專(zhuān)利名稱(chēng)：一種有效硒生物檢測(cè)用細(xì)胞株GpSEGFP4及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種有效硒生物檢測(cè)用細(xì)胞株及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
硒是許多真核生物、細(xì)菌和古菌的必需微量元素，主要以第21種氨基酸硒代半胱氨酸(Selenocysteine, See)的形式進(jìn)入硒蛋白發(fā)揮功能,與人類(lèi)健康關(guān)系密切。研究結(jié)果表明硒缺乏易造成心血管疾病、免疫力低下、男性不育、增加各種癌癥的患病幾率等；而過(guò)多攝入硒可引起動(dòng)物的各種急性和慢性硒中毒。硒在地殼中分布廣泛但不均勻，中國(guó)約有三分之二的地區(qū)為缺硒區(qū)；而某些個(gè)別地區(qū)含量非常高，甚至達(dá)到了對(duì)人畜有中毒危險(xiǎn)的水平。生物體主要從環(huán)境中獲取硒元素并部分轉(zhuǎn)化為在體內(nèi)發(fā)揮功能的有效硒，體內(nèi)有效硒含量直接或間接影響動(dòng)植物的健康生長(zhǎng)，因此檢測(cè)環(huán)境及生物制品中有效硒的含量對(duì)維系生物安全具有重要的意義。硒的化學(xué)性質(zhì)與硫非常類(lèi)似，經(jīng)硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白吸收的硒酸鹽，在細(xì)菌胞內(nèi)經(jīng)ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase, ATPS)活化為腺苷 _5’_ 憐硒酸(Adenosine 5’_PhosphoSelenate,APSe)，可進(jìn)一步還原形成亞硒酸和Se2_。胞內(nèi)的Se2_在硒磷酸合成酶(SelD)的催化下活化為硒磷酸；絲氨 酰tRNA合成酶可催化tRNAuoT轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)和絲氨酸活化為Ser-tRNAras'在硒代半胱氨酸合酶(SelA)的催化下利用Ser-tRNAg-和硒磷酸合成Sec-tRNAueAsec;。SedRNAu。廣e能被特殊的延伸因子SelB識(shí)別結(jié)合，與GTP、硒代半胱氨酸插入識(shí)別序列(Selenocysteine insertion sequence, SECIS,圖1)形成 SelB 四兀復(fù)合物，通過(guò)與核糖體mRNA相互作用，將Sec密碼子UGA解讀為Sec。原核生物中硒蛋白的表達(dá)，必需具以下幾個(gè)條件:1) mRNA具硒代半胱氨酸的密碼子UGA ；2) UGA正下游的莖環(huán)結(jié)構(gòu)SECIS(順式作用元件);3)4種獨(dú)特的基因產(chǎn)物SelA、SelB、SelC、SelD (反式作用元件)。這些條件的滿足并不能保證UGA/SECIS —定會(huì)編碼Sec，UGA能否通讀翻譯形成硒蛋白由多種因素調(diào)控，如:硒源的充足與否；SelB四元復(fù)合物形成的過(guò)程和組分的比例；RF2和Sec-tRNA^-的相對(duì)濃度和UGA通讀的準(zhǔn)確性等。鑒于硒劑量的重要性，各地區(qū)環(huán)境及生物樣品中硒含量的檢測(cè)備受關(guān)注。目前常見(jiàn)的硒含量測(cè)定方法主要為物理化學(xué)方法。其他測(cè)定方法包括分析含硒酶的活性等，如測(cè)定哺乳動(dòng)物體內(nèi)硒依賴(lài)的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性可間接測(cè)定硒的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。而上述方式只能檢測(cè)樣品內(nèi)總硒含 量，無(wú)法檢測(cè)出能被生物利用的有效硒，更無(wú)法檢測(cè)出生物對(duì)何種狀態(tài)的硒元素有更高的利用率。硒酸鹽為常見(jiàn)的生物有效硒的一種。根據(jù)原核生物硒代半胱氨酸的插入機(jī)制，在硒酸鹽為限制因子的條件下，硒酸鹽可有效轉(zhuǎn)化為Sec，且在充足的硒蛋白mRNA及SelB的情況下，培養(yǎng)基中的硒含量可能與胞內(nèi)硒蛋白(報(bào)告基因)的合成量有一定的正相關(guān)性，此為構(gòu)建有效硒生物檢測(cè)器的理論基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種有效硒生物檢測(cè)用細(xì)胞株GpSEGFP4的構(gòu)建方法，該方法通過(guò)UGA/SECIS控制熒光蛋白GFP表達(dá)，在外界條件優(yōu)化的前提下，培養(yǎng)基中硒酸鹽的含量即為被大腸桿菌所利用的生物有效硒，通過(guò)分析硒含量和熒光蛋白的熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系，從而定量砸，構(gòu)建有效砸的檢測(cè)器。為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
一種有效硒生物檢測(cè)用細(xì)胞株GpSEGFP4的構(gòu)建方法，該細(xì)胞株的構(gòu)建方法包括以下的步驟:
一、vSECISl載體的構(gòu)建
1.1) ρΚΜδο I載體構(gòu)建
定點(diǎn)突變?chǔ)宝?載體得到ZAoI酶切位點(diǎn)，純化產(chǎn)物并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證得ρΚ6ΖΑοΙ載體；
1.2) ^oXho 1-CA Γ 載體構(gòu)建
氯霉素抗性基因進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠中電泳，并割膠回收、純化目的條帶，用SmaI酶切pKa^oJ載體，純化后與氯霉素抗性基因連接，經(jīng)菌液PCR與測(cè)序驗(yàn)證得至Ij ^oXho 載體；
1.3) vSECISl載體構(gòu)建
通過(guò)兩次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增得到SECIS序列，模板依次為ρΚ6ΖΑο載體、第一
次PCR產(chǎn)物純化產(chǎn)物，將第二次PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并純化，用Xho I和HindIII分別酶切PCAT載體和SECIS序列，純化酶切產(chǎn)物并連接，經(jīng)菌液PCR和測(cè)序驗(yàn)證得到VSECISI 載體；
1.4)ρ5￡Τ_Λ 突變載體構(gòu)建
對(duì)vSECISl質(zhì)粒進(jìn)行定點(diǎn)突變，將純化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證得到13個(gè)正確的突變體；
二、pC0LA-5WJSC載體構(gòu)建
2.1) pC0LA-5WC載體構(gòu)建
PCR擴(kuò)增基因序列，純化PCR產(chǎn)物并與pMD18T simple載體連接，測(cè)序驗(yàn)證得到 pMD18T sim^le-SelC,用 Nde 1、Kpn I 分別酶切 PCOLAduet-1 載體、sSelC質(zhì)粒,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、割膠回收純化、連接并轉(zhuǎn)入DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR與測(cè)序驗(yàn)證得到pC0LA-5fe7C 載體；
2.2) pC0LA-5fe以SC載體構(gòu)建
擴(kuò)增SelAB基因序列，PCR產(chǎn)物純化、與pMD18T simple載體連接、轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細(xì)胞并測(cè)序驗(yàn)證得到PMD-18T si卿Ie-SeIAB，BatnH I細(xì)ind III雙酶切pC0LA_5WC質(zhì)粒與sSelAB基因序列，酶切產(chǎn)物電泳并割膠回收純化、連接并轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR與測(cè)序驗(yàn)證得到pC0LA-5fe以SC載體；
三、pSECIS突變體篩選
3.1)測(cè)定13種突變體及野生型的生長(zhǎng)曲線
從Chl平板上挑取突變的13種及野生型菌種的單菌落，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，用含氨芐青霉素和硒酸鈉的LB培養(yǎng)基稀釋菌液至0D_=0.05，37°C，振蕩培養(yǎng)，測(cè)定1、2、3、4、5、6、7 h七個(gè)時(shí)間點(diǎn)的菌液OD6tltl ；
記錄分析在含硒和不含硒液體LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)繁殖速度；在不含硒的氨芐LB培養(yǎng)基中，只有不編碼硒蛋白的野生型正常生長(zhǎng)，其他的生長(zhǎng)均非常緩慢且無(wú)明顯區(qū)別；在0.5 mM硒酸鹽存在的情況下，野生型生長(zhǎng)速度與不加硒的生長(zhǎng)類(lèi)似，而VSECIS\的生長(zhǎng)速度明顯提高，基本是陽(yáng)性對(duì)照野生型生長(zhǎng)速度的一半左右，快于vSECISl以及另外的SECIS突變；篩選獲得》SECIS\突變體；
四、^mi^-SECIS-GFP載體構(gòu)建 4.1)載體構(gòu)建
三次PCR擴(kuò)增SEGFP序列在GFP 5’端引入U(xiǎn)GA/SECIS序列，模板依次為基因、第一次PCR產(chǎn)物、第二次PCR產(chǎn)物；純化PCR產(chǎn)物，第三次PCR產(chǎn)物末端加A，后純化并與pMD18T simple載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5 α，篩選并測(cè)序驗(yàn)證，得到pMD18Tsimp載體;I和歷m/ III分別酶切sSEGFP和pET23a并連接、轉(zhuǎn)化，得到PSEGFP質(zhì)粒并菌液PCR驗(yàn)證；
4.2) v^2 ,a-SECIS4-GFP 突變體構(gòu)建
m^SECIS-GFP質(zhì)粒載體突變，將PCR產(chǎn)物純化后轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5 α感受態(tài)細(xì)胞并測(cè)序驗(yàn)證；提取PSEGFP4質(zhì)粒并與'質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞獲得GpSEGFP4。作為優(yōu)選，所述的步驟1.1)的PCR體系為:
5XPS Buffer10 μ L,2.5 mM dNTP4 μ L,
100 ng/ μ IAxhl F 1.25 μ L,
100 ng/ μ L AxhI R 1.25 μ L,
130 ng/ μ L 模板 0.5 μ L,
2.5 U/μ L Prime STAR 0.5 μ L,ddH2032.5 μ L ；
所述的尤rAI F的序列為SEQ ID:N0.3 -Axhl R的序列為SEQ ID:N0.4 ；
PCR 程序?yàn)?98°C 5 min ；98°C 15 s，61°C 15 s，72 °C 5 min，20 個(gè)循環(huán)；72°C 10
min。作為優(yōu)選，所述的步驟1.2)的PCR體系為:
5XPS Buffer 10 μ L,
dNTP 4 μ L，
CAT F (100 ng/μ L) 1.25 μ L,
CAT R (lOOng/μ L) 1.25 μ L,pSM5 質(zhì)粒(37 ng/μ L) 2 μ L,
Prime STAR DNA Polymerase (2.5 U/μ L) 0.5 μ L,ddH20 30 μ L ；
所述的 CAT F 序列為 SEQ ID:N0.1 'CAT R 序列為 SEQ ID:N0.2 ；
PCR條件:除延伸時(shí)間為40s、循環(huán)為30個(gè)外，同pK6ZAoI載體的構(gòu)建。作為優(yōu)選，所述的步驟1.3)兩次PCR體系均為:
10XPCR Buffer 5 μ L,
dNTP (2.5 mM) 4 μ L,
上游引物(100 ng/yL)2 yL,下游引物(100 ng/yL)2 yL,
模板(48 ng/μ L) I μ L, rTaq (5 U/ μ L) 0.5 μ L, ddH20 35.5 μ L)；
兩次PCR上游引物均為SEQ ID:N0.5，下游引物依次為SEQ ID:N0.6、SEQ ID:N0.7 ； PCR 反應(yīng)條件:95°C 5 min ；95°C 30 s，62°C 30 s，72 °C 30s，35 個(gè)循環(huán)；72°C 10
min。作為優(yōu)選，所述的步驟1.4) PCR條件中退火溫度為62.4°C，突變PCR體系、PCR條件以及產(chǎn)物純化同pK6ZAoI載體構(gòu)建。作為優(yōu)選，所述的步驟2.1)擴(kuò)增基因序列采用PCR體系如下: rTaq (5 U/ μ L)0.2 μ L、
DH5a 基因組 0.5 μ L、
SelC F(100 ng/μ L) I μ L、
SelC R(100 ng/μ L) I μ L、dNTP 2 yL、
10XPCR Buffer 2 μ L、ddH20 13.3 μ L ；
所述的 SelC F 的序列為 SEQ ID:N0.37 -,SelC R 的序列為 SEQ ID:N0.38 ；
PCR 條件:95°C 5 min ；95°C 30 s,52°C 30 s,72°C 30 8，30個(gè)循環(huán)；72。0 10 min。作為優(yōu)選，所述的步驟2.2) PCR體系:
SelAB F (100 ng/μ L) I μ L、
SelAB R (100 ng/ μ L) I μ L,
所述的 SelAB F 的序列為 SEQ ID:N0.34，SelAB 7 的序列為 SEQ ID:N0.35 ；
延伸時(shí)間為3 min，其他PCR條件同pK6ZAoI突變。作為優(yōu)選，所述的步驟4.1) PCR體系與PCR條件同擴(kuò)增，上游引物依次為5￡邵1、SEG 2、SECjW下游引物均為SEG^下游引物均為SEG^, SEGYl的序列為SEQ ID:N0.39，SEGY2 的序列為 SEQ ID:N0.40，SBGF3 的序列為 SEQ ID:N0.41，SEG認(rèn)的序列為 SEQID:N0.42 ;第三次PCR產(chǎn)物末端加A，采用50 μ L PCR體系為24.5 μ LddH2O'15 μ L模板、5 μ L dNTP (2.5 mM) ,5 μ LlOXPCR Buffer、rTaq 酶(5 U/μ L) 0.5 μ I。作為優(yōu)選，所述的步驟4.2)PCR條件同突變體構(gòu)建，引物為SBCISF4 -,SBCISR4:的序列為 SEQ ID:N0.14，SBCISF4 的序列為 SEQ ID:N0.15。本發(fā)明通過(guò)UGA/SECIS控制熒光蛋白GFP表達(dá)，在外界條件優(yōu)化的前提下，培養(yǎng)基中硒酸鹽的含量即為被大腸桿菌所利用的生物有效硒，通過(guò)分析硒含量和熒光蛋白的熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系，從而定量硒，構(gòu)建有效硒的檢測(cè)器。硒蛋白的合成途徑可知，提高硒合成Sec和硒蛋白的效率和準(zhǔn)確率，將提高此檢測(cè)器的靈敏度和準(zhǔn)確度。因UGA下游核苷酸序列影響硒蛋白的合成效率 和準(zhǔn)確率，利用原核載體構(gòu)建硒代半胱氨酸插入所需莖環(huán)結(jié)構(gòu)及其突變載體，并以此控制b內(nèi)酰胺酶的翻譯表達(dá)，經(jīng)氨芐青霉素篩選獲得高效、高準(zhǔn)確率的
，并以此構(gòu)建GFP超表達(dá)載體pSEGFP。因SelABC的共表達(dá)可提高硒蛋白的翻譯效率，通過(guò)共轉(zhuǎn)化pSEGFP和咖IABC，誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果表明胞質(zhì)蛋白的熒光強(qiáng)度與硒酸鹽濃度在一定范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。此結(jié)果表明，我們已初步構(gòu)建大腸桿菌有效硒生物檢測(cè)器，為利用此方法進(jìn)一步分析測(cè)定環(huán)境及生物樣品中的有效硒含量奠定了基礎(chǔ)。


圖1為Sec插入識(shí)別序列SECIS結(jié)構(gòu)(大腸桿菌甲酸鹽脫氫酶為例)。其中黑體為Sec密碼子UGA，斜體為突變位點(diǎn)。圖2為SelC、SelAB的PCR擴(kuò)增及vSelABC的PCR驗(yàn)證。A.基因序列擴(kuò)增PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳圖(M.DL2, OOOtmDNA Marker, 1.DH5 α基因組PCR得到的產(chǎn)物，
2.陰性對(duì)照)；B.基因序列擴(kuò)增PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳圖(M.DL5, OOOtmDNAMarker，I.DH5 α基因組PCR產(chǎn)物，2.陰性對(duì)照)；C.PCR驗(yàn)證vSelABC載體構(gòu)建(Μ.DL5, OOOtmDNA Marker, 1.質(zhì)粒利用 SelAB 基因內(nèi)部引物 SelABC12.7p 和 SelCR 進(jìn)行PCR得到的產(chǎn)物，2.陰性對(duì)照)。圖3為C誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖；M.蛋白質(zhì)Marker，1.1PTG誘導(dǎo)前，2.1PTG誘導(dǎo)后。圖4為及其突變載體的構(gòu)建簡(jiǎn)示。圖5為含不同載體的大腸桿菌BL21(DE3)生長(zhǎng)曲線。A.BL21(DE3)在O mM硒酸鹽和100 μ L/mL Amp環(huán)境下生長(zhǎng)曲線。B.BL21 (DE3)在0.5 mM硒酸鹽和100uL/mL Amp環(huán)境下生長(zhǎng)曲線。圖6為pSEGFP4結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)示圖。圖7為pSEGFP4的誘導(dǎo)表達(dá)圖；A.pSEGFP4的結(jié)構(gòu)。B.誘導(dǎo)表達(dá)(M.低分子量蛋白Marker，1.誘導(dǎo)前，2.1PTG誘導(dǎo)，3.1PTG誘導(dǎo)和0.5mM硒酸鈉)。圖8為GFP熒光強(qiáng)度與硒酸鹽濃度之間的關(guān)系。
具體實(shí)施例方式材料
大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞、大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞、含(enhanced greenfluorescent protein,6F/*)基因的 pEGFP-Cl 載體、pSIM5 載體、pUC18-Kan_6 (pK6)載體、PCOLAduet-U pET23a載體均由實(shí)驗(yàn)室保存。rTaq酶、prime STAR酶、限制性內(nèi)切酶GWe
1、Kpn I, Bam^ 1、Hind III, Smal, XhoO, dNTPUOXPCR BufferUOXT BufferUOXKBuffer>5 Xprime STAR Buffer、10X loading Buffer、T4 Buffer、T4 ligase、PMD-18Tsimple Vector購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。硒酸鈉購(gòu)自sigma公司，酵母提取物和胰蛋白胨購(gòu)自O(shè)xoid LTD (Hampshire, England)。其它常用器材和試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。PCR 引物
根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕蛐蛄?，用primer premier 5.0完成引物設(shè)計(jì),并由上海賽百盛生物有限公司合成。所用引物見(jiàn)表I。表 I本發(fā)明所用引物列表
權(quán)利要求
1.一種有效硒生物檢測(cè)用細(xì)胞株GpSEGFP4的構(gòu)建方法，其特征在于該細(xì)胞株的構(gòu)建方法包括以下的步驟: 一、vSECISl載體的構(gòu)建 ` 1.1) ρΚΜδο I載體構(gòu)建 定點(diǎn)突變?chǔ)宝?載體得到ZAoI酶切位點(diǎn)，純化產(chǎn)物并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證得ρΚ6ΖΑοΙ載體； ` 1.2) ^oXho 1-CA Γ 載體構(gòu)建 氯霉素抗性基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠中電泳，并割膠回收、純化目的條帶，用SmaI酶切pKa^oJ載體，純化后與氯霉素抗性基因連接，經(jīng)菌液PCR與測(cè)序驗(yàn)證得至Ij ^oXho 載體； ` 1.3) vSECISl載體構(gòu)建 通過(guò)兩次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增得到SECIS序列，模板依次為ρΚ6ΖΑο載體、第一次PCR產(chǎn)物純化產(chǎn)物，將第二次PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并純化，用Xho I和HindIII分別酶切PCAT載體和SECIS序列，純化酶切產(chǎn)物并連接，經(jīng)菌液PCR和測(cè)序驗(yàn)證得到VSECISI 載體； `1.4)ρ5￡Τ_Λ 突變載體構(gòu)建 對(duì)vSECISl質(zhì)粒進(jìn)行定點(diǎn)突變，將純化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證得到13個(gè)正確的突變體； 二、pC0LA-5WJSC載體構(gòu)建 `2.1) pC0LA-5WC載體構(gòu)建 PCR擴(kuò)增基因序列，純化PCR產(chǎn)物并與pMD18T simple載體連接，測(cè)序驗(yàn)證得到 pMD18T sim^le-SelC,用 Nde 1、Kpn I 分別酶切 PCOLAduet-1 載體、sSelC質(zhì)粒,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、割膠回收純化、連接并轉(zhuǎn)入DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR與測(cè)序驗(yàn)證得到pC0LA-5fe7C 載體； `2.2) pC0LA-5fe以SC載體構(gòu)建 擴(kuò)增SelAB基因序列，PCR產(chǎn)物純化、與pMD18T simple載體連接、轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細(xì)胞并測(cè)序驗(yàn)證得到PMD-18T si卿Ie-SeIAB，BatnH I細(xì)ind III雙酶切pC0LA_5WC質(zhì)粒與sSelAB基因序列，酶切產(chǎn)物電泳并割膠回收`純化、連接并轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR與測(cè)序驗(yàn)證得到pC0LA-5fe以SC載體； 三、pSECIS突變體篩選 `3.1)測(cè)定13種突變體及野生型的生長(zhǎng)曲線 從Chl平板上挑取突變的13種及野生型菌種的單菌落，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，用含氨芐青霉素和硒酸鈉的LB培養(yǎng)基稀釋菌液至0D_=0.05，37°C，振蕩培養(yǎng)，測(cè)定1、2、3、`4、5、6、7 h七個(gè)時(shí)間點(diǎn)的菌液OD6tltl ； 記錄分析在含硒和不含硒液體LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)繁殖速度；在不含硒的氨芐LB培養(yǎng)基中，只有不編碼硒蛋白的野生型正常生長(zhǎng)，其他的生長(zhǎng)均非常緩慢且無(wú)明顯區(qū)別；在0.5 mM硒酸鹽存在的情況下，野生型生長(zhǎng)速度與不加硒的生長(zhǎng)類(lèi)似，而VSECIS\的生長(zhǎng)速度明顯提高，基本是陽(yáng)性對(duì)照野生型生長(zhǎng)速度的一半左右，快于vSECISl以及另外的SECIS突變；篩選獲得》SECIS\突變體；四、pET23a-SECIS-GFP載體構(gòu)建 .4.1)載體構(gòu)建 三次PCR擴(kuò)增SEGFP序列在GFP 5’端引入U(xiǎn)GA/SECIS序列，模板依次為基因、第一次PCR產(chǎn)物、第二次PCR產(chǎn)物；純化PCR產(chǎn)物，第三次PCR產(chǎn)物末端加A，后純化并與pMD18T simple載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5 α，篩選并測(cè)序驗(yàn)證，得到pMD18Tsimp載體;I和歷m/ III分別酶切sSEGFP和pET23a并連接、轉(zhuǎn)化，得到PSEGFP質(zhì)粒并菌液PCR驗(yàn)證； .4.2) pET23a-SECIS4-GFP 突變體構(gòu)建 m^SECIS-GFP質(zhì)粒載體突變，將PCR產(chǎn)物純化后轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5 α感受態(tài)細(xì)胞并測(cè)序驗(yàn)證；提取PSEGFP4質(zhì)粒并與'質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞獲得GpSEGFP4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種有效硒生物檢測(cè)用細(xì)胞株GpSEGFP4的構(gòu)建方法，其特征在于步驟1.1)的PCR體系為: 5XPS Buffer10 μ L, 2.5 mM dNTP4 μ L,100 ng/ μ IAxhl F 1.25 μ L,100 ng/ μ L AxhI R 1.25 μ L, 130 ng/ μ L 模板 0.5 μ L,2.5 U/μ L Prime STAR 0.5 μ L,ddH2032.5 μ L ； 所述的尤rAI F的序列為SEQ ID:N0.3 -Axhl R的序列為SEQ ID:N0.4 ； PCR 程序?yàn)?98°C 5 min ；98°C 15 s，61°C 15 s，72 °C 5 min，20 個(gè)循環(huán)；72°C 10min0
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種有效硒生物檢測(cè)用細(xì)胞株GpSEGFP4的構(gòu)建方法，其特征在于步驟1.2)的PCR體系為:5XPS Buffer 10 μ L,dNTP 4 μ L，CAT F (100 ng/μ L) 1.25 μ L,CAT R (lOOng/μ L) 1.25 μ L,pSM5 質(zhì)粒(37 ng/μ L) 2 μ L,Prime STAR DNA Polymerase (2.5 U/μ L) 0.5 μ L,ddH20 30 μ L ；所述的 CAT F 序列為 SEQ ID:N0.1 'CAT R 序列為 SEQ ID:N0.2 ； PCR條件:除延伸時(shí)間為40s、循環(huán)為30個(gè)外，同pK6ZAoI載體的構(gòu)建。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種有效硒生物檢測(cè)用細(xì)胞株GpSEGFP4的構(gòu)建方法，其特征在于步驟1.3)兩次PCR體系均為:10XPCR Buffer 5 μ L,dNTP (2.5 mM) 4 μ L, 上游引物(100 ng/yL)2 yL, 下游引物(100 ng/yL)2 yL,模板(48 ng/μ L) I μ L, rTaq (5 U/ μ L) 0.5 μ L, ddH20 35.5 μ L)； 兩次PCR上游引物均為SEQ ID:N0.5，下游引物依次為SEQ ID:N0.6、SEQ ID:N0.7 ； PCR 反應(yīng)條件:95°C 5 min ；95°C 30 s，62°C 30 s，72 °C 30s，35 個(gè)循環(huán)；72°C 10min。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種有效硒生物檢測(cè)用細(xì)胞株GpSEGFP4的構(gòu)建方法，其特征在于步驟1.4) PCR條件中退火溫度為62.40C，突變PCR體系、PCR條件以及產(chǎn)物純化同ρΚ6Ζδο I載體構(gòu)建。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種有效硒生物檢測(cè)用細(xì)胞株GpSEGFP4的構(gòu)建方法，其特征在于步驟2.1)擴(kuò)增基因序列采用PCR體系如下:rTaq (5 U/ μ L)0.2 μ L、 DH5a 基因組 0.5 μ L、SelC F(100 ng/μ L) I μ L、SelC R(100 ng/μ L) I μ L、dNTP 2 yL、10XPCR Buffer 2 μ L、ddH20 13.3 μ L ；所述的 SelC F 的序列為 SEQ ID:N0.37 -,SelC R 的序列為 SEQ ID:N0.38 ； PCR 條件:95°C 5 min ；95°C 30 s,52°C 30 s,72°C 30 8，30個(gè)循環(huán)；72。0 10 min。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種有效硒生物檢測(cè)用細(xì)胞株GpSEGFP4的構(gòu)建方法，其特征在于步驟2.2) PCR體系:SelAB F (100 ng/μ L) I μ L、SelAB R (100 ng/ μ L) I μ L, 所述的 SelAB F 的序列為 SEQ ID:N0.34，SelAB 7 的序列為 SEQ ID:N0.35 ； 延伸時(shí)間為3 min，其他PCR條件同pK6ZAoI突變。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種有效硒生物檢測(cè)用細(xì)胞株GpSEGFP4的構(gòu)建方法，其特征在于步驟4.DPCR體系與PCR條件同擴(kuò)增，上游引物依次為5￡邵1、5￡邵2、5￡邵3，下游引物均為5^1 ，5￡邵1的序列為SEQ ID:N0.39，5H F2的序列為SEQ ID:N0.40，5￡邵3的序列為SEQ ID:N0.41, 的序列為SEQ ID:N0.42 ;第三次PCR產(chǎn)物末端加A，采用50μ L PCR體系為 24.5 μ L ddH20、15 μ L模板、5 μ L dNTP (2.5 mM)、5 μ LlO X PCR Buffer,rTaq 酶(5 U/μ L) 0.5 μ I。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種有效硒生物檢測(cè)用細(xì)胞株GpSEGFP4的構(gòu)建方法，其特征在于步驟4.2) PCR條件同vSECIS突變體構(gòu)建，引物為5￡Π4、SECISV^ -,SECISR^的序列為 SEQ ID:N0.14, SBCISF4:的序列為 SEQ ID:ΝΟ.15。
10.根據(jù)權(quán)利要求Γ9任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的構(gòu)建方法得到的細(xì)胞株GpSEGFP4。
全文摘要
本發(fā)明涉及有效硒生物檢測(cè)用細(xì)胞株GpSEGFP4的構(gòu)建方法，方法為一、pSECIS1載體的構(gòu)建，1.1)pK6XhoI載體構(gòu)建，1.2)pK6XhoI-CAT載體構(gòu)建，1.3)pSECIS1載體構(gòu)建，1.4)pSECIS突變載體構(gòu)建，二、pCOLA-SelABC載體構(gòu)建，2.1)pCOLA-SelC載體構(gòu)建，2.2)pCOLA-SelABC載體構(gòu)建，三、pSECIS突變體篩選，3.1)測(cè)定13種pSEICIS突變體及野生型的生長(zhǎng)曲線，四、pET23a-SECIS-GFP載體構(gòu)建，4.1)pET23a-SECIS-GFP載體構(gòu)建，4.2)pET23a-SECIS4-GFP突變體構(gòu)建。該方法能構(gòu)建硒的檢測(cè)器。
文檔編號(hào)C12R1/19GK103233033SQ201310132610
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月16日
發(fā)明者孫梅好, 徐麗珊, 馬建輝, 邱洋松, 孫婧, 孫愛(ài), 鄔丹妮, 張冰倩 申請(qǐng)人:浙江師范大學(xué)