雞蛋清溶菌酶及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種雞蛋清溶菌酶及其制備方法，所述雞蛋清溶菌酶的蛋白活性的多肽氨基酸編碼序列為序列表400<1>所示序列，制備方法包括：(1)獲取雞蛋清溶菌酶基因；(2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建；(3)基因工程菌株的構(gòu)建；(4)基因工程重組雞蛋清溶菌酶生產(chǎn)方法；所述雞蛋清溶菌酶具有穩(wěn)定、純凈、生物活性高的特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于制藥、飼料等多個(gè)領(lǐng)域，其制備方法將基因工程菌株作用于發(fā)酵合成溶菌酶，所構(gòu)建的工程菌株能大量增加酶基因的拷貝數(shù)，提高酶的表達(dá)量，從而實(shí)現(xiàn)雞蛋清溶菌酶的高效合成，不受原材料來(lái)源的限制。
【專(zhuān)利說(shuō)明】雞蛋清溶菌酶及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是雞蛋清溶菌酶及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 溶菌酶（lysozyme)首先是從尼科遼（Nicolle) 1907年發(fā)表枯草芽孢桿菌溶解因 子的報(bào)告開(kāi)始的。兩年后，拉希琴科（Laschtscbenko)指出，雞蛋清有強(qiáng)抑菌作用，是酶作 用的結(jié)果。1922年，弗來(lái)明（Fleming)發(fā)現(xiàn)人的鼻涕、唾液、眼淚也有強(qiáng)力的溶菌活性，因其 具有溶菌作用，被命名為溶菌酶。溶菌酶廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，是一種天然的 抗菌劑，能特異性地作用于細(xì)胞壁N-乙酰葡萄糖胺（N-acetylglucosamine，NAG)和N-乙 酰胞壁酸（N-acetylmuramic acid，NAM)之間的β-1，4糖苷鍵，破壞肽聚糖支架，使微生物 細(xì)胞在內(nèi)部滲透壓的作用下漲裂，細(xì)胞質(zhì)外泄，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。溶菌酶的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn) 定，在pH值4-7范圍內(nèi)，KKTC處理Imin仍能保持原酶活性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和部分革蘭氏 陰性菌有很好的抑菌作用，對(duì)人和動(dòng)物的細(xì)胞則不發(fā)生溶菌作用，被WHO和許多國(guó)家認(rèn)定 為無(wú)毒、無(wú)害、安全的添加劑，被越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、生物技術(shù)、食品以及動(dòng)物生產(chǎn) 中。
[0003] 根據(jù)溶菌酶氨基酸序列和底物的差異，可以將溶菌酶大致分為3種類(lèi)型：c型（雞 蛋清溶菌酶）、g型（鵝蛋清溶菌酶）和噬菌體溶菌酶。迄今為止，生產(chǎn)上應(yīng)用最多的是雞 蛋清溶菌酶（hen egg white Isozyme)。雞蛋清中溶菌酶的含量很豐富，約占蛋清總蛋白的 3.4% -3. 5%，作為溶菌酶類(lèi)的典型代表，是結(jié)構(gòu)了解最清楚的溶菌酶之一。它含有129個(gè) 氨基酸，分子量約為14, 300Da，雞蛋清溶菌酶具有的廣譜抗性使其在食品和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域早 已得到廣泛地應(yīng)用。溶菌酶制劑能有效防止球蟲(chóng)病，飼喂小麥基礎(chǔ)日糧的雞，添加和不添加 酶對(duì)球蟲(chóng)病的應(yīng)激呈現(xiàn)不同的反應(yīng)，對(duì)照組雞生長(zhǎng)被抑制52. 5%，而加酶組為30. 5%，而 且損傷系數(shù)要好得多。此外，溶菌酶還能改變腸道微生物群，增加腸道有益菌，使腸道內(nèi)的 胺、甲酚等有害物減少，增加機(jī)體抗病力，提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能。在不用任何抗生素情況下， 于肉雞飼料中添加飼用溶菌酶制劑，可促進(jìn)雞體的健康，增加體重和飼料報(bào)酬，減少死亡。 飼用溶菌酶可以促進(jìn)飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收，提高飼料的消化率，最大限度地提高飼 料原料的利用率。
[0004] 目前，我國(guó)主要采用蛋廠雞蛋殼中殘留的雞蛋清為原料來(lái)生產(chǎn)雞蛋清溶菌酶，其 中相關(guān)的報(bào)道很多，有直接結(jié)晶法、親和色譜法、離子交換法、沉淀法、雙水相萃取、超濾法 等。各種方法優(yōu)缺點(diǎn)不一，產(chǎn)品的質(zhì)量和生產(chǎn)成本也有所不同。沉淀法是一種工業(yè)上應(yīng)用 比較成熟的提取方法，其在技術(shù)要求和生產(chǎn)成本上都比較好。但自雞蛋清中提取溶菌酶存 在著生產(chǎn)成本高、生產(chǎn)工藝復(fù)雜、生產(chǎn)規(guī)模受限制等問(wèn)題，難于滿足越來(lái)越大的市場(chǎng)需求， 因此尋找其他廉價(jià)的生產(chǎn)雞蛋清溶菌酶的途徑是非常有意義的，近年來(lái)人們正研究利用分 子生物技術(shù)構(gòu)建基因工程菌，通過(guò)發(fā)酵手段生產(chǎn)溶菌酶，將是提高溶菌酶產(chǎn)量，降低成本 的有效手段之一。
[0005] 雞蛋清溶菌酶應(yīng)用抗病基因工程研究最早起始于上世紀(jì)90年代初，1992年， Trudel等將雞蛋清溶菌酶基因首次導(dǎo)入煙草并隨后檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因植株有溶菌酶活性。2000 年，Carolina等通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將雞蛋清溶菌酶基因?qū)氲今R鈴薯中，結(jié)果表明14-20 株轉(zhuǎn)基因植株對(duì)細(xì)菌性軟腐病的抗性增強(qiáng)。2007年，劉興敏等人根據(jù)T4噬菌體溶菌酶的 氨基酸序列，選用植物偏愛(ài)的密碼子設(shè)計(jì)并人工合成了溶菌酶基因，導(dǎo)入宿主細(xì)菌E. coli BL21 (DE3)pLysS，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，宿主菌在2h內(nèi)全部被溶菌酶基因的表達(dá)產(chǎn)物裂解，說(shuō)明 該溶菌酶基因?qū)?xì)菌具有很強(qiáng)的抗性。2008年，李斌等將雞蛋清溶菌酶基因 LYZ插入表達(dá) 載體pET15b，獲取大量高純度雞蛋清溶菌酶，其純度達(dá)90%以上，為利用大腸桿菌系統(tǒng)規(guī) ?；a(chǎn)重組雞蛋清溶菌酶奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
[0006] 而當(dāng)今動(dòng)物疾病盛行，抗生素在預(yù)防治療畜禽疾病起到了不可磨滅的作用，但考 慮到其相關(guān)副作用，人們不得不去尋求一種安全、高效的飼用抗生素替代品，這已成為本世 紀(jì)畜牧工作者面臨的迫切問(wèn)題。早己應(yīng)用與醫(yī)療、食品等行業(yè)的溶菌酶引起了飼料行業(yè)的 注意。然而當(dāng)前商品化溶菌酶多為雞蛋清提取，較高的成本限制了其在畜禽養(yǎng)殖和飼料工 業(yè)中的應(yīng)用。國(guó)內(nèi)一些企業(yè)抓住時(shí)機(jī)，通過(guò)生物技術(shù)已工業(yè)化生產(chǎn)出大量溶菌酶，且成本較 低。由于溶菌酶是初次應(yīng)用于該行業(yè)，目前市場(chǎng)畜禽應(yīng)用溶菌酶的報(bào)道極少，因而對(duì)這種新 的產(chǎn)品在市場(chǎng)推廣應(yīng)用之前，飼料行業(yè)急需在畜禽中的應(yīng)用效果評(píng)價(jià)的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn) 正是基于此目的，對(duì)溶菌酶在肉雞中的應(yīng)用作一有效性評(píng)價(jià)，探討其作為安全添加劑替代 抗生素應(yīng)用可能性，具有廣泛的社會(huì)意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種雞蛋清溶菌酶。
[0008] 本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問(wèn)題在于提供上述雞蛋清溶菌酶的制備方法。
[0009] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0010] 一種雞蛋清溶菌酶，其蛋白活性的多肽氨基酸編碼序列為序列表400〈1>所示序 列，具體為：
[0011] KVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAAKFESNFNTQATNRNTDGSTDYGILQINSRWWCNDGRT PGSRNLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKIVSXGNGMNAWVAWRNRCKGTDVQAWIRGCRLo
[0012] 上述雞蛋清溶菌酶的制備方法，具體構(gòu)建步驟如下：
[0013] (1)獲取雞蛋清溶菌酶基因：根據(jù)Gene Bank中已發(fā)表的編碼具有雞蛋清溶菌酶 蛋白活性的多肽氨基酸序列，合成了雞蛋清溶菌酶的cDNA序列，并根據(jù)大腸桿菌表達(dá)宿主 進(jìn)行密碼子的優(yōu)化，所得多肽氨基酸序列為序列表400〈1>所示序列；
[0014] (2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建：用酶切連接的方法分別將上述雞蛋清溶菌酶基因與載體 pET-28a相連，得到攜帶雞蛋清溶菌酶基因的重組表達(dá)載體pET28a (+) /LYZ，并進(jìn)行雙酶切 驗(yàn)證；
[0015] (3)基因工程菌株的構(gòu)建：將上述驗(yàn)證正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌株 BL21(DE3)中，得到含有重組質(zhì)粒的基因工程菌株；
[0016] (4)基因工程重組雞蛋清溶菌酶生產(chǎn)方法：通過(guò)在發(fā)酵條件下使工程菌株在IPTG 的誘導(dǎo)下大量合成雞蛋清溶菌酶，經(jīng)提取、純化后制成溶菌酶產(chǎn)品。
[0017] 優(yōu)選的，上述雞蛋清溶菌酶的制備方法，所述步驟（2)中所用的原核表達(dá)載體是 大腸桿菌表達(dá)載體pET_28a，構(gòu)建載體宿主細(xì)胞是大腸桿菌DH5 α菌株，表達(dá)宿主細(xì)胞是大 腸桿菌BL21(DE3)菌株。
[0018] 優(yōu)選的，上述雞蛋清溶菌酶的制備方法，所述步驟（4)中重組溶菌酶的生產(chǎn)工藝 為：重組工程菌E. Co I i BL21 (DE3) /pET28a (+) /LYZ接種于LB培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為 37°C，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min條件下，培養(yǎng)至菌液OD值為0. 4?0. 6時(shí)，取出ImL菌液作為對(duì) 照，剩下的部分加入IPTG(終濃度為0. 5?2mM/mL)進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間為4?6小時(shí)，誘 導(dǎo)結(jié)束后12000r/min離心2?5min收集菌體，并將誘導(dǎo)前后的菌體煮沸后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，檢測(cè)溶菌酶蛋白的表達(dá)，之后將獲得的菌體經(jīng)裂解、變性、復(fù)性等純化提取后制成溶 菌酶產(chǎn)品，再利用SDS-PAGE電泳檢測(cè)溶菌酶的純化效果。
[0019] 優(yōu)選的，上述雞蛋清溶菌酶的制備方法，所述LB培養(yǎng)基的成分為蛋白胨10g/L、酵 母粉5g/L、氯化鈉10g/L，通過(guò)常規(guī)方法制備而成。
[0020] 本發(fā)明的有益效果：
[0021] 上述雞蛋清溶菌酶，具有穩(wěn)定、純凈、生物活性高的特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于制藥、飼料 等多個(gè)領(lǐng)域，其制備方法以大腸桿菌為基礎(chǔ)，運(yùn)用基因工程重組技術(shù)構(gòu)建基因工程菌株，應(yīng) 用基因合成獲得相關(guān)酶基因，并應(yīng)用分子生物學(xué)制藥技術(shù)，將基因工程菌株作用于發(fā)酵合 成溶菌酶，所構(gòu)建的工程菌株能大量增加酶基因的拷貝數(shù)，提高酶的表達(dá)量，從而實(shí)現(xiàn)雞蛋 清溶菌酶的高效合成，不受原材料來(lái)源的限制，為實(shí)現(xiàn)大批量、低價(jià)、工業(yè)化生產(chǎn)雞蛋清溶 菌酶提供了一條可行途徑。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為本發(fā)明的載體構(gòu)建示意圖；
[0023] 圖2為本發(fā)明pET28a(+)/LYZ重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證電泳圖，其中：
[0024] M 為 DNA marker ; 1-2 為 pET28a (+) /LYZ/BamHI/Hind III ;
[0025] 圖3為本發(fā)明的重組菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)/LYZ的蛋白表達(dá)電泳圖，其 中：
[0026] 泳道M為低分子量蛋白Marker ;泳道1為誘導(dǎo)前全菌裂解液；泳道2-4為誘導(dǎo)后 全菌裂解液；
[0027] 圖4為本發(fā)明的重組溶菌酶蛋白純化后的SDS-PAGE電泳圖，其中：
[0028] 泳道M為低分子量蛋白Marker ;泳道1、2為包涵體純化后的溶菌酶蛋白；
[0029] 圖5為本發(fā)明溶菌酶的殺菌效應(yīng)圖，其中：
[0030] 3、4為添加 PBS緩沖液的陰性對(duì)照，5為溶菌酶標(biāo)品的陽(yáng)性對(duì)照，6為本發(fā)明溶菌酶 產(chǎn)生的抑菌圈。

【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所述技術(shù)方案作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0032] 實(shí)施例1
[0033] -種雞蛋清溶菌酶的制備方法，利用基因合成技術(shù)獲得雞蛋清溶菌酶的cDNA 序列，應(yīng)用E. coli表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)雞蛋清溶菌酶Iyz基因進(jìn)行高效表達(dá)，構(gòu)建包含目的基 因 Iyz的重組大腸桿菌，在IPTG的誘導(dǎo)下進(jìn)行發(fā)酵合成，最后通過(guò)提取、純化獲得雞蛋 清溶菌酶的方法。本發(fā)明所用的目的基因是根據(jù)NCBI公布的雞蛋清溶菌酶蛋白序列 (ACCESSIONNUMBER:GI345100466)合成的，本發(fā)明中重組載體的的宿主細(xì)胞為大腸桿菌 BL21 (DE3)。所構(gòu)建的重組表達(dá)載體不僅包括編碼酶的DNA序列，還具有表達(dá)該基因所需的 控制兀件。
[0034] 具體構(gòu)建方法的步驟如下：
[0035] 1、雞蛋清溶菌酶Iyz基因的合成
[0036] 根據(jù)NCBI公布的雞蛋清溶菌酶蛋白序列（ACCESSION NUMBER:GI345100466)，按 照大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性重新優(yōu)化序列，替換稀有密碼子，調(diào)節(jié)AT含量，使其可在大腸桿 菌BL21 (DE3)中高效表達(dá)，然后將該優(yōu)化的基因序列交給上海英濰捷基公司合成，合成后 的序列克隆至PMD18-T載體。
[0037] 2、重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0038] (1)表達(dá)載體的制備：
[0039] 在卡那霉素（50 μ g/mL)的LB培養(yǎng)基中接種攜帶質(zhì)粒pET_28a的大腸桿菌DH5 α 菌株（購(gòu)自寶生物公司），于37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將I. 5mL菌液轉(zhuǎn)入微量離心管中，12000r/ min,離心30s收集菌體，棄上清，控干殘液。將沉淀重懸于100 μ L預(yù)冷的溶液I (50mmol鹿 糖，25mmol Tris，10mmol EDTA，pH8.0)，混合均勻。加入 200yL 新配置的溶液 2(0.2mol NaOH，1 % SDS)蓋緊管口，輕輕搖勻，放置冰上l-2min至液體清亮。加入150 μ L預(yù)冷的溶 液3 (3mol乙酸甲，ρΗ4. 8)輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，使溶液3在粘稠的細(xì)菌裂解液中混合均勻，冰浴 3_5min，12000r/min，離心5min，將上清轉(zhuǎn)移到另一管中，12000r/min鐘，離心5min，再將上 清移到另一離心管中。加入2-2. 5倍體積的無(wú)水乙醇，混勻，冰浴（或-20°C )放置30min。 12000r/min，離心5min，收集質(zhì)粒DNA沉淀。用70 %乙醇洗滌沉淀2-3次，棄去殘液，空氣 中干燥10-20min，用20 μ L的雙蒸水溶解沉淀。
[0040] 所獲得的pET-28a即可用作連接酶基因的載體，載體構(gòu)建示意圖如圖1所示。
[0041] (2)重組表達(dá)載體的構(gòu)建：
[0042] ①將合成得到的含有雞蛋清溶菌酶Iyz基因的菌株活化，利用小提試劑盒提取 DH5 a /pMD18-T-LYZ的質(zhì)粒，pMD18-T-LYZ和pET-28a(+)質(zhì)粒分別用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶 進(jìn)行雙酶切，然后電泳、切膠回收酶切后的質(zhì)粒和目的基因，均選用50yL酶切體系：
[0043] a.

【權(quán)利要求】
1. 一種雞蛋清溶菌酶，其特征在于：其蛋白活性的多肽氨基酸編碼序列為序列表 400〈1>所示序列，具體為： KVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAAKFESNFNTQATNRNTDGSTDYGILQINSRWWCNDGRTPGSR NLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKIVSXGNGMNAWVAWRNRCKGTDVQAWIRGCRLo
2. 權(quán)利要求1所述的雞蛋清溶菌酶的制備方法，其特征在于：具體構(gòu)建步驟如下： (1) 獲取雞蛋清溶菌酶基因：根據(jù)Gene Bank中已發(fā)表的編碼具有雞蛋清溶菌酶蛋白 活性的多肽氨基酸序列，合成了雞蛋清溶菌酶的cDNA序列，并根據(jù)大腸桿菌表達(dá)宿主進(jìn)行 密碼子的優(yōu)化，所得多肽氨基酸序列為序列表400〈1>所示序列； (2) 重組質(zhì)粒的構(gòu)建：用酶切連接的方法分別將上述雞蛋清溶菌酶基因與載體 pET-28a相連，得到攜帶雞蛋清溶菌酶基因的重組表達(dá)載體pET28a (+) /LYZ，并進(jìn)行雙酶切 驗(yàn)證； (3) 基因工程菌株的構(gòu)建：將上述驗(yàn)證正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌株BL21(DE3) 中，得到含有重組質(zhì)粒的基因工程菌株； (4) 基因工程重組雞蛋清溶菌酶生產(chǎn)方法：通過(guò)在發(fā)酵條件下使工程菌株在IPTG的誘 導(dǎo)下大量合成雞蛋清溶菌酶，經(jīng)提取、純化后制成溶菌酶產(chǎn)品。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的雞蛋清溶菌酶的制備方法，其特征在于：所述步驟（2)中所 用的原核表達(dá)載體是大腸桿菌表達(dá)載體pET_28a，構(gòu)建載體宿主細(xì)胞是大腸桿菌DH5 α菌 株，表達(dá)宿主細(xì)胞是大腸桿菌BL21(DE3)菌株。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的雞蛋清溶菌酶的制備方法，其特征在于：所述步驟（4)中重 組溶菌酶的生產(chǎn)工藝為：重組工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET28a(+)/LYZ接種于LB培養(yǎng)基 中，在培養(yǎng)溫度為37°C，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min條件下，培養(yǎng)至菌液0D值為0. 4?0. 6時(shí)，取 出lmL菌液作為對(duì)照，剩下的部分加入終濃度為0. 5?2mM/mL的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間 為4?6小時(shí)，誘導(dǎo)結(jié)束后12000r/min離心2?5min收集菌體，并將誘導(dǎo)前后的菌體煮沸 后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測(cè)溶菌酶蛋白的表達(dá)，之后將獲得的菌體經(jīng)裂解、變性、復(fù)性等純 化提取后制成溶菌酶產(chǎn)品，再利用SDS-PAGE電泳檢測(cè)溶菌酶的純化效果。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的雞蛋清溶菌酶的制備方法，其特征在于：所述LB培養(yǎng)基的成 分為蛋白胨l〇g/L、酵母粉5g/L、氯化鈉10g/L，通過(guò)常規(guī)方法制備而成。
【文檔編號(hào)】C12N9/36GK104263709SQ201410500154
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月26日
【發(fā)明者】王連民, 劉珂飛, 荊瑋 申請(qǐng)人:天津生機(jī)集團(tuán)股份有限公司