專利名稱：能增強溶菌酶溶菌活性的蛋白質和小分子多肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及能夠與溶菌酶結合并促進溶菌酶活性的TRAP蛋白和一組同源多肽分子。
背景技術：
眾所周知，溶菌酶能夠通過破壞細菌表面的細胞壁而殺死細胞。已經(jīng)有多種來源的溶菌酶被應用于臨床研究。但是目前還沒有有關其功能激活劑的研究報道。TRAP蛋白是金葡菌表面蛋白，其主要生物學功能是參與金葡菌毒素調控，隨著TRAP蛋白磷酸化水平的升高，金葡菌的外毒素水平上調(Balaban，N.et alAutoinducer of virulence as a target for vaccine and theraphy against Staphylococcusaureus.Science 280，438-440(1995)；Balaban，N.，Goldkorn，T.，Gov，Y.，Hirshberg，M.，Koyfman，N.，Matthews，H.R.，Nhan，R.T.，Singh，B.，and Uziel，O.(2001)J.Biol.Chem.276，2658-2667；Novick RP，Ross HF，Projan SJ，Kornblum J，Kreiswirth B，andMoghazeh S.(1993)EMBO J.12，3967-3975；Gov Y，Borovok I，Korem M，SinghVK，Jayaswal RK，Wilkinson BJ，RichSM，and Balaban N.(2004)J Biol Chem.27914665-72)。研究表明阻斷RAP和TRAP這一信號傳導通路可以降低金葡菌外毒素的分泌，同時我們在實驗中發(fā)現(xiàn)TRAP蛋白的C末端可以成為有效的肽疫苗來保護機體抵抗金葡菌引起的感染(Yang，G.，Cheng，H.C.，Liu，C.，Xue，Y.N.，Gao，Y.P.，Liu，N.L，Gao，B.，Wang，D.P.，Li，S.R.，Shen，B.F.and Shao，N.S(2003)Peptides 24，1823-1828；Yang G，Gao YP，Dong J，Liu C，Xue NN，F(xiàn)an M，Shen BF，Shao NS.(2005)J Biol Chem.28027431-27435)。目前尚未關于TRAP蛋白其它功能的研究報道。我們研究發(fā)現(xiàn)，TRAP蛋白及其C末端同源小分子多肽能夠與溶菌酶結合并促進溶菌酶溶菌活性。

發(fā)明內容
1.TRAP蛋白能夠與溶菌酶結合并促進溶菌酶溶菌活性我們通過ELISA的實驗方法發(fā)現(xiàn)TRAP蛋白能夠與溶菌酶相互結合，并通過溶菌酶體外活性測定試劑盒證明TRAP蛋白與溶菌酶一起孵育能夠增強溶菌酶的溶菌活性。
2.一組能夠與溶菌酶結合并增強溶菌酶溶菌活性的TRAP蛋白C末端同源小分子多肽我們選擇三個序列高度保守能夠模擬TRAP蛋白抗原表位的活性短肽(邵寧生等(2003)中國專利申請?zhí)?3150203.2)，通過溶菌酶體外活性測定試劑盒檢測TRAP蛋白對溶菌酶活性激活作用，結果發(fā)現(xiàn)該三種小分子多肽能夠增強溶菌酶的溶菌活性。


附圖1a包被TRAP蛋白，用溶菌酶抗體檢測溶菌酶和TRAP蛋白的結合。
其中1為包被TRAP蛋白孔的測定結果；2為未包被TRAP蛋白孔的測定結果。
圖1b包被溶菌酶，用TRAP蛋白抗體檢測溶菌酶和TRAP蛋白的結合。
其中1為包被溶菌酶孔的測定結果；2為未包被溶菌酶蛋白孔的測定結果。
圖2不同濃度的TRAP蛋白對溶菌酶溶菌活性的增強作用?？v坐標為細菌溶液的透光度。
圖3不同濃度的合成肽對溶菌酶溶菌活性的增強作用?？v坐標為細菌溶液的透光度。
具體實施例1.TRAP蛋白與溶菌酶的結合并激活溶菌酶活性1.1材料TRAP蛋白由本實驗室表達并純化，溶菌酶購自SIGMA公司。TRAP和溶菌酶的多克隆抗體由本實驗室制備。HRP標記的抗兔二抗和溶菌酶活性試劑盒購自萊博公司。
1.2方法1.2.1ELISA方法檢測TRAP蛋白與溶菌酶的結合①以TRAP蛋白包被酶標板，包被濃度為(2μg/孔)，4℃過夜，PBST洗滌一遍，10％胎牛血清37℃封閉1小時，PBST洗滌三遍，加入溶菌酶(5μg/孔)，37℃孵育1小時，PBST洗滌三遍，加入溶菌酶抗體(1∶1000)，37℃孵育1小時，PBST洗滌三遍，加入HRP標記的抗兔二抗(1∶10000)，TMB底物顯色液，室溫顯色10分鐘，每孔加入50μl 2N H2SO4，450nm波長下測OD值。
②以溶菌酶包被酶標板，包被濃度為(2μg/孔)，4℃過夜，PBST洗滌一遍，10％胎牛血清37℃封閉1小時，PBST洗滌三遍，加入TRAP蛋白(5μg/孔)，37℃孵育1小時，PBST洗滌三遍，加入TRAP蛋白抗體(1∶1000)，37℃孵育1小時，PBST洗滌三遍，加入HRP標記的抗兔二抗(1∶10000)，TMB底物顯色液，室溫顯色10分鐘，每孔加入50μl 2N H2SO4，450nm波長下測OD值。
1.2.2TRAP蛋白增強溶菌酶溶菌活性的作用觀察本實驗是按照溶菌酶活性測定試劑盒的具體操作方法來檢測TRAP蛋白對溶菌酶溶菌活性的增強作用。具體方法將溶菌酶標準品(4000unit/μl，200μl)與TRAP蛋白(0.5μg/μl，200μl)，(0.05μg/μl，200μl)混合，PBS(200μl)緩沖液為對照。37℃孵育1小時。稀釋至250unit，冰上5分鐘，與菌液37℃孵育15分鐘，在530nm測定透光度。
1.3結果1.3.1TRAP蛋白與溶菌酶的特異結合通過ELISA的方法檢測發(fā)現(xiàn)TRAP蛋白能夠特異與溶菌酶結合(圖1a，1b)。
1.3.2TRAP蛋白能夠增強溶菌酶的溶菌活性通過活性測定發(fā)現(xiàn)TRAP蛋白能夠增強溶菌酶溶菌活性(圖2)。
2.TRAP蛋白C末端同源小分子多肽對溶菌酶活性促進作用2.1材料化學合成的短肽SYFDYLYPPRPA，純度大于95％，其它材料同1.1。
2.2方法同1.2.2。具體將溶菌酶標準品(4000unit/μl，200μl)與短肽(0.1μg/μl，200μl)，(0.01μg/μl，200μl)混合，37℃孵育1小時，稀釋至250unit，冰上5分鐘，與菌液37℃孵育15分鐘，在530nm測定透光度。
2.3結果通過活性測定發(fā)現(xiàn)不同濃度短肽能夠增強進溶菌酶溶菌活性(圖3)。
3.我們在實驗中驗證了多種同源的TRAP蛋白能夠與不通來源的溶菌酶結合，得到相同結果。在附圖中僅列出TRAP蛋白(GenBankTM接受號AFF202641)和溶菌酶(雞蛋白來源SigmaL7651)相互作用的實驗結果。
權利要求
1金黃色葡萄球菌中RAP蛋白的靶分子TRAP(target of RAP)蛋白能夠與溶菌酶相互結合并能夠增強溶菌酶的溶菌活性；
2權利要求1中的TRAP蛋白是指來源于各種不同葡萄球菌菌株的同源蛋白分子，其氨基酸序列同源性大于80％；
3權利要求1中的TRAP蛋白可以是任何制備方法來源的TRAP蛋白分子；
4權利要求1中的溶菌酶是指不同種屬來源的溶菌酶；
5權利要求1中的溶菌酶可以是任何制備方法來源的溶菌酶分子；
6一組能夠與溶菌酶相互結合并增強溶菌酶溶菌活性的TRAP蛋白C末端同源小分子多肽；
7權利要求6中小分子多肽性是指具有下列通式氨基酸組成的一組保守性多肽分子S/T-Y/W-F-E/D-X-X-L-Y-P/A-X-X-X。其中S代表絲氨酸殘基，T代表蘇氨酸殘基，Y代表酪氨酸殘基，W代表色氨酸殘基，F(xiàn)代表苯丙氨酸殘基，E代表谷氨酸殘基，D代表天冬氨酸殘基，L代表亮氨酸殘基，P代表脯氨酸殘基，A代表丙氨酸殘基，X代表任何天然L-型氨基酸殘基或D-型異構體。
8權利要求7中的多肽分子可以是任何制備方法來源的多肽分子；
9任何包含權利要求7中的多肽分子序列的蛋白或多肽分子，其特征在于能夠與溶菌酶相互結合并增強溶菌酶溶菌活性；
10權利要求1-9中任一項所述蛋白或多肽分子在醫(yī)藥研究領域中的應用，其主要特征是增強溶菌酶溶菌活性。
11權利要求1-9中任一項所述蛋白或多肽分子在微生物發(fā)酵生產(chǎn)中的應用，其主要特征是增強溶菌酶溶菌活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及能夠與溶菌酶相互結合并促進溶菌酶活性的TRAP蛋白和一組能夠與溶菌酶相互結合并增強溶菌酶溶菌活性的TRAP蛋白C末端同源小分子多肽，該組多肽具有下列通式氨基酸組成S/T－Y/W－F－E/D－X－X－L－Y－P/A－X－X－X。其中S代表絲氨酸殘基，T代表蘇氨酸殘基，Y代表酪氨酸殘基，W代表色氨酸殘基，F(xiàn)代表苯丙氨酸殘基，E代表谷氨酸殘基，D代表天冬氨酸殘基，L代表亮氨酸殘基，P代表脯氨酸殘基，A代表丙氨酸殘基，X代表任何天然L－型氨基酸殘基或D－型異構體。本發(fā)明的能夠增強溶菌酶溶菌活性的TRAP蛋白和多肽可應用醫(yī)藥領域增強溶菌酶的溶菌活性或微生物發(fā)酵中增強溶菌酶的溶菌活性。
文檔編號A61K38/48GK1944458SQ20051010787
公開日2007年4月11日 申請日期2005年10月8日 優(yōu)先權日2005年10月8日
發(fā)明者楊光, 邵寧生, 高亞萍, 董潔, 李少華, 柳川, 沈倍奮, 范明 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所