固定化漆酶對克百威與毒死蜱污染土壤的修復(fù)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種固定化漆酶對克百威和毒死蜱污染土壤的修復(fù)方法，即將固定化漆酶分別用于克百威和毒死蜱污染的土壤進行修復(fù)，土壤采用泥漿，水土比為3:1，其中農(nóng)藥的初始濃度為100mg/L，固定化漆酶投入泥漿中的量為20g/60ml，溫度為25~45°C，pH值為5~9，每隔8h進行一次農(nóng)藥降解率的測定。本發(fā)明可以在較寬的pH、溫度及鹽濃度范圍內(nèi)處理中、高濃度的污染物，在不產(chǎn)生二次污染的情況下，使克百威或毒死蜱污染的土壤得到有效的修復(fù)。
【專利說明】固定化漆酶對克百威與毒死蜱污染土壤的修復(fù)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于環(huán)保領(lǐng)域，具體的說是采用兩種方法對漆酶進行固定化并采用固定化漆酶對克百威與毒死蜱污染土壤的修復(fù)方法。

【背景技術(shù)】
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[0002]漆酶(Iaccase)亦稱為對苯二酚氧化酶,是一種含銅的氧化還原酶,屬于氧化酶的藍銅家族，廣泛存在于植物、細菌和幾乎所有的真菌中。漆酶具有較好的底物專一性和穩(wěn)定性，可降解多環(huán)芳烴化合物(PAHs)、氯化芳香化合物、苯酚和留體類激素及其衍生物等多種化合物，另外漆酶在進行反應(yīng)時產(chǎn)生的副產(chǎn)物只有水，完全稱得上是一種“生態(tài)友善”的酶，在環(huán)保方面具有巨大的應(yīng)用價值。
[0003]與直接利用游離態(tài)漆酶相比，先將漆酶經(jīng)過物理或化學的方法固定在某一載體上再加以利用具有以下幾點優(yōu)勢:1.酶穩(wěn)定性有所提高，游離態(tài)漆酶在使用過程中易隨環(huán)境的變化而變性失活，將其固定化后可明顯提高漆酶的穩(wěn)定性；2.固定化漆酶易從反應(yīng)系統(tǒng)中分離，同時反應(yīng)也較易于控制；3.完成降解后，固定化漆酶可進行回收、重復(fù)利用；4.酶固定化后便于運輸和貯存。


【發(fā)明內(nèi)容】

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[0004]發(fā)明目的:
[0005]本發(fā)明涉及一種固定化漆酶對克百威與毒死蜱污染土壤的修復(fù)方法，其目的是采用固定化后的真菌漆酶來降解土壤中的克百威與毒死蜱，為農(nóng)藥污染土壤的修復(fù)開辟一條新的途徑。
[0006]技術(shù)方案:
[0007]一種固定化漆酶對克百威與毒死蜱污染土壤的修復(fù)方法，其特征在于:具體步驟如下:利用固定化漆酶對克百威或毒死蜱污染的土壤進行修復(fù)，土壤采用泥漿，水土比為3:1，污染物的初始濃度為100mg/L，固定化漆酶投入泥漿中的量為20g/60ml，溫度為25-45 °C，pH值為5-9，降解時間為72h。
[0008]對漆酶進行固定的一種方法如下:
[0009]將質(zhì)量濃度為3%的海藻酸鈉溶液在60°C恒溫加熱，并不斷攪拌至海藻酸鈉完全溶解為均勻的膠體，靜置至海藻酸鈉膠體完全冷卻，將海藻酸鈉膠體通過制粒器滴入裝有質(zhì)量濃度1%氯化鈣溶液的燒杯中(氯化鈣的主要作用是包裹住海藻酸鈉膠體，制得的載體表面為氯化鈣，里面為海藻酸鈉)，制成直徑為3.0mm-7.0mm的載體小球；載體小球在120r/min、25°C條件下振蕩4h后取出，使用蒸餾水反復(fù)、多次沖洗，直至氯化鈣溶液完全洗凈；隨后將載體小球放入裝有體積濃度I %戊二醛溶液的錐形瓶中，交聯(lián)6h ;取出并用蒸餾水多次洗滌小球，直至載體表面的戊二醛被完全洗凈；最后將完成交聯(lián)的載體小球移入裝有游離態(tài)漆酶的錐形瓶中，于120r/min、25°C條件下在恒溫搖床中固定化4h，取出并洗去小球表面的游離態(tài)漆酶，得到固定化漆酶。
[0010]對漆酶進行固定的另一種方法如下:
[0011]將質(zhì)量濃度為2%的海藻酸鈉溶液在60°C恒溫加熱，并不斷攪拌至海藻酸鈉完全溶解為均勻的膠體，靜置至海藻酸鈉膠體完全冷卻，隨后在海藻酸鈉膠體中加入占混合溶液質(zhì)量I %的活性炭粉末(此處指加入的活性炭質(zhì)量為混合溶液(這里忽略海藻酸鈉的質(zhì)量，計算上單指其中蒸餾水的質(zhì)量)質(zhì)量的1%，例:該種載體為0.4g海藻酸鈉加上20ml蒸餾水，混合成為膠體后再加入0.2g的活性炭，此時其中有2%的海藻酸鈉、I %的活性炭)，勻速攪拌使活性炭粉末在其中分布均勻；之后將混合的膠體通過制粒器滴入裝有質(zhì)量濃度I %氯化I丐溶液的燒杯中，制成直徑為3.0mm-7.0mm的載體小球；載體小球在120r/min、25°C條件下振蕩4h后取出，使用蒸餾水反復(fù)、多次沖洗，直至氯化鈣溶液完全洗凈；隨后將載體小球放入裝有游離態(tài)漆酶的錐形瓶中，于120r/min、25°C條件下在恒溫搖床中固定化4h，取出并洗去小球表面的游離態(tài)漆酶，即得到固定化漆酶。
[0012]優(yōu)點及效果:
[0013]本發(fā)明提出了一種固定化漆酶對克百威與毒死蜱污染土壤的修復(fù)方法，具有如下優(yōu)點:
[0014]1.成本較低:發(fā)明中采用的固定化載體材料主要有海藻酸鈉、氯化鈣、活性炭，這些材料都具有來源豐富、價格低廉等特點，另外漆酶也是自然界中廣泛存在的一種酶類，較易于獲得；
[0015]2.綠色環(huán)保:發(fā)明中所用的大部分材料都具有無毒無害、性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容以及抗微生物分解等特點，在使用中不會造成二次污染；
[0016]3.發(fā)明中固定化漆酶的制備或農(nóng)藥的降解都可在正常條件下進行，同時操作也較簡便，因而可進行大范圍的推廣。
[0017]將兩種固定化漆酶應(yīng)用于克百威與毒死蜱的降解工作中，利用高效液相色譜法測定農(nóng)藥的降解率，得出兩種固定化漆酶對克百威或毒死蜱都具有較好的降解效果。

【具體實施方式】
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[0018]一種固定化漆酶對克百威和毒死蜱污染土壤的修復(fù)方法，其特征在于:具體方法步驟如下:利用固定化漆酶對克百威或毒死蜱污染的土壤進行修復(fù)，土壤采用泥漿，水土比為3:1，污染物的初始濃度為100mg/L，固定化漆酶投入泥漿中的量為20g/60ml，溫度為25-45°C，pH值為5-9，降解時間為72h，每隔8h進行一次農(nóng)藥降解率的測定。
[0019]本發(fā)明同時以農(nóng)藥空白、載體空白和游離態(tài)漆酶作為對照?？紤]到固定化漆酶在環(huán)境中應(yīng)用時會受到一些環(huán)境影響因子的影響，故對其進行了一定的研究，首先考察不同溫度(25°C、35°C和45°C)對固定化漆酶降解農(nóng)藥的影響，其次檢驗不同的pH值對降解過程的影響，其中設(shè)定的PH分別為5、7和9，每隔8h進行一次農(nóng)藥降解率的測定。
[0020]第一種對漆酶的固定化方法采用了海藻酸鈉為主要載體材料，具體操作如下:
[0021]準確稱取0.6g海藻酸鈉、Ig氯化鈣分別于100ml、500ml的燒杯中，向其中再分別加入20ml、99ml的蒸餾水。在60°C左右恒溫加熱海藻酸鈉溶液，并不斷攪拌至海藻酸鈉完全溶解為均勻的膠體，靜置一段時間。將冷卻完全的海藻酸鈉膠體通過制粒器滴入裝有氯化隹丐溶液的500ml燒杯中，制成直徑為4.0mm的載體小球。小球在120r/min、25°C條件下振蕩4h后取出，使用蒸餾水反復(fù)、多次沖洗，直至氯化鈣溶液完全洗凈。隨后將載體小球放入裝有1%戊二醛溶液的250ml錐形瓶中，交聯(lián)6h。取出并用蒸餾水多次洗滌小球，直至載體表面的戊二醛被完全洗凈。最后將完成交聯(lián)的載體小球移入裝有游離態(tài)漆酶的250ml錐形瓶中，于120r/min、25°C條件下在恒溫搖床中固定化4h，取出并洗去小球表面的游離態(tài)漆酶，制備完成后固定化漆酶可放入冰箱中冷減備用。
[0022]第二種對漆酶的固定化方法采用了海藻酸鈉、活性炭粉末為主要的載體材料，具體操作如下:
[0023]準確稱取0.4g海藻酸鈉、Ig氯化鈣分別于100ml、500ml的燒杯中，向其中再分別加入20ml、99ml的蒸餾水，另外再稱取0.4g的活性炭粉末備用。在60°C左右恒溫加熱海藻酸鈉溶液，并不斷攪拌至海藻酸鈉完全溶解為均勻的膠體，靜置一段時間。在冷卻完全的海藻酸鈉膠體中加入準備好的活性炭粉末，勻速攪拌使活性炭粉末在其中分布均勻。之后將混合的膠體通過制粒器滴入裝有氯化I丐溶液的500ml燒杯中，制成直徑為4.0mm的載體小球。小球在120r/min、25°C條件下振蕩4h后取出，使用蒸餾水反復(fù)、多次沖洗，直至氯化鈣溶液完全洗凈。隨后將載體小球放入裝有游離態(tài)漆酶的250ml錐形瓶中，于120r/min、25°C條件下在恒溫搖床中固定化4h，取出并洗去小球表面的游離態(tài)漆酶，制備完成后固定化漆酶可放入冰箱中冷藏備用。
[0024]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明，但本發(fā)明的保護范圍不受實施例的限制。
[0025]實施例1:
[0026]在相同溫度、pH和振蕩速度的條件下，將兩種固定化漆酶、游離態(tài)漆酶分別放入含有100mg/L克百威與毒死蜱的泥漿中，每隔8h測定一次兩種固定化漆酶以及游離態(tài)漆酶對克百威和毒死蜱的降解率，72h后得出固定化漆酶或游離態(tài)漆酶對兩種農(nóng)藥都具有一定的降解效果，且前48h內(nèi)的降解速率要快一些，同時隨著降解時間的增加固定化漆酶的降解效果明顯要優(yōu)于游離態(tài)漆酶。這初步說明，從降解率的角度來看，本發(fā)明中的漆酶用于修復(fù)克百威或毒死蝶污染的土壤是可行的。
[0027]表I固定化漆酶、游離態(tài)漆酶對兩種農(nóng)藥的降解率比較
[0028]
第一種固定化漆酶第二種固定化漆酶游離態(tài)漆酶降解率_降解率(％)_降解率(％)_(%)_克百威毒死蜱克百威毒死蜱克百威毒死蜱
"24-- 43.08 35.29 48.43 42Λ\ 47.59 38^61 ~ 48h 62.00 55.38 70.91 65.23 52.33 48.74 72h 74.19 70.61 81.27 75.50 57.04 55.18
[0029]實施例2:
[0030]設(shè)置反應(yīng)降解時的溫度為35°C，pH為5.0、7.0、9.0，將兩種固定化漆酶分別投入含有100mg/L克百威或毒死蜱的泥漿中，在120r/min的條件下振蕩，每隔8h測定一次農(nóng)藥的降解率，72h后兩種固定化漆酶對于克百威或毒死蜱的降解率都可達到60%以上，同時兩種固定化漆酶都在pH為5.0時對農(nóng)藥具有較好的降解效果。另外由于活性炭的吸附作用，第二種固定化漆酶的降解效果要略優(yōu)于第一種固定化漆酶對農(nóng)藥的降解效果。
[0031]表2不同pH值下固定化漆酶降解農(nóng)藥的相關(guān)參數(shù)
[0032]
固定化漆酶對農(nóng)藥的降解率(％)—
pH克百威毒死蜱
583.2779.66
方法^'
778.6376.84
970.8268.25
591.4087.31
卞并一.一785.6981.57
976.9472.63
[0033]實施例3:
[0034]設(shè)置反應(yīng)降解時的pH為5.0，溫度為25°C、35°C、45°C，將兩種固定化漆酶分別投入含有100mg/L克百威或毒死蜱的泥漿中，在120r/min的條件下振蕩，每隔8h測定一次農(nóng)藥的降解率，72h后兩種固定化漆酶對于克百威或毒死蜱的降解率同樣都可達到70%以上，而當溫度為35°C時，固定化漆酶對克百威或毒死蜱的降解率達到了最高值，第一種固定化漆酶對克百威的降解率為83.27%，對毒死蜱的降解率為79.66%，第二種固定化漆酶對克百威的降解率為91.40%。對毒死蜱的降解率為87.31%。
[0035]實施例4:
[0036]準確稱取0.6g海藻酸鈉、Ig氯化鈣分別于100ml、500ml的燒杯中，向其中再分別加入20ml、99ml的蒸餾水。在60°C恒溫加熱海藻酸鈉溶液，并不斷攪拌至海藻酸鈉完全溶解為均勻的膠體，靜置一段時間。將冷卻完全的海藻酸鈉膠體通過制粒器滴入裝有氯化鈣溶液的500ml燒杯中，制成直徑為4.0mm的載體小球。小球在120r/min、25°C條件下振蕩4h后取出，使用蒸餾水反復(fù)、多次沖洗，直至氯化鈣溶液完全洗凈。隨后載體小球移入裝有游離態(tài)漆酶的250ml錐形瓶中，于120r/min、25°C條件下在恒溫搖床中固定化4h，取出并洗去小球表面的游離態(tài)漆酶，放入冰箱中冷藏備用。取20g固定化漆酶小球放入含有10mg/L克百威或毒死蜱的泥漿中，調(diào)節(jié)pH為5.0，溫度為35°C，每隔8h測定一次農(nóng)藥的降解率，得出固定化漆酶在最初的48h內(nèi)降解速率較快，72h后克百威與毒死蜱的降解率可分別到達 85.31%和 80.49%。
[0037]實施例5:
[0038]準確稱取0.4g海藻酸鈉、Ig氯化鈣分別于100ml、500ml的燒杯中，向其中再分別加入20ml、99ml的蒸餾水，另外再稱取0.2g的活性炭粉末備用。在60°C恒溫加熱海藻酸鈉溶液，并不斷攪拌至海藻酸鈉完全溶解為均勻的膠體，靜置一段時間。在冷卻完全的海藻酸鈉膠體中加入準備好的活性炭粉末，勻速攪拌使活性炭粉末在其中分布均勻。之后將混合的膠體通過制粒器滴入裝有氯化鈣溶液的500ml燒杯中，制成直徑為4.0mm的載體小球。小球在120r/min、25°C條件下振蕩4h后取出，使用蒸餾水反復(fù)、多次沖洗，直至氯化鈣溶液完全洗凈。隨后將載體小球放入裝有游離態(tài)漆酶的250ml錐形瓶中，于120r/min、25°C條件下在恒溫搖床中固定化4h，取出并洗去小球表面的游離態(tài)漆酶，放入冰箱中冷藏備用。取20g固定化漆酶小球放入含有100mg/L克百威或毒死蜱的土壤泥漿中，調(diào)節(jié)pH為5.0，溫度為35°C，每隔8h測定一次農(nóng)藥的降解率，得出固定化漆酶在最初的48h內(nèi)降解速率較快，72h后克百威與毒死蜱的降解率可分別到達89.72%和85.64%。
[0039]實施例6:
[0040]將混合的膠體通過制粒器滴入裝有氯化鈣溶液的燒杯中，制成直徑為3.0mm的載體小球，其他條件同實施例4。
[0041]實施例7:
[0042]將混合的膠體通過制粒器滴入裝有氯化鈣溶液的燒杯中，制成直徑為7.0mm的載體小球，其他條件同實施例5。
[0043]結(jié)論:采用本發(fā)明中的固定化漆酶分別對克百威與毒死蜱污染的土壤進行修復(fù)，通過農(nóng)藥降解率的測定可知該發(fā)明可有效的修復(fù)有機污染土壤。
【權(quán)利要求】
1.一種固定化漆酶對克百威與毒死蜱污染土壤的修復(fù)方法，其特征在于:具體步驟如下:利用固定化漆酶對克百威或毒死蜱污染的土壤進行修復(fù)，土壤采用泥漿，水土比為3:1，污染物的初始濃度為100mg/L，固定化漆酶投入泥漿中的量為20g/60ml，溫度為25-45 °C，pH值為5-9，降解時間為72h。
2.按權(quán)利要求1所述的固定化漆酶對克百威與毒死蜱污染土壤的修復(fù)方法，其特征在于:對漆酶進行固定的方法如下: 將質(zhì)量濃度為3%的海藻酸鈉溶液在60°C恒溫加熱，并不斷攪拌至海藻酸鈉完全溶解為均勻的膠體，靜置至海藻酸鈉膠體完全冷卻，將海藻酸鈉膠體通過制粒器滴入裝有質(zhì)量濃度1%氯化鈣溶液的燒杯中，制成直徑為3.0mm-7.0mm的載體小球；載體小球在120r/min、25°C條件下振蕩4h后取出，使用蒸餾水反復(fù)、多次沖洗，直至氯化鈣溶液完全洗凈；隨后將載體小球放入裝有體積濃度1%戊二醛溶液的錐形瓶中，交聯(lián)6h ;取出并用蒸餾水多次洗滌小球，直至載體表面的戊二醛被完全洗凈；最后將完成交聯(lián)的載體小球移入裝有游離態(tài)漆酶的錐形瓶中，于120r/min、25°C條件下在恒溫搖床中固定化4h,取出并洗去小球表面的游離態(tài)漆酶，得到固定化漆酶。
3.按權(quán)利要求1所述的固定化漆酶對克百威與毒死蜱污染土壤的修復(fù)方法，其特征在于:對漆酶進行固定的方法如下: 將質(zhì)量濃度為2%的海藻酸鈉溶液在60°C恒溫加熱，并不斷攪拌至海藻酸鈉完全溶解為均勻的膠體，靜置至海藻酸鈉膠體完全冷卻，隨后在海藻酸鈉膠體中加入占混合溶液質(zhì)量1%的活性炭粉末，勻速攪拌使活性炭粉末在其中分布均勻；之后將混合的膠體通過制粒器滴入裝有質(zhì)量濃度1%氯化鈣溶液的燒杯中，制成直徑為3.0mm-7.0mm的載體小球；載體小球在120r/min、25°C條件下振蕩4h后取出，使用蒸餾水反復(fù)、多次沖洗，直至氯化鈣溶液完全洗凈；隨后將載體小球放入裝有游離態(tài)漆酶的錐形瓶中，于120r/min、25°C條件下在恒溫搖床中固定化4h，取出并洗去小球表面的游離態(tài)漆酶，即得到固定化漆酶。
【文檔編號】C12N11/10GK104209316SQ201410500072
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月25日
【發(fā)明者】王新, 劉麗, 崔麗, 梁吉艷, 鮑佳 申請人:沈陽工業(yè)大學