一種構建腫瘤多藥耐藥細胞模型的方法及通過該法建立的人乳腺癌多藥耐藥細胞株的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤生物學領域，具體涉及一種反應氧族單機制造模構建體外腫瘤多 藥耐藥細胞模型的方法，同時還涉及通過該法建立的人乳腺癌多藥耐藥細胞株。
【背景技術】
[0002] 構建體外腫瘤細胞模型是研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展及干預的重要實驗基礎，造模條件 和造模方法的選擇是模型構建的決定因素，是揭示同類腫瘤形成的分子機制及研究腫瘤藥 物干預的關鍵平臺。
[0003] 腫瘤多藥耐藥（multidrugresistance,MDR)是指腫瘤細胞接觸抗腫瘤藥后產生 抗藥性，也對結構不同、機制各異的多種抗腫瘤藥物產生交叉耐藥的現象。MDR是臨床腫瘤 化療最常見的問題，至今未能解決，其原因或與其核心機制不明、無法進行靶向預防及治療 有關。因此，開發(fā)多藥耐藥腫瘤的細胞模型對于進一步研究其發(fā)生機制、探索其治療靶點及 篩選、評價相關藥物具有重大意義。然而MDR產生的核心機制尚未闡明，研究表明：外排蛋 白的表達及功能上調、細胞解毒系統(tǒng)活力增強、抗腫瘤靶點改變以及凋亡應答失敏等因素 相互聯(lián)系、互相影響，既是MDR細胞的表型特征，又介導了MDR的形成。因此，尋找連接和主 導以上各機制的核心因素，并利用該因素設計、構建MDR細胞模型，不僅有助于闡明MDR的 病理過程，更將為相應靶點探索、藥物篩選提供更為合理、高效的評價對象。
[0004] 由于核心機制不明，國內外構建MDR腫瘤細胞模型的主流方法是：直接選用臨床 使用的某種抗腫瘤藥物，對化療敏感的一種腫瘤細胞長期培養(yǎng)，得到該細胞對某抗腫瘤藥 的耐藥細胞株。該方法所構建的MDR細胞模型是當今研究MDR相關領域的主要工具。此類 細胞株的構建主要包括以下幾種類型：藥物濃度遞增法、大劑量沖擊法、大劑量沖擊結合濃 度遞增法及轉基因結合藥物篩選法等。這種構建方式可以在一定程度上模擬臨床MDR產 生的基本情況，卻仍有多方面不足，包括：（1)模型設計難以模擬臨床MDR形成的核心機制： 臨床抗腫瘤治療往往使用藥物聯(lián)用，因此，僅選擇一種藥物建立的MDR模型，其特征雖然可 能具備某些臨床MDR的共性，但更會體現該種藥物藥理作用相關的一系列個性，得到的耐 藥細胞株惡性表型具有明顯的局限性，因此以該模型為實驗對象進行的機制、靶點及藥物 研究無法代表其他情況MDR的普遍情況、甚至會忽視多藥耐藥形成的核心因素，無法滿足 科研需求。（2)實驗操作相關的缺點：傳統(tǒng)構建方法操作繁瑣、復雜，培養(yǎng)成本高，構建時間 普遍較長，相應失敗率較高，培養(yǎng)條件沒有統(tǒng)一標準，所得細胞耐藥程度差異大。（3)實用 性方面的限制：MDR細胞模型是研究腫瘤多藥耐藥機制及藥物的常用、必要平臺，然而傳統(tǒng) 模型建立的種類非常有限，市售常用的MDR細胞株種類少、價格高，無法滿足個體化研究需 要。其次，由于每次建模只能得到一種藥物誘導的一種細胞株，且所得模型僅對該種藥物 有較高的耐藥性，而對其他藥物耐藥程度有限，因此，以其為實驗對象所得的結果將與臨床 MDR情況出現較大偏差。此外，抗腫瘤藥物誘導建立的耐藥細胞株生長速度普遍較慢，也大 大限制了研究使用。綜上所述，尋找耐藥形成的共性、核心機制，探索更有優(yōu)勢的MDR模型 培養(yǎng)方式，將有助于改善本領域的研究平臺，促進相關基礎研究及藥物研究的發(fā)展。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的旨在提供一種以反應氧族（reactiveoxygenspecies,R0S)為單一 誘導因素構建體外腫瘤多藥耐藥細胞模型的方法，同時還涉及依據該法建立的人乳腺癌多 藥耐藥細胞株MCF-7/R0S。
[0006] 基于上述目的，本發(fā)明采取了如下技術方案：一種構建腫瘤多藥耐藥細胞模型的 方法，包括以R0S為孵育藥物對敏感腫瘤細胞進行持續(xù)培養(yǎng)、使敏感腫瘤細胞產生多藥耐 藥的步驟。
[0007]所述rosSh2o2。
[0008] 所述敏感腫瘤細胞為人乳腺癌細胞MCF-7。
[0009] 所述方法的具體步驟是： (1) 細胞培養(yǎng)：選擇某種對化療藥物敏感的腫瘤細胞株，調整細胞濃度，分組培養(yǎng)備 用； (2) 篩選培養(yǎng)條件：各組細胞分別使用不同的R0S濃度進行持續(xù)培養(yǎng)，4周后在存活細 胞組中選擇最高的R0S濃度作為該種耐藥模型的最優(yōu)造模濃度； (3) 構建耐藥模型：選用對數生長期的該種腫瘤細胞，調整細胞濃度，使用步驟（2)所 得的最優(yōu)造模濃度持續(xù)培養(yǎng)腫瘤細胞，培養(yǎng)過程中按生長情況傳代； (4) 耐藥性跟蹤指導的循環(huán)培養(yǎng)：每隔2-3周對步驟（3)中的R0S培養(yǎng)細胞進行耐藥倍 數評價；重復執(zhí)行步驟（3)的相關操作，直到評價結果提示細胞產生的耐藥性符合預期；凍 存細胞。
[0010] 步驟（3)所用R0S為H202，濃度0?liimol/L，培養(yǎng)時間為20周。
[0011] 所述方法中，各步驟所用培養(yǎng)基為含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。
[0012] 步驟（2)及步驟（3)培養(yǎng)細胞過程中隔天隨更換培養(yǎng)基更換R0S。
[0013] 根據所述方法建立的人乳腺癌多藥耐藥細胞株，細胞株命名為MCF-7/R0S，所用 R0S為H202，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學，430072;保藏日 期：2015年1月28日；保藏編號為CCTCC-C201520。
[0014] 本發(fā)明首次使用R0S作為造模藥物進行單因素造模，以恒定劑量長期、定向誘導 細胞，模擬臨床腫瘤耐藥的形成過程。與現有技術相比，該法具有如下技術優(yōu)勢： (1)實驗過程簡單，造模條件穩(wěn)定，可顯著降低造模成本。
[0015] (2)所建立的耐藥細胞株對多種抗腫瘤藥物均有交叉耐藥，同時具有細胞增殖快 的優(yōu)點，可有助于提_相關研究的效率。
[0016] (3)具有廣泛的適用性：實驗表明，以R0S為造模藥物建立的模型具有與 臨床多藥耐藥腫瘤相似的多種重要表型，包括：多藥耐藥相關蛋白1(multidrug resistance-associatedprotein1,MRP1)和P_ 糖蛋白（P-glycoprotein,P_gp)表達 增高；與耐藥機制密切相關的核轉錄因子Nrf2、HIF-1a等過度激活；解毒系統(tǒng)代表酶系 GST高度上調；多藥耐藥特異性功能分子PKCa、c-Myc表達增加等。
[0017] 同時，發(fā)明人在前期研究中也發(fā)現：多種商售腫瘤耐藥細胞中R0S含量均高于其 敏感株，其中某商售人乳腺癌耐藥細胞MCF-7/ADM的R0S含量為其敏感株的2. 77±0. 21 倍。這表明，ROS可能是多藥耐藥形成的核心因素，通過調控P-gp或其他功能分子促進耐 藥產生。本發(fā)明選用R0S造模成功，為"R0S可誘導腫瘤多藥耐藥形成"提供了重要證據，同 時，其耐藥機理也決定了R0S誘導腫瘤細胞形成多藥耐藥具有廣泛適用性。此外，試驗也證 實，除MCF-7外，以類似條件培養(yǎng)K562細胞，也可誘導其產生耐藥性。
[0018] 根據本發(fā)明提供的造模方法建立的人乳腺癌多藥耐藥細胞株MCF-7/R0S，對阿霉 素、紫杉醇、順鉬、氟尿嘧啶和長春新堿的耐藥指數分別達13. 99、4. 61、5. 32、1. 73、8. 80,具 有多藥耐藥特性，可為研究相關機制、靶點探索和新藥篩選提供了更為合理的實驗模型。
【附圖說明】
[0019] 圖1為阿霉素（ADM)和紫杉醇（Taxol)對各組細胞的IC5(I對比圖，圖中：林表示產 < 0? 01ks空白對照；##表示/^< 0? 01ks0? 1iimol/L阿霉素組； 圖2為本發(fā)明人乳腺癌多藥耐藥細胞株MCF-7/R0S的顯微圖； 圖3為MCF-7和MCF-7/R0S的細胞生長曲線； 圖4為MRP1在MCF-7細胞中的表達及定位，其中圖4-a為MCF-7細胞的DAPI核染圖像 (藍色)，圖4-b為MCF-7細胞的MRP1染色圖像(綠色)，圖4-c為MCF-7細胞的DAPI與MRP1 染色疊加圖像 圖5為MRP1在MCF-7/R0S細胞中的表達及定位，其中圖5-a為MCF-7/R0S細胞的DAPI核染圖像(藍色)，圖5-b為MCF-7/R0S細胞的MRP1染色圖像(綠色)，圖5-c為MCF-7/R0S細 胞的DAPI與MRP1染色疊加圖像； 圖6為P-gp在MCF-7細胞中的表達及定位，其中圖6-a為MCF-7/細胞的DAPI核染 圖像(藍色)，圖6-b為MCF-7細胞的P-gp染色圖像(綠色)，圖6-c為MCF-7細胞的DAPI與 P-gp染色疊加圖像； 圖7為P-gp在MCF-7/R0S細胞中的表達及定位，其中圖7-a為MCF-7/R0S細胞的DAPI核染圖像(藍色)，圖7-b為MCF-7/R0S細胞的P-gp染色圖像(綠色)，圖7-c為MCF-7/R0S細 胞的DAPI與P-gp染色疊加圖像； 圖8為HIF-1a在MCF-7細胞中的表達及定位；其中圖8-a為MCF-7細胞的DAPI核染 圖像(藍色)，圖8-b為MCF-7細胞的HIF-1a染色圖像(綠色)，圖8-c為MCF-7細胞的DAPI 與HIF-la染色疊加圖像； 圖9為HIF-1a在MCF-7/R0S細胞中的表達及定位；其中圖9-a為MCF-7/R0S細胞 的DAPI核染圖像(藍色)，圖9-b為MCF-7/R0S細胞的HIF-1a染色圖像(綠色)，圖9-c為 MCF-7/R0S細胞的DAPI與HIF-1a染色疊加圖像； 圖10為Nrf2在MCF-7細胞中的表達及定位，其中圖10-a為MCF-7細胞的DAPI核染 圖像(藍色)，圖l〇-b為MCF-7細胞的Nrf2染色圖像(綠色)，圖10-c為MCF-7細胞的DAP