一種氨基功能化磁性納米粒子分離溶菌酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明設(shè)計(jì)一種氨基功能化磁性納米粒子分離溶菌酶的制備方法，特別設(shè)計(jì)一種利用磁性納米吸附材料從蛋清中分離溶菌酶的方法，屬于精細(xì)化工技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]溶菌酶又稱胞壁質(zhì)酶，其化學(xué)名為N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，由一條多肽鏈組成，分子內(nèi)有4個(gè)二硫鍵交聯(lián)，結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，并且耐酸堿，在pHl.2-11.2范圍內(nèi)劇烈變化仍能保持良好的穩(wěn)定性，對(duì)熱也極為穩(wěn)定，在PH3.0條件下，沸水浴中加熱60min仍保持90%以上。1907年，Nicolle最早發(fā)表了枯草桿菌溶菌因子的報(bào)告，兩年后，Laschtschenk指出，雞蛋也有較強(qiáng)溶菌活性，并把它命名為溶菌酶。緊接著Fleming和Meyer等證實(shí)植物中也含有溶菌酶，以后人們對(duì)溶菌酶的特性有了更深入的認(rèn)識(shí)。
[0003]不同來(lái)源的溶菌酶分子大小不一樣，其氨基酸排列順序也有所不同，因此，它們的理化性質(zhì)有很大差別。例如，T4噬菌體溶菌酶由164個(gè)氨基酸組成，分子量為19kDa ;雞蛋溶菌酶只有129個(gè)氨基酸，其分子量約為14.3kDa ;植物中分離出溶菌酶，其分子量較大，約為24kDa-29kDa。各種溶菌酶的等電點(diǎn)在10.7-11.5之間。其中，人們研究最深入的是雞蛋蛋清溶菌酶。
[0004]溶菌酶的用途很多，是一種安全性高的食品添加劑，可以作為防腐、保鮮劑，廣泛應(yīng)用于乳制品、低度酒、飲料、水產(chǎn)品、肉類制品和糕點(diǎn)等的防腐保鮮；在醫(yī)藥上，溶菌酶具有多種藥理作用，廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)，溶菌酶作為一種存在于人體正常體液及組織中的非特異性免疫因素，具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒的功效。
[0005]隨著生活水平的提高和科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，在藥物和食品中添加化學(xué)藥品開始被許多國(guó)家限制，因此具有天然活性的溶菌酶因其高效且安全而深受關(guān)注。溶菌酶研究雖然在我國(guó)起步較晚些，但國(guó)家近20年投入了巨大人力和財(cái)力對(duì)溶菌酶的分離提取及開發(fā)應(yīng)用進(jìn)行了大量的研發(fā)工作，尤其上世紀(jì)有關(guān)蛋清溶菌酶技術(shù)的研究多次被列為國(guó)家級(jí)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目。然而，與國(guó)外相比，我國(guó)的溶菌酶制造業(yè)規(guī)模仍然有較大差距，生產(chǎn)技術(shù)仍相對(duì)落后。因而目前國(guó)內(nèi)高活性蛋清溶菌酶的生產(chǎn)供應(yīng)還不能滿足我國(guó)日益增長(zhǎng)的需求。
[0006]功能性磁性納米顆粒是以合成的化學(xué)高分子物質(zhì)，天然高分子物質(zhì)或無(wú)機(jī)物材料作為殼體修飾材料，通過(guò)物理、化學(xué)方法吸附或包埋Fe304所形成的具有核/殼結(jié)構(gòu)且粒徑在納米級(jí)的功能性磁性納米顆粒，并且可以在外加磁場(chǎng)的作用下進(jìn)行快速的分離、定位及導(dǎo)向。功能性磁性納米顆粒表面特定的功能基團(tuán)(如0H、C00H、CH0、順2等)對(duì)Fe 304起到保護(hù)作用，防止其氧化，漏磁。此外，粒徑小于30nm的磁性顆粒具有超順磁性，稱為超順磁性納米顆粒；超順磁性納米顆粒具有較強(qiáng)的磁響應(yīng)性，在外加磁場(chǎng)的作用下，磁性顆?？梢钥焖俑患?、定位，當(dāng)外加磁場(chǎng)消失后，磁性的也隨之消失。因此，研究磁性納米材料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附分離已成為國(guó)內(nèi)外重要的研究課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明是為解決常規(guī)溶菌酶提取過(guò)程中，低溫分離低，高溫易變性等缺點(diǎn)，提出了采用表面修飾氨基的磁性Fe304納米粒子來(lái)吸附分離蛋清中的溶菌酶。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案由以下部分組成。
[0009]1)磁性Fe304納米粒子的制備:將硫酸亞鐵和氯化鐵溶解在水中，室溫下，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，想其中逐滴加入25%的氨水，攪拌反應(yīng)30min后升溫至70°C，繼續(xù)攪拌30min后冷卻，用磁體分離固體粒子，用去離子水反復(fù)沖洗，最終得到磁性Fe304納米粒子。反應(yīng)原理如式1所示。
[0010]Fe (II) +2Fe (III) +80H = Fe 304+4H201
[0011]2)氨基功能化磁性Fe304納米粒子的制備:將磁性Fe 304納米粒子放入無(wú)水的甲苯中，超聲作用15min，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，室溫下攪拌5h，用磁體收集磁性粒子，用乙醇和二氯甲烷反復(fù)沖洗后干燥，即可得到氨基功能化的磁性納米粒子。
[0012]3)雞蛋清溶菌酶吸附:取新鮮雞蛋的蛋清，向其中加入磷酸鹽緩沖溶液(pH =7.0)，在冰水浴條件下攪拌6h，分離上層白色絮狀沉淀，在4°C下冷凍離心，除去不溶性沉淀，所得上清液作為溶菌酶分離的蛋清原料液。
[0013]4)溶菌酶的分離:將吸附飽和的氨基功能化磁性納米粒子加入磷酸鹽緩沖液(20nmol, pH = 8.0, lmol/L NaCl)，放置于恒溫振蕩器中振蕩洗脫2h。經(jīng)磁性分離得到洗脫液，放入4 °C冰箱中。
[0014]上述3)中的雞蛋清液與磷酸鹽緩沖液的體積比例為lmL: lmL ;氨基功能化磁性納米粒子與蛋清溶液的比例為lg:(100-150)mL。
[0015]本發(fā)明采用的氨基功能化磁性納米粒子具有納米尺度結(jié)構(gòu)，比表面積很大，實(shí)現(xiàn)大容量的吸附；磁性顆粒能夠強(qiáng)化分離速度實(shí)現(xiàn)快速分離過(guò)程。因此，本發(fā)明制備的氨基功能化磁性納米粒子能夠從蛋清液中通過(guò)吸附-解吸作用選擇性的分離溶菌酶。該分離方法對(duì)蛋清溶菌酶的提取分離方法簡(jiǎn)單，條件溫和，對(duì)溶菌酶影響較小，吸附量大。該材料可以多次重復(fù)利用。
[0016]下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本
【發(fā)明內(nèi)容】
進(jìn)行描述。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1、2本發(fā)明制得的氨基功能化磁性納米粒子SEM照片；
[0018]圖3、4本發(fā)明制得的氨基功能化磁性納米粒子TEM照片；
[0019]圖5本發(fā)明制得的氨基功能化磁性納米粒子紅外光譜圖；
具體實(shí)施例
[0020]實(shí)施例1
[0021]將3g Fe Cl2.4H20和8.lg FeCl3.6H20溶解在200mL去離子水中，室溫下，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向其中逐滴加入85mL 25%氨水，攪拌30min后升溫至70°C繼續(xù)攪拌30min，冷卻到室溫后用磁體收集，用去離子水多次沖洗，干燥，得到磁性Fe304納米粒子。將4g磁性Fe304納米粒子放入50mL無(wú)水甲苯中，超聲作用15min，在氮