雙功能修飾鐵蛋白重鏈亞基納米粒子及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種雙功能修飾的鐵蛋白重鏈亞基納米粒子及其制備方法和用途。所述的雙功能修飾的鐵蛋白重鏈亞基納米粒子其在FTH1的N端或C端修飾有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白。本發(fā)明的鐵蛋白重鏈亞基納米粒子修飾有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP，與修飾有EGF的納米粒子同時(shí)進(jìn)行變復(fù)性，并在體外進(jìn)行自組裝，形成的雜合蛋白納米粒子能夠針對(duì)性地靶向腫瘤細(xì)胞并保持熒光活性，該納米粒子的制備方法為實(shí)現(xiàn)生物大分子類的納米載體的功能化修飾提供了新的方法和參考，為后續(xù)選擇藥物靶向腫瘤細(xì)胞治療提供了非常好的模型，具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】雙功能修飾鐵蛋白重鏈亞基納米粒子及其制備方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種雙功能修飾的鐵蛋白重鏈亞基納米粒子及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]納米材料的特性使其在腫瘤診斷分析方面具有許多優(yōu)勢(shì)，納米技術(shù)的近期發(fā)展使得納米級(jí)載體可以同時(shí)連接上各種功能性分子，包括對(duì)腫瘤特異識(shí)別的配體、抗體、抗癌藥物以及成像探針等。生物籠狀蛋白本身就是天然生物大分子，具有良好的生物兼容性。他們通常是由多個(gè)多肽亞基結(jié)合形成中空結(jié)構(gòu)，外部與中空直徑均在納米尺度，使得納米材料易于在其表面、內(nèi)部以及各蛋白亞基界面之間進(jìn)行修飾，組裝成各種多功能分子。近來(lái)隨著基因工程、蛋白化學(xué)修飾技術(shù)與納米技術(shù)的融合，這方面的工作已經(jīng)引起了普遍的關(guān)注和興趣。
[0003]有大量研究表明，腫瘤細(xì)胞的表皮生長(zhǎng)因子受體(epithelial growth factorreceptor, EGFR)表達(dá)量過(guò)高，這使得EGFR成為腫瘤治療中一個(gè)非常好的靶點(diǎn)。表面修飾EGF的納米粒子，能通過(guò)配體受體結(jié)合作用進(jìn)入細(xì)胞，這為藥物的傳遞提供了良好的可行性。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有的納米粒子對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向作用過(guò)程中示蹤性不夠好，觀察和分析不夠方便，且功能單一的缺陷，而提供一種新的鐵蛋白重鏈亞基納米粒子及其制備方法和用途。本發(fā)明的鐵蛋白重鏈亞基納米粒子修飾有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP，與修飾有EGF的納米粒子同時(shí)進(jìn)行變復(fù)性，并在體外進(jìn)行自組裝，形成的雜合蛋白納米粒子能夠針對(duì)性地靶向腫瘤細(xì)胞并保持熒光活性，該納米粒子的制備方法為實(shí)現(xiàn)生物大分子類的納米載體的功能化修飾提供了新的方法和參考，為后續(xù)選擇藥物靶向腫瘤細(xì)胞治療提供了非常好的模型，具有很好的應(yīng)用前景。
[0005]本發(fā)明提供下述技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題。
[0006]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是:一種雙功能修飾的鐵蛋白重鏈亞基納米粒子，其在FTHl的N端或C端修飾有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白。
[0007]本發(fā)明中，所述的FTHl為本領(lǐng)域最常見(jiàn)的鐵蛋白重鏈亞基納米粒子(專利CN101942022A中已經(jīng)對(duì)其做了詳細(xì)披露)，其還可以是現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報(bào)道過(guò)的任意的鐵蛋白重鏈亞基納米粒子。
[0008]綠色熒光蛋白(GFP)，是源自維多利亞水母的新型報(bào)告分子，在藍(lán)光或紫外光照射下其熒光發(fā)色團(tuán)會(huì)發(fā)出綠色熒光，無(wú)需加任何輔助因子。而增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)是錢永健等人在1995年運(yùn)用S65T單點(diǎn)突變技術(shù)得到的光穩(wěn)定性和熒光強(qiáng)度大幅增強(qiáng)的GFP突變體，其熒光強(qiáng)度為GFP的4~35倍，它具有非常穩(wěn)定的構(gòu)象，不易發(fā)生光漂白且易于檢測(cè)，無(wú)論融合與蛋白質(zhì)的N端還是C端都不會(huì)影響目的蛋白的構(gòu)象的特點(diǎn)。與此同時(shí)，相對(duì)于生物發(fā)光成像，熒光成像無(wú)輻射、方便、直觀、標(biāo)記靶點(diǎn)多樣、費(fèi)用低，易于被大多數(shù)研究人員接受。在腫瘤的研究中，可為腫瘤的成像提供有效手段。
[0009]本發(fā)明的雙功能修飾的鐵蛋白重鏈亞基納米粒子優(yōu)選在FTHl的N端修飾有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白。
[0010]較佳地，所述雙功能修飾的鐵蛋白重鏈亞基納米粒子在FTHl和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白之間還連接有短肽。所述的短肽優(yōu)選G4S短肽。
[0011]所述的雙功能修飾的鐵蛋白重鏈亞基納米粒子的氨基酸序列最優(yōu)選如SEQ IDN0.1所示。
[0012]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二是:一種雜合蛋白納米粒子，其由修飾有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的鐵蛋白重鏈亞基納米粒子和修飾有EGF的鐵蛋白重鏈亞基納米粒子組成。
[0013]本發(fā)明中，所述的EGF(Epidermal Growth Factor)為本領(lǐng)域常規(guī)所述的含義,其為表皮生長(zhǎng)因子，是哺乳動(dòng)物體內(nèi)的一種小肽，在體內(nèi)體外都對(duì)多種組織細(xì)胞有強(qiáng)烈的促分裂作用。
[0014]較佳地，所述的雜合蛋白納米粒子由N端修飾有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的鐵蛋白重鏈亞基納米粒子和N端修飾有EGF的鐵蛋白重鏈亞基納米粒子組成。
[0015]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之三是:如前所述的雜合蛋白納米粒子的制備方法，其包括如下步驟:
[0016](I)基因工程菌株的構(gòu)建:分別構(gòu)建表達(dá)修飾有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白和修飾有EGF的鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白的基因工程菌株，其中，所用的表達(dá)載體為PET-28 (+)，所用的宿主菌為大腸桿菌；
[0017](2)融合蛋白的表達(dá)和收獲:將步驟(1)所述的基因工程菌株接種于LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，然后破碎菌體，離心，分別收獲表達(dá)修飾有穿膜肽的鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白和修飾有EGF的鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白；
[0018](3)雜合蛋白納米粒子的自組裝:將步驟(2)收獲的表達(dá)修飾有穿膜肽的鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白和修飾有EGF的鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白在體外進(jìn)行變性，然后置于透析液中進(jìn)行梯度透析復(fù)性，收獲自組裝而得的雜合蛋白納米粒子。
[0019]步驟(1)中，所述的大腸桿菌優(yōu)選E.coliBL21菌株。
[0020]步驟(2)中，收獲表達(dá)修飾有穿膜肽的鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白和修飾有EGF的鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白的方式為本領(lǐng)域常規(guī)所述，較佳地為將包涵體蛋白進(jìn)行洗滌和純化；或者，將可溶性蛋白進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，以達(dá)到純化的目的。
[0021]步驟(3)中，所述的梯度透析復(fù)性較佳地包括如下步驟:將變性的融合蛋白按比例混合，使得蛋白總濃度為0.lmg/mL ;用橡皮筋捆住透析袋的一端，將變性蛋白裝入透析袋，用橡皮筋捆住透析袋的另一端；將透析袋置于復(fù)性液中，4°C條件下開(kāi)始復(fù)性，復(fù)性過(guò)程中逐漸減低脲素的濃度，使得變性蛋白慢慢正確折疊，隔6h換一次復(fù)性液，經(jīng)由St印I~Step6復(fù)性結(jié)束后，將透析袋里的蛋白溶液取出，離心，得上清液，用0.2μπι濾膜過(guò)濾除去未正確折疊的蛋白沉淀物。
[0022]其中，所述復(fù)性液的配方優(yōu)選如下:
[0023]Stepl:50mM Tris-OH, 50mM NaCl, 0.5mMEDTA,0.1 % PEG (聚乙二醇)，10%甘油，4M脲素，0.2mM GSH (還原型谷胱甘肽)，0.1mM GSSG (氧化型谷胱甘肽)，pH7.9 ；[0024]St印2:50mM Tris-OH, 50mM NaCl, 0.5mMEDTA,0.1 % PEG (聚乙二醇)，10%甘油，3M脲素，0.2mM GSH (還原型谷胱甘肽)，0.1mM GSSG (氧化型谷胱甘肽)，pH7.9 ；
[0025]St印3:50mMTris-OH,50mMNaCl,0.5mMEDTA,0.1% PEG(聚乙二醇)，10 % 甘油，2M脲素，0.2mM GSH (還原型谷胱甘肽)，0.1mM GSSG (氧化型谷胱甘肽)，pH7.9 ；
[0026]St印4:50mM Tris-OH, 50mM NaCl, 0.5mMEDTA,0.1 % PEG (聚乙二醇)，10%甘油，IM脲素，0.2mM GSH (還原型谷胱甘肽)，0.1mM GSSG (氧化型谷胱甘肽)，pH7.9 ；
[0027]St印5:50mM Tris-OH, 10%甘油，ρΗ7.9 ；
[0028]St印6:50mM Tris-OH, 10%甘油，ρΗ7.9。
[0029]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之四是:如前所述的雜合蛋白納米粒子在制備靶向腫瘤細(xì)胞的藥物中的用途。
[0030]在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。
[0031]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0032]本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于:
[0033]本發(fā)明通過(guò)基因工程手段分別對(duì)重鏈鐵蛋白進(jìn)行了靶向分子EGF及熒光分子EGFP的修飾，并且通過(guò)包涵體變復(fù)性的方法實(shí)現(xiàn)了兩種不同功能的融合蛋白亞基的自組裝，通過(guò)透射電子顯微鏡、Western Blotting、流式細(xì)胞儀等考察了納米粒子的組裝及活性情況。結(jié)果顯示通過(guò)以上的方法構(gòu)建的納米粒子同時(shí)具有EGF靶向于EGFR的活性和EGFP的熒光活性。本研究不僅成功的運(yùn)用基因工程的手段實(shí)現(xiàn)了鐵蛋白的功能化修飾，而且表明采用基因工程制備融合蛋白的方法可以拓寬這類納米粒子的功能化方法。本發(fā)明為同類型納米粒子的多功能化的制備提供了新的方法和思路，拓展了其在癌癥診療方面的應(yīng)用，為后續(xù)選擇藥物靶向腫瘤細(xì)胞治療提供了非常好的模型，具有很好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0034]圖1為EGF-FTH1/EGFP-G4S-FTH1雜合蛋白納米顆粒的透射電鏡圖。
[0035]圖2為EGF-FTH1/EGFP-G4S-FTH1的雜合蛋白納米顆粒對(duì)乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞EGFR的靶向結(jié)合能力及其熒光活性；其中，乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞孵育(a)0yM，(b)0.02 μ M, (c)0.lyMEGF-FTHl/EGFP-G4S-FTHl 納米粒子以及(d)同時(shí)孵育 10 μ M EGF和0.1 μ MEGF-FTH1/EGFP-G4S-FTH1納米粒子；正常乳腺細(xì)胞MCF-10A孵育(e) O μ M和(f) 0.02 μ MEGF-FTH1/EGFP-G4S-FTH1 納米粒子。
【具體實(shí)施方式】
[0036]下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書選擇。
[0037]下述實(shí)施例中，所使用的主要儀器和試劑如下:
[0038]載體ρΕΤ-28(+)和 pET-28 (+)/FTHl 為實(shí)驗(yàn)室保存。Ε.col1.DH5 α 和 Ε.col1.BL2感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于北京天根生化科技公司。
[0039]限制性內(nèi)切酶購(gòu)于Takara生物工程有限公司。[0040]DNA引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
[0041]測(cè)序由上海美季生物技術(shù)有限公司完成。
[0042]隔水式恒溫培養(yǎng)箱:GNP-9050型，購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。
[0043]超聲波細(xì)胞粉碎機(jī):JY92-1IN型，購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司。
[0044]壓力蒸汽滅菌器:SYQ-DSX_280B型，購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械廠。
[0045]其余儀器或試劑如未特別述及，均為常規(guī)市售可得。
[0046]實(shí)施例1EGFP-G4S-FTH1和EGF-FTHl融合蛋白的表達(dá)
[0047]1、采用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增hEGF: =FTHl的基因，并將片段分別插于pET28a(+)載體上，轉(zhuǎn)化入DH5 a t感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)之后，將序列正確的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入Ecol1.BL21 (DE3)表達(dá)菌株，以獲得目標(biāo)工程菌。EGF-FTHl目標(biāo)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0048]EGF-FTHl包涵體的制備和洗滌參見(jiàn)華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院2011屆李旭畢業(yè)論文《功能化重鏈亞基鐵蛋白納米粒子的制備及其乳腺癌細(xì)胞靶向的研究》。
[0049]2、采用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增EGFP-G4S-FTH1的基因，并將片段插于pET28a(+)載體上，轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)之后，將序列正確的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入Ecol1.BL21(DE3)表達(dá)菌株，以獲得目標(biāo)工程菌。EGFP-G4S-FTH1目標(biāo)蛋白的氨基酸序列如SEQ IDN0.1所示。
[0050]EGFP-G4S-FTH1包涵體的制備:以I: 100的比例，向100ml LB液體培養(yǎng)基中(卡那霉素終濃度50 μ g/ml)接種菌液，37°C搖培至OD值0.5-0.6時(shí)，將終濃度ImM的IPTG加入其中，于37°C誘導(dǎo)4h。50ml離心管收集菌沉，于_20°C凍存過(guò)夜。取IOml BufferA重懸菌體，進(jìn)行超聲破碎(條件:300w,工作3s,間歇7s,99次)，后5500rpm/min,離心20min,得粗包涵體。加入25mlBuffer B重懸包涵體，于搖床振蕩洗漆5min, 5500rpm/min,離心15min,得沉淀，重復(fù)進(jìn)行洗滌3次，得較純的包涵體。
[0051]實(shí)施例2雜合納米粒子EGF-FTH1/EGFP-G4S-FTH1的制備
[0052]1、包涵體的變性
[0053]加入25ml Buffer C到較純的包涵體中，超聲重懸至無(wú)肉眼可見(jiàn)顆粒，于28°C恒溫振蕩器變性過(guò)夜。用0.22 μ m濾器過(guò)濾后，進(jìn)行SDS-PAGE，檢測(cè)變性后目標(biāo)蛋白的純度，得兩種變性蛋白:EGFP-G4S-FTH1 和 EGF-FTHl。
[0054]2、復(fù)性:采用梯度透析法進(jìn)行包涵體的復(fù)性。首先處理透析袋:取透析袋，在Buffer D中煮沸IOmin,雙蒸水漂洗干凈后，置于Buffer E中煮沸IOmin,冷卻，于4°C備用。將變性后的EGFP-G4S-FTH1、EGF-FTHl以4: 6的摩爾比混合，體積為50ml，蛋白總質(zhì)量為5mg,混勻后裝入預(yù)處理過(guò)的透析袋中，封閉好透析袋后，于4°C冰箱內(nèi)進(jìn)行復(fù)性。約每6h更換一次透析液，以下為每次所需更換的透析液的配方；
[0055]Stepl:50mM Tris-OH, 50mM NaCl, 0.5mMEDTA,0.1 % PEG (聚乙二醇)，10%甘油，4M脲素，0.2mM GSH (還原型谷胱甘肽)，0.1mM GSSG (氧化型谷胱甘肽)，pH7.9 ；
[0056]St印2:50mM Tris-OH, 50mM NaCl, 0.5mMEDTA,0.1 % PEG (聚乙二醇)，10%甘油，3M脲素，0.2mM GSH (還原型谷胱甘肽)，0.1mM GSSG (氧化型谷胱甘肽)，pH7.9 ；
[0057]St印3:50mM Tris-OH, 50mM NaCl, 0.5mMEDTA,0.1 % PEG (聚乙二醇)，10%甘油，2M脲素，0.2mM GSH (還原型谷胱甘肽)，0.1mM GSSG (氧化型谷胱甘肽)，pH7.9 ；
[0058]St印4:50mM Tris-OH, 50mM NaCl, 0.5mMEDTA,0.1 % PEG (聚乙二醇)，10%甘油，IM脲素，0.2mM GSH (還原型谷胱甘肽)，0.1mM GSSG (氧化型谷胱甘肽)，pH7.9 ；[0059]St印5:50mM Tris-OH, 10%甘油，ρΗ7.9 ；
[0060]St印6:50mM Tris-OH, 10%甘油，ρΗ7.9。
[0061]復(fù)性結(jié)束后，將透析袋里的蛋白溶液取出，離心，得上清液。用0.2μπι濾膜過(guò)濾除去未正確折疊的蛋白沉淀物。用50KDa超濾管對(duì)蛋白液進(jìn)行濃縮到l_2mL左右，用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定其蛋白含量。進(jìn)行SDS-PAGE和NATIVE-PAGE考察復(fù)性蛋白是否能自組裝成正確的籠狀結(jié)構(gòu)。所得的EGF-FTH1/EGFP-G4S-FTH1雜合蛋白納米顆粒的透射電鏡圖如圖1所
/Jn ο
[0062]實(shí)施例3FTH1/EGFP-G4S-FTH1雜合蛋白納米粒子細(xì)胞靶向性的研究
[0063](I)將MDA-MB-468細(xì)胞胰蛋白酶消化后以2X IO5個(gè)細(xì)胞每孔的濃度鋪于已加入細(xì)胞爬片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞混勻后37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜使細(xì)胞貼壁。
[0064](2)細(xì)胞貼壁后IXPBS緩沖液洗滌3次，加入0μΜ，0.02μΜ，0.1μΜ濃度的EGF-FTH1/EGFP-G4S-FTH1納米粒子，同時(shí)一個(gè)細(xì)胞樣品還加入10 μ M EGF，孵育3小時(shí)。 [0065](3)孵育完成后用I XPBS緩沖液洗滌3次，洗去未內(nèi)化入細(xì)胞的納米粒子，再加入4%的多聚甲醛室溫固定細(xì)胞5min。
[0066](4)用IXPBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次除去殘留的多聚甲醛溶液，200ng/mL的DAPI，每孔200 μ L，DAPI溶液用I X PBS溶液配置。37°C培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)20分鐘。
[0067](5)取出爬片封片后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的狀態(tài)，其結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，本發(fā)明的雜合蛋白納米粒子能夠針對(duì)性地靶向腫瘤細(xì)胞并保持熒光活性，為實(shí)現(xiàn)生物大分子類的納米載體的功能化修飾提供了新的方法和參考，為后續(xù)選擇藥物靶向腫瘤細(xì)胞治療提供了非常好的模型，具有很好的應(yīng)用前景。
[0068]
【權(quán)利要求】
1.一種雙功能修飾的鐵蛋白重鏈亞基納米粒子，其特征在于，其在FTHl的N端或C端修飾有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的雙功能修飾的鐵蛋白重鏈亞基納米粒子，其特征在于，其在FTHl和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白之間還連接有短肽。
3.如權(quán)利要求2所述的雙功能修飾的鐵蛋白重鏈亞基納米粒子，其特征在于，所述的短肽為G4S短肽。
4.如權(quán)利要求1所述的雙功能修飾的鐵蛋白重鏈亞基納米粒子，其特征在于，所述的雙功能修飾的鐵蛋白重鏈亞基納米粒子的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
5.一種雜合蛋白納米粒子，其特征在于，其由修飾有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的鐵蛋白重鏈亞基納米粒子和修飾有EGF的鐵蛋白重鏈亞基納米粒子組成。
6.如權(quán)利要求5所述的雜合蛋白納米粒子的制備方法，其特征在于，其包括如下步驟: (1)基因工程菌株的構(gòu)建:分別構(gòu)建表達(dá)修飾有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白和修飾有EGF的鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白的基因工程菌株，其中，所用的表達(dá)載體為PET-28 (+)，所用的宿主菌為大腸桿菌； (2)融合蛋白的表達(dá)和收獲:將步驟(1)所述的基因工程菌株接種于LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，然后破碎菌體，離心，分別收獲表達(dá)修飾有穿膜肽的鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白和修飾有EGF的鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白； (3)雜合蛋白納米 子的自組裝:將步驟(2)收獲的表達(dá)修飾有穿膜肽的鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白和修飾有EGF的鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白在體外進(jìn)行變性，然后置于透析液中進(jìn)行梯度透析復(fù)性，收獲自組裝而得的雜合蛋白納米粒子。
7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的大腸桿菌為E.coliBL21 菌株，和 / 或， 步驟(2)中，收獲表達(dá)修飾有穿膜肽的鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白和修飾有EGF的鐵蛋白重鏈亞基融合蛋白的方式為本領(lǐng)域常規(guī)所述，較佳地為將包涵體蛋白進(jìn)行洗滌和純化；或者，將可溶性蛋白進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，以達(dá)到純化的目的。
8.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的梯度透析復(fù)性包括如下步驟:將變性的融合蛋白按比例混合，使得蛋白總濃度為0.lmg/mL ;用橡皮筋捆住透析袋的一端，將變性蛋白裝入透析袋，用橡皮筋捆住透析袋的另一端；將透析袋置于復(fù)性液中，4°C條件下開(kāi)始復(fù)性，復(fù)性過(guò)程中逐漸減低脲素的濃度，使得變性蛋白慢慢正確折疊，隔.6h換一次復(fù)性液，經(jīng)由Stepl~St印6復(fù)性結(jié)束后，將透析袋里的蛋白溶液取出，離心，得上清液，用0.2 μ m濾膜過(guò)濾除去未正確折疊的蛋白沉淀物。
9.如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述復(fù)性液的配方如下:Stepl:50mMTris-OH,50mM NaCl，0.5mMEDTA,0.1 % PEG, 10 % 甘油，4M 脲素，0.2mM GSH，0.1mM GSSG,pH7.9 ；
St印2:50mM Tris-OH,50mM NaCl，0.5mMEDTA,0.1 % PEG，10% 甘油，3M脲素，0.2mM GSH,.0.1mM GSSG, pH7.9 ；
St印3:50mM Tris-OH,50mM NaCl，0.5mMEDTA,0.1 % PEG，10%甘油，2M脲素，0.2mM GSH,.0.1mM GSSG, pH7.9 ；
St印4:50mM Tris-OH,50mM NaCl，0.5mMEDTA,0.1 % PEG，10%甘油，IM脲素，0.2mM GSH,.0.1mM GSSG，ρΗ7.9 ；
St印5:50mM Tris-OH, 10%甘油，ρΗ7.9 ；
St印6:50mM Tris-OH, 10%甘油，ρΗ7.9。
10.如權(quán)利要 求5所述的雜合蛋白納米粒子在制備靶向腫瘤細(xì)胞的藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】C07K1/113GK104017088SQ201410290635
【公開(kāi)日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月25日
【發(fā)明者】曹旭妮, 蔣曉丹, 王焦清, 邱李輝 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)