修飾的表面的制作方法
【專利摘要】本文提供了用于采用聚合物涂覆表面的方法和組合物。該方法和組合物適用于進(jìn)行生物反應(yīng)。具體地，該生物反應(yīng)可以包括酶反應(yīng)。
【專利說明】修飾的表面 交叉引用
[00011 本申請要求于2013年12月5日提交的美國臨時申請?zhí)?1/912,027以及于2014年4 月14日提交的美國臨時申請?zhí)?1/979,431的權(quán)益，這些申請通過引用并入本文。
【背景技術(shù)】
[0002] 在許多合成測序(SBS)系統(tǒng)中，克隆擴增和SBS在玻璃流動池通道中進(jìn)行。PCR引物 經(jīng)由被動結(jié)合的聚合物涂層附接至該通道的內(nèi)表面。在使用前，弱結(jié)合的聚合物鏈被洗掉， 但剩下的聚合物可能在大量的SBS循環(huán)期間不同程度地耗盡，從而導(dǎo)致信號逐漸喪失。這在 采用高pH和升高的溫度條件時是特別令人擔(dān)憂的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 提供了用于通過并入生物分子的表面引發(fā)聚合來制備聚合物涂層的方法和組合 物。在一些情況下，該組合物和方法對于進(jìn)行核酸反應(yīng)和合成測序是有用的。在一些情況 下，該組合物和方法對于提供穩(wěn)固(robust)的涂層是有用的。
[0004] 本公開內(nèi)容的一個方面提供了一種組合物，其包含:偶聯(lián)有10個或更多個核酸分 子的表面，其中在至少30個PCR循環(huán)后，至少90 %的核酸分子保持完整并偶聯(lián)至所述表面， 其中每個PCR循環(huán)包含以下反應(yīng)條件：（a)在至少85°C的溫度下持續(xù)至少15秒的變性步驟； (b)在至少50°C的溫度下持續(xù)至少15秒的退火步驟；以及(c)在至少70°C的溫度下持續(xù)至少 30秒的延伸步驟。
[0005] 在本文提供的方面的一些實施方案中，所述表面覆蓋有聚合物刷。在本文提供的 方面的一些實施方案中，該聚合物刷包含丙烯酰胺。在本文提供的方面的一些實施方案中， 該聚合物刷進(jìn)一步包含N-(2_羥乙基)丙烯酰胺。在本文提供的方面的一些實施方案中，至 少1，000個不同的核酸分子偶聯(lián)至該表面。在本文提供的方面的一些實施方案中，至少100， 〇〇〇個不同的核酸分子偶聯(lián)至該表面。在本文提供的方面的一些實施方案中，至少1，〇〇〇， 〇〇〇個不同的核酸分子偶聯(lián)至該表面。
[0006] 本公開內(nèi)容的一個方面提供了一種用于進(jìn)行酶反應(yīng)的方法，其包括：（a)提供具有 聚合物刷涂層以及偶聯(lián)至該聚合物刷的多個生物分子的基底；以及(b)采用所述基底上的 生物分子進(jìn)行一種或多種酶反應(yīng)。
[0007] 在本文提供的方面的一些實施方案中，所述生物分子選自：寡核苷酸、多核苷酸、 適體、蛋白質(zhì)和抗體。在本文提供的方面的一些實施方案中，所述酶反應(yīng)選自：聚合酶鏈反 應(yīng)、測序反應(yīng)、連接反應(yīng)、延伸反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在本文提供的方面的一些實施方案中，進(jìn)一 步包括向所述基底施加熱量。在本文提供的方面的一些實施方案中，在40個循環(huán)的合成測 序反應(yīng)后，至少90%的所述生物分子保留至少90%的完整性。在本文提供的方面的一些實 施方案中，在25個循環(huán)的聚合酶鏈反應(yīng)后，至少90%的所述生物分子保留至少90%的完整 性。在本文提供的方面的一些實施方案中，所述基底包含至少1，〇〇〇,〇〇〇個不同類型的生物 分子，并且其中每個生物分子均為寡核苷酸。在本文提供的方面的一些實施方案中，所述酶 反應(yīng)為延伸反應(yīng)。
[0008] 本公開內(nèi)容的一個方面提供了一種制備修飾的表面的方法，其包括：（a)提供表 面；（b)使引發(fā)劑物質(zhì)與所述表面共價鍵合；（c)從該引發(fā)劑物質(zhì)進(jìn)行聚合物的表面引發(fā)聚 合，由此產(chǎn)生包含多個聚合物鏈的聚合物涂層；以及(d)將兩個或更多個不同的生物分子偶 聯(lián)至該聚合物涂層。
[0009] 本公開內(nèi)容的一個方面提供了一種制備修飾的表面的方法，其包括：（a)提供表 面；（b)使引發(fā)劑物質(zhì)與所述表面共價鍵合；（c)從該引發(fā)劑物質(zhì)進(jìn)行兩個或更多個不同類 型的丙烯酰胺單體的混合物的表面引發(fā)聚合，由此產(chǎn)生包含多個聚合物鏈的聚合物涂層； 以及(d)將生物分子偶聯(lián)至該聚合物涂層。
[0010] 在本文提供的方面的一些實施方案中，所述生物分子選自：寡核苷酸、多核苷酸、 適體、蛋白質(zhì)和抗體。在本文提供的方面的一些實施方案中，所述兩個或更多個不同的生物 分子為兩個不同的寡核苷酸。在本文提供的方面的一些實施方案中，所述兩個或更多個不 同類型的丙烯酰胺單體選自：丙烯酰胺、N-(2-羥乙基)丙烯酰胺、乙二醇丙烯酰胺和甲基丙 烯酸羥乙酯(HEMA)。在本文提供的方面的一些實施方案中，所述表面選自玻璃、二氧化硅、 氧化鈦、氧化鋁、氧化銦錫（ΙΤ0)、硅、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、多環(huán)烯烴、聚甲基 丙烯酸甲酯(PMMA)、鈦和金。在本文提供的方面的一些實施方案中，所述表面包含玻璃。在 本文提供的方面的一些實施方案中，所述表面包含硅。在本文提供的方面的一些實施方案 中，所述表面選自：流動池、測序流動池、流動通道、微流體通道、毛細(xì)管、壓電表面、孔、微 孔、微孔陣列、微陣列、芯片、晶片、非磁性珠、磁珠、鐵磁珠、順磁珠、超順磁珠以及聚合物凝 膠。在本文提供的方面的一些實施方案中，所述引發(fā)劑物質(zhì)包含有機硅烷。在本文提供的方 面的一些實施方案中，所述引發(fā)劑物質(zhì)包含圖1所示的分子。在本文提供的方面的一些實施 方案中，所述表面引發(fā)聚合包括原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)。在本文提供的方面的一些實 施方案中，所述表面引發(fā)聚合包括可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)。在本文提供的方面的一些 實施方案中，所述生物分子包含5'acrydite修飾的寡核苷酸。在本文提供的方面的一些實 施方案中，該生物分子包含抗體。在本文提供的方面的一些實施方案中，該生物分子包含 肽。在本文提供的方面的一些實施方案中，該生物分子包含適體。在本文提供的方面的一些 實施方案中，該生物分子的偶聯(lián)包括聚合過程中acrydite修飾的生物分子的并入。在本文 提供的方面的一些實施方案中，該生物分子包括在溴乙?；稽c的反應(yīng)。在本文提供的方 面的一些實施方案中，該生物分子的偶聯(lián)包括在疊氮基位點的反應(yīng)。在本文提供的方面的 一些實施方案中，該生物分子的偶聯(lián)包括疊氮-炔Huisgen環(huán)加成。
[0011] 本公開內(nèi)容的一個方面提供了一種組合物，其包含：（a)表面；（b)通過表面引發(fā)聚 合形成的、與該表面共價結(jié)合的聚合物涂層，其中該聚合物涂層包含2個或更多個不同類型 的丙烯酰胺單體;以及(c)偶聯(lián)至該聚合物涂層的生物分子。
[0012] 本公開內(nèi)容的一個方面提供了一種組合物，其包含：（a)表面；（b)通過表面引發(fā)聚 合形成的、與該表面共價結(jié)合的聚合物涂層；以及(c)偶聯(lián)至該聚合物涂層的至少兩個不同 的生物分子。
[0013] 在本文提供的方面的一些實施方案中，所述生物分子包含寡核苷酸。在本文提供 的方面的一些實施方案中，該寡核苷酸在其5'端與聚合物偶聯(lián)。在本文提供的方面的一些 實施方案中，該寡核苷酸在其3'端與聚合物偶聯(lián)。在本文提供的方面的一些實施方案中，該 生物分子包含抗體。在本文提供的方面的一些實施方案中，該生物分子包含適體。在本文提 供的方面的一些實施方案中，所述至少兩個不同的生物分子包含寡核苷酸。在本文提供的 方面的一些實施方案中，所述寡核苷酸在其5'端與所述聚合物涂層偶聯(lián)。在本文提供的方 面的一些實施方案中，所述寡核苷酸在其3'端與所述聚合物涂層偶聯(lián)。在本文提供的方面 的一些實施方案中，所述至少兩個不同的生物分子包含抗體。在本文提供的方面的一些實 施方案中，所述至少兩個不同的生物分子包含適體。在本文提供的方面的一些實施方案中， 所述表面包含玻璃。在本文提供的方面的一些實施方案中，所述表面包含硅。在本文提供的 方面的一些實施方案中，該聚合物涂層包含聚丙烯酰胺。在本文提供的方面的一些實施方 案中，該聚合物涂層包含PMMA。在本文提供的方面的一些實施方案中，該聚合物涂層包含聚 苯乙烯。在本文提供的方面的一些實施方案中，該表面引發(fā)聚合包括原子轉(zhuǎn)移自由基聚合 (ATRP)。在本文提供的方面的一些實施方案中，該表面引發(fā)聚合包括可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移 (RAFT)。 援引并入
[0014] 本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請均通過引用并入本文，其程度如 同特別地且單獨地指出每個單獨的出版物、專利或?qū)＠暾埻ㄟ^引用而并入。 附圖簡述
[0015] 本發(fā)明的新穎特征在所附的權(quán)利要求書中具體闡述。通過參考以下對利用本發(fā)明 原理的說明性實施方案加以闡述的詳細(xì)描述以及附圖，將會獲得對本發(fā)明的特征和優(yōu)點的 更好的理解，在這些附圖中：
[0016] 圖1示出了引發(fā)劑硅烷的實例。
[0017] 圖2示出了磷酰膽堿-丙烯酰胺單體的實例。
[0018] 圖3示出了甜菜堿-丙烯酰胺單體的實例。
[0019] 圖4示出了用于生產(chǎn)具有寡核苷酸的聚丙烯酰胺表面涂層的過程的實例。
【具體實施方式】 [0020] 概述
[0021] 本公開內(nèi)容提供了關(guān)于表面上的改善的聚合物涂層的方法和組合物。該聚合物涂 層可以通過結(jié)合至表面的引發(fā)劑物質(zhì)經(jīng)由表面引發(fā)聚合(SIP)而產(chǎn)生。該聚合物涂層可以 并入修飾的單體，以調(diào)節(jié)該涂層的物理化學(xué)性質(zhì)。該聚合物涂層可以并入寡核苷酸。
[0022] 表面
[0023] 本公開內(nèi)容中提供的方法和組合物可以包括在表面上產(chǎn)生聚合物涂層。該表面可 以包括玻璃、二氧化娃、氧化鈦、氧化錯、氧化銦錫（IT0 )、娃、聚二甲基硅氧烷(PDMS )、聚苯 乙烯、聚烯烴(如聚（甲基戊烯）（PMP)和Zeonor?)、環(huán)烯烴共聚物如Topas?、聚甲基丙烯酸 甲酯(PMMA)、其他塑料、鈦、金、其他金屬或其他合適的材料。該表面可以是平坦的或圓的、 連續(xù)的或非連續(xù)的、光滑的或粗糙的。表面的實例包括流動池、測序流動池、流動通道、微流 體通道、毛細(xì)管、壓電表面、孔、微孔、微孔陣列、微陣列、芯片、晶片、非磁性珠、磁珠、鐵磁 珠、順磁珠、超順磁珠以及聚合物凝膠。
[0024] 引發(fā)劑物質(zhì)附接
[0025] 本公開內(nèi)容中提供的方法和組合物可以包含用于鍵合至支持表面的引發(fā)劑物質(zhì)。 在一些情況下，該引發(fā)劑物質(zhì)包含至少一種有機硅烷。該有機硅烷可以包含一個表面鍵合 基團，導(dǎo)致單足(mono-pedal)結(jié)構(gòu)。該有機硅烷可以包含兩個表面鍵合基團，導(dǎo)致雙足(pi-pedal) 結(jié)構(gòu) 。該有機硅烷可以包含三個表面鍵合基團 ，導(dǎo)致三足 (tri-pedal) 結(jié)構(gòu)。 該表面 鍵合基團可以包含Me03Si (例如，參見圖1，[0100]項）。該表面鍵合基團可以包含(MeO)3Si。 該表面鍵合基團可以包含(EtO) 3Si。該表面鍵合基團可以包含(AcO)3Si。該表面鍵合基團可 以包含(Me2N) 3Si。該表面鍵合基團可以包含(H0)3Si。對于有機硅烷包含多個表面鍵合基團 的情況，該表面鍵合基團可以是相同的或可以是不同的。該有機硅烷可以包含圖1中示出的 硅烷試劑。在一些情況下，該引發(fā)劑物質(zhì)包含至少一種有機膦酸，其中表面鍵合基團包含 (Η0) 2Ρ(=0)。該有機膦酸可以包含一個表面鍵合基團，導(dǎo)致單足結(jié)構(gòu)。該有機膦酸可以包 含兩個表面鍵合基團，導(dǎo)致雙足結(jié)構(gòu)。該有機膦酸可以包含三個表面鍵合基團，導(dǎo)致三足結(jié) 構(gòu)。
[0026]可以用硅烷溶液如硅烷在乙醇、水或其混合物中的溶液進(jìn)行基底（例如，玻璃基 底）的硅烷處理。在用硅烷溶液處理之前，可以清洗基底?？梢酝ㄟ^在硫酸-過氧化氫溶液中 浸沒來進(jìn)行清洗。為了將引發(fā)劑物質(zhì)附接至塑料基底，可以向表面施加二氧化硅薄膜?？梢?通過多種方法如真空沉積法沉積二氧化硅，該真空沉積法包括但不限于化學(xué)氣相沉積 (CVD)、濺射法以及電子束蒸發(fā)。隨后可以在沉積的二氧化硅層上進(jìn)行硅烷處理。
[0027] 表面引發(fā)聚合(SIP)
[0028] 本公開內(nèi)容中提供的方法和組合物可以包括從與表面結(jié)合的引發(fā)劑物質(zhì)形成聚 合物涂層。所得到的聚合物涂層可以包含線性鏈。所得到的聚合物涂層可以包含輕度支化 的鏈。該聚合物涂層可以形成聚合物刷薄膜。該聚合物涂層可以包含一定的交聯(lián)。該聚合物 涂層可以形成接枝結(jié)構(gòu)。該聚合物涂層可以形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。該聚合物涂層可以形成支化結(jié) 構(gòu)。該聚合物可以包含均一的聚合物。該聚合物可以包含嵌段共聚物。該聚合物可以包含梯 度共聚物。該聚合物可以包含周期共聚物。該聚合物可以包含統(tǒng)計共聚物。
[0029] 聚合物涂層可以包含具有特定長度或長度范圍的聚合物分子。聚合物分子可以具 有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、 60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、 350、400、450或500個骨架原子或分子(例如，碳）的長度。聚合物分子可以具有至多2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、 60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、 350、400、450或500個骨架原子或分子(例如，碳）的長度。聚合物分子可以具有至少2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、 60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、 350、400、450或500個單體單元(例如，丙烯酰胺分子）的長度。聚合物分子可以具有至多2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、 55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、 300、350、400、450或500個單體單元(例如，丙烯酰胺分子)的長度。
[0030] 該聚合物可以包含聚丙烯酰胺（PA)。該聚合物可以包含聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA)。該聚合物可以包含聚苯乙烯(PS)。該聚合物可以包含聚乙二醇(PEG)。該聚合物可 以包含聚丙烯腈(PAN)。該聚合物可以包含聚(苯乙烯-r-丙烯腈）（PSAN)。該聚合物可以包 含單一類型的聚合物。該聚合物可以包含多種類型的聚合物。該聚合物可以包含在"Ayres， N.(2010).Polymer brushes:Applications in biomaterials and nanotechnology.Polymer Chemistry，1 (6)，769-777" 中或在"Barbey，R.，Lavanant，L.， Paripovic,D.,Schiiwer,N.,Sugnaux,C.,Tugulu,S.,&Klok,H.A.(2009).Polymer brushes via surface-initiated controlled radical polymerization:synthesis, characterization,properties ,and applications.Chemical reviews,109(11),5437-5527"中描述的任何聚合物。
[0031]該聚合可以包括用于控制聚合物鏈長度、涂層均勻性或其他性質(zhì)的方法。該聚合 可以包括受控的自由基聚合(CRP)。該聚合可以包括原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)。該聚合可 以包括可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT)。該聚合可以包括活性聚合過程，包括在"Ayres，N. (2010) .Polymer brushes :Applications in biomaterials and nanotechnology.Polymer Chemistry，1 (6)，769-777" 中或在"Barbey，R.，Lavanant，L.， Paripovic,D.,Schiiwer,N.,Sugnaux,C.,Tugulu,S.,&Klok,H.A.(2009).Polymer brushes via surface-initiated controlled radical polymerization:synthesis, characterization,properties ,and applications.Chemical reviews,109(11),5437-5527"中描述的那些。
[0032]生物分子的并入
[0033] 可以將生物分子偶聯(lián)至本公開內(nèi)容中描述的聚合物涂層。該生物分子可以包括抗 體。該生物分子可以包括蛋白質(zhì)。該生物分子可以包括肽。該生物分子可以包括酶。該生物 分子可以包括適體。該生物分子可以包括寡核苷酸。
[0034] 可以將寡核苷酸偶聯(lián)至本公開內(nèi)容中描述的聚合物涂層。該寡核苷酸可以包括引 物。該寡核苷酸可以包括可裂解的連接。可裂解的連接可以是可酶促裂解的。該寡核苷酸可 以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、 50、55或60個堿基。該寡核苷酸在長度上可以不同，如3至5個堿基、1至50個堿基、6至12個堿 基、8至12個堿基、15至25個堿基、25至35個堿基、35至45個堿基，或45至55個堿基。偶聯(lián)至涂 層的單個寡核苷酸在長度上可以彼此不同。
[0035] 可以在聚合過程期間將生物分子(例如，寡核苷酸)并入至聚合物涂層中。例如，可 以在聚合過程期間添加5'-acrydite修飾的寡核苷酸，以允許寡核苷酸并入至正在聚合的 聚丙烯酰胺結(jié)構(gòu)中。在一些情況下，寡核苷酸在5'端偶聯(lián)至聚合物涂層。在一些情況下，寡 核苷酸在3 '端偶聯(lián)至聚合物涂層。在一些情況下，一些寡核苷酸在3 '端偶聯(lián)至聚合物涂層， 而一些寡核苷酸在5 '端偶聯(lián)至聚合物涂層。
[0036] 可以在聚合過程之后將生物分子(例如，寡核苷酸)并入至聚合物涂層中。例如，可 以在聚合過程期間向聚合物結(jié)構(gòu)中添加反應(yīng)位點。生物分子可以在聚合之后在該反應(yīng)位點 處并入。該反應(yīng)位點可以包括溴乙?；稽c。該反應(yīng)位點可以包括疊氮基。該反應(yīng)位點可以 包括與疊氮-炔Huisgen環(huán)加成相容的位點。
[0037] 生物分子(例如，寡核苷酸)可以以受控的方式并入至聚合物涂層中，其中特定的 生物分子位于聚合物涂層的特定區(qū)域。生物分子可以隨機并入至聚合物涂層中，其中特定 的生物分子隨機分布在整個聚合物涂層中。
[0038] 在一些情況下，本發(fā)明的組合物包含表面、與所述表面共價結(jié)合的聚丙烯酰胺涂 層以及偶聯(lián)至所述聚丙烯酰胺涂層的至少一個寡核苷酸。在其他情況下，該表面包括偶聯(lián) 至聚丙烯酰胺涂層的至少 1、10、100、1〇,〇〇〇、1〇〇,〇〇〇、1，〇〇〇,〇〇〇、10，〇〇〇,〇〇〇、100, 〇〇〇， 000或1，000，000，000個寡核苷酸。
[0039] 聚合物涂層的物理化學(xué)特征的修飾
[0040] 本公開內(nèi)容中描述的聚合物涂層的物理化學(xué)特征可以進(jìn)行調(diào)節(jié)。該調(diào)節(jié)可以通過 在聚合過程期間并入修飾的丙烯酰胺單體來實現(xiàn)。
[0041 ]在一些情況下，可以在聚合過程期間并入乙氧基化丙烯酰胺單體?？梢酝ㄟ^使乙 氧基化丙烯酰胺單體存在于聚合溶液中而將其并入。該乙氧基化丙烯酰胺單體可以包括 CH2 = CH-C0-NH(-CH2-CH2-0-)nH形式的單體。該乙氧基化丙烯酰胺單體可以包括羥乙基丙 烯酰胺單體。該乙氧基化丙烯酰胺單體可以包括乙二醇丙烯酰胺單體。該乙氧基化丙烯酰 胺單體可以包括甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)。該乙氧基化丙烯酰胺單體可以包括N-(2-羥乙 基)丙烯酰胺。乙氧基化丙烯酰胺單體的并入可以產(chǎn)生更加疏水的聚丙烯酰胺表面涂層。
[0042] 在一些情況下，可以在聚合過程期間并入磷酰膽堿丙烯酰胺單體。該磷酰膽堿丙 烯酰胺單體可以包括具有圖2所示結(jié)構(gòu)的單體。該磷酰膽堿丙烯酰胺單體可以包括其他磷 酰膽堿丙烯酰胺單體?？梢酝ㄟ^使磷酰膽堿丙烯酰胺單體存在于聚合溶液中而將其并入。
[0043] 在一些情況下，可以在聚合過程期間并入甜菜堿丙烯酰胺單體。該甜菜堿丙烯酰 胺單體可以包括具有圖3所示結(jié)構(gòu)的單體。可以通過使甜菜堿丙烯酰胺單體存在于聚合溶 液中而將其并入。
[0044] 所述聚合物涂層可以具有均勻的厚度。該聚合物涂層在其區(qū)域上可以具有不同的 厚度。該聚合物涂層可以為平均至少Uim厚。該聚合物涂層可以為至少2μπι厚。該聚合物涂層 可以為至少3μηι厚。該聚合物涂層可以為至少5μηι厚。該聚合物涂層可以為至少ΙΟμπι厚。該聚 合物涂層可以為至少15μπι厚。該聚合物涂層可以為至少20μπι厚。該聚合物涂層可以為至少 25μηι厚。該聚合物涂層可以為至少30μηι厚。該聚合物涂層可以為至少40μηι厚。該聚合物涂層 可以為至少50μηι厚。該聚合物涂層可以為至少75μηι厚。該聚合物涂層可以為至少100μπι厚。 該聚合物涂層可以為至少150μηι厚。該聚合物涂層可以為至少200μηι厚。該聚合物涂層可以 為至少300μηι厚。該聚合物涂層可以為至少400μηι厚。該聚合物涂層可以為至少500μηι厚。該 聚合物涂層可以為約1 Mi至約1 Ομπι厚。該聚合物涂層可以為約5μηι至約15μηι厚。該聚合物涂 層可以為約1〇Μ?至約20μηι厚。該聚合物涂層可以為約30μηι至約50μηι厚。該聚合物涂層可以 為約1 Ομπι至約50μηι厚。該聚合物涂層可以為約1 Ομπι至約1 ΟΟμπι厚。該聚合物涂層可以為約50 μπι至約100μπι厚。該聚合物涂層可以為約50μηι至約200μηι厚。該聚合物涂層可以為約100μπι至 約3 Ομπι厚。該聚合物涂層可以為約10 Ομπι至約5 0 Ομπι厚。
[0045] 反應(yīng)
[0046] 本公開內(nèi)容中描述的聚合物涂層可以用于進(jìn)行反應(yīng)。所進(jìn)行的反應(yīng)可以是酶促反 應(yīng)。用于所進(jìn)行的反應(yīng)的試劑可以包含核酸。該反應(yīng)可以包括消化反應(yīng)。該反應(yīng)可以包括延 伸反應(yīng)，如引物延伸或重疊延伸。該反應(yīng)可以包括擴增反應(yīng)，如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及其變 型（如多重PCR、巢式PCR、逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)、半定量PCR、定量PCR(qPCR)或?qū)崟rPCR、降 落PCR或組裝PCR)、基于核酸序列的擴增（NASBA)(參見例如，"Compton，J(1991). Nucleic acid sequence-based amplification.Nature 350(6313):91-2."）、鏈置換測定（SDA)(參 見例如，美國專利號5，712，124，"Strand displacement amplification"）以及環(huán)介導(dǎo)的等 溫擴增（LAMP)(參見例如，美國專利號 6,410,278，"Processforsynthesizingnucleic acid"）。該反應(yīng)可以包括轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，如體外轉(zhuǎn)錄。該反應(yīng)可以包括測序反應(yīng)，如基于BAC的測 序、焦磷酸測序、合成測序，或在"Mardis，E.R. (2008) .Next-generation DNA sequencing methods.Annu.Rev.Genomics Hum.Genet. ,9,387-402" 中描述的任何方法。
[0047] 本公開內(nèi)容中描述的聚合物涂層可以是穩(wěn)固的。聚合物涂層的穩(wěn)固性可以通過耐 久性、抗降解性或經(jīng)受某些條件后涂層的附著水平來體現(xiàn)。聚合物涂層的穩(wěn)固性可以通過 偶聯(lián)至該聚合物涂層的、在經(jīng)受某些條件后仍偶聯(lián)至該聚合物涂層的生物分子(例如，寡核 苷酸）的數(shù)目或百分比來體現(xiàn)。條件可以包括但不限于持續(xù)時間，溫度或系列溫度，化學(xué)品 (例如，酸、堿、還原劑、氧化劑)的存在，機械力(例如，應(yīng)力、應(yīng)變、振動、高壓、真空），條件的 組合，或條件或條件組合的反復(fù)循環(huán)(例如，包含溫度和化學(xué)品使用的反應(yīng)循環(huán)）。持續(xù)時間 可以包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50分鐘，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小時，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或 13 天，或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、50或60周。溫度 可以包括至少0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100°(：。 溫度可以包括至多0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或 100°C?；瘜W(xué)品可以包括強酸、弱酸、強堿、弱堿、強氧化劑、弱氧化劑、強還原劑、弱還原劑、 酶、單體、聚合物、緩沖液、溶劑或其他試劑。條件的循環(huán)可以包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、 100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、 4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000個循環(huán)。在一些實施方案中，使用本文的聚合物 涂層進(jìn)行至少 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或 1000個條件循環(huán)，并且其中在該循環(huán)后，至少50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%的聚合物鏈保持完全完整并與所 述表面鍵合。
[0048] 在一些實施方案中，本文的聚合物涂層用作進(jìn)行合成測序(SBS)的固體支持體。在 SBS中，靶多核苷酸序列可以如下確定:采用聚合酶反應(yīng)延伸合適的引物來產(chǎn)生其互補體， 并對產(chǎn)生該互補體的堿基的連續(xù)摻入進(jìn)行表征。通常將該靶序列固定在固體支持體上。然 后，通過順序添加使不同堿基A、T、G或C中的每一種與靶標(biāo)接觸，并通過附接至該堿基的合 適的標(biāo)記物來檢測任何摻入事件。與現(xiàn)有技術(shù)方法相比，本發(fā)明需要存在保留3'至5'核酸 外切酶功能的聚合酶，對該聚合酶進(jìn)行誘導(dǎo)以在檢測摻入之后去除摻入的標(biāo)記的堿基。然 后可以將相應(yīng)的未標(biāo)記的堿基摻入互補鏈中，以允許進(jìn)行進(jìn)一步的序列測定。重復(fù)該程序 使互補體的序列得到鑒定，并由此也鑒定了靶序列。在一些實施方案中，使用本文的聚合物 涂層進(jìn)行至少 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或 1000個合成測序（SBS)循環(huán)，例如，如美國專利號6,833,246的方法描述的，并且其中在583 后，至少 50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、 99.5 %或99.9 %的聚合物鏈保持完全完整并與所述表面鍵合。在SBS循環(huán)之前，該聚合物涂 層可以具有至少 1〇、20、50、100、200、500、1，000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000或 100，000、200，000、500，000、1，000，000、2，000，000、5，000,000、10，000,000、20，000,000、 100，000，000、200，000，000、500，000，000或十億個與其偶聯(lián)的核酸分子。在SBS循環(huán)之前， 該聚合物涂層可以具有在其上排列的面密度為至少約1〇、20、50、100、200、500、1，000、2， 000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、1，000,000、1x10 7、5x107、1x108、5x108、1x10 9、 5x109、1x101()、5x101()或lxlO 11個分子/平方微米的核酸分子。在一些情況下，在SBS循環(huán)之 前，該聚合物涂層具有在其上排列的面密度為約lxl〇 2至約lxl〇6個/平方微米的核酸分子。 在一些情況下，在SBS循環(huán)之前，該聚合物涂層具有在其上排列的面密度為約5xl0 2至約 5xl04個/平方微米的核酸分子。在一些情況下，在SBS循環(huán)之前，該聚合物涂層具有在其上 排列的面密度為約lxl〇 3至約lxl〇4個/平方微米的核酸分子。
[0049] 在一些實施方案中，使用本文的聚合物涂層對結(jié)合至該涂層的核酸聚合物鏈進(jìn)行 PCR。例如，PCR可以包括多個循環(huán)，其中每個循環(huán)包括變性步驟、退火步驟以及延伸或伸長 步驟。該變性步驟可以包括使核酸經(jīng)受至少約85 °C、86 °C、87 °C、88 °C、89 °C、90 °C、91°C、92 °C、93°C、94°C、95°C、96°C、97°C或98°C的溫度。該變性步驟可以包括至少約15秒、20秒、25 秒、30秒、35秒、40秒或45秒的持續(xù)時間。該退火步驟可以包括使核酸經(jīng)受至少約50 °C、51 。(：、52。(：、53。(：、54。(：、55。(：、56。(：、57。(：、58。(：、59。(：、60。(：、61。(：、62。(：、63。(：、64。(：或65。(：的溫 度。該退火步驟可以包括至少約15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒或45秒的持續(xù)時間。該延 伸或伸長步驟可以包括至少約70 °C、71°C、72 °C、73 °C、74°C、75°C、76°C、77 °C、78°C、79°C或 80 °C的溫度。該延伸或伸長步驟可以包括至少約30秒、40秒、50秒、60秒、70秒、80秒、90秒、 100秒、110秒或120秒的持續(xù)時間?？梢允褂帽疚牡木酆衔锿繉舆M(jìn)行至少10、20、30、40、50、 60、70、80、90或100個聚合酶鏈反應(yīng)(？0〇循環(huán)，并且其中在最終的？0?循環(huán)后，至少50%、 60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或 99.9 %的聚合物鏈保持完全完整并與所述表面鍵合。在PCR循環(huán)之前，該聚合物涂層可以具 有至少 10、20、50、100、200、500、1，000、2,000、5,000、10,000、20,000、50，000或 100,000、 200，000、500，000、1，000，000、2，000，000、5，000，000、10，000,000、20，000,000、100,000， 000、200，000，000、500，000，000或十億個與其偶聯(lián)的核酸分子。在PCR循環(huán)之前，該聚合物 涂層可以具有在其上排列的密度為至少10、20、50、100、200、500、1，000、2,000、5,000、10， 000、20,000、50,000、100,000、1，000,000、1x107、5x107、1x10 8、5x108、1x109、5x109、1x10 10、 5xl01()或lxlO11個分子/平方微米的核酸分子。在一些情況下，在PCR循環(huán)之前，該聚合物涂 層具有在其上排列的面密度為約lxl〇 2至約lxl〇6個/平方微米的核酸分子。在一些情況下， 在PCR循環(huán)之前，該聚合物涂層具有在其上排列的面密度為約5xl0 2至約5xl04個/平方微米 的核酸分子。在一些情況下，在PCR循環(huán)之前，該聚合物涂層具有在其上排列的面密度為約 lxlO3至約lxlO4個/平方微米的核酸分子。
[0050] 優(yōu)勢
[0051] 具有多個鍵合基團的引發(fā)劑物質(zhì)如硅烷的使用可以提供較高的熱和水解穩(wěn)定性 (參見，例如，美國專利號6,262,216)。這樣的穩(wěn)定性可以提高涂層在反應(yīng)或其他處理的反 復(fù)循環(huán)中的耐久性。
[0052]如本文所述的表面涂層的使用可以提供比未涂覆的表面所提供的環(huán)境更加酶相 容或更有利的環(huán)境。具有如本文所述的經(jīng)調(diào)節(jié)的物理化學(xué)特征的表面涂層可以提供用于在 該表面之上或附近或在結(jié)合至該表面的分子上進(jìn)行酶反應(yīng)的優(yōu)勢。該優(yōu)勢可以包括與表面 的非特異性結(jié)合的減少。該優(yōu)勢可以包括酶如聚合酶的最優(yōu)環(huán)境。例如，中性親水聚合物和 連接基團可以為酶提供有利的環(huán)境。 實施例 實施例1-平坦表面陣列的產(chǎn)生
[0053]使具有圖1所示結(jié)構(gòu)的引發(fā)劑硅烷在EtOH的存在下結(jié)合至平坦的二氧化硅基底， 從而形成雙足表面聚合物引發(fā)位點。在CuBr、PMDETA和H20的存在下，使丙烯酰胺和乙氧基 化丙稀酰胺的混合物與acrydite修飾的寡核苷酸一起在基底上經(jīng)歷原子轉(zhuǎn)移自由基聚合 (ATRP)。這形成了結(jié)合至表面引發(fā)劑位點的、共價鍵合的、輕微交聯(lián)的聚丙烯酰胺表面涂 層，其厚度在約50nm至約200nm之間，并且其結(jié)構(gòu)中并入了寡核苷酸(參見圖4)〇 實施例2-平坦表面陣列在測序中的應(yīng)用
[0054]如實施例1中所述制備聚丙烯酰胺涂覆的基底。使待測序的DNA與并入至該聚合物 結(jié)構(gòu)中的寡核苷酸結(jié)合。向該基底添加合成測序試劑，并使合成測序進(jìn)行40個循環(huán)。至少 90%的聚合物鏈保持完整并與表面鍵合。 實施例3-平坦表面陣列在DNA擴增中的應(yīng)用
[0055] 如實施例1所述制備聚丙烯酰胺涂覆的基底。使待擴增的DNA與并入至該聚合物結(jié) 構(gòu)中的寡核苷酸結(jié)合。向該基底添加聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑，并使PCR進(jìn)行30個循環(huán)。至少 90%的聚合物鏈保持完整并與表面鍵合。 實施例4-疊氮基-PEG4-N，N-雙(3-(三甲氧基硅烷基)丙基)氨基甲酸酯的合成
[0056] 疊氮基-PEG4-醇（BroadPharm，220mg; 1 .Ommol)通過與2ml CH3CN共蒸發(fā)兩次進(jìn)行 干燥，然后在犯下與在lml CH2C12中的雙光氣（200mg; 1. Ommol)合并。在環(huán)境溫度下靜置過 夜后，將溶劑蒸發(fā)以獲得280mg呈淺黃色的油的產(chǎn)物，其無需進(jìn)一步純化而使用。1H-匪R (CDCl3):S(ppm)4.46(2H，t J = 2.8Hz;q^0C(0)Cl);3.79(2H，t J = 4.5Hz;q^CH2N3);3.68-3.70(10H,m,CH2〇CH2)；3.41(2H,t J = 5.2Hz ,CH2N3) 〇
[0057] 將雙（三甲氧基硅烷基丙基）胺（342mg/320uL;1.0mmol)與 DIEA(136mg/182uL; 1.05mmol)在N2下的lml干醚中合并，并在冰上冷卻至〇-4°C。將疊氮基-PEG4氯甲酸酯 (280mg; 1. Ommol)溶解在lml干醚中并通過注射器逐滴添加，隨后在環(huán)境溫度下繼續(xù)攪拌過 夜。添加另外2ml的干醚，并將溶液快速過濾并蒸發(fā)以產(chǎn)生呈淡黃色的油的硅烷（~550mg) o^-NMI^CDsOD) :S(ppm)4.20-4.24(2H，br m，C§?0C(0)N〈）；3.67-3.74(13H，m，q^0CH2); 3.39(2H，t J~5.0Hz，OT2N3) ;3.35(21H，s，q^0Si) ;3.22-3.28(4H，br m，-OT2NC(0)0_); 1.60-1.70(4H，br m，C-C蟲-C);0.55-0.65(4H，br m，C-C步-Si)。
實施例5-N-(3-(溴乙酰氨基)丙基）甲基丙烯酰胺的合成 [0058]將1'1-(3-氨基丙基）甲基丙稀酰胺鹽酸鹽(？〇1}^(^611〇6 8;36〇11^;2.〇1111]1〇1)與1'1-(溴 乙酰氧基）琥泊酰亞胺(Broad Pharm; 570mg; 2 · 4mmo 1)在N2下在1 OmL無水CH2CI2中合并，并 用冰MeOH冷卻至-10°C。然后在攪拌的同時逐滴添加二異丙基乙胺（Aldrich，800uL; 4.2mmol)。將該溶液另外冷攪拌30min，然后在室溫下攪拌3h。將該溶液用40ml乙酸乙酯稀 釋，并用各為12ml的1M HC1、0.1M NaOH及隨后的鹽水依次洗滌。將有機相用MgS〇4干燥并蒸 發(fā)，以得到220mg(~40% )呈灰白色固體的溴乙?；c氯乙?；a(chǎn)物的3:1混合物。1H-NMR (丙酮-d6):S(ppm)7.70(lH，br s，NHa);7.40(lH，br s，NHb);5.7卜5.73(lH，br m，CH=C); 5.30-5.32(lH,m,CH，=C)；4.08(0.5H,s,CH2C1)；3.89(1.5H,s,CH 2Br) ；3.24-3.32(4H,m, CH2N) ； 1.91-1.93(3H,br m,CH3) ； 1.68(2H,br qnt ,J = 6.4Hz ；H2' CC^CH^ ) · LC-MS(ESI): 5.7min:242,243,244(10:1:3;M · Na+/氯）；219,220,221(10:1:3;M · H+/氯）；134,135,136 (10:0.6:3;M-CH2 = C(Me)C0NH-/氯）；126,127(10: l;M-Cl/BrCH2CCONH-).5.9min:286,287， 288,289(10:1:10:1;]?.恥7溴） ；263,265,266(10:10:1;]\1.!17溴）；178，179，180，181(10: 0 · 6:10:0 · 6 ;M-CH2 = C(Me)C0NH7溴）；126，127( 10:1 ;M-Cl/BrCH2CCONH-)。
實施例6-N-(4-疊氮基丁基）甲基丙烯酰胺的合成 [0059]在裝備有攪拌棒和滴液漏斗并用干燥仏沖洗的50mL燒瓶中，將4-疊氮基-1-丁胺 (Synthonix； 1. lg；8.75mmol)與DIEA( 1 ·22g;9·5mmol)在15mL無水乙酸乙酯中合并。將溶液 在冰水浴中冷卻至2°C，并逐滴添加甲基丙烯酰氯(0.96g;9.2mmol)在5ml干醚中的溶液并 攪拌超過30min。去除冰浴，添加另外15ml的干乙酸乙酯，并在環(huán)境溫度下繼續(xù)攪拌過夜。通 過過濾將固體去除并將合并的濾液用10 m 1水洗滌兩次、用鹽水洗滌一次，然后干燥 (1^〇4)，真空蒸發(fā)以獲得1.5(^(93%)呈橙色液體的產(chǎn)物。1!1-匪1?(0)(：1 3)^(卯111)5.92-5.83(lH,br s ,ΝΗ) ； 5.68 (1H, t J = 0.8Hz ； =CHa) ； 5.68( lH,m, =CHb) ； 3.45(4H, br m, NCH2) ； 1.97( 3H,t J=1.4Hz,CH3) ； 1.69-1.60(4H,br m, C-CH2-C). MS(ESI): 126.2(M-CH2N3);183.2(M · H+);205.2(M · Na+)。由于在4°C儲存2-3周后通過NMR注意到伴N2析出的 分解，因此該產(chǎn)物在10天內(nèi)使用。
實施例7-流動池表面的硅烷化
[0060] 對于大多數(shù)實驗，所使用的流動池均為由Corning? 7740硼硅酸鹽、低膨脹、I型 玻璃（p/n 63825-05，EM Sciences, Hatfield, PA)制造的平坦的"毛細(xì)管微載玻片 (capillary micro glass slide)"。將較短長度的0.5mm ID熱縮PTFE管密封至該毛細(xì)管的 兩端，以提供與歧管、注射器等的防漏連接。對于一些實驗，采用"翻新的（refurbished)" Illumina MiSeq?流動池。通過用200mM過硫酸鈉在65°C下18hr，隨后1M K0H/65°C/6hr，用 去離子水沖洗并用氮氣流干燥，來將它們原有的表面涂層剝離。
[0061 ] 在硅烷化之前，通過在25°C下浸沒在硫酸-過氧化氫溶液(Nanostrip，Cyantek Corp.，F(xiàn)remont CA)中16-18hr，然后用去離子水徹底漂洗并用氮氣流干燥，來清潔所有的 毛細(xì)管流動池表面。將清潔的流動池儲存在氮氣下并在48小時內(nèi)硅烷化。通過用新制備的、 適當(dāng)硅烷在95:5乙醇-水中的2% (wt/vol)溶液填充流動池并在室溫下溫育4-18小時來進(jìn) 行硅烷化。然后將流動池用乙醇和去離子水徹底漂洗;用氮氣干燥，并在環(huán)境溫度下儲存。 實施例8-經(jīng)由表面引發(fā)丙烯酰胺ATRP的寡核苷酸引物固定 [0062] 用2-溴-2-甲基-N，N-雙-(3-三甲氧基硅烷基丙基）丙酰胺（參見例如，US 2011/ 0143967)將用于SI-ATRP的流動池如實施例7所述進(jìn)行硅烷化。
[0063] 引物脫水(Dry-down):將等量的5'_acrydite修飾的正向引物(FWD) (4uL，ImM)與 反向引物（REV)(4uL，lmM)在0.9mL錐形尖端的HPLC小瓶中合并。將溶液在環(huán)境溫度下在 Speed-Vac蒸發(fā)儀上縮減至干(10-15分鐘）。將含有干燥引物的小瓶用隔膜密封的螺帽緊緊 封閉，并通過18號注射器針頭連接至真空/N2歧管。通過注射器針頭進(jìn)行5個循環(huán)的交替真 空/氮氣再填充將該小瓶去氧。
[0064]流動池去氧:通過用干燥氮氣吹掃，將待用于SI-ATRP的流動池去氧。
[0065]溶劑去氧：在另一個小瓶中，通過用氮氣連續(xù)鼓泡30分鐘將由在水中的28%甲醇 (V:V)組成的溶劑混合物去氧。
[0066] 催化劑/丙稀酰胺溶液的制備：稱取CuBr (6 · 8mg，47 · 4umol)和CuBr2(3 · 9mg， 17.5umol)，并將其放置在含有磁性攪拌棒的20mL加隔膜蓋的小瓶中。將該小瓶連接至真 空/氮氣歧管并通過三個循環(huán)的排空-氮氣回填小心地去氧。然后將去氧的溶液的一部分 (14.5mL)通過氣密注射器轉(zhuǎn)移至含有銅鹽的小瓶中。最后，添加丙烯酰胺（42.5mg， 600umol)和PMDETA( 14uL，67 · 2umol)，并將溶液劇烈攪拌同時用氮氣鼓泡另外15分鐘。偶爾 需要將溶液短暫地聲處理以使CuBr固體分散，從而獲得淺藍(lán)色的均相溶液。
[0067] 將聚合溶液轉(zhuǎn)移至流動池:使脫水引物在脫氧的催化劑/丙烯酰胺溶液(20uL)中 重建，該引物通過氣密注射器轉(zhuǎn)移。將所得溶液轉(zhuǎn)移至來自步驟3的預(yù)先吹掃的流動池，將 其完全填滿。該流動池的末端用石蠟?zāi)?parafilm)密封，并在無氧環(huán)境下將該流動池維持 在環(huán)境溫度下24-48小時。
[0068] 洗滌和儲存：流動池用28%甲醇-水和lXTE緩沖液（~lmL/ea)沖洗并在4°C下儲 存。 實施例9-通過丙烯酰胺/溴乙?；?丙烯酰胺的溶液引發(fā)FRP接枝進(jìn)行的寡核苷酸引物 固定
[0069] 將流動池表面用3_(丙烯酰氨基）丙基三甲氧基硅烷（Gelest，Inc)進(jìn)行硅烷化 (silanated)〇
[0070]吹掃流動池:通過用干燥氮氣吹掃將待用于FRP的流動池去氧。
[0071]溶液制備和聚合:將在小瓶中的丙烯酰胺(0.0713g，lmmol)和N-(3-溴乙酰氨基丙 基）甲基丙烯酰胺(6.41^，0.024111111〇1)在組11丨(1水(58)中的溶液用橡膠隔膜密封的蓋子蓋 住。通過用氮氣鼓泡30分鐘將該溶液去氧。通過添加過硫酸鉀（2.5mg，在50uL脫氣的水中 0.0093mmol)的溶液與純四亞甲基二胺(4.45mg，0.038mmol)引發(fā)聚合。將所得溶液立即轉(zhuǎn) 移至流動池中，將其完全填滿。該流動池的末端用石蠟?zāi)?parafilm)密封，并在無氧環(huán)境下 將該流動池維持在環(huán)境溫度下60-80分鐘。通過用4-6ml的水清洗該流動池來終止聚合，隨 后用lmL的6XSSPE去除未結(jié)合的聚合物。該流動池儲存在4°C的6XSSPE中。
[0072]引物綴合：將5 ' -硫代磷酸酯修飾的正向引物（2.5uL，ImM)與反向引物（2.5uL， ImM)的合并溶液放置在0.9mL錐形尖端的HPLC小瓶中。將該溶液在環(huán)境溫度下在Speed-Vac 蒸發(fā)儀上縮減至干（10-15分鐘），隨后在6x SSPE(20uL)中再溶解。將儲存溶液從流動池去 除并通過氣密注射器置換為引物溶液。該流動池的末端用石蠟?zāi)?parafilm)緊緊密封，并 將該流動池維持在55 °C下2小時。使該流動池冷卻至環(huán)境溫度，然后用Mi 11 iq水、6xSSPE和 ΙχΤΕ(每次漂洗lmL)漂洗。將含有1XTE的流動池用石蠟?zāi)?parafilm)密封并在4°C下儲存。 實施例10-引物通過使用點擊化學(xué)在硅烷化的流動池表面上的直接固定
[0073] 通過在25°C下浸沒在硫酸-過氧化氫溶液(Nanostrip，Cyantek Corp ·，F(xiàn)remont CA)中16-18hr，然后用去離子水徹底沖洗并用氮氣流干燥，來清潔流動池表面。將流動池在 氮氣下儲存，并在48小時內(nèi)用新制備的疊氮基-PEG4-N，N-雙(3-(三甲氧基硅烷基)丙基)氨 基甲酸酯在95:5乙醇-水中的2% (wt/vo 1)溶液硅烷化18小時。然后將該流動池用乙醇和去 離子水徹底漂洗，并用氮氣干燥。添加在0.1M Tris緩沖液(pH 7.0)中含有各100uM的5'-炔 基修飾的寡核苷酸正向引物和反向引物、5mM Cul以及10mM三-(3-羥丙基三唑基甲基）胺 (THPTA)的溶液并維持在22°C下18小時，之后去除寡核苷酸溶液并將該流動池用去離子水 漂洗，干燥并在4 °C下儲存。 實施例11-通過雜交的固定化分析
[0074] 用與正向引物（"FWD"）互補的5'-CY3標(biāo)記的寡核苷酸雜交靶標(biāo)來確認(rèn)成功的引物 附接:將流動池用在pH 7.4的6X SSPE緩沖液中的250nM靶寡核苷酸填充，在55°C下溫育lh， 冷卻至25°C，隨后用4-5倍體積的6X SSPE洗滌。用基于CCD的成像熒光顯微鏡(LED bb激發(fā)； 彡640nm發(fā)射濾光器)測量表面熒光。然后去除雜交靶標(biāo)溶液，并將該流動池在55°C下用20 倍體積的甲酰胺洗凈，并在4°C下儲存在無核酸酶的水中。 實施例12-固相DNA擴增和簇生成
[0075] 將準(zhǔn)備好的流動池(例如，在先前實施例中準(zhǔn)備的那些)放置在可編程的熱流體站 (為特定目的構(gòu)建的CentiPD)上。主動冷卻的（actively cooled)Peltier熱電模塊 (Laird)、NTC熱敏電阻溫度傳感器和可編程的PID控制器(Laird)提供熱控制?？蛇_(dá)到的溫 度范圍為20-100°C。在流體側(cè)上，250ul注射器栗(Cavro)通過毛細(xì)管流動池以特定的速度 抽出已編程的體積的試劑。通過具有通向每個試劑管的吸管（sipper)的24通換向閥(VICI) 選擇合適的試劑。使準(zhǔn)備好的試劑Eppendorf管靜置在置于冰浴中的鋁冷卻塊中（以在方案 時間段期間將其維持在4°C)。
[0076] 如下制備10mM dNTP的溶液:將300yL的每種dNTP儲備溶液(儲備溶液濃度：lOOmM) 合并以制備25mM儲備液，然后將1000yL的25mM儲備液添加至1500yL的10mM Tris pH 8.0 中。
[0077] 以1X(約10mL等份)和5X量制備了 HB1溶液，示于表1中： 表1:HB1溶液
[0078]以5X和IX量(約10mL等份)制備了洗滌緩沖液(W2)，如表2中所示： 表2:W2溶液
[0079] 通過將15yL的500μΜ引物儲備溶液添加至1485yL的HB1溶液中，制備了濃度為5μΜ 的標(biāo)記的引物(FP)溶液，如表3中所示： 表3:FP溶液
[0080] 制備了擴增預(yù)混物(APM)溶液，如表4中所示： 表4:APM緩沖溶液
[0081 ]制備了擴增混合物(AM)，如表5中所示： 表5: AM緩沖溶液
[0082]制備了線性化混合物(LM)溶液，如表6中所示： 表6:LM溶液
[0083] 制備了文庫稀釋緩沖液，其包含具有0.1%Tween-20的pH 8.5的lOmM Tris-Cl。
[0084] 如下制備稀釋文庫：1)將儲備2N NaOH溶液稀釋成如表7中所示的0.1N NaOH溶液。 2)通過將2yL的PhiX添加至8yL的文庫稀釋緩沖液中，將儲備10nM PhiX溶液稀釋成2恤。3) 通過將1 OyL的0.1 N NaOH添加至1 OyL的2nM樣品溶液中并在室溫下溫育5分鐘，使樣品變性。 4)通過將980yL預(yù)冷的HB1溶液添加至20yL樣品中，將變性的樣品稀釋至20PM3)通過將650 yL預(yù)冷的HB1溶液添加至350yL的20pM樣品溶液中，將稀釋的樣品進(jìn)一步稀釋至7pM。6)將稀 釋的樣品保存在冰上直到后續(xù)使用。 表7:0.1 N NaOH溶液
[0085]向試劑板上裝載在2mL Eppendorf管中的溶液，其中試劑管與合適的CentPD吸管 匹配，具體如下：試劑l:950ul HB1;試劑2:950ul APM;試劑3:1300ul AM1;試劑4:1100ul FM(甲酰胺 100%);試劑5:1300ul AM2;試劑6:1100ul W2;試劑7:350ul LM;試劑8:400ul ΝΑ0Η(0·1Ν NaOH);試劑9:400ul FP。
[0086]將如在先前實施例中描述的準(zhǔn)備好的流動池放置在熱流體站上，并如表9所述在 CentH)上啟動并運行成簇方案： 表9: CentH)成簇方案


[0087] 1)將所有的試劑準(zhǔn)備好(？41^(1)(6(^1^4以17825°(：)，其中最后的是耶1和12緩沖 夜（Illumina命名法）。2)在90°C下以lyL/s的速率引入150yL的模板。該模板為PhiX DNA文 庫(在HB1中7pM，變性的，插入物大小45(^?)。3)在溫育30秒后，將溫度以0.05度/s的速率經(jīng) 18分鐘緩慢降低至40°(：。4)同樣在40°C下，以0.5yL/ sec用200yL的W2洗掉過量的模板。5)通 過以lyL/s注入150yL的擴增混合物(AM1)來實現(xiàn)接枝的引物的第一次延伸，以3yL氣泡結(jié)束 (book ended)以防止可能在傳送至流動池的線路中發(fā)生的試劑的混合。90秒的溫育步驟允 許充足的時間通過Bst酶進(jìn)行完全的模板復(fù)制。6)將流動池冷卻至25°C，并采用以0.5yL/s 速率栗送的150yL 0.1N NaOH，以及隨后用150yL緩沖液(W2)來將模板剝離。7)將流動池加 熱至60°C以準(zhǔn)備用于等溫擴增。8)通過重復(fù)這三個步驟來進(jìn)行32個循環(huán)的等溫擴增：（a)以 3.5yL/s在28yL 100%甲酰胺(FM)中變性；（b)以lyL/s用28yL不含酶的預(yù)擴增緩沖液(APM) 去除甲酰胺并允許再雜交；以及(c)以4yL/s用72yL擴增混合物(AM)進(jìn)行引物延伸。9)用120 yL的W2以及95yL的HB1洗掉擴增試劑。10)在25°C的溫度下以lyL/s引入150yL線性化試劑 (LM)(以切割一半的擴增鏈）。11)將流動池加熱至38°C，并溫育5min(USER處理，通過尿嘧啶 DNA糖基化酶切割仙）。12)將新鮮的20yL的LM溶液移動至流動池中并溫育5min，重復(fù)五次。 13)在線性化后，將溫度降低至25°C，并用150yL W2和95yL HB1洗滌。14)用200yL的0.1N NaOH使流動池再次變性，并用200yL的W2洗滌。15)以lyL/s引入200yL與剩余鏈互補的Cy3 5'標(biāo)記的測序引物(FP)。16)將溫度升至60°C，并將溶液溫育5min以允許雜交。17)在將溫度 降至40°C后，用150yL W2洗掉過量的引物。18)在將溫度進(jìn)一步降至25°C后，用150yL的W2進(jìn) 一步洗滌流動池。
[0088]在具有Alta U-4000CXD相機(Apogee)的定制落射熒光顯微鏡上拍攝成簇群落的 圖像。由于雜交的引物在5'端用Cy3熒光團標(biāo)記，因此我們使用Cy3-4040C濾光器模塊 (Semrock)以及532nm LED作為激發(fā)光源。用ELWD Nikon 0.6NA物鏡將圖像放大40倍，使得 視野的大小為375x375um〇
[0089]盡管本文中已經(jīng)示出并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯 而易見的是，這些實施方案僅以示例的方式提供。本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的情況 下現(xiàn)將想到多種變化、改變和替代。應(yīng)當(dāng)理解，本文中所述的本發(fā)明實施方案的各種替代方 案可用于實施本發(fā)明。目的在于以下述權(quán)利要求限定本發(fā)明的范圍，并由此涵蓋這些權(quán)利 要求范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)及其等同物。
【主權(quán)項】
1. 一種組合物，其包含： 偶聯(lián)有10個或更多個核酸分子的表面，其中在至少30個PCR循環(huán)后，至少90%的所述核 酸分子保持完整并偶聯(lián)至所述表面，其中每個PCR循環(huán)包含以下反應(yīng)條件： (a) 在至少85 °C的溫度下持續(xù)至少15秒的變性步驟； (b) 在至少50°C的溫度下持續(xù)至少15秒的退火步驟；以及 (c) 在至少70°C的溫度下持續(xù)至少30秒的延伸步驟。2. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述表面覆蓋有聚合物刷。3. 如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述聚合物刷包含丙烯酰胺。4. 如權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述聚合物刷進(jìn)一步包含N-(2-羥乙基)丙烯酰胺。5. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中至少1，000個不同的核酸分子偶聯(lián)至所述表面。6. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中至少100,000個不同的核酸分子偶聯(lián)至所述表面。7. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中至少1，000,000個不同的核酸分子偶聯(lián)至所述表 面。8. -種用于進(jìn)行酶反應(yīng)的方法，其包括： (a) 提供具有聚合物刷涂層以及偶聯(lián)至所述聚合物刷的多個生物分子的基底；以及 (b) 采用所述基底上的所述生物分子進(jìn)行一種或多種酶反應(yīng)。9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述生物分子選自：寡核苷酸、多核苷酸、適體、蛋白 質(zhì)和抗體。10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述酶反應(yīng)選自：聚合酶鏈反應(yīng)、測序反應(yīng)、連接反 應(yīng)、延伸反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。11. 如權(quán)利要求9所述的方法，其進(jìn)一步包括向所述基底施加熱量。12. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中在40個循環(huán)的合成測序反應(yīng)后，至少90 %的所述生 物分子保留至少90 %的完整性。13. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中在25個循環(huán)的聚合酶鏈反應(yīng)后，至少90%的所述生 物分子保留至少90 %的完整性。14. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述基底包含至少1，000,000個不同類型的生物分 子，并且其中每個生物分子均為寡核苷酸。15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述酶反應(yīng)為延伸反應(yīng)。16. -種制備修飾的表面的方法，其包括： (a) 提供表面； (b) 使引發(fā)劑物質(zhì)與所述表面共價鍵合； (c) 從所述引發(fā)劑物質(zhì)進(jìn)行聚合物的表面引發(fā)聚合，由此產(chǎn)生包含多個聚合物鏈的聚 合物涂層；以及 (d) 將兩個或更多個不同的生物分子偶聯(lián)至所述聚合物涂層。17. -種制備修飾的表面的方法，其包括： (a) 提供表面； (b) 使引發(fā)劑物質(zhì)與所述表面共價鍵合； (c) 從所述引發(fā)劑物質(zhì)進(jìn)行兩個或更多個不同類型的丙烯酰胺單體的混合物的表面引 發(fā)聚合，由此產(chǎn)生包含多個聚合物鏈的聚合物涂層；以及 (d)將生物分子偶聯(lián)至所述聚合物涂層。18. 如權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述生物分子選自：寡核苷酸、多核苷酸、適 體、蛋白質(zhì)和抗體。19. 如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述兩個或更多個不同的生物分子為兩個不同的 寡核苷酸。20. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述兩個或更多個不同類型的丙烯酰胺單體選自： 丙烯酰胺、N-(2-羥乙基)丙烯酰胺、乙二醇丙烯酰胺和甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)。21. 如權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述表面選自玻璃、二氧化硅、氧化鈦、氧化 鋁、氧化銦錫（ITO)、硅、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、多環(huán)烯烴、聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA)、鈦和金。22. 如權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述表面包含玻璃。23. 如權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述表面包含硅。24. 如權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述表面選自：流動池、測序流動池、流動通 道、微流體通道、毛細(xì)管、壓電表面、孔、微孔、微孔陣列、微陣列、芯片、晶片、非磁性珠、磁 珠、鐵磁珠、順磁珠、超順磁珠以及聚合物凝膠。25. 如權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述引發(fā)劑物質(zhì)包含有機硅烷。26. 如權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述引發(fā)劑物質(zhì)包含圖1所示的分子。27. 如權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述表面引發(fā)聚合包括原子轉(zhuǎn)移自由基聚合 (ATRP)〇28. 如權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述表面引發(fā)聚合包括可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移 (RAFT)。29. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物分子包含5 ' acrydite修飾的寡核苷酸。30. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物分子包含抗體。31. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物分子包含肽。32. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物分子包含適體。33. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物分子的偶聯(lián)包括聚合過程中acrydite修飾 的生物分子的并入。34. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物分子的偶聯(lián)包括在溴乙?；稽c的反應(yīng)。35. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物分子的偶聯(lián)包括在疊氮基位點的反應(yīng)。36. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物分子的偶聯(lián)包括疊氮-炔Huisgen環(huán)加成。37. -種組合物，其包含： (a) 表面； (b) 通過表面引發(fā)聚合形成的、與所述表面共價結(jié)合的聚合物涂層，其中該聚合物涂層 包含2個或更多個不同類型的丙烯酰胺單體;以及 (c) 偶聯(lián)至所述聚合物涂層的生物分子。38. -種組合物，其包含： (a) 表面； (b) 通過表面引發(fā)聚合形成的、與所述表面共價結(jié)合的聚合物涂層；以及 (c) 偶聯(lián)至所述聚合物涂層的至少兩個不同的生物分子。39. 如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述生物分子包含寡核苷酸。40. 如權(quán)利要求39所述的組合物，其中所述寡核苷酸在其5 '端與所述聚合物偶聯(lián)。41. 如權(quán)利要求39所述的組合物，其中所述寡核苷酸在其3 '端與所述聚合物偶聯(lián)。42. 如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述生物分子包含抗體。43. 如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述生物分子包含適體。44. 如權(quán)利要求38所述的組合物，其中所述至少兩個不同的生物分子包含寡核苷酸。45. 如權(quán)利要求44所述的組合物，其中所述寡核苷酸在其5 '端與所述聚合物涂層偶聯(lián)。46. 如權(quán)利要求44所述的組合物，其中所述寡核苷酸在其3 '端與所述聚合物涂層偶聯(lián)。47. 如權(quán)利要求38所述的組合物，其中所述至少兩個不同的生物分子包含抗體。48. 如權(quán)利要求38所述的組合物，其中所述至少兩個不同的生物分子包含適體。49. 如權(quán)利要求37或38所述的組合物，其中所述表面包含玻璃。50. 如權(quán)利要求37或38所述的組合物，其中所述表面包含硅。51. 如權(quán)利要求37或38所述的組合物，其中所述聚合物涂層包含聚丙烯酰胺。52. 如權(quán)利要求37或38所述的組合物，其中所述聚合物涂層包含PMMA。53. 如權(quán)利要求37或38所述的組合物，其中所述聚合物涂層包含聚苯乙烯。54. 如權(quán)利要求37或38所述的組合物，其中所述表面引發(fā)聚合包括原子轉(zhuǎn)移自由基聚 合(ATRP)。55. 如權(quán)利要求37或38所述的組合物，其中所述表面引發(fā)聚合包括可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn) 移(RAFT)〇
【文檔編號】G01N33/543GK105940024SQ201480074638
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2014年12月5日
【發(fā)明人】格倫·麥克加爾
【申請人】桑特里萊恩科技控股公司