專利名稱：：摻氮多壁碳納米管在制備生物醫(yī)學(xué)材料中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于納米材料在生物醫(yī)學(xué)中應(yīng)用的新型學(xué)科領(lǐng)域。涉及以摻氮碳納米管為主的納米尺度的新型碳材料與細胞及血液的相互作用。更具體的說是摻氮多壁碳納米管在制備生物醫(yī)學(xué)材料中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：納米技術(shù)90年代以來獲得了突破性的進展，它與生物化學(xué)、分子生物學(xué)整合將對21世紀的生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)生深刻的影響。它將利用生物大分子進行物質(zhì)組裝、分析與檢測技術(shù)的優(yōu)化、并將藥物靶向性與基因治療等研究引入微型、微觀領(lǐng)域。利用納米技術(shù)可將生物降解性和生物相容性的聚合物與藥物一起制成納米藥物，作為靶向藥物制劑，直接導(dǎo)入病灶部位的器官、組織甚至細胞，達到提高藥物療效，降低毒性的作用；將納米材料作為藥物載體，以增加某些藥物的胃腸吸收，提高其生物利用度；將納米材料作為載體，可用于基因的輸送和治療。近年來，碳納米管的生物相容性研究成為學(xué)者們關(guān)注的逐步發(fā)展起來的前沿、交叉性新型學(xué)科領(lǐng)域，它的迅猛發(fā)展將在21世紀促使激活所有工業(yè)領(lǐng)域產(chǎn)生一場革命性的變化。碳納米管(CNTs)是一種納米尺度的新型碳材料。單臂碳納米管(SWCNTs)由單層石墨(直徑0.42nm)構(gòu)成，而多壁碳納米管(MWCNTs)由直徑2100nm的多個同心石墨圓柱體組成。碳納米管在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究已經(jīng)吸引了越來越多的關(guān)注，并正在迅速形成一個新的研究方向。有研究表明，碳納米管沒有顯示出劇烈的毒性，也保持著原有免疫細胞的功能性。然而，目前對單臂碳納米管(SWCNTs)的生物相容性研究，特別是血液蛋白的吸附研究報道很少。碳納米管引入氮雜質(zhì)后，碳納米管的鍵合在引入位置處將被破壞并進行重組，而且雜質(zhì)也可能在隙間引入雜質(zhì)態(tài)，從而使半導(dǎo)體性碳納米管的導(dǎo)電性得到改變。氮原子在周期表上與碳原子相鄰，因此氮原子較易摻雜。氮原子慘入后，會使得結(jié)晶度下降，但仍保持原有晶態(tài)機構(gòu)。摻氮多壁碳納米管(MWCNTs-N)有著顯著地促進電子傳遞的能力，對抗壞血酸、還原性輔酶等生物分子的電催化作用顯著增強，其主要原因可能在于氮的摻雜，在納米管上產(chǎn)生了高密度的缺位點，即類似于高有序石墨電極的棱面結(jié)構(gòu)，目前相關(guān)研究都是針對MWCNTs-N的物理化學(xué)方面的性質(zhì)，使其具有阻止蛋白質(zhì)非特異性吸附和識別特定蛋白分子的功能等。研究其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的開發(fā)和應(yīng)用還幾乎是空白。特別是以生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用為目標(biāo)的對于氮摻雜多壁碳納米管的生物相容性尚未見文獻報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明首先公開了摻氮多壁碳納米管在制備組織相容性和血液相容性生物醫(yī)學(xué)材料中的應(yīng)用。本發(fā)明進一步公開了摻氮多壁碳納米管在用于抗溶血方面的應(yīng)用。本發(fā)明更進一步公開了摻氮多壁碳納米管在用于血小板粘附方面的應(yīng)用。本發(fā)明在進一步公開了摻氮多壁碳納米管在用于抗凝血性方面的應(yīng)用。本發(fā)明還公開了摻氮多壁碳納米管在細胞粘附和細胞生長方面的應(yīng)用。本發(fā)明選用的摻氮多壁碳納米管(MWCNTs-N)有著顯著地促進電子傳遞的能力，對抗壞血酸、還原性輔酶等生物分子的電催化作用顯著增強，因此，本發(fā)明人從慘氮多壁碳納米管(MWCNTs-N)表面的溶血，血小板粘附和成纖維細胞的粘附和生長行為來探究碳納米管的生物相容性。材料的血液相容性評價是材料生物學(xué)評價的重要組成部分，是最常用的粗篩試驗，也被認為是細胞毒性評價的一個補充試驗。溶血實驗的機理在于紅細胞破壞之后會造成血紅蛋白的釋放，血紅蛋白四方量的多少能通過分光光度計測定的OD值反應(yīng)出來，材料溶血率在5%以下為符合要求，可以認為沒有溶血作用。本發(fā)明的溶血試驗中樣品組和對照組吸光度均取3支試管的平均值。使用碳紙和摻氮多壁碳納米管作為樣品組。分別用生理鹽水和蒸餾水做陰性對照和陽性對照。作為陰性對照組的生理鹽水和新鮮的抗凝血作用后，在離心管底部是完好的紅細胞，上部是澄清的液體，而陽性對照組的紅細胞由于受到破壞而通過破損的細胞膜釋放出血紅蛋白形成了紅色的、半透明的液體。兩種樣品材料的溶血測試結(jié)果良好，和陰性組的情況基本一致，祥見表l。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表1為樣品的溶血率測試及計算結(jié)果。從表中可以看出兩種樣品的溶血率順序為C〉MWCNTs-N,可以看出MWCNTs-N的溶血性稍優(yōu)于碳紙，且兩者溶血率都小于標(biāo)準(zhǔn)值5%，則可認為材料良好，沒有溶血性，對紅細胞沒有破壞。溶血率應(yīng)按下式計算溶血率(％)=^^xl00%C—5式中A~~樣品組的吸光度B——陰性對照組的吸光度C——陽性對照組的吸光度血小板粘附于表面并聚集成血栓子以減少出血。它能通過形成血小板栓抑制流血，通過催化凝血反應(yīng)使血小板栓穩(wěn)定，導(dǎo)致血栓。血小板粘附試驗是評價生物材料抗凝血性能的方法之一。血小板黏附率(％)=x100%式中A…-抗凝血中的血小板數(shù)；B--與材料作用完之后的抗凝血中的血小板數(shù)甲基硅油是一種抗凝血性能較好的材料,而玻璃球是抗凝血能力就很差，因此本發(fā)明就分別以它們作為陰、陽性參照物。與正常對照計數(shù)算出樣品血小板的粘附率。表2為樣品表明粘附血小板數(shù)及血小板粘附率的計算結(jié)果，可以看出兩種材料的血小板粘附率順序為OMWCNTs-N,—般認為疏水性表面可以抑制血小板的粘附和血栓的形成。因此，實驗結(jié)果說明兩種材料表面疏水性由高到低的順序為MWCNTs-N>C，而掃描電鏡結(jié)果顯示摻氮碳納米管的粗糙度顯著大于碳紙，這都與實驗過程中看到納米管接觸血液初期基本不吸附的現(xiàn)象一致。但兩種材料卻都與陰性對照組的數(shù)值接近且遠低于陽性對照組，均處于可使用范圍。表2實驗數(shù)據(jù)12血小板平均數(shù)血小板粘附率空白326369347.5硅27129128119.14%玻璃737272.579.13%碳紙25228426822,87%摻氮碳納米管283276279.519.57%本發(fā)明的圖l-6分別為碳紙和MWCNTs-N表面血小板粘附的掃描電鏡圖片。比較圖1,2可以看出碳紙和MWCNTs-N表面出現(xiàn)很多絲狀物(絲狀物為血漿中的可溶性纖維蛋白原在血小板的作用下變成的不可溶的纖維蛋白，纖維蛋白原是形成血栓的原料)。有研究表明，光滑的表面可減少血小板的聚集和解體，這與本實驗中在掃描電鏡下觀察到的在納米管表面血小板以個體存在的情況很少，基本上都是以血小板的聚集形式存在，而在碳紙表面血小板聚集較少的情況是一致的。圖3,4分別為碳紙和MWCNTs-N血小板個體的掃描電鏡圖片。圖5,6為兩種材料表面血小板聚集情況的圖片，通過比較發(fā)現(xiàn)碳紙和MWCNTs-N表面血小板發(fā)生變形和聚集并在周圍產(chǎn)生了一定量的纖維原蛋白將其包裹住，但二者聚集情況基本一致，處于同樣等級。表2中的數(shù)據(jù)表明MWCNTs-N和碳紙的血小板粘附率較為接近，但MWCNTs-N稍低于碳紙，這可能預(yù)示著MWCNTs-N的抗凝血性優(yōu)于碳紙。圖7為在生物倒置顯微鏡下直接觀察ld、1.5d、2d、3d、5d、7d幾個時間段各組細胞個數(shù)隨接種天數(shù)的變化曲線。圖l:碳紙表面血小板粘附情況(2000倍);圖2:氮摻雜碳納米管表面血小板粘附情況(2000倍)；圖3:碳紙表面血小板粘附情況(20000倍)；圖4:氮摻雜碳納米管表面血小板粘附情況(20000倍)；圖5:碳紙表面血小板粘附情況(20000倍)；圖6:氮摻雜碳納米管表面血小板粘附情況(20000倍)；圖7:不同樣品上的細胞數(shù)量隨培養(yǎng)天數(shù)的變化曲線圖。具體實施例方式為了簡單和清楚的目的，下文恰當(dāng)?shù)氖÷粤斯夹g(shù)的描述，以免那些不必要的細節(jié)影響對本技術(shù)方案的描述。本發(fā)明選用的摻氮多壁碳納米管(MWCNTs-N)可參考北京大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，第42巻,第l期,2006年l月公開的方法制得。6實施例1溶血情況研究-材料制備-陰性對照組生理鹽水(NS)陽性對照組蒸餾水(H20)樣品組碳紙(C)，氮摻雜多壁碳納米管(MWCNTs-N)配置稀釋兔血，由健康成年新西蘭兔心臟采血20ml，加2X草酸鉀lml，制備成新鮮的抗凝兔血。取新鮮的抗凝兔血8ml，加生理鹽水注射液10ml。每個樣品組3支三角瓶，每瓶各加入5cms的材料5，用生理鹽水注射液沖洗樣品三次，然后加入生理鹽水注射液5ml。陰性對照組3支三角瓶，每瓶加入生理鹽水注射液5ml。陽性對照組3支三角瓶，每瓶加入蒸餾水5ml。全部三角瓶封口后放入恒溫水浴中37±1。C保溫30min;每只試管加入0.05ml稀釋兔血，輕輕混勻，置37±1'C繼續(xù)保溫60min,取出所有三角瓶待其降至室溫；用離心機1500r.p.m離心15min;肉眼觀察上清液清亮，吸取上清液移入比色皿中，用分光光度計在545nm波長處測定吸光度，記錄結(jié)果見表1。實施例2血小板粘附情況研究材料制備陰性對照組直徑0.5mm的玻璃球表面涂以2W的甲基硅油，自然干燥后備用。陽性對照組直徑0.5mm的玻璃球樣品組碳紙(C)，氮摻雜多壁碳納米管(MWCNTs-N)在24孔板中，取lxlcn^的碳紙和摻氮碳納米管材料各2片，分別放入4個孔中。陰性對照組2個孔，各放涂有2。/。甲基硅油的直徑為0.5mm的玻璃球140個。陽性對照組2個孔，各放直徑為0.5mm的玻璃球140個。取健康成年新西蘭兔心臟血，與樣品接觸1560秒鐘，將通過材料的血液與EDTA(1%)以9:1比例混勻。再用血小板保存液稀釋抗凝血。并在鏡下做血小板計數(shù)。取出材料對表面進行掃描電鏡分析，實驗結(jié)果見表2。實施例3細胞粘附和生長行為情況研究首先將所用的小牛血清加熱到56'C解凍，待血清完全解凍后，保持在56'C的狀態(tài)半小時，得到培養(yǎng)液50ml，然后放入冰箱冷藏待用；磷酸鹽緩沖粉末溶于500ml三蒸水，得到PBS緩沖液待用；酶的配制每500ml的胰酶需要1.25g的酶，兌250ml的PBS，再加入250ml的三蒸水，然后放入冰箱冷凍待用。實驗所用細胞為小鼠成纖維細胞。按培養(yǎng)常規(guī)進行細胞培養(yǎng)。將碳紙，氮摻雜碳納米管各8片分別放在孔板里，加入培養(yǎng)液后放入恒溫箱浸泡24小時。然后在材料接種細胞，接種密度均為20萬/ml，另接種6個空白孔作為對照組；培養(yǎng)24小時后將料材料取出，晾干，噴金后用QUANTA200型掃描電鏡(荷蘭DEI公司)進行材料表面的形貌分析。材料與細胞分別培養(yǎng)ld、1.5d、2d、3d、5d、7d后按常規(guī)方法消化細胞，用計數(shù)板進行細胞計數(shù)由于成纖維細胞株主要對促進組織修復(fù)和再生中起重要作用的，因此采用小鼠的成纖維細胞做細胞粘附實驗。見圖7,從圖中可以看出，對照組在第1到5天之間，生長濃度逐漸增加，而5天后逐漸減小，說明已經(jīng)開始了衰退期；兩種樣品材料上的情形基本都是從1天開始直到第7天，細胞濃度都是在增加。材料與小鼠成纖維細胞具有較好的結(jié)合能力，無死亡細胞懸浮、且直到第7天細胞還處在增殖期，這是由于摻氮納米管的立體空間結(jié)構(gòu)為細胞提供了更大的增殖空間，生存空間大，容許長時間生長，便于細胞代謝。但細胞數(shù)量增長幅度不同，順序由高到低為MWCNTs-N〉C。這初步預(yù)示著氮摻雜的多壁碳納米管更利于細胞的粘附和生長，結(jié)果見表3。表3細胞數(shù)量(單位:lOVml)lday1.5day2day3day5day7dayControlgroup空白對照組1.752.22.83.14.23.3Carbonpaper碳紙0.50.61.4124MWCNTs-N摻氮碳納米管1.110.7513.755.4在詳細說明的較佳實施例之后，熟悉該項技術(shù)人士可清楚地了解，在不脫離上述申請專利范圍與精神下可進行各種變化與修改，凡依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍。且本發(fā)明亦不受說明書中所舉實例實施方式的限制。8權(quán)利要求1、摻氮多壁碳納米管在制備組織相容性和血液相容性生物醫(yī)學(xué)材料中的應(yīng)用。2、權(quán)利要求1所述摻氮多壁碳納米管在用于抗溶血方面的應(yīng)用。3、權(quán)利要求1所述摻氮多壁碳納米管在用于血小板粘附方面的應(yīng)用。4、權(quán)利要求1所述摻氮多壁碳納米管在用于抗凝血性方面的應(yīng)用。5、權(quán)利要求1所述摻氮多壁碳納米管在細胞粘附和細胞生長方面的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及摻氮多壁碳納米管在制備組織相容性和血液相容性生物醫(yī)學(xué)材料中的應(yīng)用。本發(fā)明人從摻氮多壁碳納米管(MWCNTs-N)表面的溶血，血小板粘附和成纖維細胞的粘附和生長行為來探究摻氮多壁碳納米管的生物相容性。通過溶血和血小板粘附實驗及計算表明氮摻雜的多壁碳納米管的溶血率和血小板粘附率均符合標(biāo)準(zhǔn)，材料處于可使用的范圍。通過小鼠的成纖維細胞做細胞粘附實驗表明氮摻雜的多壁碳納米管更利于細胞的粘附和生長。預(yù)示氮摻雜的多壁碳納米管可將生物降解性和生物相容性的聚合物與藥物一起制成納米藥物，作為靶向藥物制劑，直接導(dǎo)入病灶部位，達到提高藥物療效，降低毒性的目的。文檔編號A61K47/04GK101537206SQ20091006866公開日2009年9月23日申請日期2009年4月29日優(yōu)先權(quán)日2009年4月29日發(fā)明者李德軍,瑩楊,麗袁申請人:天津師范大學(xué)