水稻褐飛虱主效基因qBph30(t)的分子標記及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了水稻抗褐飛虱主效基因qBph30(t)的分子標記及其應用。通過將水稻抗蟲品系05BPH16(♂)與抗蚊青占(♀)雜交獲得的F2各單株的基因型，同時結合F2:3各家系的抗褐飛虱的抗性級別進行遺傳連鎖分析，獲得抗蟲品系05BPH16中抗性基因qBph30(t)的緊密連鎖分子標記。本發(fā)明的分子標記可以有效檢測抗蟲品系05BPH16及其衍生品種(系)中是否含有該抗性主效基因，快速提高抗褐飛虱水稻材料的選擇效率，獲得含有qBph30(t)基因的抗褐飛虱水稻品種。
【專利說明】水稻褐飛虱主效基因qBph30(t)的分子標記及其應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物分子遺傳學領域，具體涉及水稻抗褐飛虱主效基因qBph30(t)的 分子標記及其在選育水稻抗褐飛虱品種中的應用。

【背景技術】
[0002] 稻褐飛風（NilaparvatalugensStil.，簡稱BPH)屬于同翅目飛風科 (Homoptera:Delphacidae)昆蟲，是水稻種植過程中最主要的蟲害之一。它具有刺吸式口 器，直接刺穿植株的維管束韌皮部攝取汁液中的可溶性糖類、無機鹽離子和氨基酸等營養(yǎng) 物質，阻礙水稻植株正常生長，嚴重時整株死亡且顆粒無收，被稱為"飛虱火燒"；同時蟲體 做為病菌的媒介，傳播多種水稻病害，如病毒病、齒葉矮縮病和草叢矮縮病等。從20世紀 50年代開始褐飛虱對我國水稻生產為害的程度逐漸加劇，為害地域由南方水稻生產區(qū)域向 北方擴展。據(jù)中國農業(yè)年鑒統(tǒng)計數(shù)據(jù)，在1966、1969、1973、1977、1983等年份大爆發(fā)，而在 1987、1991、2003、2005、2006和2007年這幾年中我國水稻種植區(qū)發(fā)生全國性稻飛虱（主要 是褐飛虱）爆發(fā)，超過50%以上的水稻種植面積受到稻褐飛虱危害，對我國的水稻糧食生 產安全造成嚴重的威脅。
[0003]目前，使用化學殺蟲劑來控制褐飛虱危害是農業(yè)生產中最主要的防治方法，這種 方法不僅加大了水稻生產成本，并且殺死褐飛虱天敵，容易引起褐飛虱的再爆發(fā)，同時對土 地、水體等生態(tài)因素造成污染，以及生物鏈中毒性的累積和相應的人類健康問題；而利用寄 主植物的抗性基因，培育并推廣種植抗褐飛虱水稻品種是防治褐飛虱最為經濟有效和環(huán)境 友好的方法。從早期的抗褐飛虱水稻品種Mudgo開始，研究人員培育了一批抗褐飛虱的品 種（系），如IR26、IR36、IR56和IR64等，這些抗蟲品種的推廣對控制褐飛虱的危害起到了 一定效果；但是，大面積推廣抗褐飛虱水稻品種引起了褐飛虱生物型的演變，攜帶抗性基因 的水稻品種會逐步喪失對褐飛虱的抗性。在新培育品種中引入抗性更強的基因或聚合多個 抗性基因的方式可以提高水稻品種的抗性水平和延長抗性持續(xù)的時間。由此也就需要挖掘 更多新的抗褐飛虱種質資源，到2013年為止，在水稻中已報道了超過35個以上抗性位點， 其中超過28個抗褐飛虱主效基因被定位。目前分子標記輔助選擇（MAS)已經與傳統(tǒng)雜交 方法結合應用于抗褐飛虱水稻品種的培育，通過基因聚合途徑來提高水稻對褐飛虱的抗性 既可出于經濟考慮，而且在生態(tài)和進化方面可能也有很重要的價值。
[0004] 本研究利用構建的雜交后代群體，對抗源05BPH16材料進抗褐飛虱基因的定位， 獲得與抗性基因緊密連鎖的分子標記，為水稻抗蟲分子育種提供抗源及有實際應用價值的 分子標記，可以有目的地進行抗蟲基因的導入和聚合，以保證在水稻抗蟲育種中使用多樣 化的抗性資源，培育含有不同抗性基因的品種或含有多個抗性基因的品種以長期抵御不同 生物型的褐飛虱群體。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一是提供水稻抗褐飛虱主效基因qBph30(t)的一種分子標記。
[0006] 本發(fā)明的目的之二是提供上述分子標記的檢測方法。
[0007] 本發(fā)明的目的之三是提供的上述分子標記在選育抗褐飛虱水稻中的用途。
[0008] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案：
[0009] 水稻抗褐飛虱主效基因qBph30(t)的分子標記，其由下列引物對經PCR擴增獲得， 所述引物對的上游引物為SeqIDNO. 1所示的序列，所述引物對的下游引物為SeqIDN0. 2 所示的序列；
[0010] SeqIDNO. 1 ：5, -AGCCCAAATGGAACAAACAA-3J
[0011] SeqIDNO. 2 :5, -GCTCACGGTTAAGCAATGGT-3，。
[0012] 本發(fā)明還提供了所述分子標記用于篩選水稻抗褐飛虱主效基因qBph30(t)的方 法，包括步驟：以待檢測的水稻基因組DNA為模板，以權利要求1所述的引物對進行PCR 擴增，如果引物能夠擴增出247bp的基因片段，說明待檢測的水稻存在抗褐飛虱主效基因 qBph30 (t)〇
[0013] 本發(fā)明公開了所述的分子標記對在水稻輔助育種中的用途。
[0014] 另外，本發(fā)明還公開了一種篩選抗褐飛虱水稻品種的方法，其特征在于，使用權利 要求1中所述的分子標記，以待檢測的水稻基因組DNA為模板進行PCR擴增，并判斷是否能 擴增出247bp的基因片段，如果能擴增出所述247bp片段，則標志著該待檢水稻為存在抗褐 飛虱主效基因qBph30(t)的抗性水稻材料。
[0015] 作為優(yōu)選，上述方法以待檢測的水稻基因組DNA為模板進行PCR擴增后，可以通過 凝膠電泳檢測或測序的方式，判斷是否能擴增出247bp的基因片段。
[0016] 本發(fā)明具各的有益效果
[0017] 1.通過本發(fā)明首次用SSR和STS標記較精細定位了水稻品系05BPH16中攜帶的抗 褐飛虱主效基因qBph30(t)。
[0018] 2.通過本發(fā)明分子標記定位的主效基因位點位置明確，鑒定方便。通過檢測與該 基因位點連鎖的分子標記，即可以預測水稻植株的褐飛虱抗性，用于水稻品種或品系的基 因型檢測，以判斷該品種或品系是否具有褐飛虱抗性，進而快速篩選抗蟲品種或品系用于 水稻育種。
[0019] 3.輔助育種選擇目標明確，節(jié)約成本。在傳統(tǒng)抗蟲育種中，首先要收集具有抗蟲親 本與栽培品種進行一系列雜交，而且要對雜交后獲得的水稻材料進行抗褐飛虱性狀的鑒定 并進行選擇，操作復雜，同時還在很大程度上受環(huán)境的影響。此外，在進行抗蟲鑒定之前，先 要獲得蟲源并飼養(yǎng)繁殖褐飛虱群體，同時還要求接種蟲源與水稻秧苗苗齡較同步，這同樣 給育種工作帶來麻煩，若不能有效地處理好蟲源、秧苗以及環(huán)境之間的關系，抗褐飛虱的表 型鑒定結果可靠性就很低。因此，抗蟲育種不僅費時，而且難度大，成本高。然而，通過檢測 抗褐飛虱主效基因位點，可以在苗期就鑒定出高抗褐飛虱的單株，淘汰其他植株，不僅節(jié)約 生產成本而且大大提高抗褐飛虱水稻品種的選擇效率，極大地縮短抗蟲水稻品種的育種周 期。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1.水稻品系05BPH16第4染色體短臂上的抗褐飛虱主效基因qBph30 (t)與分 子標記QY14緊密連鎖關系。
[0021] 圖2.分子標記QY14在親本及雜交后代單株中的PCR擴增帶型。第1孔為抗蚊青 占，第2孔為05BPH16,第3至22點樣孔均為雜交育種后代單株。

【具體實施方式】
[0022] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和本質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0023] 以下實施例中使用的儀器、試劑、試劑盒均可由市售得到；
[0024]QY14是基于日本晴和9311基因組相應序列設計開發(fā)的一個分子標記。
[0025] 實施例1:分子標記的獲取
[0026](一）抗蚊青占/05BPH16F2群體構建及表型鑒定
[0027] (1)抗源05BPH16是來源于高抗褐飛虱的廣西普通野生稻與栽培稻雜交、回交轉 育的抗性后代材料，抗蟲鑒定實驗表明，05BPH16對取自廣西南寧市郊區(qū)水稻田的褐飛虱群 體具有高抗特性。為了尋找簡單有效且與qBph30(t)緊密連鎖的分子標記，本發(fā)明以感蟲 品種抗蚊青占為母本，以抗褐飛虱品系05BPH16為父本雜交，得到的Fi再自交，從而構建了 F2分離群體；每個F2單株通過自交獲得相應的F2:3家系。
[0028] (2)采用苗期接種對親本、F2:3家系進行抗蟲性鑒定。為確保親本和F2:3群體中 的每個家系生長一致，所有供試材料在播種前分別浸種催芽。每個家系（品種）各50粒 種子播種于一個長45cm、寬35cm、高8cm，且盛有5cm厚營養(yǎng)土的鐵質托盤中。每盤每個 材料播種2個重復，其中隨機播種親本和TN1 (感性對照）各2個重復。播種7天后，淘 汰病弱苗。待苗長到兩葉一芯期時，按8頭/苗的比例接種2-3齡褐飛虱若蟲，最后罩上 尼龍紗網。當感蟲品種TN1全部死亡時，參照Qiu等（2010，High-resolutionmapping ofthebrownplanthopperresistancegeneBph6inriceandcharacterizingits resistanceinthe9311andNipponbarenearisogenicbackgrounds.TheorAppl Genet121:1601-1611)的方法對每個單株進行0、1、3、5、7或9級的抗性評價（表1)，對親 本材料和群體的每個家系通過加權平均計算該家系的抗性級別，并根據(jù)抗性級別推測此單 株基因型。
[0029] (二）抗蚊青占/05BPH16F2群體的分子標記分析
[0030] (1)用CTAB法(Murray&Thompson, 1980Rapidisolationof high-molecular-weightplantDNA.NucleicAcidsRes8:4321-4325)提取親本及F2 群 體各單株的葉片基因組DNA。
[0031] (2)根據(jù)gramene網站（http://www.gramene.org/)公布的標記按照較均勻的 遺傳距離選擇一定數(shù)目分子標記。另外，基于該基因最后的定位區(qū)段，參考水稻品種日本 晴相應的基因組序列，利用SSR搜索工具SSRIT(http://www.gramene.org/db/markers/ ssrtool)來尋找SSR基序，并根據(jù)其側翼序列設計引物，為備選標記。其中，SSRIT設置參 數(shù)為：最大基序長度為3聚體，最小重復數(shù)為5,搜索所有的SSR基序。選擇所有大于15個 堿基（基序長度X重復數(shù)）的SSR基序，最后，基于該基因后期的定位區(qū)段，比較測序水稻 品系9311與日本晴相應的基因組序列，在兩者具有差異的區(qū)段設計STS標記用于進一步的 精細定位。
[0032] (3)SSR、STS標記的分析參照Temnykh的方法（TemnykhSetal，2〇00.Mapping and genome organization of microsatellite sequences in rice. Theor Appl Genet 100 :697-712)。反應體系組分如下：
[0033]

【權利要求】
1. 水稻抗褐飛虱主效基因qBph30(t)的分子標記，其由下列引物對經PCR擴增獲得， 所述引物對的上游引物為Seq ID NO. 1所示的序列，所述引物對的下游引物為Seq ID NO. 2 所示的序列； Seq ID NO. 1 :5' -AGCCCAAATGGAACAAACAA-3， Seq ID NO. 2 :5, -GCTCACGGTTAAGCAATGGT-3，。
2. 權利要求1所述分子標記用于篩選水稻抗褐飛虱主效基因qBph30(t)的方法，其 特征在于，包括步驟：以待檢測的水稻基因組DNA為模板，以權利要求1所述的引物對進行 PCR擴增，如果引物能夠擴增出247bp的基因片段，說明待檢測的水稻存在抗褐飛虱主效基 因 qBph30 (t)。
3. 權利要求1所述的分子標記對在水稻輔助育種中的用途。
4. 一種篩選抗褐飛虱水稻的方法，其特征在于，使用權利要求1中所述的分子標記，以 待檢測的水稻基因組DNA為模板進行PCR擴增，并判斷是否能擴增出247bp的基因片段，如 果能擴增出所述247bp片段，則標志著該待檢水稻為存在抗褐飛虱主效基因qBph30 (t)的 抗性水稻材料。
5. 按照權利要求4所述的方法，其特征在于：以待檢測的水稻基因組DNA為模板進行 PCR擴增后，可以通過凝膠電泳檢測或測序的方式，判斷是否能擴增出247bp的基因片段。
【文檔編號】C12Q1/68GK104328168SQ201410500123
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年9月26日 優(yōu)先權日:2014年9月26日
【發(fā)明者】李容柏, 邱永福, 覃寶祥, 焦曉真, 楊萌, 薛艷霞, 劉芳 申請人:廣西大學