一種肺癌輻射抗性細(xì)胞株的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說是涉及一種具有穩(wěn)定輻射抗性的肺癌輻射 抗性細(xì)胞株的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，2014年國家癌癥中心發(fā)布《中國腫瘤登記年 報(bào)》報(bào)道，肺癌在我國惡性腫瘤中發(fā)病率居第一位，每年新發(fā)病例約60萬，死亡病例約49 萬。放射治療是目前肺癌多學(xué)科綜合治療的重要手段之一，統(tǒng)計(jì)顯示超過70%的患者在診 療過程中要接受放射治療。然而，雖經(jīng)各種手段綜合治療，肺癌療效總體差強(qiáng)人意，5年生存 率長期徘徊于15%左右，亟待改善。腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是肺癌放射治療失敗的主要原因，現(xiàn)有 研宄認(rèn)為，肺癌放射治療后殘留細(xì)胞，即肺癌輻射抗性細(xì)胞侵襲力和轉(zhuǎn)移活性增強(qiáng)，是腫瘤 復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。因此，構(gòu)建肺癌輻射抗性細(xì)胞體外模型，對(duì)提高肺癌治療療效具有重要 意義。
[0003]目前用于構(gòu)建肺癌輻射抗性細(xì)胞的方法主要有小劑量等分割照射法和亞致死劑 量照射法，其中小劑量等分割照射法因照射次數(shù)較多、構(gòu)建周期需一年以上，細(xì)胞污染幾率 大，穩(wěn)定傳代成系較難。亞致死劑量照射法是采用使肺癌細(xì)胞DNA單鏈斷裂的亞致死劑量 1次性照射，例如分別給予肺癌A549和H1299細(xì)胞亞致死劑量6. 5Gy和5. 5Gy的1次性照 射。但目前臨床常規(guī)劑量分割放射治療總劑量應(yīng)不低于60Gy，亞致死劑量照射法與現(xiàn)有臨 床放療模式相差較大，因此采用此法構(gòu)建的肺癌輻射抗性細(xì)胞無法最大限度模擬臨床復(fù)發(fā) 癌放射生物學(xué)特性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種具有穩(wěn)定輻射抗性的肺癌輻射抗性細(xì)胞株的構(gòu)建方法， 照射次數(shù)少，構(gòu)建周期短，細(xì)胞污染幾率小，構(gòu)建的輻射抗性細(xì)胞株能模擬臨床復(fù)發(fā)癌放射 生物學(xué)特性。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種肺癌輻射抗性細(xì)胞株的構(gòu)建 方法，包括以下步驟：
[0006] ①將肺癌細(xì)胞置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)其覆蓋培養(yǎng)瓶60~70%并 處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，接種于六孔板中，把六孔板置于照射野中心，六孔板底面覆蓋1. 5cm厚 的組織等效填充物，照射源為醫(yī)用直線加速器，6MV-X線，機(jī)架旋轉(zhuǎn)180°，在室溫條件下射 線從下方垂直入射，劑量率300cGy/min，源皮距SSD= 100cm，第1次予以2Gy照射；
[0007] ②照射后更換新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶80%以上時(shí)，胰酶消化，傳代兩次以 上；
[0008]③傳代后置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2~3天，待細(xì)胞再次覆蓋培養(yǎng)瓶60~ 70 %后，再次給予2Gy照射；
[0009] ④每一次照射后的細(xì)胞均按上述步驟②和步驟③的方法傳代并培養(yǎng)至穩(wěn)定狀態(tài) 后再進(jìn)行照射，依次增加照射劑量達(dá)4Gy、6Gy、8Gy和lOGy，每劑量均照射2次，總劑量達(dá) 60Gy，繼續(xù)培養(yǎng)及傳代5代以上至細(xì)胞形態(tài)、增殖穩(wěn)定，凍存?zhèn)溆谩?br>[0010] 進(jìn)一步，所述六孔板中每孔細(xì)胞接種量為5X105個(gè)。
[0011] 進(jìn)一步，所述醫(yī)用直線加速器為Varian23-EX醫(yī)用直線加速器。
[0012] 進(jìn)一步，所述X線的照射野大小為30cmX30cm。
[0013] 本發(fā)明的技術(shù)方案有如下有益效果：
[0014] 1、利用本發(fā)明構(gòu)建肺癌輻射抗性細(xì)胞株，總共進(jìn)行射線照射10次，照射次數(shù)少； 構(gòu)建周期約6個(gè)月，時(shí)間短；且因細(xì)胞從細(xì)胞無菌培養(yǎng)室外置于放射治療室的次數(shù)較少，細(xì) 胞污染幾率小，優(yōu)于小劑量等分割照射法；
[0015] 2、集落形成實(shí)驗(yàn)是目前國際公認(rèn)的檢測(cè)細(xì)胞輻射抗性的金標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明采用集落 形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的輻射抗性，結(jié)果表明采用本發(fā)明構(gòu)建的肺癌輻射抗性細(xì)胞株的平均致 死量％、準(zhǔn)閾劑量Dq和2Gy生存分?jǐn)?shù)SF2均高于亞致死劑量照射法，即采用本發(fā)明構(gòu)建肺 癌輻射抗性細(xì)胞株的輻射抗性高于亞致死劑量照射法；
[0016] 3、本發(fā)明照射總劑量為60Gy，與現(xiàn)有臨床放療模式相近，構(gòu)建的輻射抗性細(xì)胞株 能最大限度模擬臨床復(fù)發(fā)癌放射生物學(xué)特性。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明構(gòu)建方法的流程圖；
[0018] 圖2為A549細(xì)胞與輻射抗性A549R細(xì)胞在倒置光學(xué)相差顯微鏡（100倍放大）下 的形態(tài)圖，其中，A為A549細(xì)胞形態(tài)圖，B為A549R細(xì)胞形態(tài)圖；
[0019]圖3為集落形成實(shí)驗(yàn)繪制的A549與輻射抗性細(xì)胞的細(xì)胞生存曲線圖，其中A為單 靶多擊模型，B為二次線性模型；
[0020] 圖4為H1299細(xì)胞與輻射抗性H1299R細(xì)胞在倒置光學(xué)相差顯微鏡（100倍放大） 下的形態(tài)圖，其中，C為H1299細(xì)胞形態(tài)圖，D為H1299R細(xì)胞形態(tài)圖；
[0021] 圖5為集落形成實(shí)驗(yàn)繪制的H1299與輻射抗性細(xì)胞的細(xì)胞生存曲線圖，其中C為 單靶多擊模型，D為二次線性模型。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 人肺腺癌細(xì)胞株A549和H1299,購于南京凱基生物有限公司，培養(yǎng)基為含10 %胎 牛血清（購于四季青公司）的1640培養(yǎng)基（購自賽默飛世爾生物化學(xué)有限公司），分別置 于37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0023] 實(shí)施例1
[0024] 如圖1所示，一種肺癌輻射抗性細(xì)胞株的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0025] ①將人肺癌細(xì)胞株A549置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)其覆蓋培養(yǎng)瓶 60~70%并處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，以每孔5X105個(gè)接種于六孔板中，把六孔板置于照射野中 心，六孔板底面覆蓋1. 5cm厚的組織等效填充物，照射源為Varian23-EX醫(yī)用直線加速器， 6MV-X線，機(jī)架旋轉(zhuǎn)180°，在室溫條件下射線從下方垂直入射，劑量率300cGy/min，源皮距 SSD= 100cm，照射野大小為30X30cm，第1次予以2Gy照射；
[0026] ②照射后更換新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶80%以上時(shí)，胰酶消化，傳代兩次以 上；
[0027] ③傳代后置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2~3天，待細(xì)胞再次覆蓋培養(yǎng)瓶60~ 70 %后，再次給予2Gy照射；
[0028] ④每一次照射后的細(xì)胞均按上述步驟②和步驟③的方法傳代并培養(yǎng)至穩(wěn)定狀態(tài) 后再進(jìn)行照射，依次增加照射劑量達(dá)4Gy、6Gy、8Gy和10Gy，每劑量均照射2次，總劑量達(dá) 60Gy，繼續(xù)培養(yǎng)及傳代5代以上至細(xì)胞形態(tài)、增殖穩(wěn)定，即得到A549肺癌輻射抗性細(xì)胞，命 名為A549R(A549_radioresistance)細(xì)胞，凍存?zhèn)溆谩?b