zhǎng)cm。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物各項(xiàng)行為包括飲水，精神活動(dòng)正常，糞便無(wú)異常，實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死動(dòng)物，檢查各臟器，動(dòng)物的心、肝、脾、肺、腎等均正常，肝臟色澤鮮紅，光滑。小鼠體重變化見(jiàn)表l。表1.不同劑量CNTFt在不同給藥途徑下對(duì)小鼠體重的影響組別(n)初始體重(g)終末體重(g)體重變化(g)Lee，s指數(shù)OO正常對(duì)照24.0±1.427.6±1.43.6±1.2304.40±8.92DI0-對(duì)照57.3±2.766.2±2.68.9±2.1343.87±15.16腹腔低劑量58.6±3.056.9±2.3-1.7±1.3"332.07±15.61直腸低劑量56.9±2.955.8±3.0-1.1±1.7"332.16±11.76腹腔高劑量57.0±3.050.9±1.3-6.1±2.5"319.92±13.63*直腸高劑量57.2±2.251.6±2.2-5.6±1.3"313.73±15.08*"，p<0.01,*，p<0.05vsDI0-對(duì)照。實(shí)施例七制備以CNTFt為活性組分的注射劑配方:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>無(wú)菌過(guò)濾后分裝lml/支，冷凍保存，或凍干，制成凍干粉針。實(shí)施例八制備治療視網(wǎng)膜變性疾病、視神經(jīng)損傷及青光眼的滴眼劑配方:<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>無(wú)菌過(guò)濾后分裝10ml/支，4C保存。序列表<110>截短型人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子活性片段及其融合蛋白〈120〉中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所<130>IDC080036<160>7〈170>Patentlnversion3.2<210〉1<211>188<212〉PRT<213>人工序列<400>1MetTyrGlyArgLysLysArgArgGinArgArgArgGlyGlyGlyThr151015MetAspLeuCysSerArgSerlieTrpLeuAlaArgLyslieArgSer202530AspLeuThrAlaLeuThrGluSerTyrValLysHisGinGlyLeuAsn354045LysAsnlieAsnLeuAspSerAlaAspGlyMetProValAlaSerThr505560AspGinTrpSerGluLeuThrGluAlaGluArgLeuGinGluAsnLeu65707580GinAlaTyrArgThrPheHisValLeuLeuAlaArgLeuLeuGluAsp859095GinGinValHisPheThrProThrGluGlyAspPheHisGinAlalie100105110HisThrLeuLeuLeuGinValAlaAlaPheAlaTyrGinlieGluGlu115120125LeuMetlieLeuLeuGluTyrLyslieProArgAsnGluAlaAspGly130135140MetProlieAsnValGlyAspGlyGlyLeuPheGluLysLysLeuTrp145150155160GlyLeuLysValLeuGinGluLeuSerGinTrpThrValArgSerlie165170175HisAspLeuArgPhelieSerSerHisGinThrGly180185<210>2<211〉172<212>PRT<213>人工序列<400>2MetAspLeuCysSerArgSerlieTrpLeuAlaArgLyslieArgSer151015AspLeuThrAlaLeuThrGluSerTyrValLysHisGinGlyLeuAsn202530LysAsnlieAsnLeuAspSerAlaAspGlyMetProValAlaSerThr354045AspGinTrpSerGluLeuThrGluAlaGluArgLeuGinGluAsnUu505560200810088976.3AlaArgLeuLeuGluAsp65707580GinGinValHisPheThrProThrGluGlyAspPheHisGinAlalie859095HisThrLeuLeuLeuGinValAlaAlaPheAlaTyrGinlieGluGlu100105110LeuMetlieLeuLeuGluTyrLyslieProArgAsnGluAlaAspGly115120125MetProlieAsnValGlyAspGlyGlyLeuPheGluLysLysLeuTrp130135140GlyLeuLysValLeuGinGluLeuSerGinTrpThrValArgSerlie145150155160HisAspLeuArgPhelieSerSerHisGinThrGly165170<210>3<211〉564<212〉腿<213>人工序列<400〉3tatggtcgtaaa卿cgacgccaacgtagacgtggtggtggtaccatggacctctgtagc60cgctctatctggctagcaaggaagattcgttcagacctgactgctcttacggaatcctat120gtgaagcatcagggcctgaacaagaacatcaacctggactctgcggatgggatgccagtg180gcaagcactgatcagtggagtgagctgaccgaggcagagcgactcca柳gaaccttcaa240gcttatcgtaccttccatgtaccccaaccgaaggtgactttttgcataccagatagaggagctgatgggatgcctattaacta犯ggtgctgcaggagctatttcttctcatcagactgg<210〉4〈211>519〈212>腿〈213>人工序列〈400〉4atggacctctgtagccgctccttacggaatcctatgtgaagatgggatgccagtggcaagcaagagaaccttcaagcttacagcaggtgcattttaccccctccaagtcgctgcctttgcatcccccgcaatgaggctgaa犯aagctgtggggcct犯acatgaccttcgtttcatttc<210>5<211>11<212〉PRT<213>人工序列<400〉5tttgttggccaggctcttagaagaccagcaggtgcatttt300ccatcaagctatacatacccttcttctccaagtcgctgcc360gttaatgatactcctggaatacaagatcccccgcaatgag420tgttggagatggtggtctctttgagaaaaagctgtggggc480ttcacagtggacagtaaggtccatccatgaccttcgtttc540gtaa564tatctggctagcaaggaagattcgttcagacctgactgct60gcatcagggcctgaacaagaacatcaacctggactctgcg120cactgatcagtggagtgagctgaccgaggc卿gcgactc180tcgtaccttccatgttttgttggccaggctcttagaagac240aaccgaaggtgacttccatcaagctatacatacccttctt300ataccagatagaggagttaatgatactcctggaatac卿360tgggatgcctattaatgttggagatggtggtctctttgag錫ggtgctgcaggagctttcacagtggacagtaaggtccatc■ttctcatcagactgggtaa519TyrGlyArgLysLysArgArgGinArgArgArg1510〈210〉6<211>16<212>PRT<213>人工序列<400>6ArgGinlieLyslie.TrpPheGinAsnArgArgMetLysTrpLysLys151015〈210>7<211>36<212〉PRT<213〉人工序列<400>7AspAlaAlaThrAlaThrArgGlyArgSerAlaAlaSerArgProThr151015GluArgProArgAlaProAlaArgSerAlaSerArgProArgProArg202530ArgProValGlu3權(quán)利要求1.蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽融合截短型人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子活性片段，其特征在于該蛋白包含SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。2.截短型人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子活性片段，其特征在于該片段包含SEQIDN0.2所示的氨基酸序列。3.編碼權(quán)利要求1所示蛋白的SEQIDNO.3所示的核酸序列。4.編碼權(quán)利要求2所示蛋白的SEQIDNO.4所示的核酸序列。5.權(quán)利要求l的蛋白序列，其中所述蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽序列由以下幾種的任何一種氨基酸序列組成或其功能性片段組成。(A)含選自HIV-1反式'激活蛋白(trans-activatortranscription,TAT)中的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)，其氨基酸序列包含SEQIDNO.5所示的序列。(B)果蠅觸角蛋白同源結(jié)構(gòu)域(ANTP)，其氨基酸序列包含SEQIDNO.6所示的序列。(C)單純皰療病毒(HSV)VP22的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)序列，其氨基酸序列包含SEQIDNO.7所示的序列。6.—種含有編碼權(quán)利要求1所述蛋白的核酸序列的核酸分子及表達(dá)載體。7.含有權(quán)利要求2所述截短型活性片段的核酸序列的核酸分子及重組表達(dá)栽體。8.制備權(quán)利要求包括對(duì)截短型人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子活性片段的設(shè)計(jì)；獲得蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽融合截短型人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子活性片段基因的cDNA;構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；以稀釋復(fù)性方法進(jìn)行復(fù)性。9.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的蛋白或核酸分子在制備用于治療神經(jīng)退行性疾病的藥物的用途，所迷疾病包括并不限于阿爾茨海默病、帕金森綜合癥、黑質(zhì)退行性病變、多發(fā)性硬化癥、亨延頓舞蹈癥、脊髄性肌萎縮和肌萎縮性側(cè)索硬化癥等運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病，以及神經(jīng)損傷相關(guān)疾病等。10.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的蛋白或核酸分子在制備用于治療肥胖癥或與肥胖癥相關(guān)疾病的藥物中的用途。11.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的蛋白或核酸分子在制備用于治療視網(wǎng)膜退行性疾病及青光眼的藥物中的用途。12.—種藥物組合物，其含有權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)所述的蛋白或核酸分子作為活性成分、和藥學(xué)上可接受的載體或賦性劑。13.根據(jù)權(quán)利要求12的藥物組合物，所述藥物組合物的給藥方式選自靜脈給藥、皮下給藥、肌肉給藥、鞘內(nèi)給藥或粘膜給藥。14.根據(jù)權(quán)利要求13的藥物組合物，所述的粘膜給藥選自鼻腔粘膜給藥、口腔粘膜給藥或直腸粘膜給藥。15.根據(jù)權(quán)利要求12的藥物組合物，所述藥物組合物的制劑形式選自口服制劑或胃腸外制劑或其相應(yīng)的緩控釋制劑。16.根據(jù)權(quán)利要求15的藥物組合物，所述藥物組合物的胃腸外制劑形式選自注射劑、凍干制劑、吸入霧劑、皮膚涂抹劑、滴眼液劑或其緩控釋制劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽融合截短型人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子活性片段的蛋白以及含有編碼所述截短型活性片段的核苷酸序列的核酸分子。本發(fā)明涉及含有上述核酸分子的表達(dá)載體。本發(fā)明還涉及所述蛋白或核酸分子用于制備治療神經(jīng)退行性疾病(包括阿爾茨海默病、帕金森綜合癥、黑質(zhì)退行性病變、多發(fā)性硬化癥、亨延頓舞蹈癥、脊髓性肌萎縮和肌萎縮性側(cè)索硬化癥等運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病等)的藥物的用途、用于制備視網(wǎng)膜退行性疾病、青光眼、肥胖癥或與肥胖癥相關(guān)的疾病及神經(jīng)損傷相關(guān)疾病的藥物的用途。本發(fā)明特別涉及含有所述蛋白或核酸分子的藥物組合物，及其經(jīng)注射、舌下含服、肺吸入、鼻腔粘膜及肛栓或皮膚吸收、滴眼液吸收等多種方式施用。文檔編號(hào)A61K9/19GK101555284SQ20081008897公開(kāi)日2009年10月14日申請(qǐng)日期2008年4月10日優(yōu)先權(quán)日2008年4月10日發(fā)明者周建平,孫曼霽,曲恒燕,前李申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所