專利名稱：3-取代芳基氧化吲哚在多藥耐藥腫瘤細胞方面的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新型抗腫瘤化合物3-取代芳基氧化吲哚，尤其是3-取代芳基氧化吲 哚在多藥耐藥腫瘤細胞方面的應用。
背景技術：
化療是腫瘤綜合治療的主要方法之一，對于非實體瘤(如白血病)則是最重要的 治療手段。臨床常用化療方案往往是多藥聯合使用，且劑量較大，在抑制、殺滅腫瘤細胞的 同時，不可避免的導致部分腫瘤細胞對化療藥物的耐受，稱為獲得性耐藥。其最大特點是多 藥耐藥(multi-drug resistance，MDR)，即腫瘤細胞在接受某些特定的化療藥物作用后，不 僅對該類藥物產生耐受，同時對未接觸過的即與該藥化學結構、藥理作用完全不同的其他 化療藥物也產生耐受性。這種交叉性藥物耐受，是化療失敗的主要原因。明確多藥耐藥產 生的機制和逆轉多藥耐藥是臨床上迫切需要解決的問題，也是目前腫瘤藥物治療研究的一研究表明，腫瘤細胞多藥耐藥的產生是多種復雜的機制介導的，主要包括(1)細 胞膜糖蛋白增加藥物的逆向轉運和外排。這類蛋白包括膜糖蛋白Pgp(由mdrl基因編 碼)，多藥耐藥相關蛋白MRP，肺耐藥相關蛋白LRP以及乳腺癌耐藥相關蛋白BCRP等。此類 蛋白大多屬于ATP結合盒蛋白家族(ATPbinding cassette，ABC)，通過結合、水解ATP將細 胞內特定的藥物底物泵出，從而降低胞漿藥物濃度，導致耐藥。(2)凋亡相關基因或蛋白表 達失控，包括bcl-2凋亡抑制基因的異常激活、ras蛋白的異常活化、凋亡促進基因bax表達 受抑以及Fas途徑凋亡信號通路的改變等。最終使程序性細胞死亡失效或受抑，導致腫瘤 細胞對以促進細胞凋亡為主要藥理機制的一類化療藥物產生耐藥。(3)細胞氧化和解毒酶 系作用增強如細胞色素酶P450、谷胱甘肽-S轉移酶(glutathione S-transferase, GST) 等表達增高或活性增強，加速細胞內各種藥物的代謝，導致耐藥。(4)DNA修復能力增強如 06-甲基鳥苷 DNA 轉移酶(06-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)，使腫瘤細胞 對干擾DNA復制的一類化療藥物產生耐藥。(5)某些藥物的靶酶、靶蛋白表達下調導致耐 藥如DNA拓撲異構酶II (Τ0Ρ0 II)下調導致腫瘤細胞對阿霉素、米托蒽醌、依托泊甙(VP 16)等的耐受、二氫葉酸還原酶(DHFR)表達下調導致對甲氨蝶呤(MTX)的耐藥等。研究還表明，細胞膜表面糖蛋白介導的藥物外排被認為是大多數MDR腫瘤細胞發(fā) 生耐藥的主要機制。1976年Juliano與Ling首先觀察到具有MDR表型中國倉鼠卵巢細胞內藥物積聚 發(fā)生障礙，并且細胞膜上有一種分子量為170000的糖蛋白的過度表達，該MDR細胞對藥物 的攝入與親代細胞無差異，而藥物外排能力卻明顯增加。耐藥性的產生是由于細胞膜Pgp 的作用，并克隆了 Pgp編碼基因，即多藥耐藥基因(MDR1)。人MDR基因家族包括MDRl及 MDR2。MDRl位于第七號染色體q21. 1，是有功能耐藥基因，MDR2為無功能耐藥基因，但它常 與MDRl —起擴增，與MDRl有同源性，其染色體位置與MDRl相鄰。MDRlcDNA長4669bp，第 179-3840bp之間為可讀區(qū)，起始密碼為ATG，共編碼1280個氨基酸殘基。人與鼠MDRl基因
3序列有高度同源性，二者區(qū)別集中在氨基端和羧基端的第一個跨膜區(qū)。此外，人MDRl基因 與細菌轉運蛋白基因也非常相似，由此推測MDRl基因是一個高度保守的基因家族?；趯DRl基因的上述推測，使得目前常用逆轉耐藥的構建方法也多針對MDRl 基因及其產物Pgp，但是由于效果有限或毒副作用強，難以應用于臨床。由于多藥耐藥表型 的出現涉及多種機制、多個耐藥相關基因及蛋白的改變，并且多種機制相互聯系，各個耐藥 相關的基因、蛋白功能也不是單一一種，如Pgp可能還與凋亡的抑制、腫瘤干細胞的發(fā)生等 有關等等，所以單純針對某一種耐藥機制研制的逆轉劑效果必然是有限的。目前的藥物開發(fā)已經進入由靶點找藥物的階段，因此，發(fā)現在多藥耐藥中起關鍵 作用的新基因，明確其調控機制，并且全面了解其介導耐藥的機理，從而據此研制、設計靶 向的干預方法，對于最終克服腫瘤的多藥耐藥表型的產生或逆轉其耐藥性有著至關重要的
眉、ο新型抗腫瘤化合物3-取代芳基氧化吲哚(以下簡稱PH II-7)，是本申請人合成并 首先發(fā)現其具有抗腫瘤活性的作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于公開化合物PH II-7在多藥耐藥腫瘤細胞方面的應用，具體地 是化合物 PH II-7 對于 K562/A02、HL60/ADR、MCF-7/ADR、KBv200, A549DDP 多藥耐藥腫瘤細胞 的抗腫瘤細胞活性應用的同時還對所述多藥耐藥腫瘤細胞阻抑藥物外排、逆轉耐藥活性的 應用?；衔颬H II-7在調節(jié)K562/A02細胞多藥耐藥表型的應用；化合物PH II-7在調節(jié) K562細胞和K562/A02細胞藥物外排和胞內藥物蓄積的應用。本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點在于PH II-7本身既有內在的直接殺傷腫瘤細胞活性， 又可通過下調MDRl的表達，逆轉藥物外排介導的多藥耐藥表型。傳統(tǒng)的克服腫瘤耐藥的耐 藥方法是將專門的耐藥逆轉劑與傳統(tǒng)化療藥聯用，逆轉劑本身的種種毒副作用與化療藥既 有宿主毒性疊加而導致治療方案的可行性降低。而本發(fā)明證明了化合物PH II-7同時具備 內在的抗腫瘤細胞活性和阻抑藥物外排逆轉耐藥的活性的作用，還證明了化合物PH II-7 在具備高效廣譜抗腫瘤細胞特性的同時，還具備對多藥耐藥腫瘤細胞的有效殺傷作用。本 發(fā)明首次實現了 PH II-7可以通過PKCA-F0S-MDR1信號通路下調MDRl基因的表達，并首次 將PH II-7應用于腫瘤細胞逆轉耐藥表型。


圖1是PH II-7分子的化學結構圖。圖2是PH II-7對K562異體移植瘤的抑制效果圖(相對腫瘤體積)和阿霉素為 陽性對照圖(η = 6，士sd)。圖3是PH ΙΙ-7對Κ562/Α02異體移植瘤的抑制效果圖(相對腫瘤體積)和阿霉 素為陽性對照圖(η = 6，士sd)。圖4是PH II-7對荷瘤鼠相對體重的影響圖。圖5是PH II-7對PKCA表達水平的影響圖。圖中以K562/A02的表達水平為相對值1，計算K562，以及K562/A02被不同PH II-7作用48小時后PKCA的表達水平變化。
圖6是PH II-7對MDRl表達水平的影響圖。圖中以K562/A02的表達水平為相對值1，計算K562，以及K562/A02被不同PH II-7作用48小時后MDRl的表達水平變化。圖7是K562/A02細胞中RNA干擾PKCA對MDRl及c_F0S，c-JUN基因表達水平的 影響圖。圖中1，2，3電泳道分別代表24小時，48小時，72小時。圖8是PH II-7和阿霉素對K562細胞的誘導凋亡效果圖(作用24小時，藥物濃 度如圖中標注)。圖9是PH II-7和阿霉素對K562/A02細胞的誘導凋亡效果圖(作用24小時，藥 物濃度如圖中標注)。圖10是激光共聚焦成像圖。圖中熒光點代表阿霉素，顯示K562/A02胞內阿霉素呈PH 11_7作用時間依賴性增 加。圖11是流式細胞術檢測PH II-7對K562/A02胞內阿霉素蓄積的影響圖。圖中X軸代表阿霉素濃度，Y軸代表細胞計數。
具體實施例方式本發(fā)明涉及的PH II-7新型抗腫瘤化合物化學結構如圖1所示，通過高通量的人 類基因表達譜芯片技術檢測其作用于多藥耐藥系K562/A02后導致的基因表達譜變化，從 基因水平評價PH II-7的作用模式，證明其可以影響一系列耐藥相關基因的表達，并證明其 可以通過PKCA-F0S-MDR1信號通路下調MDRl基因的表達，并可以將PH II-7應用于腫瘤細 胞逆轉耐藥表型。具體實驗如下實驗材料1、細胞株人白血病細胞系K562及其多藥耐藥細胞系K562/A02為本申請人常規(guī)培 養(yǎng)傳代的細胞。K562/A02是本室用阿霉素逐步誘導K562細胞建立的多藥耐藥細胞株，具有 典型的MDR表型。細胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中，加入10%的胎牛血清(FBS)，IOmmol/L 的H印es和68. 4mmol/L的谷胺酰胺，于37°C 5% C02飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。K562/A02 在培養(yǎng)過程中加入阿霉素lmg/L以維持耐藥性，實驗前三天停止加藥。2、藥物及試劑(1)阿霉素(Doxorubicin)購自法碼西亞普強公司，用生理鹽水配制成lmg/ml的 母液待用。(2)PRMI1640購于美國GIBCO公司，胎牛血清購于中國醫(yī)學科學院血液學研究所 科技公司。(3)RNA 干擾試劑盒(SilenceTM siRNA Constructing Kit)購于 Ambion 公司。(4) Trizol RNA提取試劑盒、M-MLV逆轉錄試劑盒以及脂質體lipofectamin2000 為Invotrogen公司產品。(5)DEPC、隨機引物、dNTP購于上海生物工程有限公司。(6) Realtime 試齊[J盒。
3、基因芯片GeneChip Human GenomeU133 Plus 2.0 Array,為美國 Affymetrix 公司生產的人 類基因表達譜芯片，可提供47，000多個轉錄本和38，500多個基因的表達信息。4主要儀器C02 孵箱 Napco5410 型(美國 Napco 公司)；倒置顯微鏡CK40型(日本Olympus公司)；無菌操作臺(蘇靜集團安泰公司)；Realtine PCR 儀 7500 型(美國 Apllied Biosystems 公司)；紫外分光光度劑DU-70型(美國Beckman公司)；Biofuge fresco臺式低溫離心機(德國Heraeus公司)；低溫冰箱-86°C ULT_freezer(Thermo forma 公司)；Gene Amp PCR system 2400 型擴增儀(美國 Pekin Elmer 公司)；DYY8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京市六一儀器廠)；凝膠成像系統(tǒng)Alpha Ease FC (美國 Alpha Innotech 公司)；HZQ-Q振蕩器(哈爾濱東聯電子開發(fā)有限公司)；基因芯片檢測平臺，包括基因芯片滾動雜交儀、全自動芯片洗滌工作站、高分辨率 芯片掃描儀及相關分析軟件等(美國Affymetrix公司)。5、實驗動物Balb/c裸鼠(nu/nu)，雌性，5_7周齡，體重16 22g，購自中國生物制品檢定所動 物中心，在SPF級動物合格環(huán)境下飼養(yǎng)。藥理實驗一將PH II-7作用于多種實體瘤和血液腫瘤細胞系，及敏感和耐藥成對細胞系，評價 化合物體外抗腫瘤活性，尤其是抗耐藥腫瘤活性。試驗方法本實驗共包括18個腫瘤細胞 系，測試每種細胞系對阿霉素的IC50。另有5個多藥耐藥細胞系及其對應的親代細胞系， 測試每種細胞系對PH II-7和陽性對照藥阿霉素的IC50，A549ddp和A549的陽性對照藥是 CDDP。1.細胞培養(yǎng)a、培養(yǎng)液的配制RPMI1640培養(yǎng)液(RPMI粉劑一袋，NaHC032g, Hepes 3g，丙酮酸 鈉0. Ilg溶于IOOOml去離子水中，0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌)；胎牛血清56°C、30min 滅活，按10%、20%比例加入，RPMI1640培養(yǎng)液中，4°C保存。b、滅菌及無菌操作操作前應紫外燈照射滅菌臺面30min，進入超凈臺前75%酒 精擦手和臺面，所有操作應在酒精燈旁進行，所用器物須經火焰燒灼滅菌，注意無菌原則。C、細胞計數用96%酒精清洗計數板及蓋玻片后，用鏡頭紙擦干，將蓋玻片覆蓋 在計數板上，用吸管充分吹打培養(yǎng)瓶中的細胞懸液，均勻后立即吸取少量懸液，從邊緣輕滴 1-2滴使剛好充滿計數板與蓋玻片之間的空隙。顯微鏡下觀察并計數四角大方格內細胞數， 如有壓邊僅計算壓其中固定兩邊的細胞，計算公式如下 細胞數/ml = (4大格細胞總數/4) X 10000 X稀釋倍數2. MTT 實驗即取1 XlO5Ail的細胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔180 μ 1，培養(yǎng)24小時后加
6入20 μ 1不同濃度的PH 11-7，對照組加20 μ 1生理鹽水，繼續(xù)培養(yǎng)72小時，再向每孔加入 20 μ 1 ΜΤΤ，避光孵育4小時后，1，OOOg離心10分鐘，棄上清，每孔加入100 μ 1 DMS0，震蕩 混勻后于酶標儀上測定570nm的光吸收值，計算IC5(I。實驗結果PH II-7在測試的各個細胞系均顯示明顯的殺傷效果(見表一)，尤其是在阿霉素 基本無效的5個多藥耐藥細胞系，其殺傷效果尤其顯著(見表二)。多藥耐藥細胞系K562/A02，HL60/ADR, MCF7/ADR的IC50對比其親代細胞系，阿霉 素差異倍數高達18倍至377倍，而對PH 11-7，差異倍數僅為0. 7倍至5. 3倍。表一 PH II-7對18種不同來源人腫瘤細胞系的殺傷效果 表二 PH II-7對多藥耐藥腫瘤細胞系的殺傷效果。 藥理實驗二將PH II-7應用于K562，K562/A02裸鼠移植瘤的殺傷，以阿霉素為對照，評價其體 內殺傷耐藥腫瘤的效果及毒性。試驗方法1.血病細胞K562和K562/A02裸鼠移植瘤模型的建立選取雌性Balb/c nu/nu裸鼠，周齡5-7周，體重16_20g。接種前1-3天Csl37照 射400rad。取對數生長期的K562/A02細胞接種于右前肢根部背側皮下，每只裸鼠接種細胞 數為1 X 107個/0. 2ml，三天后于左側相同部位接種相同數量的K562細胞，4-6天后待腫瘤 長至40mm3后開始分組治療。2.藥物與劑量將PHII-7溶于自制溶劑(蓖麻油無水乙醇Tween80為490 490 20)中， 配成7. 5mg/ml的儲存液，治療時用無菌生理鹽水稀釋成所需濃度。實驗分陰性對照組、陽 性對照組和治療組，陰性對照組給予溶劑，陽性對照給予阿霉素4mg/kg，治療組設高、低兩 個劑量組，高劑量組為50mg/kg，低劑量組為25mg/kg。3.給藥方法隨機分組當日開始給藥，間隔3天用藥一次，連續(xù)5次，0. 2ml/10g腹腔注射 (i. p.)。4.計算方法4.1腫瘤體積
裸小鼠移植瘤模型使用游標卡尺測量腫瘤直徑，動態(tài)觀察藥物的抗腫瘤效應，腫 瘤直徑的測量每兩天一次，腫瘤體積的計算公式為V =1/2 XaXb2(式中a和b分別為腫瘤的長徑和短徑)抗腫瘤活性評價指標為腫瘤抑制率(IR% )，采用下面公式計算IR%= (1-VT/V0) X 100%(式中VT為治療組腫瘤體積，V0為對照組腫瘤體積)4. 2相對體積比每次測量的相對腫瘤體積比(RTV)計算公式為RTV = VtZV0(式中=Vtl為分組治療開始時測量的體積，Vt為每一次測量時的體積)抗腫瘤活性 評價指標為腫瘤抑制率(IR% )，采用下面公式計算IR%= (1-Tetv/Cetv) X 100%(式中Τκτν為治療組RTV，Cetv為對照組RTV)實驗結果如圖2，3所示，25mg/kg劑量PH 11_7顯著抑制移植瘤的體積，K562組 RTV(相對腫瘤體積)減少 51. 94% (P < 0. 05)，K562/A02 組 RTV 減少 65. 27% (P < 0. 05)， 同時呈現良好的宿主耐受性，RBW(相對體重)相對對照組，無明顯差異。而陽性對照藥阿霉 素對K562/A02移植瘤僅達成8. 8%的抑制率，同時卻造成如圖4所示的RBW的顯著降低。藥理實驗三PH II-7處理前后的基因表達譜變化比較，評價PH 11_7抗耐藥腫瘤細胞的作用機 制。試驗方法實驗分三組K562，K562/A02，K562/A02的 200nM 濃度 PH II-7 處理 48 小時組，提 取各組的總RNA，處理后雜交Affymetrix人類基因表達譜芯片，掃描，信號轉化，生物信息 學分析，發(fā)現PH II-7抗耐藥腫瘤的基因機制。1.總RNA提取和探針制備采用Trizol試劑分別提取細胞的總RNA，利用T7_ (dT) 24做為引物，在反轉錄酶的 作用下，由RNA反轉錄成單鏈cDNA，使用Affymetrix公司的EnzoRNA Transcript Labeling
Kit體外反轉錄合成生物素標記的cRNA探針。cRNA探針經片段化處理后用于基因芯片雜 、-父。2.雜交和掃描實驗室使用Affymetrix 公司的GeneChip Human Genome U133Plus 2. OArray 芯 片，包含47000個轉錄本，U133系列高密度寡核苷酸芯片利用原位光刻技術生產，檢測時用 一種熒光標記，雜交在Hybridization Oven 640中完成，在洗滌工作站FS450上按照芯片 類型，運行洗脫程序，對芯片進行清洗、染色和信號放大過程。用Scanner 30007G 4C掃描 儀上對芯片進行掃描和信號值轉換。雜交前芯片質控由“test chip”完成。3.數據分析芯片掃描獲得的數據使用GeneChip Operating Software (GCOS)分析處理，在比 較兩張芯片的結果之前，先對每張芯片的數據進行標準化(normalization)處理。以熒光強度比值的對數，作為篩選差異表達基因的標準。實驗結果表達譜差異分析結果表明，本試驗采用的Human Genome U133 Plus 2. OArray包 括大約54000個探針。根據芯片雜交后熒光信號的對數值，篩選K562/A02及K562細胞的 差異表達基因，共發(fā)現差異倍數大于2倍的基因3203個，其中K562/A02相對K562上調的 基因3522個，下調的基因1478個。K562/A02的PH II-7處理組對比K562/A02的對照組， 發(fā)現差異基因1126個，其中上調639個，下調487個。實驗重點分析與耐藥相關的基因，發(fā)現PKCA和MDRl基因在K562/A02組相對K562 組顯著上調，而在PH II-7處理后的K562/A02細胞又顯著下調。證明了 MDRl是PH II-7 對耐藥腫瘤細胞殺傷的重要機制。藥理實驗四Realtime PCR相對定量分析驗證PKCA和MDRl基因表達變化1.引物設計以 β-actin 為內參，比較 K562 與 K562/A02 及 PH II-7 處理后的 K562/A02 中 MDRl基因的相對表達水平。根據GeneBank中sorcin基因與β-actin基因編碼區(qū)序列，參 照Realtime PCR實驗引物設計的基本原則，設計用于RealtimePCR相對定量分析的檢測引 物，并將候選的引物序列輸入GeneBank中用Blast軟件進行序列同源性搜索，排除那些和 其他基因的編碼序列或EST同源的候選序列。最終采用的引物及其擴增片段全長如表3所 示表3用于Realtime PCR實驗的MDR1、PKCA、β -actin引物核苷酸序列 2.準備反應板向反應板的每個反應孔中依次加入如下試劑SYBR Premix Ex Taq 10 μ 1上游引物(10μ Μ)0. 4μ 1下游引物(10μ Μ)0. 4 μ 1ROX Reference DyeII (50Χ) 0. 4 μ 1cDNA 模板6. 8μ1Nuclease-Free Water補至 20 μ 13. Real-time PCR 反應反應條件為95°C預變性 IOmin ；95°C變性 15sec，60°C復 性、延伸Imin，共40個循環(huán)；4.熔解分析反應條件為95°C變性15s，60°C復性lmin，95°C再變性15s ；應用7500System Software 進行數據分析。
實驗結果Real-time PCR驗證結果與表達譜芯片一致K562/A02的PKCA和MDRl基因表達 水平相對于K562顯著升高。而在PH II-7處理48小時候，K562/A02的PKCA和MDRl基因 表達水平如圖5、圖6所示的呈PH II-7劑量依賴性降低。藥理實驗五1、siRNA 的設計根據GeneBank中PKCA基因的序列和siRNA設計原則，應用Ambion公司(http:// www. ambion. com)的設計軟件(siRNA Target Finder and DesignTools),自 sorcin mRNA 的起始密碼子開始尋找“ΑΑ” 二連序列，記下其3’端的19個堿基序列作為候選的siRNA 靶序列。將候選的靶序列輸入GeneBank中用Blast軟件進行序列同源性搜索，排除那些 和其他基因的編碼序列或EST同源的候選序列。結果結合文獻，靶向PKCA的siRNA的目 標序列選擇為AAGGCTTCCAGTGCCAAGTTTCCTGTCTC，另外根據堿基構成相同的原則設置亂序 對照AATTCTCCGAACGTGTCACGTCCTGTCTC。用 Blast 驗證得知兩個序列與 GeneBank 中人 類已知基因序列沒有同源性。利用針對三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因的正、反義鏈的 siRNA模板作為陽性對照，設計的正、反義寡聚核苷酸模板的3’端都加上T7啟動子引物 5’ -CCTGTCTC-3’，組成的29堿基的寡聚核苷酸模板有上海生物工程公司合成。體外轉錄法合成siRNA基本的實驗原理和流程合成轉錄模板將寡聚核苷酸模板離心，重懸于無核酶的滅菌去離子水中，使終濃度大約為 200 μ M ；將溶解后的寡聚核苷酸用TEWl 250稀釋，測定在260nm的OD值，計算寡聚核 苷酸濃度，計算方法濃度(UM) = (0D260X5000)/9.7 ；用無菌水活著TE將每個寡聚核苷酸模板的濃度調整為100 μ M ；室溫解凍轉錄模板合成試劑 Τ7 promoter primer、10 XKlenow ReactionBuffer> DNA Hyb buffer、10XdNTP mix、Nuclease—free water ；將siRNA的正、反義寡聚核苷酸模板與T7啟動子引物雜交，GAPDH的正、反義寡聚
核苷酸模板作為陽性對照；T7promoter primer1 μ 1DNA Hyb buffer3μ 1寡聚核苷酸模板鏈Iyl_70°C水浴5min，然后室溫放置5min向上述雜交體系中加入如下試劑，輕輕混勻后離心。IOXKlenow Reaction Buffer 1 μ 1IOXdNTP mix1 μ 1Nuclease-free water2 μ 1Exo-Klenow1 μ 137°C水浴30min合成轉錄模板
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(1)雙鏈RNA的合成室溫解凍2 XNTP Mix 和 10 X T7Reaction Buffer，輕輕混勻；a每個SiRNA都在室溫下進行兩個轉錄體系，合成正義和反義的siRNA。每個反應 體系按下列順序混合sense or antisense siRNA 2 μ 1templateNuclease-free water4 μ 12 X NTP Mix10 μ 110XT7Reaction Buffer2μ 1T7enzyme mix2 U 1_37°C 水浴 2hb將正義和反義反應轉錄體系混合于一管內37°C水浴反應過夜，合成雙鏈siRNA。(2) siRNA 的純化a向上述合成的雙鏈siRNA中順序加入下列試劑Digestion Buffer6μ 1Nuclease-Free Water48.5 μ 1RNAse3μ 1DNAse2. 5 μ 1_混合均勻，37 °C孵浴2hb向上述體系中加入400 μ 1 Binding Buffer，室溫孵浴2_5min ；c 用 100 μ 1 的 siRNA Washing Buffer 將過濾柱預濕；d 加入含有 siRNA 的 siRNA Binding Buffer, 10, OOOrpm 離心 lmin，棄去收集管中 的液體；e 向過濾柱中加入 500 μ 1 的 siRNA Washing Buffer, 10，OOOrpm 離心 lmin,棄去
收集管中的液體；f 向過濾柱中加入 500 μ 1 的 siRNA Washing Buffer, 10，OOOrpm 離心 lmin,棄去
收集管中的液體，然后更換一個新的收集管；g向過濾柱中加入100 μ 1 75°C預熱的Nuclease-Free Water，室溫放置2min ；h 12，OOOrpm離心2min，將收集管中得到的純化的siRNA置于_80°C保存待用.。(3) siRNA的定量將10 μ 1純化得到的siRNA稀釋到Iml TE中，測定樣品在260nm 的吸光度值，計算樣品濃度，方法濃度(μΜ) = (OD260 X 4000)/142. siRNA的轉染取對數生長期的細胞，用無血清、無抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)液洗 滌兩次，調整細胞濃度為3. 2 X 105/ml，每孔400 μ 1加入24孔板；將不同濃度的siRNA稀釋于Opti-MEMl中(50 μ 1/孔)，輕輕混勻，另外將合適濃 度的脂質體Lipofectamine 2000稀釋于Opti-MEMl中(50 μ 1/孔)，混合后室溫放置5min。 5min后將脂質體和siRNA兩兩混合，輕輕混勻后室溫放置20min ；將100 μ 1脂質體-siRNA復合物加入細胞中，搖動培養(yǎng)板輕輕混勻；
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37°C培養(yǎng)4-6h后，每孔加入500 μ 1含20% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液；在轉染后的不同時間點收集細胞，進行下一步的檢測。實驗結果siRNA顯著抑制了 PKCA的表達，同時誘導c_F0S，c_JUN，及MDRl基因的表達水平 如圖7所示的顯著性降低。由于表達譜芯片中同時發(fā)現了 PKCA和MDRl基因的表達水平顯 著下調，通過本實驗證明了 PHII-7通過PKCA-FOS/JUN-MDRl途徑影響MDRl基因的表達水平。藥理實驗六以阿霉素為對照，測試PH II-7對K562和K562/A02細胞凋亡的影響，評價PH 11_7 對耐藥腫瘤細胞的誘導凋亡效果。凋亡細胞對用于細胞活性鑒定的染料PI有抗染性，壞死細胞則不能。細胞膜有損 傷的壞死細胞的DNA可被PI著染產生紅色熒光，而細胞膜保持完好的凋亡細胞則不會有紅 色熒光產生。因此，在細胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號。正?；罴毎c此 相似。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為(FITC-/PI-)；右上象限 是非活細胞，即壞死細胞，為(FITC+/PI+)；而右下象限為凋亡細胞，顯現(FITC+/PI-)實驗分組，除兩細胞系各自的一個雙陰，兩個單陽，一個雙陽性對照外，每個細胞 系各設PH 11-70. 3 μ M，0. 6 μ M，0. 75 μ M濃度處理組，和一個阿霉素0. 1 μ Μ,濃度處理組。試驗方法1.取對數生長期的細胞，調整細胞濃度為5 X 105/ml鋪入6孔細胞培養(yǎng)板，分別加 入不同PH 11-7, 370C 5% C02條件下孵育24小時。2. 24小時后，收集細胞，IOOOrpm 4°C離心5分鐘，棄上清。3.用無菌水按1 4的比例稀釋結合緩沖液(binding buffer)4.用binding buffer調整待測細胞的濃度為5 X 105 1 X 106/ml.，取Iml細胞， IOOOrpm 4°C離心5分鐘，棄上清。5.用 Iml PBS 洗滌 1 次，IOOOrpm 離心 5 分鐘。6.用 0.5ml binding buffer 重懸細胞，取 195 μ 1 細胞懸液，加入 5 μ IAnnexinV 和10 μ 1 PI，室溫下避光孵育10 15min7.加入300 μ 1 Binding Buffer，立即上機(流式細胞儀)檢測流式細胞儀激發(fā) 光波長用488nm，用一波長為515nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于560nm的濾器 檢測PI。實驗結果詳細結果見圖8、圖9所測各個濃度PH II-7在各個細胞系均能顯著誘導凋亡，早 期凋亡細胞的比例隨PH II-7的濃度增加而增加，對比兩細胞系，PH II-7誘導凋亡的量/ 效關系無顯著差異。0. ΙμΜ的阿霉素在敏感細胞K562可產生與0.6μΜ的PH ΙΙ-7相當的 誘導凋亡效果，在Κ562/Α02細胞卻無明顯誘導凋亡作用。藥理實驗七激光共聚焦成像測定外排泵功能試驗方法取IX 105/mlK562 和 K562/A02 細胞，接種于 24 孔板中，1ml，經 0. 3 μ Μ,濃度 PH11-7，處理24h、48h、72h。收集細胞，IXPBS洗2次。加入lug/ml阿霉素500ul，37°C震蕩水 浴孵育lh。IXPBS洗2次，用500ul生理鹽水重懸后取50ul移至平皿，激光共聚焦顯微鏡 下觀察細胞內阿霉素紅色熒光。實驗結果K562/A02胞內阿霉素熒光強度呈PH 11_7作用劑量和時間依賴性增加(見圖10)。本茶果醋選用優(yōu)質茶葉為原料，采用常溫濃縮的方法得到的茶汁濃縮液，更多地 保留了茶葉的有益成分與茶香，具有茶葉的獨特風味，又有醋的醇香，而且柔順爽口，能夠 實現與果醋的完美結合。本茶果醋采用成品果醋，果醋口味任意，因此可以極大地縮短加工 周期和簡化工藝，并有利于茶果醋的質量均一控制。本發(fā)明具有可以兼顧茶和果醋風味、其 澄清和濃縮工藝具有對茶飲料主要化學成分和品質影響較小的突出優(yōu)點。藥理實驗八流式細胞術測定外排泵功能取1 X 105/mlK562和K562/A02細胞，接種于24孔板中，Iml，經不同濃度PH 11_7， 處理24h、48h、72h。收集細胞，IXPBS洗2次。加入lug/ml阿霉素500ul，37°C震蕩水浴孵 育lh。IXPBS洗2次，用500ul生理鹽水重懸轉入流式管，經流式細胞儀檢測胞內阿霉素熒 光強度。實驗結果流式細胞術檢測到K562/A02胞內阿霉素熒光強度呈PH 11_7作用劑量和時間依 賴性增加(見圖11)，結合實驗五的結果，提示PH II-7通過下調MDRl的表達，降低了 MDRl 編碼蛋白產物P-gp介導的藥物外排，增加了阿霉素的胞內蓄積，從而在一定程度上逆轉里 多藥耐藥表型。
權利要求
3-取代芳基氧化吲哚對于K562/A02、HL60/ADR、MCF-7/ADR、KBV200，A549DDP多藥耐藥腫瘤細胞的抗腫瘤細胞活性應用的同時還對所述多藥耐藥腫瘤細胞阻抑藥物外排、逆轉耐藥活性的應用。
2.3-取代芳基氧化吲哚對于調節(jié)K562/A02細胞多藥耐藥表型的應用。
3.3-取代芳基氧化吲哚對于調節(jié)K562細胞和K562/A02細胞藥物外排和胞內藥物蓄積 的應用。
4.3-取代芳基氧化吲哚對于誘導K562細胞，K562/A02等人腫瘤細胞凋亡的應用。
5.3-取代芳基氧化吲哚對于參于調控K562/A02中MDR1基因表達的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及3-取代芳基氧化吲哚在多藥耐藥腫瘤細胞方面的應用，具體地是化合物PH II-7對于K562/A02、HL60/ADR、MCF-7/ADR、KBV200，A549DDP多藥耐藥腫瘤細胞的抗腫瘤細胞活性應用的同時還對所述多藥耐藥腫瘤細胞阻抑藥物外排、逆轉耐藥活性的應用?；衔颬H II-7在調節(jié)K562/A02細胞多藥耐藥表型的應用；化合物PH II-7在調節(jié)K562細胞和K562/A02細胞藥物外排和胞內藥物蓄積的應用。
文檔編號A61P35/00GK101879160SQ20091006876
公開日2010年11月10日 申請日期2009年5月7日 優(yōu)先權日2009年5月7日
發(fā)明者劉娟妮, 周園, 楊純正, 楊銘, 熊冬生, 王金宏, 程昕, 紀慶, 蘇曄, 范冬梅, 許元富, 譚耀紅, 邵曉楓, 高瀛岱 申請人:中國醫(yī)學科學院血液學研究所