專利名稱：腦紅蛋白在促進(jìn)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及促進(jìn)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)技術(shù)，具體涉及腦紅蛋白在促進(jìn)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，腦卒中、老年癡呆的發(fā)病率不斷上升，因交通和建筑及工程等事故引發(fā)的腦/脊髓損傷也呈多發(fā)趨勢(shì)。在腦卒中、老年癡呆、腦/脊髓損傷等疾病中，神經(jīng)元突起的斷損、縮短是導(dǎo)致腦功能障礙的重要原因。而促進(jìn)神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)、再生是治療以上腦疾病的關(guān)鍵。尋找能夠有效促進(jìn)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的藥物和方法，是當(dāng)前醫(yī)學(xué)和醫(yī)藥界面臨的
重要課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是提供一種能夠促進(jìn)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的物質(zhì)。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明提供的能夠促進(jìn)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的物質(zhì)是腦紅蛋白(Neuroglobin,簡(jiǎn)稱 Ngb，譯為腦紅蛋白或神經(jīng)紅蛋白)。腦紅蛋白Neuroglobin(簡(jiǎn)稱Ngb,譯為腦紅蛋白或神經(jīng)紅蛋白)，為新近發(fā)現(xiàn)的腦組織、神經(jīng)元特異表達(dá)的含血卟啉結(jié)構(gòu)的血紅蛋白家族成員。與已知的血紅蛋白 (hemoglobin)、肌紅蛋白(myoglobin)的最大不同是腦紅蛋白所含的血紅素為六配位鍵， 而非五配位鍵結(jié)構(gòu)。Cytoglobin(簡(jiǎn)稱Cygb,譯為細(xì)胞紅蛋白)是與腦紅蛋白結(jié)構(gòu)相近的另一新發(fā)現(xiàn)的血紅蛋白家族成員，廣泛表達(dá)于各種細(xì)胞和組織。腦紅蛋白的生理功能還不清楚，迄今為止，國內(nèi)外還未見有關(guān)腦紅蛋白與神經(jīng)突起生長(zhǎng)的報(bào)道。本發(fā)明在原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)，隨神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)，腦紅蛋白(Ngb)基因表達(dá)量顯著增加，而細(xì)胞紅蛋白(Cygb)的基因表達(dá)沒有變化。在原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)元和小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞(neuroblastoma cell, N2acell)中轉(zhuǎn)染本課題組構(gòu)建的腦紅蛋白質(zhì)粒，與對(duì)照組相比，腦紅蛋白基因編碼的蛋白表達(dá)量增加，神經(jīng)元的突起明顯增長(zhǎng)。反之，采用RNA干擾技術(shù)抑制原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)元和小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞的內(nèi)源性腦紅蛋白蛋白的表達(dá)，與對(duì)照組相比，神經(jīng)細(xì)胞的突起明顯變短。本發(fā)明研究充分證明腦紅蛋白具有促進(jìn)神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)作用。在小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞中轉(zhuǎn)染腦紅蛋白質(zhì)粒兩天后再予無氧無糖(體外模擬缺血)處理，與對(duì)照組相比，細(xì)胞的突起明顯增長(zhǎng)，證明增加腦紅蛋白在缺血病理狀態(tài)下仍具有促進(jìn)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的作用。在腦卒中、老年癡呆、腦/脊髓損傷等疾病中，神經(jīng)元突起的斷損、縮短是腦功能障礙的重要原因，而促進(jìn)神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)或再生是治療以上腦疾病的關(guān)鍵。因此，腦紅蛋白促進(jìn)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的這一新發(fā)現(xiàn)使得腦紅蛋白基因及其編碼的蛋白可用于制備治療腦卒中、老年癡呆、腦/ 脊髓損傷等疾病藥物。
實(shí)驗(yàn)資料實(shí)驗(yàn)?zāi)康腎)明確腦紅蛋白(neuroglobin, Ngb)與神經(jīng)元突起生長(zhǎng)是否相關(guān)；2) 證明通過轉(zhuǎn)染腦紅蛋白基因，增加腦紅蛋白的蛋白表達(dá)，可促進(jìn)神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)；3)證明通過RNA干擾技術(shù)抑制腦紅蛋白基因和蛋白的表達(dá)，可抑制神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)；4)證明在無氧無糖培養(yǎng)條件下，通過轉(zhuǎn)染腦紅蛋白基因，可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞突起的生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、試劑、實(shí)驗(yàn)步驟及實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)施例中相應(yīng)部分的內(nèi)容一致，見實(shí)施例。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)揭示I. Neuroglobin (腦紅蛋白)mRNA表達(dá)量與神經(jīng)元突起生長(zhǎng)呈正相關(guān)；2.轉(zhuǎn)染腦紅蛋白基因，提聞腦紅蛋白的蛋白表達(dá)量，可以促進(jìn)神經(jīng)兀突起的生長(zhǎng)和長(zhǎng)度；3. RNA干擾可降低細(xì)胞內(nèi)源性腦紅蛋白的蛋白表達(dá)量，并阻斷神經(jīng)元突起的生長(zhǎng);4.轉(zhuǎn)染腦紅蛋白基因，可以促進(jìn)受無氧無糖(即缺血)損傷的神經(jīng)元的突起生長(zhǎng);5.利用基因或蛋白轉(zhuǎn)染技術(shù)增加腦紅蛋白的表達(dá)，對(duì)腦卒中、老年癡呆、腦外傷、 脊髓外傷等疾病造成的神經(jīng)突起斷裂、回縮有潛在治療作用。利用腦紅蛋白(neuroglobin)促進(jìn)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的功能,可將其用于治療神經(jīng)元突起損傷性疾病(包括腦卒中、老年癡呆、腦/脊髓損傷)的藥物或直接作為治療這類疾病的藥物使用。具體可以利用基因或蛋白轉(zhuǎn)染技術(shù)提高腦紅蛋白表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)突起的生長(zhǎng)或修復(fù)，達(dá)到治療這類疾病的目的。


圖I :腦紅蛋白(Ngb)mRNA在原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)元中的表達(dá)圖。a為反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)代表性結(jié)果；b為統(tǒng)計(jì)結(jié)果，證明腦紅蛋白(Ngb)的相對(duì)表達(dá)水平(與內(nèi)參肌動(dòng)蛋白(β-actin)比值)隨神經(jīng)元生長(zhǎng)時(shí)間顯著上升，**表示與O天相比P <0.01 ;c為為統(tǒng)計(jì)結(jié)果,證明細(xì)胞紅蛋白(Cygb)的相對(duì)表達(dá)水平(與內(nèi)參β-actin 比值)在神經(jīng)元生長(zhǎng)過程中無顯著差異。圖2 :小鼠腦紅蛋白mRNA編碼區(qū)全長(zhǎng)序列克隆圖。a為克隆犾得的小鼠腦紅蛋白 mRNA編碼區(qū)(即開放讀碼框架)的全長(zhǎng)核苷酸序列；其中第270個(gè)核苷酸為胸腺嘧啶(T， 粗體)，在基因庫小鼠腦紅蛋白mRNA為胞嘧啶(C) ；b為所克隆的小鼠腦紅蛋白mRNA編碼的 151個(gè)氨基酸序列，與蛋白數(shù)據(jù)庫中的小鼠腦紅蛋白(蛋白數(shù)據(jù)號(hào)NP_071859. 1，http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/NP_071859. I)的 151 個(gè)氨基酸序列完全一致。圖 2 中用整個(gè)序列表不本研究使用系列和基因庫系列，用區(qū)間編號(hào)范圍表不共同序列。圖3 :腦紅蛋白(Ngb)真核表達(dá)載體的構(gòu)建圖。a為所構(gòu)建的p-Ngb_GFP表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖，小鼠Ngb編碼DNA序列被插入到p-EGFP-Nl載體的MCS (multiple cloning site,多克隆位點(diǎn))區(qū)；b為p-EGFP-Nl載體的MCS核苷酸序列圖，腦紅蛋白DNA序列連接到p-EGFP-Nl載體MCS區(qū)的Bgl II和Bam HI兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；c為所構(gòu)建的p_Ngb_GFP 質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果，粗體下劃線部分為Ngb序列，兩端為載體序列。
圖4:轉(zhuǎn)染p-Ngb-GFP-Nl質(zhì)粒增加細(xì)胞腦紅蛋白的蛋白表達(dá)量結(jié)果圖。a為小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染p-EGFP-Nl、p-Ngb-GFP-Nl、p-Cygb-GFP-Nl質(zhì)粒2天后提取總蛋白、 測(cè)定蛋白濃度；取2011 g總蛋白經(jīng)SDS/PAGE膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜，用腦紅蛋白(Ngb) —抗和相應(yīng)的熒光二抗孵育，顯色結(jié)果證明轉(zhuǎn)染p-Ngb-GFP-Nl質(zhì)粒表達(dá)Ngb-GFP蛋白；b為小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞轉(zhuǎn)染p-Ngb-GFP-Nl質(zhì)粒，一天后固定細(xì)胞，Ngb —抗和相應(yīng)的TRITC-標(biāo)記熒光二抗染色，結(jié)果證明轉(zhuǎn)染P-Ngb-GFP-Nl使細(xì)胞內(nèi)腦紅蛋白的蛋白表達(dá)量增多(箭頭指示細(xì)胞)；(顯示轉(zhuǎn)染P-EGFP-Nl質(zhì)粒的細(xì)胞無腦紅蛋白的高表達(dá)。所有圖片放大倍數(shù)一致，標(biāo)尺長(zhǎng)度為10微米。圖5 :過表達(dá)腦紅蛋白促進(jìn)神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)結(jié)果圖。a顯示過表達(dá)腦紅蛋白使神經(jīng)元突起長(zhǎng)度增加。b為轉(zhuǎn)染細(xì)胞紅蛋白質(zhì)粒對(duì)照結(jié)果，顯示神經(jīng)元突起較短。c為轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白質(zhì)粒對(duì)照結(jié)果，顯示神經(jīng)元突起較短。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明增加腦紅蛋白表達(dá)具有促進(jìn)神經(jīng)元突起增長(zhǎng)的作用。圖6 :轉(zhuǎn)染p-Ngb-siRNA質(zhì)粒抑制腦紅蛋白表達(dá)結(jié)果圖。其中a為合成的 Ngb-siRNA的核苷酸結(jié)構(gòu)和測(cè)序結(jié)果，粗體下劃線部分為發(fā)揮RNA干擾作用的正向、反向序列山圖為本研究所使用的RNA干擾序列與基因庫序列比對(duì)結(jié)果腦紅蛋白干擾序列與基因庫小鼠腦紅蛋白cDNA序列(BC024263. I)片段480-498 —致；c圖為RT-PCR結(jié)果，證明轉(zhuǎn)染p-Ngb-siRNA顯著降低小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞內(nèi)腦紅蛋白基因的表達(dá)，Ngb質(zhì)粒為陽性對(duì)照， N2a/Ngb-siRNA為轉(zhuǎn)染p-Ngb-siRNA質(zhì)粒的N2a細(xì)胞，N2a/vec為轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒的N2a細(xì)胞； 內(nèi)參為β-actin ;d圖為Western blot結(jié)果,證明轉(zhuǎn)染p-Ngb-siRNA顯著降低N2a細(xì)胞內(nèi) Ngb蛋白的表達(dá)。*，Ρ<0·05。圖7 :siRNA干擾抑制腦紅蛋白表達(dá)阻礙神經(jīng)突起的生長(zhǎng)結(jié)果圖。在N2a神經(jīng)瘤母細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染腦紅蛋白R(shí)NA干擾質(zhì)粒(即Ngb-siRNA)和空載體(即vec)三天,換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間(0、3、6、12、24小時(shí))，固定細(xì)胞，照相。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Ngb-siRNA 的細(xì)胞突起長(zhǎng)度比vec組細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的野生型細(xì)胞(wild type)明顯變短。標(biāo)尺,20微米。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I動(dòng)物孕16天昆明小鼠(購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；細(xì)胞原代小鼠大腦皮層神經(jīng)元，小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞(N2a細(xì)胞，50代以內(nèi)用于實(shí)驗(yàn))；試劑過表達(dá)質(zhì)粒p-Ngb-EGFP-Nl、p-EGFP-Nl、p-Cygb-EGFP-Nl 本課題組構(gòu)建；RNA 干擾質(zhì)粒Ngb-siRNA、N-control由本專利申請(qǐng)發(fā)明人應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)干擾序列，上海英濰捷基公司合成，本課題組構(gòu)建；DMEM，0ΡΤΙ-ΜΕΜ，胎牛血清，Neurobasal (Gibco公司， 美國)；限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hind III、BamHI和Sal I以及PCR試劑(TAKARA公司，中國)；Rnasin, oligo (dT) 15Primer 和 M-MLV reverse transcriptase (Promega 公司，美國)；引物(上海生工生物工程有限公司)；siRNA載體質(zhì)粒pGenesil-Ι (武漢晶賽生物技術(shù)有限公司)；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒(0MEGA公司，美國)；質(zhì)粒大提試劑盒(QIAGEN 公司，美國)；Lipofectamine 2000 (Invitrogen 公司，美國)；Mouse Neuron Nucleofector Kit (Amaxa 公司，德國)；neuroglobin 抗體(Santa Cruz 公司，美國)；核苷酸點(diǎn)突變?cè)噭┖?北京全式金生物技術(shù)有限公司)；儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(Forma,美國);倒置突光顯微鏡(Olympus 1X70,日本)； 凝膠電泳分析系統(tǒng)(上海培新科技有限公司)；圖像分析系統(tǒng)(Image pro-plus Kodak,美國)；厭氧艙(上海新苗科技有限公司)；多功能酶標(biāo)儀SYNERGY2 (Bio-tech，美國)；紫外分光光度計(jì)(Pharmacia Biotech，美國)，共聚焦顯微鏡LSM 510(ZEISS，德國)。實(shí)驗(yàn)步驟I.腦紅蛋白表達(dá)水平與神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的相關(guān)性取孕16天小鼠胚胎，分離大腦皮層神經(jīng)元，接種到35-mm細(xì)胞培養(yǎng)皿正常培養(yǎng)(細(xì)胞培養(yǎng)方法參見申請(qǐng)人已發(fā)表文章 Chen et al.，J Neurosci Res 79 :114_8，2005)，分別提取培養(yǎng) 0、2、4、6、8 天的神經(jīng)元總 RNA，取RNA 2微克，隨機(jī)引物(O. 5微克/微升)I微升，用無RNA酶水補(bǔ)足至12微升。在70°C 反應(yīng)5分鐘，再在4°C反應(yīng)3分鐘。依次加入5Xbuffer 4微升，RNasin (40單位/微升)I 微升，dNTPs (10微摩爾)2微升；混勻后置室溫5分鐘。加逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV I微升后總體積為20微升。置室溫10分鐘后，在42°C反應(yīng)60分鐘，再70°C反應(yīng)10分鐘，合成cDNA，采用上海生工合成特異性小鼠腦紅蛋白的PCR引物(正向引物5’ -catcgggcagtgggagtgaggc-3 ； 反向引物5’-tccaggcggtccttgtagctg-3’),按PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系以94°C反應(yīng)2分鐘，94°C 變性45秒，55°C退火30秒，72°C延伸50秒，25個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5分鐘，同時(shí)擴(kuò)增腦紅蛋白和內(nèi)參β-actin (肌動(dòng)蛋白)，將PCR產(chǎn)物電泳進(jìn)行定量分析，以同一樣本的腦紅蛋白/肌動(dòng)蛋白比值代表腦紅蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析腦紅蛋白基因在神經(jīng)元突起生長(zhǎng)過程中的表達(dá)差異，RT-PCR方法參見Chen et al.，JNeurosci Res 79 :114-8,2005ο2.腦紅蛋白(Ngb)促進(jìn)小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞突起生長(zhǎng)的作用小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞按4Χ IO5個(gè)細(xì)胞傳35-mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，正常培養(yǎng)約24小時(shí)至細(xì)胞有80-90 %融合時(shí)，將培養(yǎng)液替換成Iml OPTI-M繼續(xù)培養(yǎng)I小時(shí)。將I. 5微升lipofectamine2000用500微升OPTI-M稀釋并置室溫5分鐘，即為溶液A ;將質(zhì)粒p-Ngb-EGFP-Nl或p-EGFP-Nl分別用500微升OPTI-M稀釋，即為溶液B。將溶液B加到溶液A，混勻并置室溫30分鐘，即為轉(zhuǎn)染緩沖液溶液C。用溶液C替換上述培養(yǎng)細(xì)胞的0ΡΤΙ-Μ，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后換成正常培養(yǎng)基(小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染方法參見申請(qǐng)人已發(fā)表文章Li et al. , Neurochem Res32(8) :1375-80. 2007)。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，I)提取總蛋白，Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞Ngb-EGFP蛋白的表達(dá)量；(Western blot方法參見申請(qǐng)人已發(fā)表文章Ye et al. , Pharmacologica Sinica 30:913-8,2009)。2)固定細(xì)胞，免疫突光染色檢測(cè)腦紅蛋白表達(dá)；(免疫熒光染色方法參見申請(qǐng)人已發(fā)表文章Li et al.，Neurochem Res 32 1375-80.2007)。3)換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)固定細(xì)胞，顯微鏡照相， Image-Pro Plus 6. O軟件測(cè)量50個(gè)以上轉(zhuǎn)染細(xì)胞的突起長(zhǎng)度；獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。3.腦紅蛋白(Ngb)促進(jìn)原代培養(yǎng)的神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的作用取孕16天小鼠胚胎， 分離大腦皮層神經(jīng)兀，按Mouse Neuron Nucleofector Kit說明書分別轉(zhuǎn)染p-Ngb-EGFP-Nl 或p-EGFP-Nl或p-Cygb-EGFP-Nl質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染神經(jīng)元并接種到35_mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，正常培養(yǎng)3天，不同時(shí)間點(diǎn)固定細(xì)胞，顯微鏡照相，使用Image-Pro Plus 6. O軟件測(cè)量50個(gè)以上神經(jīng)元的突起長(zhǎng)度，重復(fù)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)至少3次，SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。4.腦紅蛋白(Ngb) siRNA干擾抑制小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞突起生長(zhǎng)的作用小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞按4X IO5個(gè)/毫升的密度接種到35-mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，正常培養(yǎng)24小時(shí)，按步驟2 的方法分別轉(zhuǎn)染Ngb-siRNA或p-Gensil空載體6小時(shí)，換新鮮正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，按4X IO5個(gè)/ml傳35-mm培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，I)PCR或Western blot分別檢測(cè)腦紅蛋白基因和蛋白的表達(dá)；2)換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間，固定細(xì)胞，顯微鏡照相， 使用Image-Pro Plus 6. O軟件測(cè)量50個(gè)以上神經(jīng)元的突起長(zhǎng)度，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。5.腦紅蛋白(Ngb) siRNA干擾抑制原代培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞突起生長(zhǎng)的作用取孕16 天小鼠胚胎，分離大腦皮層神經(jīng)元，按Mouse Neuron Nucleofector Kit說明書分別轉(zhuǎn)染 p-Ngb-siRNA-GensiI 或 p-N-control-Gensil 或 p-Cygb-siRNA-Gensi 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染神經(jīng)兀并接種到35-_細(xì)胞培養(yǎng)皿，正常培養(yǎng)5天，不同時(shí)間點(diǎn)固定細(xì)胞，顯微鏡照相，測(cè)量轉(zhuǎn)染神經(jīng)元的突起長(zhǎng)度，重復(fù)實(shí)驗(yàn)至少3次，SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。6.腦紅蛋白(Ngb)促進(jìn)無氧無糖條件下N2a細(xì)胞突起生長(zhǎng)的作用小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞按4X IO5個(gè)細(xì)胞傳35-mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，正常培養(yǎng)約24小時(shí)至細(xì)胞有80-90%融合時(shí)， 采用Iipofectamine 2000轉(zhuǎn)染方法(同前)轉(zhuǎn)染p-Ngb-EGFP-Nl或p-EGFP-Nl質(zhì)粒6小時(shí)。繼續(xù)正常培養(yǎng)24小時(shí)后，換無糖無血清培養(yǎng)液在厭氧艙37°C無氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)0、3、 6、9小時(shí)(無糖無氧培養(yǎng)具體方法參見申請(qǐng)人已發(fā)表論文Chen et al，Glia 42:315-324， 2003 ；Chen et al, J Cereb Blood Flow Metab 25 :338_347，2005)，固定細(xì)胞，顯微鏡照相， Image-Pro Plus 6. O軟件測(cè)量50個(gè)以上轉(zhuǎn)染細(xì)胞的突起長(zhǎng)度；獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果I.在原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)元，隨時(shí)間的延長(zhǎng)神經(jīng)元突起逐步增長(zhǎng)，用反轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR方法證明腦紅蛋白mRNA表達(dá)量也隨神經(jīng)元突起生長(zhǎng)時(shí)程顯著增加，見圖la， b,而細(xì)胞紅蛋白(Cygb)mRNA表達(dá)不變,見圖Ic ;表明神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)與腦紅蛋白的表達(dá)正相關(guān)。2.采用RT-PCR方法從小鼠腦組織提取的總RNA中克隆出編碼小鼠腦紅蛋白的 cDNA全長(zhǎng)序列(456個(gè)核苷酸),經(jīng)上海英濰捷基(Invitrogen)公司測(cè)序，圖2a結(jié)果顯示所克隆的編碼小鼠腦紅蛋白的cDNA全長(zhǎng)序列；將測(cè)序結(jié)果通過http://blast. ncbi. nlm. nih. gov網(wǎng)頁的neucleotide BLAST程序與基因庫mRNA序列相比對(duì),結(jié)果顯示所克隆的小鼠腦紅蛋白cDNA序列全長(zhǎng)中僅第270個(gè)核苷酸不同(C — T)，見圖2a中粗體；blastx程序顯示所克隆的小鼠腦紅蛋白cDNA序列編碼的氨基酸序列，見圖2b，與蛋白數(shù)據(jù)庫中小鼠腦紅蛋白序列完全一致(蛋白數(shù)據(jù)號(hào)NP_071859. I, http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ protein/NP_071859. 1)。小鼠腦紅蛋白基因編碼的腦紅蛋白蛋白全長(zhǎng)與人源腦紅蛋白基因編碼的蛋白有94%的同源性。3.用Bgl II和Bam HI酶將編碼腦紅蛋白的DNA片段雙酶切，與相同處理的 p-EGFP-Nl載體經(jīng)T4連接酶相連接，構(gòu)建成表達(dá)Ngb-GFP融合蛋白的p-Ngb_GFP質(zhì)粒，結(jié)構(gòu)見圖3a ;圖3b圖顯示腦紅蛋白基因插入p-EGFP-Nl載體MCS區(qū)的核苷酸序列；經(jīng)上海英濰捷基公司測(cè)序顯示所插入的腦紅蛋白序列正確，見圖3c粗體部分，腦紅蛋白終止密碼序列被去除以表達(dá)突光融合蛋白。綠色突光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作為指示蛋白，在熒光顯微鏡下可以直接觀察到。同樣方法制備了 P-Cygb-GFP表達(dá)質(zhì)粒。4.將p-Ngb-GFP、p-Cygb-GFP、p-EGFP-Nl質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞(N2a)， Western blot方法證明只有轉(zhuǎn)染p-Ngb-GFP質(zhì)粒的細(xì)胞表達(dá)大量的Ngb-GFP蛋白，該蛋白可被腦紅蛋白(Ngb)抗體特異識(shí)別，見圖4a ;細(xì)胞免疫熒光方法也證明轉(zhuǎn)染p-Ngb-GFP質(zhì)粒的細(xì)胞表達(dá)大量的Ngb-GFP,該蛋白可被Ngb抗體識(shí)別，見圖4b (箭頭指示細(xì)胞)，而轉(zhuǎn)染 P-EGFP-Nl質(zhì)粒的細(xì)胞表達(dá)大量的綠色熒光蛋白(GFP)，該蛋白不被腦紅蛋白抗體識(shí)別，見圖4c。這些結(jié)果均證明轉(zhuǎn)染p-Ngb-GFP質(zhì)?？梢蕴岣呒?xì)胞腦紅蛋白的量。5.小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染p-Ngb-GFP、p-Cygb-GFP、p-EGFP-Nl質(zhì)粒，換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3、6、9、18小時(shí)，測(cè)量細(xì)胞最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度(> 50個(gè)細(xì)胞)，計(jì)算平均長(zhǎng)度， 統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果證明過表達(dá)腦紅蛋白明顯促進(jìn)小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞突起的長(zhǎng)度(表I)。表I :過表達(dá)腦紅蛋白增加無血清培養(yǎng)基處理誘導(dǎo)的小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞突起長(zhǎng)度 (X +5, η = 50-150)
權(quán)利要求
1. 一種突變腦紅蛋白，其特征在于腦紅蛋白的第136位氨基酸位點(diǎn)由亮苷酸變?yōu)楦彼帷?br> 全文摘要
本發(fā)明在原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)，隨神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)，腦紅蛋白基因表達(dá)量顯著增加。在原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)元以及小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞中轉(zhuǎn)染本發(fā)明構(gòu)建的腦紅蛋白質(zhì)粒，與對(duì)照組相比，腦紅蛋白基因編碼的蛋白表達(dá)增加，神經(jīng)元的突起明顯增長(zhǎng)，證明增加腦紅蛋白具有促進(jìn)神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)作用。在原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)元以及小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞中轉(zhuǎn)染本發(fā)明構(gòu)建的腦紅蛋白R(shí)NA干擾質(zhì)粒，與對(duì)照組相比，內(nèi)源性腦紅蛋白表達(dá)減少，神經(jīng)細(xì)胞突起明顯變短，證明內(nèi)源性腦紅蛋白具有促進(jìn)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的生理作用。在小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞中轉(zhuǎn)染腦紅蛋白質(zhì)粒后再予無氧無糖處理，與對(duì)照組相比，神經(jīng)細(xì)胞的突起明顯增長(zhǎng)，證明增加腦紅蛋白具有促進(jìn)受損神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)作用。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102584986SQ20121002429
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月10日
發(fā)明者余上斌, 劉倩蓉, 李莉, 羅振釗, 賴曉晶, 陳曉釬 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)