專利名稱：中藥神曲在殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥神曲作為腸道吸收促進(jìn)劑的新用途，特別是神曲在殼聚糖包覆的 溶菌酶脂質(zhì)體的腸道吸收促進(jìn)劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
溶菌酶(Lysozyme)，化學(xué)名稱為N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，又稱胞壁質(zhì)酶，能切 斷N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之間的β -1，4糖苷鍵，破壞肽聚糖支架，在內(nèi)部滲 透壓的作用下使細(xì)胞脹裂開(kāi)，具有溶解革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的能力，是一種堿性的粘多糖 水解酶。而且溶菌酶作為一種重要的非特異性免疫因子，在體內(nèi)具有抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)及 加快組織修復(fù)等多種功能(Tenovuo J. ,Clinical applications of antimicrobial host proteins lactoperoxidase lysozyme and lactoferrin in xerostomia :efficacy and safety, Oral Dis.，2002，8 (1) -.23-29.) 溶菌酶作為藥物以含片、粉劑和腸溶膠囊為主，多作用于胃腸道等組織，或作為體 外用藥，其體內(nèi)吸收效率低下，生物利用度也很有限。為提高溶菌酶的血藥濃度，改變口服 藥物的劑型可能克服影響溶菌酶口服吸收的各種因素。研究人員對(duì)蛋白類(lèi)藥物的口服吸收給予廣泛關(guān)注，其中最普遍、有效的方法就是 將藥物微囊化處理。脂質(zhì)體是一項(xiàng)比較成熟的藥物載體技術(shù)，能避免內(nèi)容物被氧化、降解， 或被人體的酸或酶破壞，而且與細(xì)胞有一定的親和性，可增加藥物透過(guò)細(xì)胞膜的能力。作為 藥物載體，脂質(zhì)體在體內(nèi)具有一定的靶向性和藥物緩釋作用，能更有效并長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)揮藥 效。而且脂質(zhì)體膜材與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相似，由磷脂等組成，不會(huì)引起局部組織損傷，不誘發(fā) 過(guò)敏反應(yīng)而能多次長(zhǎng)期使用，對(duì)人體無(wú)毒、安全。有研究發(fā)現(xiàn)生物黏附性的給藥系統(tǒng)能延長(zhǎng)藥物在吸收部位的停留時(shí)間，有助 于藥物的吸收(Thanou M.，Verhoef J. C.，Junginger H. E.，Oral drug absorption enhancement by chitosan and its derivatives, Adv. Drug Deliv. Rev.，2001，52 117-126.)，殼聚糖是具有良好的生物相容性和較強(qiáng)的生物粘附性的多糖，作為藥物載體的 材料有助于藥物的吸收，其原因可能是膜上生物黏附和緊密連接的瞬間展開(kāi)。因此以殼聚 糖包覆脂質(zhì)體可進(jìn)一步促進(jìn)溶菌酶的吸收。為了更進(jìn)一步促進(jìn)溶菌酶的吸收，希望找到毒性小、安全性好的腸道吸收促進(jìn)劑， 中藥作為我國(guó)中醫(yī)的特有藥物，可以從豐富的中藥材中篩選獲得與現(xiàn)有的腸道吸收促進(jìn)劑 功能相同的藥物，促進(jìn)溶菌酶的吸收。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種中藥神曲作為殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體的腸道吸收 促進(jìn)劑的應(yīng)用。本發(fā)明的發(fā)明目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。將中藥神曲按常規(guī)方法煎制得中藥干重0. 6g/ml的湯劑；采用薄膜法制備殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體，制得的殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體的載藥量為5. 46mg/ml，使用時(shí)， 中藥神曲與殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體的體積比為15 1-5 3。所述殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體按文獻(xiàn)參考采用薄膜法制備，將磷脂混合物和 維生素E溶于適量無(wú)水乙醚，水浴超聲溶解。將溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸除有機(jī)試劑， 直至干燥脂質(zhì)膜沉淀在瓶壁上，繼續(xù)抽吸IOmin后停止。加入溶菌酶溶液繼續(xù)旋轉(zhuǎn)3小 時(shí)，探針式超聲lmin，形成溶菌酶脂質(zhì)體溶液。在磁力攪拌的作用下，緩慢滴加殼聚糖溶 液，10°C孵育1小時(shí)以上。選擇卵磷脂膽固醇為4 1(W/W)，溶菌酶磷脂混合物為 1 6. 25 (W/W)作為最佳制備工藝條件，制得的微球具有良好的分散性和穩(wěn)定性，其平均 粒徑為(61.57士13.2)歷，包封率為81.9%，載藥量為5. 46mg/ml，溶菌酶酶活為原來(lái)的 87. 9%。中藥材——神曲(Medicated Leaven)，歸屬脾、胃經(jīng)，在中醫(yī)中起健脾和胃、消食 化積的功效。本發(fā)明以殼聚糖包覆的脂質(zhì)體作為蛋白類(lèi)藥物溶菌酶的載體，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了神 曲能明顯促進(jìn)口服溶菌酶的腸道吸收，提高其生物利用度，并且長(zhǎng)期服用該藥物后使溶菌 酶在體內(nèi)的停留時(shí)間延長(zhǎng)至一周以上。本發(fā)明結(jié)果表明，小鼠僅口服溶菌酶溶液后其腸道吸收不足1 %，而小鼠連續(xù)口服 神曲與溶菌酶脂質(zhì)體4天后其溶菌酶的腸道吸收高達(dá)9%，再次延長(zhǎng)口服神曲與溶菌酶脂 質(zhì)體的時(shí)間至14天后小鼠對(duì)溶菌酶的腸道吸收超過(guò)13%，而且停止給藥后9天內(nèi)仍能在血 液中檢測(cè)出溶菌酶?？梢?jiàn)神曲能大幅度促進(jìn)殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體的腸道吸收。


圖1溶菌酶的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體的透射電鏡圖；圖3神曲對(duì)殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體的腸道吸收促進(jìn)作用；圖4神曲和脂質(zhì)體對(duì)溶菌酶的藥效動(dòng)力學(xué)影響圖(飼喂14天后停藥)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖1-圖4進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明是如何實(shí)現(xiàn)的。實(shí)施例1.稱取神曲6g(10只小鼠用量)用常規(guī)方法煎煮至IOml液體，離心取上清，每只 小鼠口服約1.0ml每次。2.使用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)溶菌酶的血藥濃度進(jìn)行測(cè)定間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)步驟如下①包被0. 5 μ g/ml的溶菌酶包被酶標(biāo)板，每孔加入100 μ 1，置4°C冰箱中過(guò)夜。②封閉每孔加入300 μ 1封閉液，37°C溫育2小時(shí)。③競(jìng)爭(zhēng)每孔加入不同濃度的溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)液50 μ 1和抗血清溶液50 μ 1，充分混合 后37°C溫育1小時(shí)。④二抗每孔加入HRP-羊抗兔IgGlOOy 1，37°C溫育1小時(shí)。⑤顯色每孔加入底物顯色液100μ 1，37°C溫育20min。
⑥終止每孔加入50 μ 1終止液。⑦檢測(cè)使用酶標(biāo)儀在490nm處檢測(cè)其吸光度。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的線性范圍為0. 1 μ g/ml-30 μ g/ml之間，回歸方程為y =-0. 0702x+0. 716，線性相關(guān)度為0. 99，標(biāo)準(zhǔn)曲線參見(jiàn)圖1。3.殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體的制備按文獻(xiàn)參考采用薄膜法進(jìn)行制備，并用
0.2%的殼聚糖進(jìn)行孵育包覆，制得的脂質(zhì)體為乳白色混懸液，透射電鏡檢測(cè)(參見(jiàn)圖2) 呈圓形，球體分散均勻，脂質(zhì)體的粒徑在52-80nm之間，平均粒徑為(61. 57 士 13. 2)nm(n = 100)。4.神曲對(duì)殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體的腸道吸收促進(jìn)作用實(shí)驗(yàn)組小鼠同時(shí)口服神曲湯劑20_60ml/kg和殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體 4-12ml/kg ；中藥對(duì)照組僅口服殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體8ml/kg ；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組僅口服服 神曲湯40ml/kg，連續(xù)口服4天后，根據(jù)該藥物藥效動(dòng)力學(xué)曲線，選取4小時(shí)(血藥濃度最 高)眼眶取血，檢測(cè)溶菌酶的血藥濃度，結(jié)果參見(jiàn)圖3 實(shí)驗(yàn)組的溶菌酶血藥濃度為(19. 33士5. 55) μ g/ml,是實(shí)驗(yàn)對(duì)照組血藥濃度的 7. 95倍，可見(jiàn)溶菌酶的腸道吸收明顯增加。按小鼠總血量5ml計(jì)，經(jīng)腸道吸收的溶菌酶總量 為96. 65 μ g，生物利用度最高達(dá)到9. 67%，較實(shí)驗(yàn)對(duì)照組僅為1 %左右的生物利用度，有了 明顯的提高。而中藥對(duì)照組的血藥濃度為(4. 28士0.39) μ g/ml，是實(shí)驗(yàn)對(duì)照組血藥濃度的
1.7倍，可見(jiàn)脂質(zhì)體作為藥物載體在一定程度上也能促進(jìn)溶菌酶的腸道吸收。5.神曲和脂質(zhì)體對(duì)溶菌酶的藥效動(dòng)力學(xué)影響(飼喂14天后停藥)因常規(guī)中藥湯劑以一至兩周為療程，為進(jìn)一步研究神曲對(duì)溶菌酶的腸道吸收和體 內(nèi)有效時(shí)間的維持，各組小鼠喂藥連續(xù)14天，停藥后4小時(shí)以及隔日取血，檢測(cè)溶菌酶的血 藥濃度，考察神曲對(duì)溶菌酶的藥效動(dòng)力學(xué)影響，結(jié)果參見(jiàn)圖4 實(shí)驗(yàn)組停藥后4小時(shí)后溶菌酶血藥濃度為(27. 50士3. 54) μ g/ml，按小鼠總血量 5ml計(jì)，經(jīng)腸道吸收的溶菌酶總量為137. 5 μ g，比實(shí)施例一中實(shí)驗(yàn)組的生物利用度提高了 4. 09%，可見(jiàn)適當(dāng)延長(zhǎng)服藥周期，可能更有利于中藥作用的發(fā)揮，可以提高溶菌酶的腸道吸 收。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠停藥24小時(shí)后血藥濃度從6. 5 μ g/ml下降為2. 25 μ g/ml，48小 時(shí)后為1. 65 μ g/ml，其后一直持續(xù)到停藥后第5天仍能在血液中檢測(cè)出微量的溶菌酶，可 見(jiàn)在脂質(zhì)體的保護(hù)下能一定程度上延長(zhǎng)溶菌酶的體內(nèi)停留時(shí)間。而實(shí)驗(yàn)組的血藥濃度在停 藥24小時(shí)后血藥濃度為13. 35 μ g/ml，48小時(shí)后仍有6. 25 μ g/ml，而且在之后的3 9天 內(nèi)實(shí)驗(yàn)組的血藥濃度在(4. 39 2. 43) μ g/ml之間，是原吸收最大值的15%左右，可見(jiàn)神曲 能進(jìn)一步延長(zhǎng)溶菌酶在體內(nèi)的停留時(shí)間，并維持較平穩(wěn)的血藥濃度。6.血液中溶菌酶的生物活性為驗(yàn)證口服殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體后經(jīng)腸道吸收的溶菌酶是否仍保持其生 物活性，以實(shí)施例二中各組小鼠停藥后4小時(shí)的血清檢測(cè)其酶活，采用溶菌酶微球菌比濁 法進(jìn)行檢測(cè)，以其水解溶壁微球菌(Micrococcus luteus)的速度計(jì)算血清中溶菌酶的比 活，結(jié)果如表1所示表1各組小鼠的溶菌酶血藥濃度及比活
權(quán)利要求
中藥神曲在殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體中的應(yīng)用，其特征在于將中藥神曲按常規(guī)方法煎制得中藥干重0.6g/ml的湯劑；采用薄膜法制備殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體，制得的殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體的載藥量為5.46mg/ml，使用時(shí)，中藥神曲與殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體的體積比為15∶1 5∶3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥神曲在殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體中的應(yīng)用，其特征在 于優(yōu)化制備工藝條件后制得的殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體的載藥量為5. 46mg/ml，溶菌 酶酶活為原來(lái)的87. 9%，平均粒徑為(61. 57士 13. 2)nm，包封率為81. 9%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中藥神曲的新用途，尤其涉及一種中藥神曲在殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體中的應(yīng)用。將中藥神曲按常規(guī)方法煎制得中藥干重0.6g/ml的湯劑；采用薄膜法制備殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體，制得的殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體的載藥量為5.46mg/ml，使用時(shí)，中藥神曲與殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體的體積比為15∶1-5∶3。神曲能明顯促進(jìn)殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體的口服吸收，大幅度提高殼聚糖包覆的溶菌酶脂質(zhì)體的腸道吸收效率，提高溶菌酶的血藥濃度。并且溶菌酶在體內(nèi)保持良好的生物活性，能較好的行使其生物學(xué)功能。本發(fā)明對(duì)中藥神曲和殼聚糖包覆的脂質(zhì)體挖掘了新的醫(yī)藥用途，有很好的藥用前景。
文檔編號(hào)A61K36/00GK101933949SQ201010273320
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月3日
發(fā)明者沈彥萍, 沈文婧, 陳宇光 申請(qǐng)人:上海沈李科工貿(mào)有限公司