水稻抗褐飛虱基因Bph9及其分子標(biāo)記和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了水稻抗褐飛虱基因Bph9及其分子標(biāo)記和應(yīng)用。其具有SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列，其cDNA序列如SEQ?ID?No.2所示。Bph9基因定位于分子標(biāo)記InD2和RM28466之間。與該基因緊密連鎖的分子標(biāo)記還有RM28438、InD28450、InD28453、InD14、InD28432、RM28481和RM28486之一，可用于篩選含有抗褐飛虱基因Bph9的水稻。Bph9基因?qū)儆贜BS-LRR基因家族，編碼的蛋白質(zhì)與植物抗病性相關(guān)，通過遺傳轉(zhuǎn)化和雜交，將Bph9基因轉(zhuǎn)入普通水稻品種，能夠提高水稻對褐飛虱的抗性，從而減輕褐飛虱產(chǎn)生的危害，達(dá)到增產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)的目的。
【專利說明】水稻抗褐飛虱基因Bph9及其分子標(biāo)記和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種水稻抗褐飛虱基因Bph9，同時還涉及該基因的分子標(biāo)記以及該基因及其分子標(biāo)記在選育抗褐飛虱水稻及水稻種子中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是一種重要的糧食作物，世界上有超過一半的人以其為主食。同時，由于水稻基因組精細(xì)遺傳圖和物理圖譜已完成，其轉(zhuǎn)基因技術(shù)相對容易，并且與其它禾本科作物基因組具有共線性，因而被視做模式植物。隨著包括水稻在內(nèi)的多種生物基因組測序的完成，人類開始進(jìn)入后基因組時代。全面開展功能基因組研究已成為生命科學(xué)的前沿領(lǐng)域。因此水稻功能基因的研究對社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生物學(xué)研究具有重大意義。
[0003]糧食安全問題，是全世界人民面臨的挑戰(zhàn)。50、60年代的矮化育種和70年代的雜交水稻培育兩次科技革命使水稻產(chǎn)量大幅度提高。褐飛虱是一種爆發(fā)力強(qiáng)、危害性大的水稻蟲害。褐飛虱的成蟲、若蟲刺吸水稻汁液，引起黃葉或枯死，褐飛虱還傳播或誘發(fā)多種水稻病害，導(dǎo)致減產(chǎn)或絕收。上世紀(jì)60年代以前，褐飛虱僅在我國局部稻區(qū)時有發(fā)生。其后，隨著氣候、環(huán)境、種植結(jié)構(gòu)、耕作制度、栽培方式的變化，褐飛虱為害地域由南向北擴(kuò)展，發(fā)生頻次增加，危害程度加重。據(jù)中國農(nóng)業(yè)年鑒記載，1966、1969、1973、1977、1983和2003年全國性大發(fā)生，1987、1991、2005、2006和2007年全國性特大發(fā)生，褐飛虱危害面積達(dá)到水稻總面積的50%以上，給我國水稻生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損失。目前我國每年水稻褐飛虱發(fā)生面積為2000萬公頃以上，每年因褐飛虱危害造成的直接產(chǎn)量損失達(dá)280萬噸以上。褐飛虱已對我國水稻生產(chǎn)安全形成嚴(yán)重威脅。
[0004]目前，褐飛虱已經(jīng)成為我國水稻生產(chǎn)中的第一大蟲害，對我國當(dāng)前糧食安全已形成嚴(yán)重威脅。長期以來，褐飛虱的防治主要是依靠施用化學(xué)殺蟲劑。由于褐飛虱爆發(fā)多發(fā)生在水稻成熟灌漿期，此時稻株`長勢旺盛，將殺蟲劑施到稻株基部的操作非常困難。事實(shí)上由于化學(xué)殺蟲劑的連年大量施用，褐飛虱抗藥性成倍增加，使藥劑防治的效果有限。同時使用化學(xué)殺蟲劑防治褐飛虱，一方面增加了農(nóng)民的生產(chǎn)成本，另一方面化學(xué)殺蟲劑還造成對非目標(biāo)生物的毒殺、對環(huán)境和糧食污染等環(huán)境和生態(tài)問題。
[0005]褐飛虱連年持續(xù)爆發(fā)猖獗的內(nèi)在原因是我國水稻品種大面積種植的主要水稻品種抗褐飛虱性能普遍差，加上雜交稻品種株型高大，中后期田間群體大，莖葉茂密，田間郁蔽度高，營養(yǎng)適宜，有利于褐飛虱快速繁殖，對褐飛虱等蟲害表現(xiàn)為“超感蟲性”，在蟲源基數(shù)大、氣候條件適宜時，極易形成爆發(fā)流行之勢，造成嚴(yán)重危害(寒川，劉光杰等2003)。國際水稻研究所和東南亞的水稻生產(chǎn)實(shí)踐證明，栽種的水稻品種即使只帶有中等水平的抗性基因，也足以將褐飛虱的群體控制在造成危害的水平以下，不至于對水稻造成嚴(yán)重的危害和產(chǎn)量損失。因此，防控褐飛虱最為經(jīng)濟(jì)有效安全生態(tài)的措施是種植含抗褐飛虱基因的水稻品種。
[0006]水稻抗褐飛虱基因的研究始于上世紀(jì)70年代初。至今已經(jīng)在普通栽培稻和野生稻資源中鑒定和定位了二十多個水稻抗褐飛虱的主效抗蟲基因(具體綜述見Jena等，2010.Current status of Brown Planthopper(BPH)resistance and genetics.Rice2010 (3)，161-171)。 如 Bphl (Athwal et al.，1971;Hirabayashi and Ogawaj 1995 ；Sharma et al.，2003;Cha et al.，2008)，bph2 (Athwal et al.，1971;Murata etal.,1998;Murai et al.,2001), Bph3 (Lakshminarayana and Khush，1977;Jairin etal.，2007)，bph4(Kawaguchi et al.，2001)，bph5 (Khush et al.，1991), Bph6 (Kabirand Khush, 1988;Qiu et al.,2010), bph7 (Kabir and Khush，1988)，bph8(Nemoto etal.，1989)，Bph9((Nemoto et al., 1989;Muruta and Fujiwaraj 2001), BphlO(Ishii etal.，1994)，Bphll(Takita，1996)，bphl2(Hirabayashi et al.，1998，1999)，Bph13 (t)(Liu et al.,2001), Bph14(Wang et al., 2001;Du et al.，2009)，Bphl5(Huang etal.，2001;Yang et al 2004)，Bphl7(Renganayaki et al.，2002)，Bphl8 (t) (Jenaet al.，2006)，bphl9 (t) (Chen et al.，2006)，bph20 (t)、bph21 (t)、bph22 (t)、bph23 (t)、Bph24 (t) (Li et al., 2006;李容桕等，2008)，Bph20、Bph21 (Rahman et al2009)，Bph22 (t)、Bph23 (t) (Ram et al 2010)，bph24 (t) (Deen et al 2010)，bph22 (t)、bph23 (t) (Hou et al 2011),Bph25 (t)Λ Bph26 (t) (Myint et al.2005;Yara etal.2010;Myint et al.2012)。其中，Bphl4基因已經(jīng)成功克隆，這是國際上首次利用圖位克隆法分離得到的第一例水稻抗蟲基因(Du et al 2009)。
[0007]圖位克隆(map-based cloning)又稱為定位克隆(positional cloning)，是隨著分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜的發(fā)展而發(fā)展起來的一種基因克隆技術(shù)。圖位克隆法步驟包括對目標(biāo)基因進(jìn)行遺傳定位、物理定位、序列分析及遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證功能。從理論上講，任何一個能定位的基因都可用圖位克隆法分離。圖位克隆法一般適合于基因組比較小的物種，如單子葉模式植物水稻，具有基因組小、基因組物理距離與遺傳距離之比小而且標(biāo)記豐富的特點(diǎn)。水稻作為禾本科模式植物，其基因組是麥、高梁等七種禾本科植物基因組組成的同心圓的圓心，是最適合應(yīng)用圖位克隆法分離目的基因的作物之一。水稻中已經(jīng)克隆的多個基因都是通過圖位克隆法克隆的，如抗白葉枯病基因Xa-21 (Song WY等1995，A Receptor Kinase-Like Protein Encoded by the Rice Disease ResistanceGene，Xa21.Science，270:1804-1806)、Xa_l (Yoshimura 等 1998，Expression of Xa-1j abacterial blight-resistance gene in rice,is induced by bacterial inoculation.PNAS，95:1663-1668)和 Xa_26 (Sun 等 2004，Xa26 a gene conferring resistance toXanthomonas oryzae pv.0ryzae in rice, encodes an LRR receptor kinase-likeprotein.Plant Journal，37:517-527)，抗稻痕病基因 Pi_b (Wang 等 1999，The Pi_b genefor rice blast resistance belongs to the nucleotide binding and leucine-richrepeat class of plant disease resistance genes.Plant Journal, 1999，19:55-64)和 Pi_ta (Bryan 等 2000，A single amino acid difference distinguishes resistantand susceptible alleles of the rice blast resistance gene P1-ta.PlantCell，12:2033~2046)，我國科學(xué)家克隆的分蘗基因(Li 等 2003，Control of tilleringin rice.Nature 422:618-621 )、耐鹽基因(Ren 等 2005，A rice quantitative traitlocus for salt tolerance encodes a sodium transporter.Nature Genetics37 (10): 1141-1146)和高產(chǎn)基因(Weiya Xue 等 2008，Natural variation in Ghd7isan important regulator of heading date and yield potential in rice.NatureGenetics 40，761-767)，以及應(yīng)用圖位克隆法分離得到的第一例水稻抗蟲基因(Du等2009，Identification and characterization of Bphl4，a gene conferring resistanceto brown planthopper in rice.PNAS，106:22163-22168)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明目的在于提供一種水稻抗褐飛虱的基因Bph9及其應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明另一目的是提供一種抗褐飛虱基因Bph9的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明采用遺傳學(xué)的方法，構(gòu)建水稻抗褐飛虱的分離群體，利用圖位克隆的方法，分離到水稻抗褐飛虱基因Bph9。通過共分離標(biāo)記檢測表明該基因與抗褐飛虱性能是共分離的，通過遺傳轉(zhuǎn)化Bph9基因，使感性水稻出現(xiàn)抗褐飛虱的表型，證實(shí)了該基因的功能。
[0011]本發(fā)明提供一種分離的多核苷酸，其具有水稻抗褐飛虱基因Bph9序列，所述序列是SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，或該序列經(jīng)替換、缺失或增加一個或多個核苷酸，且編碼相同或相似，且具有相同功能的氨基酸序列的核苷酸序列。
[0012]本發(fā)明提供一種分離的多核苷酸，其具有水稻抗褐飛虱基因Bph9的cDNA序列，所述序列是SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，或該序列經(jīng)替換、缺失或增加一個或多個核苷酸，且編碼相同或相似，且具有相同功能的氨基酸序列的核苷酸序列。
[0013]本發(fā)明提供的分離的多核苷酸，其cDNA序列如SEQ ID N0.2所示。
[0014]本發(fā)明提供的Bph9基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，該基因全長15628bp，具有2個內(nèi)含子和3個外顯子，其⑶S分別為區(qū)段分別為2963-4073、6373-6996和12663-14960，cDNA全長4042bp，編碼1206個氨基酸，其蛋白序列如序列表SEQ ID N0.3所示。該蛋白屬于NBS-LRR家族，活性中心175-322區(qū)段為保守的NB-ARC區(qū)、392-672區(qū)段為保守的 NB-ARC 區(qū)(包括 P-1oop NTPase、AAA ATPase domain)、822_873 區(qū)段為 Leucinerich repeat (LRR,富亮氨酸重復(fù))。
[0015]應(yīng)當(dāng)理解，在不影響B(tài)ph9蛋白活性的前提下(即不在蛋白的活性中心)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/或缺失一個或幾個氨基酸獲得具有同等功能的氨基酸序列。
[0016]此外，考慮到密碼子的簡并性，例如可在其編碼區(qū)，在不改變氨基酸序列的條件下，或在其非編碼區(qū)在不影響蛋白表達(dá)的條件下，對編碼上述蛋白的多核苷酸序列進(jìn)行修改。因此，本發(fā)明還包含對編碼上述蛋白的多核苷酸序列進(jìn)行的替換、添加和/或缺失一個或多個核苷酸，具有與上述編碼具有相同功能蛋白的核苷酸序列。
[0017]本發(fā)明提供的上述多核苷酸片段其與一個同源或異源啟動子序列可操縱地連接。
[0018]本發(fā)明還包括基于所述多核苷酸的正義序列或反義序列，包括含有所述多核苷酸序列或其片段的克隆載體或表達(dá)載體、含有所述載體的宿主細(xì)胞、含有所述核苷酸序列或其片段的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物。
[0019]其中所述植物是單子葉植物。
[0020]其中所述單子葉植物是水稻。
[0021 ] 本發(fā)明提供了上述多核苷酸在水稻選育中的應(yīng)用。
[0022]本發(fā)明提供了上述多核苷酸在提高水稻抗褐飛虱抗性中的應(yīng)用
[0023]本發(fā)明提供了上述多核苷酸在制備轉(zhuǎn)基因抗褐飛虱水稻中的應(yīng)用。[0024]本發(fā)明提供一種培育具有褐飛虱抗性的植物的方法，包括:
[0025]I)用多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；所述多核苷酸含有水稻抗褐飛虱Bph9基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示；
[0026]2)將被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生為植株；
[0027]3)培養(yǎng)再生的植株并使上述多核苷酸得到表達(dá)。
[0028]本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生具有褐飛虱抗性的植物的方法，所述方法包括將具有褐飛虱抗性基因Bph9的植物與其他植物雜交產(chǎn)生具有褐飛虱抗性的子代植株。
[0029]其中所述植物是單子葉植物。
[0030]優(yōu)選地，所述植物是水稻。
[0031]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能理解，根據(jù)本發(fā)明公開的序列來設(shè)計(jì)或產(chǎn)生分子標(biāo)記可用于抗褐飛虱水稻的選育工作。
[0032]本發(fā)明同時還提供與抗褐飛虱主效基因Bph9連鎖的分子標(biāo)記，其為
[0033]RM28438 標(biāo)記引物:
[0034]正向引物序列GTTCGTGAGCCACAACAAATCC
[0035]反向引物序列GTTAAATGCTCCACCAAACACACC
[0036]或InD28450標(biāo)記引`物:
[0037]正向引物序列GGTTGGAAAAGAAGCGATCA
[0038]反向引物序列GCATCRTAAGGTTGCCATCA
[0039]或InD28453標(biāo)記引物:
[0040]正向引物序列GGCAAAGACAAGCCATAAGC[0041 ]反向引物序列 ATCCATCAGCAATGACACGA
[0042]或InD28432標(biāo)記引物:
[0043]正向引物序列TGCAGACACCACATGCATAA
[0044]反向引物序列ACGCATACACACAGGGACAA
[0045]或InD2標(biāo)記引物:
[0046]正向引物序列AACAGACACGTTGCGTCTTG
[0047]反向引物序列CTTGCCGCTTAGAGGAGATG
[0048]或InD14標(biāo)記引物:
[0049]正向引物序列CCACTCTGAAAATCCCAAGC
[0050]反向引物序列ACCAGTTAAGTCACGCTCAAA
[0051]或RM28466標(biāo)記引物:
[0052]正向引物序列CCGACGAAGAAGACGAGGAGTAGCC
[0053]反向引物序列AGGCCGGAGAGCAATCATGTCG
[0054]或RM28481標(biāo)記引物:
[0055]正向引物序列GTCAATTAACCATTGCCCATGC
[0056]反向引物序列TTCACGTGGGAACTACTCATGC
[0057]或RM28486標(biāo)記引物:
[0058]正向引物序列TTCTCTGAATGCCCTGTCTCTCC
[0059]反向引物序列GGCAAATCAGAACAAGTCTCACC,[0060]用上述標(biāo)記引物擴(kuò)增水稻基因組DNA，如果用引物RM28438能夠擴(kuò)增出213bp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD28450能夠擴(kuò)增出221bp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD28453能夠擴(kuò)增出323bp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD28432能夠擴(kuò)增出320bp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD2能夠擴(kuò)增出241bp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD14能夠擴(kuò)增出397bp的擴(kuò)增片段，或者用引物RM28466能夠擴(kuò)增出85bp的擴(kuò)增片段，或者用引物RM28481能夠擴(kuò)增出237bp的擴(kuò)增片段，或者用引物RM28486能夠擴(kuò)增出161bp的擴(kuò)增片段，均標(biāo)志著水稻品種抗褐飛虱主效基因位點(diǎn) Bph9 的存在。因此，分子標(biāo)記 RM28438、InD28450、InD28453、InD28432、InD2、InD14, RM28466, RM2848U RM28486能用于篩選含有抗褐飛虱基因Bph9的抗褐飛虱水稻。
[0061]本發(fā)明還提供了另一個水稻抗褐飛虱基因Bph9的分子標(biāo)記，其由InDel分子標(biāo)記IR2引物經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得，該引物為:
[0062]正向引物序列AGGATGGGGAGAAGAAGACG，
[0063]反向引物序列GTGTTCCTTGTCGGGTGTA。
[0064]本發(fā)明還提供與水稻抗褐飛虱抗性相關(guān)的分子標(biāo)記，其為
[0065]RM28438 標(biāo)記引物:
[0066]正向引物序列GTTCGTGAGCCACAACAAATCC
[0067]反向引物序列GTTAAATGCTCCACCAAACACACC
[0068] 或InD28450標(biāo)記引物:
[0069]正向引物序列GGTTGGAAAAGAAGCGATCA
[0070]反向引物序列GCATCRTAAGGTTGCCATCA
[0071]或InD28453標(biāo)記引物:
[0072]正向引物序列GGCAAAGACAAGCCATAAGC
[0073]反向引物序列ATCCATCAGCAATGACACGA
[0074]或InD28432標(biāo)記引物:
[0075]正向引物序列TGCAGACACCACATGCATAA
[0076]反向引物序列ACGCATACACACAGGGACAA
[0077]或InD2標(biāo)記引物:
[0078]正向引物序列AACAGACACGTTGCGTCTTG
[0079]反向引物序列CTTGCCGCTTAGAGGAGATG
[0080]或InD14標(biāo)記引物:
[0081 ]正向引物序列 CCACTCTGAAAATCCCAAGC
[0082]反向引物序列ACCAGTTAAGTCACGCTCAAA
[0083]或RM28466標(biāo)記引物:
[0084]正向引物序列CCGACGAAGAAGACGAGGAGTAGCC
[0085]反向引物序列AGGCCGGAGAGCAATCATGTCG
[0086]或RM28481標(biāo)記引物:
[0087]正向引物序列GTCAATTAACCATTGCCCATGC
[0088]反向引物序列TTCACGTGGGAACTACTCATGC
[0089]或RM28486標(biāo)記引物:
[0090]正向引物序列TTCTCTGAATGCCCTGTCTCTCC[0091 ]反向引物序列 GGCAAATCAGAACAAGTCTCACC,
[0092]或IR2標(biāo)記引物:
[0093]正向引物序列AGGATGGGGAGAAGAAGACG，
[0094]反向引物序列GTGTTCCTTGTCGGGTGTA。
[0095]本發(fā)明還提供了上述分子標(biāo)記在選育抗褐飛虱水稻中的應(yīng)用。
[0096]本發(fā)明提供了水稻抗褐飛虱基因bph9的分子標(biāo)記方法，其通過下述之一的引物對擴(kuò)增待檢水稻基因組DNA，并檢測擴(kuò)增產(chǎn)物:
[0097]I)標(biāo)記引物，RM28438標(biāo)記引物:
[0098]正向引物序列GTTCGTGAGCCACAACAAATCC
[0099]反向引物序列GTTAAATGCTCCACCAAACACACC
[0100]2)標(biāo)記引物，InD28450標(biāo)記引物:
[0101]正向引物序列GGTTGGAAAAGAAGCGATCA
[0102]反向引物序列GCATCRTAAGGTTGCCATCA
[0103]3)標(biāo)記引物，InD28453標(biāo)記引物:
[0104]正向引物序列GGCAAA`GACAAGCCATAAGC
[0105]反向引物序列ATCCATCAGCAATGACACGA
[0106]4)標(biāo)記引物，InD28432標(biāo)記引物:
[0107]正向引物序列TGCAGACACCACATGCATAA
[0108]反向引物序列ACGCATACACACAGGGACAA
[0109]5)標(biāo)記引物，InD2標(biāo)記引物:
[0110]正向引物序列AACAGACACGTTGCGTCTTG
[0111]反向引物序列CTTGCCGCTTAGAGGAGATG
[0112]6)標(biāo)記引物，InD14標(biāo)記引物:
[0113]正向引物序列CCACTCTGAAAATCCCAAGC
[0114]反向引物序列ACCAGTTAAGTCACGCTCAAA
[0115]7)標(biāo)記引物，RM28466標(biāo)記引物:
[0116]正向引物序列CCGACGAAGAAGACGAGGAGTAGCC
[0117]反向引物序列AGGCCGGAGAGCAATCATGTCG
[0118]8)標(biāo)記引物，RM28481標(biāo)記引物:
[0119]正向引物序列GTCAATTAACCATTGCCCATGC
[0120]反向引物序列TTCACGTGGGAACTACTCATGC
[0121]9)標(biāo)記引物，RM28486標(biāo)記引物:
[0122]正向引物序列TTCTCTGAATGCCCTGTCTCTCC
[0123]反向引物序列GGCAAATCAGAACAAGTCTCACC,
[0124]10)標(biāo)記引物，IR2標(biāo)記引物:
[0125]正向引物序列AGGATGGGGAGAAGAAGACG，
[0126]反向引物序列GTGTTCCTTGTCGGGTGTA，
[0127]如果用引物RM28438能夠擴(kuò)增出213bp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD28450能夠擴(kuò)增出221bp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD28453能夠擴(kuò)增出323bp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD28432能夠擴(kuò)增出320bp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD2能夠擴(kuò)增出241bp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD14能夠擴(kuò)增出397bp的擴(kuò)增片段，或者用引物RM28466能夠擴(kuò)增出85bp的擴(kuò)增片段，或者用引物RM28481能夠擴(kuò)增出237bp的擴(kuò)增片段，或者用引物RM28486能夠擴(kuò)增出161bp的擴(kuò)增片段，或者用引物IR2能夠擴(kuò)增出228bp的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著水稻品種抗褐飛虱基因位點(diǎn)Bph9的存在。
[0128]本發(fā)明還提供了一種篩選抗褐飛虱水稻的方法，其用上述的引物對之一進(jìn)行PCR方法擴(kuò)增待檢水稻基因組DNA，如果用引物RM28438能夠擴(kuò)增出213bp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD28450能夠擴(kuò)增出22Ibp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD28453能夠擴(kuò)增出323bp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD28432能夠擴(kuò)增出320bp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD2能夠擴(kuò)增出241bp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD14能夠擴(kuò)增出397bp的擴(kuò)增片段，或者用引物RM28466能夠擴(kuò)增出85bp的擴(kuò)增片段，或者用引物RM28481能夠擴(kuò)增出237bp的擴(kuò)增片段，或者用引物RM28486能夠擴(kuò)增出161bp的擴(kuò)增片段，或者用引物IR2能夠擴(kuò)增出228bp的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著水稻品種對褐飛虱 抗性的存在。
[0129]本發(fā)明通過如下步驟克隆得到Bph9基因:
[0130]1.創(chuàng)建定位群體。利用抗褐飛虱水稻與普通水稻品種雜交，F(xiàn)1代自交獲得&群體，作為抗褐飛虱基因定位群體。
[0131]2.抗褐飛虱鑒定。苗期集團(tuán)法鑒定定位群體的抗褐飛虱性能。從F2代植株上收獲種子，每份F2代植株收獲的種子于秧盤中播種20棵苗(稱為I個家系)。2葉I心期，放入2-4齡的褐飛虱若蟲(10頭/株)，記錄各家系的受害情況，每份材料重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。根據(jù)抗蟲鑒定結(jié)果，對定位群體株系的進(jìn)行了抗蟲級別的劃分。
[0132]3.抗褐飛風(fēng)基因定位。用PCR (polymerase chain reaction)和聚丙烯酰胺凝膠電泳，以及RFLP標(biāo)記和Southern雜交的方法，檢測F2各個單株的SSR和RFLP分子標(biāo)記的分離情況，結(jié)合相應(yīng)各家系的抗蟲級別，應(yīng)用JoinMap3.0和MapQTL5.0軟件，構(gòu)建水稻第12染色體的分子標(biāo)記遺傳連鎖圖，將Bph9定位在分子標(biāo)記RM28438和RM28486之間。
[0133]4.加密目標(biāo)區(qū)段分子標(biāo)記與精細(xì)定位。根據(jù)國際水稻基因組計(jì)劃公布的水稻基因組序列，設(shè)計(jì)第12染色體Bph9所在目標(biāo)區(qū)段的SSR標(biāo)記和InDel標(biāo)記的引物，用PCR和聚丙烯酰胺凝膠電泳方法檢測標(biāo)記在BC2F2大群體中的分離，通過篩選得到的重組單株的表型與基因型的關(guān)系，將抗褐飛虱基因Bph9定位在分子標(biāo)記InD2和InD18之間，與標(biāo)記InD14緊密連鎖。
[0134]5.候選基因確定。構(gòu)建了含抗褐飛虱基因Bph9的抗性親本水稻材料(Pokkali，IRGC 108921)基因組Fosmid文庫，通過定位區(qū)間分子標(biāo)記進(jìn)行PCR篩選，得到了覆蓋Bph9定位區(qū)間的陽性克隆，以雙脫氧終止法(Sanger法)進(jìn)行大片段測序，得到Bph9所在區(qū)段的基因組序列，應(yīng)用RiceGAAS軟件預(yù)測基因，并通過與日本晴和9311序列作對比分析，確定Bph9的候選基因。
[0135]6.根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)一步做共分離檢測。根據(jù)Bph9候選基因序列設(shè)計(jì)引物，用PCR和聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法對BC3F2大群體進(jìn)行檢測，這些引物對應(yīng)的標(biāo)記與抗褐飛虱的表現(xiàn)型共分離，篩選得到了抗褐飛虱的水稻株系。
[0136]7.全長cDNA克隆。根據(jù)預(yù)測的cDNA序列，以3’末端的序列設(shè)計(jì)引物，從抗褐飛虱水稻的cDNA中擴(kuò)得1692bp片段，以該段序列設(shè)計(jì)引物，通過RACE (cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù))得到了 cDNA的3’端和5’端序列，最終獲得Bph9的全長cDNA。
[0137]然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)本發(fā)明公開的Bph9的核苷酸序列，通過設(shè)計(jì)恰當(dāng)?shù)腜CR引物，即可從抗褐飛虱水稻基因組中擴(kuò)增得到Bph9基因。
[0138]8.遺傳轉(zhuǎn)化Bph9基因驗(yàn)證其功能。根據(jù)Fosmid基因組文庫篩選及測序結(jié)果，采用SalI和NcoI雙酶切Bph9基因所在Fosmid克隆所得3026bp片段作為Bph9基因啟動子區(qū)域(NcoI位點(diǎn)處為Bph9基因翻譯起始密碼子)。
[0139]利用NcoI和XhoI雙酶切Bph9基因全長cDNA克隆獲得3346bp片段，包括了 Bph9基因大部分ORF區(qū)域，也包括了其第3個外顯子的大部分(XhoI位點(diǎn)位于第3外顯子末端)。Bph9基因組序列長15628bp，具有2個內(nèi)含子和3個外顯子。其ORF長為3621bp，在3344bp處有一 XhoI位點(diǎn)，同時該XhoI位點(diǎn)位于第3外顯子末端。利用XhoI和EcoRI雙酶切Bph9基因所在Fosmid克隆獲得了 1291bp的片段，該片段包括了第3個外顯子XhoI位點(diǎn)后的部分、及Bph9基因轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)域。將以上片段通過3段連接方式連入pGEM T easy載體的NcoI和EcoRI位點(diǎn)。用NcoI和EcoRI雙酶切切出的4637bp片段即包括了 Bph9基因的完整ORF及其轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)域。
[0140]將以上SalI和NcoI雙酶切所得Bph9基因啟動子區(qū)域(3026bp片段)、NcoI和EcoRI雙酶切所得Bph9基因完整ORF及轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)域(4637bp片段)，通過3段連接方式連入pCAMBIA1301的SalI和EcoRI位點(diǎn)。測序驗(yàn)證無誤后，所得載體即為Bph9基因遺傳轉(zhuǎn)化載體(利用其啟動子區(qū)域、完整0RF、及其轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)域)，將其電轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中。
[0141]采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將Bph9基因載體(利用其啟動子區(qū)域、完整0RF、及其轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)域)導(dǎo)入正常秈稻品種Kasalath中，最后獲得Bph9陽性植株15株。用T1代Bph9轉(zhuǎn)基因植株采用苗期集團(tuán)法進(jìn)行了抗蟲鑒定，結(jié)果表明對照水稻Kasalath全部死亡，轉(zhuǎn)基因陽性植株存活，抗蟲級別為2_3級，證實(shí)Bph9基因具有抗褐飛虱的功能。因此，抗褐飛虱基因Bph9可以在水稻中應(yīng)用也可以在水稻種子中應(yīng)用，培育具有抗褐飛虱性能的水稻品種。
[0142]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果:
[0143]1.本基因的成功克隆進(jìn)一步證實(shí)了圖位克隆法克隆水稻重要基因的可靠性，該方法克隆的基因其功能明確、效果好。
[0144]2.水稻中多個編碼具有NBS結(jié)構(gòu)蛋白的基因雖已被克隆，但大多與抗病性有關(guān)，本發(fā)明克隆的Bph9基因具有明顯的抗褐飛虱性能，這對全面理解該類基因的生物學(xué)功能
有重要意義。
[0145]3.除Bphl4基因在2009年得到克隆外，國際上尚未克隆出其它的水稻抗褐飛虱基因，對水稻抗褐飛虱的分子機(jī)理仍不清楚。而本`發(fā)明克隆的Bph9基因能夠顯著提高水稻對褐飛虱的抗性，這對水稻抗褐飛虱的分子機(jī)理研究將有極大的推動作用。
[0146]4.Bph9使水稻抗褐飛風(fēng)性能大大提高,通過遺傳轉(zhuǎn)化或雜交將Bph9應(yīng)用于水稻育種中，可以改善水稻品種的抗褐飛虱性，從而減輕褐飛虱的為害，達(dá)到增產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)的目的。
[0147]5.刺吸式昆蟲是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一大類蟲害，Bph9基因克隆和抗褐飛虱功能證實(shí)，對于其他植物的抗刺吸式昆蟲研究具有重要參考作用。【專利附圖】

【附圖說明】
[0148]圖1為苗期集團(tuán)法鑒定F2:3家系中的抗蟲植株和感蟲植株結(jié)果圖。圖中所示P09-1至P09-16為抗褐飛虱親本Pokkali (IRGC 108921，含抗褐飛虱基因Bph9)與褐飛虱感性水稻品種揚(yáng)稻6號(93-11)雜交構(gòu)建了含Bph9的F2群體中每個F2單株通過自交收種獲得相應(yīng)的F2:3家系。褐飛虱危害7天后，對照感性品種臺中本地I號(TNl)明顯死亡，圖中顯示P09-1、P09-2、P09-8、P09-11、P09-12、P09-13 F2:3家系在褐飛虱危害后存活，植株生長健康，為抗蟲植株，圖中所示P09-7、P09-9、P09-10 F2:3家系在褐飛虱危害后死亡，為感蟲植株。
[0149]圖2為SSR標(biāo)記RM28486檢測單株的電泳圖。前兩個泳道分別為抗蟲親本Pokkali(IRGC 108921)和感蟲親本揚(yáng)稻6號(93-11)，后面為Pokkali與揚(yáng)稻6號雜交構(gòu)建的F23家系。如圖顯示，用與抗褐飛虱基因Bph9連鎖的SSR標(biāo)記RM28486能特異擴(kuò)增出161bp片段的第2、3、5、6、8、10、12、14、15、18、19、20、21、23號F23家系對褐飛虱均表現(xiàn)出抗蟲性，而不能擴(kuò)出161bp特異性片段的第1、4、7、9、11、13、16、17、22、24號F23家系對褐飛虱均表現(xiàn)出感蟲性。 [0150]圖3為Bph9在水稻染色體的定位圖。A:Bph9初步定位結(jié)果。染色體上邊為標(biāo)記名稱，數(shù)值是標(biāo)記間的遺傳距離(cM)，QTL掃描結(jié)果表明在分子標(biāo)記RM28486和RM28438之間有一個最大的LOD值44.1，RM28486和RM28438相距1.7cM。η代表F2定位群體單株數(shù)。
[0151]B:分子標(biāo)記RM28486和RM28438間重組單株篩選結(jié)果。整合分子標(biāo)記分析及抗褐飛虱表型結(jié)果Bph9精細(xì)定位在分子標(biāo)記InD2和RM28466之間，與標(biāo)記InD14共分離。分子標(biāo)記下的數(shù)字代表相鄰兩個分子標(biāo)記之間重組單株數(shù)。η代表用于重組單株篩選的BC2F2群體單株數(shù)。
[0152]C:InD2和RM28466之間的物理圖譜，Bph9位于InD2和RM28466間約68kb的區(qū)域。19和544-22為相互重疊覆蓋標(biāo)記InD2和RM28466區(qū)間的Fosmid克隆。
[0153]圖4為Bph9基因自身啟動子、自身完整0RF、及其自身轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)域轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)基因植株抗褐飛虱鑒定結(jié)果圖。1、9代表感蟲對照品種TN1，2代表抗性親本Pokkali(IRGC108921)，3、5、7代表感蟲對照品種Kasalath，4、6、8分別代表Bph9基因自身啟動子、自身完整0RF、及其自身轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)域轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)基因株系P0K1、P0K2和P0K3。苗期集團(tuán)法放蟲前(上圖)和放蟲后7天(下圖)的比較，對照感性品種Kasalath與TNl明顯死亡，而抗性親本Pokkali (IRGC 108921)與轉(zhuǎn)基因株系POKl、P0K2和P0K3仍然存活，植株生長健康。
[0154]圖5為Bph9基因基因組互補(bǔ)載體轉(zhuǎn)基因植株抗褐飛虱鑒定結(jié)果圖。TO代轉(zhuǎn)基因植株與感蟲對照品種TNl按對角線移栽，移栽后4株組成一個類正方形形狀，其中1、4代表感蟲對照品種TN1，2代表Bph9基因基因組互補(bǔ)載體陽性TO代轉(zhuǎn)基因植株P(guān)GK1，3代表Bph9基因基因組互補(bǔ)載體陽性轉(zhuǎn)基因植株TO代PGK2。進(jìn)入分蘗期后，接入100頭2_3齡褐飛虱若蟲,接入褐飛虱28天后，感蟲對照品種TNl整株死亡，Bph9基因基因組互補(bǔ)載體陽性轉(zhuǎn)基因植株P(guān)GK1、PGK2仍然存活，生長健康，無葉片受害。
[0155]圖6為根據(jù)Bph9基因組序列開發(fā)的功能性分子標(biāo)記IR2 (屬于InDel標(biāo)記)示例，其擴(kuò)增片段長度為228bp。圖中I代表攜帶抗褐飛虱基因Bph9的抗蟲親本Pokkali (IRGC108921)，2代表感蟲材料揚(yáng)稻6號(93-11)，3代表利用功能性分子標(biāo)記IR2從Pokkali與揚(yáng)稻6號回交后代中篩選出的攜帶抗褐飛虱基因Bph9的材料(該材料抗褐飛虱)。
[0156]圖7為分子標(biāo)記輔助選擇培育帶有Bph9基因的抗褐飛虱水稻圖。苗期抗褐飛虱鑒定，蟲源為武漢田間褐飛虱群體。圖中1、5、9代表感蟲對照品種TN1，2、6代表抗性親本PokkaliCIRGC 108921 )，3、7代表感蟲材料揚(yáng)稻6號(93_11)，4、8代表珞揚(yáng)9號(揚(yáng)稻6號遺傳背景攜帶抗褐飛虱基因Bph9)。苗期集團(tuán)法放蟲前和放蟲后7天的比較，其中，上圖為放蟲前，下圖為防蟲7天后，對照感性品種TNl與受體親本揚(yáng)稻6號明顯死亡，而抗性親本Pokkali (IRGC 108921)與珞揚(yáng)9號(揚(yáng)稻6號遺傳背景攜帶抗褐飛虱基因Bph9)仍然存活，植株生長健康。
[0157]圖8為分子標(biāo)記輔助選擇培育帶有Bph9基因的抗褐飛虱水稻圖。苗期抗褐飛虱鑒定，蟲源為褐飛虱生物型1、生物型II及生物型III。上圖為蟲源為褐飛虱生物型1、中圖為生物型II及下圖為生物型III。圖中1、6代表感蟲對照品種TNl，2、4代表珞揚(yáng)9號(揚(yáng)稻6號遺傳背景攜帶抗褐飛虱基因Bph9)，3、5代表感蟲材料揚(yáng)稻6號(93-11)。放蟲后感性受體親本揚(yáng)稻6號和臺中本地I號明顯死亡，而珞揚(yáng)9號(揚(yáng)稻6號遺傳背景攜帶抗褐飛虱基因Bph9)仍然存活，植株生長健康。
[0158]圖9為分子標(biāo)記輔助選擇培育帶有Bph9基因的抗褐飛虱水稻圖。近分蘗期抗褐飛虱鑒定，蟲源為武漢田間褐飛虱群體。放蟲后感性受體親本揚(yáng)稻6號和臺中本地I號明顯死亡，而珞揚(yáng)9號(揚(yáng)稻6號遺傳背景攜帶抗褐飛虱基因Bph9)仍然存活，植株生長健康。
[0159]圖10為分子標(biāo)記輔助選擇培育帶有Bph9基因的抗褐飛虱水稻圖。成熟期抗褐飛虱鑒定，蟲源為武漢田間褐飛虱群體，放蟲后感性受體親本揚(yáng)稻6號明顯死亡，莖桿枯萎。而珞揚(yáng)9號(揚(yáng)稻6號遺傳背景攜帶抗褐飛虱基因Bph9)仍然存活，莖桿挺拔，植株生長健康。
【具體實(shí)施方式】
[0160]以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0161]若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0162]實(shí)施例1 Bph9基因的定位克隆及連鎖分子標(biāo)記開發(fā)
[0163]1.Bph9初步定位結(jié)果
[0164]抗褐飛虱親本Pokkali (IRGC 108921，含抗褐飛虱基因Bph9)與褐飛虱感性水稻品種揚(yáng)稻6號(93-11)雜交構(gòu)建了含Bph9的F2群體，93-11和Pokkali (IRGC 108921)均來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所國家農(nóng)作物種質(zhì)保存中心，并用CTAB法(MurrayMG&Thompson,1980 Rapid isolation of high-molecular-weight plant DNA.NucleicAcids Res 8:4321-4325)提取親本及F2群體各單株的基因組DNA。每個F2單株通過自交收種獲得相應(yīng)的F2:3家系。為了鑒定F2定位群體中每個單株的抗褐飛虱表型，采用了苗期集團(tuán)法考察F2:3家系各個單株的抗性表現(xiàn)(見圖1)，以F2:3家系抗性級別代表F2單株的抗褐飛虱表型。為確保親本和F2:3群體中的每個家系生長一致，所有供試材料在播種前分別浸種催芽。每個家系(品種)各60粒種子播種于一個長58cm、寬38cm、高9cm,且盛有7cm厚營養(yǎng)土的面包盒中。每盒每個材料播種3個重復(fù)，其中隨機(jī)播種親本和TNl (感性對照)各3個重復(fù)。播種7天后間苗，淘汰病弱苗。待苗長到兩葉一心期時，按8頭/苗的比例接種2-3齡褐飛虱若蟲，最后罩上尼龍紗網(wǎng)。當(dāng)感蟲品種TNl (臺中本地I號)全部死亡時，參照Huang等(Huang Z et al,2001 Identification and mapping of two brown planthopperresistance genes in rice.Theor.Appl.Genet.102，929 - 934)的方法對每個單株進(jìn)行 0、
1、3、5、7或9級的抗性評價(表1)，對親本材料和群體的每個家系通過加權(quán)平均計(jì)算該家系的抗性級別，并根據(jù)抗性級別推測此單株基因型。
[0165]表1抗感褐飛虱鑒定分級標(biāo)準(zhǔn)
[0166]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的多核苷酸,其具有水稻抗褐飛風(fēng)基因Bph9序列，所述序列是SEQ IDN0.1所示的核苷酸序列，或該序列經(jīng)替換、缺失或增加一個或多個核苷酸，且編碼相同或相似，且具有相同功能的氨基酸序列的核苷酸序列。
2.一種分離的多核苷酸，其具有水稻抗褐飛虱基因Bph9的cDNA序列，所述序列是SEQID N0.2所示的核苷酸序列，或該序列經(jīng)替換、缺失或增加一個或多個核苷酸，且編碼相同或相似，且具有相同功能的氨基酸序列的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其cDNA序列如SEQID N0.2所示。
4.權(quán)利要求1-3任一所述的多核苷酸編碼的蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的蛋白，其具有SEQID N0.3所示的氨基酸序列。
6.含有權(quán)利要求1~3所述多核苷酸的載體。
7.含有權(quán)利要求6所述載體的宿主。
8.權(quán)利要求1~3任一所述多核苷酸在水稻選育中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1-3任一所述多核苷酸在提高水稻抗褐飛虱抗性中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1-3任一所述多核苷酸在制備轉(zhuǎn)基因抗褐飛虱水稻中的應(yīng)用。
11.水稻抗褐飛虱基因Bph9的分子標(biāo)記，其可由下述之一的引物對經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得: 1)標(biāo)記引物，RM28438標(biāo)記引物: 正向引物序列 GTTCGTGAGCCACAACAAATCC 反向引物序列 GTTAAATGCTCCACCAAACACACC 2)標(biāo)記引物，InD28450標(biāo)記引物: 正向引物序列 GGTTGGAAAAGAAGCGATCA 反向引物序列 GCATCRTAAGGTTGCCATCA 3)標(biāo)記引物，InD28453標(biāo)記引物: 正向引物序列 GGCAAAGACAAGCCATAAGC 反向引物序列 ATCCATCAGCAATGACACGA 4)標(biāo)記引物，InD28432標(biāo)記引物: 正向引物序列 TGCAGACACCACATGCATAA 反向引物序列 ACGCATACACACAGGGACAA 5)標(biāo)記引物，InD2標(biāo)記引物: 正向引物序列 AACAGACACGTTGCGTCTTG 反向引物序列 CTTGCCGCTTAGAGGAGATG 6)標(biāo)記引物，InD14標(biāo)記引物: 正向引物序列 CCACTCTGAAAATCCCAAGC 反向引物序列 ACCAGTTAAGTCACGCTCAAA 7)標(biāo)記引物，RM28466標(biāo)記引物: 正向引物序列 CCGACGAAGAAGACGAGGAGTAGCC 反向引物序列 AGGCCGGAGAGCAATCATGTCG 8)標(biāo)記引物，RM28481標(biāo)記引物: 正向引物序列 GTCAATTAACCATTGCCCATGC 反向引物序列 TTCACGTGGGAACTACTCATGC9)標(biāo)記引物，RM28486標(biāo)記引物: 正向引物序列 TTCTCTGAATGCCCTGTCTCTCC 反向引物序列 GGCAAATCAGAACAAGTCTCACC。
12.如權(quán)利要求11所述的分子標(biāo)記，還包括由InDel分子標(biāo)記IR2的引物經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得，IR2標(biāo)記引物為: 正向引物序列 AGGATGGGGAGAAGAAGACG， 反向引物序列 GTGTTCCTTGTCGGGTGTA。
13.權(quán)利要求12所述分子標(biāo)記在選育抗褐飛虱水稻中的應(yīng)用。
14.水稻抗褐飛虱基因bph9的分子標(biāo)記方法，其通過下述之一的引物對擴(kuò)增待檢水稻基因組DNA，并檢測擴(kuò)增產(chǎn)物: 1)標(biāo)記引物，RM28438標(biāo)記引物: 正向引物序列 GTTCGTGAGCCACAACAAATCC 反向引物序列 GTTAAATGCTCCACCAAACACACC 2)標(biāo)記引物，InD28450標(biāo)記引物: 正向引物序列 GGTTGGAAAAGAAGCGATCA 反向引物序列 GCATCRTAAGGTTGCCATCA 3)標(biāo)記引物，InD28453標(biāo)記引物: 正向引物序列 GGCAAAGACAAGCCATAAGC 反向引物序列 ATCCATCAGCAATGACACGA 4)標(biāo)記引物，InD28432標(biāo)記引物: 正向引物序列 TGCAGACACCACATGCATAA 反向引物序列 ACGCATACACACAGGGACAA 5)標(biāo)記引物，InD2標(biāo)記引物: 正向引物序列 AACAGACACGTTGCGTCTTG 反向引物序列 CTTGCCGCTTAGAGGAGATG 6)標(biāo)記引物，InD14標(biāo)記引物: 正向引物序列 CCACTCTGAAAATCCCAAGC 反向引物序列 ACCAGTTAAGTCACGCTCAAA 7)標(biāo)記引物，RM28466標(biāo)記引物: 正向引物序列 CCGACGAAGAAGACGAGGAGTAGCC 反向引物序列 AGGCCGGAGAGCAATCATGTCG 8)標(biāo)記引物，RM28481標(biāo)記引物: 正向引物序列 GTCAATTAACCATTGCCCATGC 反向引物序列 TTCACGTGGGAACTACTCATGC 9)標(biāo)記引物，RM28486標(biāo)記引物: 正向引物序列 TTCTCTGAATGCCCTGTCTCTCC 反向引物序列 GGCAAATCAGAACAAGTCTCACC, 10)標(biāo)記引物，IR2標(biāo)記引物: 正向引物序列 AGGATGGGGAGAAGAAGACG,反向引物序列 GTGTTCCTTGTCGGGTGTA， 如果用引物RM28438能夠擴(kuò)增出213bp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD28450能夠擴(kuò)增出221bp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD28453能夠擴(kuò)增出323bp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD28432能夠擴(kuò)增出320bp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD2能夠擴(kuò)增出241bp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD14能夠擴(kuò)增出397bp的擴(kuò)增片段，或者用引物RM28466能夠擴(kuò)增出85bp的擴(kuò)增片段，或者用引物RM28481能夠擴(kuò)增出237bp的擴(kuò)增片段，或者用引物RM28486能夠擴(kuò)增出161bp的擴(kuò)增片段，或者用引物IR2能夠擴(kuò)增出228bp的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著水稻品種抗褐飛虱基因位點(diǎn)Bph9的存在。
15.—種篩選抗褐飛虱水稻的方法，其用權(quán)利要求11中所述的引物對之一 PCR方法擴(kuò)增待檢水稻基因組DNA，如果用引物RM28438能夠擴(kuò)增出213bp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD28450能夠擴(kuò)增出221bp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD28453能夠擴(kuò)增出323bp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD28432能夠擴(kuò)增出320bp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD2能夠擴(kuò)增出241bp的擴(kuò)增片段，或者用引物InD14能夠擴(kuò)增出397bp的擴(kuò)增片段，或者用引物RM28466能夠擴(kuò)增出85bp的擴(kuò)增片段，或者用引物RM28481能夠擴(kuò)增出237bp的擴(kuò)增片段，或者用引物RM28486能夠擴(kuò)增出161bp的擴(kuò)增片段，或者用權(quán)利要求12所述的引物IR2進(jìn)行PCR方法擴(kuò)增待檢水稻基因組DNA若擴(kuò)增出228bp的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著水稻品種對褐飛虱抗性的存在。`
【文檔編號】C07K14/415GK103667309SQ201210326386
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月5日
【發(fā)明者】何光存, 陳榮智, 王洋, 荊勝利, 祝莉莉, 杜波 申請人:武漢大學(xué)